WO2016111568A1 - 바이러스 검출용 키트 - Google Patents

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WO2016111568A1
WO2016111568A1 PCT/KR2016/000153 KR2016000153W WO2016111568A1 WO 2016111568 A1 WO2016111568 A1 WO 2016111568A1 KR 2016000153 W KR2016000153 W KR 2016000153W WO 2016111568 A1 WO2016111568 A1 WO 2016111568A1
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WO
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virus
probe
kit
biomolecule
trypsin
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PCT/KR2016/000153
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English (en)
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Inventor
함승주
김현욱
송대섭
김지혜
장은지
최지혜
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
한국생명공학연구원
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to a virus detection kit, a virus detection method and a virus detection composition.
  • Viruses are infectious agents that are smaller than bacteria. It consists of genetic material RNA or DNA and the protein surrounding the genetic material. Viruses can be divided into plant viruses, animal viruses, and bacterial viruses (phages) according to the type of host. However, in most cases, depending on the type of nucleic acid, it is divided into DNA virus and RNA virus, which are further subdivided into river, neck, and fruit.
  • avian influenza is an acute viral infectious disease caused by the infection of the Avian influenza virus in chickens, ducks, or wild birds and rarely causes infection in humans.
  • Avian influenza viruses are classified into three types according to pathogenicity: high pathogenic, low pathogenic, and non-pathogenic, and human infections of highly pathogenic avian influenza A (H5N1), which may be transmitted to humans from late 2003 to February 2008. More than 640 cases have been reported.
  • Avian influenza causes enormous economic damage due to high mortality and low egg production rates of algae, and is unlikely to cause human infection, but high mortality when infected. Since the development of the underlying vaccine is difficult and the rate of spread is very high, it is necessary to minimize disease spread and economic loss through early diagnosis.
  • immunological detection methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme immunoassay (EIA) and immunofluorescence assay (IFA), and RNA detection by RT-PCR are known.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • IFA immunofluorescence assay
  • the present invention is to provide a virus detection kit, a virus detection method and a virus detection composition capable of efficiently detecting a virus within a short time.
  • the present invention also provides a virus detecting composition
  • a virus detecting composition comprising a biomolecule that specifically reacts with a surface protein of a virus and a probe that reacts with a virus activated by the biomolecule.
  • the invention also comprises contacting a sample obtained from an individual with a biomolecule that specifically reacts with a surface protein of a virus and contacting a probe that reacts the sample contacted with the biomolecule with a virus activated by the biomolecule. It provides a virus detection method comprising the step of.
  • viruses can be detected with high efficiency in a short time at low cost.
  • FIG. 1 is a view showing a schematic diagram of a method for detecting influenza virus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing a TEM image of observing the shape of the amphiphilic particles (FluSome) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the average particle diameter of the amphiphilic particles according to an embodiment of the present invention.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FIG. 5 is a view showing a result of detecting an influenza virus using amphiphilic particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a result of detecting various influenza viruses using amphiphilic particles according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the results of detecting various influenza viruses using amphiphilic particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view showing a result of detecting influenza virus using the organic-inorganic particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing a result of detecting the influenza virus using the organic-inorganic particles according to an embodiment of the present invention.
  • 10 is a view showing the results of detecting influenza virus by measuring the surface enhanced Raman scattering signal.
  • 11 is a diagram showing the results of detecting influenza virus by observing the change of color with the naked eye.
  • FIG. 12 is a view showing a result of detecting an influenza virus using a liposome according to an embodiment of the present invention.
  • HA hemagglutinin
  • M2 ion channel an M2 ion channel that regulates the balance of hydrogen ion concentrations
  • RNP Renicleoprotein
  • the inventors have studied to develop a method for early detection of viruses based on the common characteristics of the viruses described above.
  • the virus is activated using a probe capable of activating the virus through a biomolecule that specifically reacts with the surface protein of the virus and detecting the presence or absence of the virus by reacting with the activated virus. It was confirmed that the present invention was completed.
  • the present invention provides a virus detection kit comprising a biomolecule that specifically reacts with a surface protein of a virus and a probe that reacts with a virus activated by the biomolecule.
  • virus refers to an obligatory intracellular parasite, having DNA or RNA as a nucleic acid, proliferation beginning with nucleic acid, not proliferating by dividing, and having no enzyme system necessary for ATP production. it means.
  • the virus of the present invention includes a naked virus and an enveloped virus, and specifically, the virus according to an embodiment of the present invention may be an enveloped virus.
  • the envelope virus is specifically a DNA virus including a herpesvirus, a poxvirus and a hepadnavirus, a flavivirus, a togavirus, a coronavirus, Including hepatitis D, orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus, bunyavirus, filovirus and retrovirus Include all that belong to the RNA virus.
  • the orosomicovirus includes all viruses included in influenza virus A, influenza virus B, influenza virus C, isavirus, sogotovirus and quaranjavirus.
  • the coronavirus includes all viruses included in alpha coronavirus, beta coronavirus, beta coronavirus, gamma coronavirus and delta coronavirus.
  • the paramyxoviruses include all viruses included in the paramyxoviruses, rubula virus, mobilebivirus and pneumoviruses.
  • the virus includes nucleic acids and proteins surrounding them.
  • Such viral proteins protect the viral genome, are involved in the adsorption and / or fusion of viral particles to cells, the structural proteins, proteins and nucleic acids that determine the antigenicity of the virus and maintain its shape.
  • non-structural proteins which are proteins involved in synthesizing the back.
  • the term "surface protein of a virus” refers to the structural protein.
  • the "surface protein” of the present invention includes all the exogenous proteins present in the envelope which have the specific antigenicity of the virus and are involved in the adsorption and / or fusion of the virus to the cell.
  • the virus of the present invention may be a glycoprotein or a fusion protein involved in fusion to cells.
  • the surface protein of the virus may be hemagglutinin (HA), spike protein (spike protein) or F protein (F protein).
  • HA hemagglutinin
  • spike protein spike protein
  • F protein F protein
  • the virus of the present invention may be to include a surface protein that causes membrane fusion by adsorbing to the cell membrane of the host cell.
  • the virus of the present invention may include a surface protein having a property of adsorbing and / or membrane fusion with a cell membrane of a host cell when the surface protein existing in an inactive state is changed to an active form by a biomolecule. have.
  • the "virus” may be an influenza virus or a highly pathogenic influenza virus.
  • Influenza viruses are "surface proteins of the virus” and include the glycoprotein hemagglutinin (HA). After hemagglutinin is expressed as a polypeptide (precursor HA0), the proteolytic cleavage of HA O into HA 1 and HA 2 consists of hydrophobic amino acid residues under acidic conditions. The fusion peptide is activated. HA differs in amino acid composition of the cleavage site and amino acid composition of the fusion peptide depending on the pathogenicity of the influenza virus.
  • HA glycoprotein hemagglutinin
  • the "virus” may be a corona virus.
  • Corona virus includes a spike protein as a surface protein, and the spike protein includes S 1 and S 2 sites. When the S1 site of the spike protein binds to the host cell, it is cleaved into S 1 and S 2 by protease, and the hydrophobic site at the end of S2 is exposed and activated.
  • the "virus” may be a paramyxovirus.
  • Paramyxoviruses include HN proteins as surface proteins.
  • the HN protein is an adhesion (or adsorption) protein that attaches or adsorbs a virus to a host cell.
  • the virus is present as a precursor HN 0 in the virus inactive state, but is activated when the amino acid residue is removed from the C -terminal by hydrolysis.
  • Paramyxoviruses also include F proteins as surface proteins.
  • the F protein is present as precursor F 0 in the virus inactive state, but is cleaved into F 1 and F 2 by biomolecules, and then activated into a new N -terminal form F 1 .
  • the F protein includes both a polybasic residue and a monobasic residue at the cleavage site. Preferably it may be an F protein having a polybasic residue.
  • reaction means that a substance is brought into contact with another substance and a change in physical and / or chemical state such as state, color, shape or chemical bond occurs or a phenomenon thereof.
  • the state changes to an activated virus such as the surface protein of the virus is changed to form a fusion peptide.
  • the reaction of the activated virus with the probe may be a fusion reaction or an aggregation reaction.
  • the fusion reaction may be a phenomenon in which an active virus and a part of the probe of the present invention are combined.
  • the fusion reaction may be understood to include a phenomenon in which the substance inside the probe is discharged out by the fusion.
  • the active virus can be detected by confirming whether the active virus and the probe are fused using the principle that the fusion peptide present in the surface protein of the active virus fuses the cell membrane of the endosome.
  • the aggregation reaction refers to a phenomenon in which molecules or particles are stuck together in a solution.
  • the aggregation reaction refers to a phenomenon in which the stability of the probe of the present invention is lowered by a virus to be detected, so that the probes agglomerate and / or precipitate.
  • biomolecule refers to a molecule necessary for the structure, function, information transmission, and the like of an organism.
  • the biomolecule may include specific structures and / or sites for performing functions, information transfer, and the like.
  • the specific structure of such biomolecules is the driving force for reaction through intermolecular binding reaction.
  • Biomolecules include amino acids and proteins, sugars and carbohydrates, fatty acids and lipids, nucleotides and nucleic acids, and the like, and include both those made in vivo and / or artificially synthesized.
  • the "biomolecule” may be an enzyme that is a protein consisting of about 62 to 2500 amino acid residues.
  • the enzyme may be a proteolytic enzyme.
  • the first synthesized form is inactivated, but when a specific site is removed (or cleaved), a proteolytic enzyme cleaves the specific site to activate the inactivated protein.
  • proteolytic enzymes can be used without limitation as long as they can cut a specific site.
  • the protease may be one or more selected from the group consisting of furin, trypsin, serine, endoprotease, and carboxypeptidase.
  • the proteolytic enzymes include both derivatives or modified forms.
  • proteolytic enzymes include recombinant human purine, recombinant mouse purine, trypsin-EDTA, acetylated trypsin, TPCK-trypsin, N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone-trypsin, Trypsin-acrylic, Purin like protease, Kex2 proteases, transmembrane protease serine, TMPRSS2, TMPRSS4, tryptase clara, plasmin, serine proteases ( serine protease, subtilisin like endoprotease, carboxypeptidase, and combinations thereof.
  • trypsin when trypsin reacts with hemagglutinin (HA), a surface protein of the influenza virus, the enzyme digestion of trypsin occurs at His57-Asp102-Ser195 and the enzyme digestion of purine is His194-Asp153-Ser368. Takes place in position. Since trypsin can degrade both hemagglutinin of high and low pathogenic influenza viruses, trypsin can be used to detect high and low pathogenic influenza viruses. In addition, since purine can decompose only hemagglutinin of the highly pathogenic influenza virus, it is possible to detect the highly pathogenic influenza virus using purine.
  • HA hemagglutinin
  • the action of the hydrolase occurs at the boundary between the sites of S1 and S2. Therefore, the corona virus is activated as the hydrophobic region of S2 is exposed after cleavage by the action of the hydrolase, and can be detected using the probe of the present invention.
  • the biomolecule that reacts with the surface protein of the paramyxovirus may be a protease or carboxylpeptidase capable of cleavage at an arginine residue at the C -terminus.
  • the protease can recognize and cleave an F protein comprising an RXK / RR array.
  • it may be a purine or subtilisin-like endoprotease.
  • the term "active virus” or “activated virus” means a virus whose surface protein is activated by a biomolecule that specifically reacts with the surface protein of the virus.
  • the activation of the surface protein of the virus means that the surface protein of the virus has been changed into a state capable of reacting with, for example, specifically reacting with a host cell and / or a probe.
  • “Activation of the virus” herein means a process in which the inactive virus is converted into the active virus. In order to cause the virus to be infected, the process of activating the virus is necessary. Therefore, by detecting the presence of the active virus, it is possible to determine whether the virus is infected.
  • the activation of the viral surface protein means that the fusion protein or fusion peptide present in the surface protein of the virus is capable of causing a fusion reaction with the membrane of the host cell or the surface of the probe of the present invention.
  • hemagglutinin which is an activated virus
  • HA is a surface protein that is degraded by an enzyme to expose a fusion peptide present inside of hemagglutinin in an inactive form. Means converted to.
  • enzymes that specifically cleave the cleavage site of HA include purine and / or trypsin. Since purine can only degrade hemagglutinin of the highly pathogenic influenza virus, the influenza virus is highly pathogenic when HA of the influenza virus is degraded by purine.
  • trypsin can degrade both hemagglutinin of high and low pathogenic influenza viruses, trypsin exhibits high pathogenicity or low pathogenicity when degraded by trypsin.
  • the cleavage site of the low pathogenic influenza virus consists of -R- at the C-terminus, and the cleavage site of the high pathogenic influenza virus consists of R / K-R-K-K-R.
  • HA When HA is activated by an enzyme that specifically cleaves a cleavage site of HA, rearrangement of HA occurs and the fusion peptide in HA is exposed outward to become an active virus.
  • the reaction of the probe with the influenza virus occurs by the fusion peptide of the influenza virus.
  • Virus infection can be detected by measuring a signal that changes in response to the probe's response.
  • the activated virus means that the surface protein S protein is converted from the inactive form to the form in which the hydrophobic region existing inside the spike protein is exposed.
  • the protein is cleaved into S1 and S2 by a protease, and the hydrophobic portion at the end of S2 is exposed to activate the virus.
  • the hydrophobic region exposed at the S2 is attached to the hydrophobic region in the cell membrane of the host cell, and the other side is bound with the viral outer membrane, and a conformation change occurs when the center of the S2 region is folded, resulting in membrane fusion.
  • the probe of the present invention and the activated corona virus react, the stability of the probe is changed to generate various signals, and the change of the probe can be detected by measuring the change.
  • membrane fusion is initiated by forming an active surface protein containing SS-binding chains F 1 and F 2 and fixing the N -terminal residue of F 1 , which exhibits broad hydrophobicity, to the cell membrane of the host cell or the cell membrane of the target. Therefore, paramyxovirus is activated by the biomolecule of the present invention reacts with the surface protein, and the activated virus reacts with the probe of the present invention, causing a change in the probe. Thus, the virus can be detected by measuring the change.
  • the probe of the present invention may exhibit various structures or forms depending on the type of virus or virus surface protein to be detected.
  • the probe may have a membrane structure.
  • the membrane includes a mono layer or bilayer structure.
  • the mono layer is a membrane structure including a "hydrophobic region-hydrophilic region", and in one embodiment, may be a structure including a hydrophobic core and a hydrophilic shell in an aqueous solution.
  • the bilayer is a film structure including "hydrophilic region-hydrophobic region-hydrophobic region-hydrophilic region". In one embodiment, the bilayer may be a form in which two mono layers are combined. In addition, the bilayer may have a structure including a hydrophilic core, a hydrophobic region surrounding the hydrophilic core, and a hydrophilic shell surrounding the hydrophobic region.
  • the probe having the membrane structure may be prepared by a conventional method to which the present invention belongs, and according to one embodiment, microfludization, high-pressure homogenization, and emulsion using microfluidization equipment It may be prepared using an emulsion method or ultrasonic waves, but is not limited thereto.
  • micelle is meant a particle having a hydrophobic core and a hydrophilic shell.
  • the micelle may be a micelle of a surfactant or a polymer self-assembled micelle.
  • the micelles also include a multi-layered form including two or more monolayers.
  • the micelles include, but are not limited to, spherical, ellipsoidal, or cylindrical.
  • the probe of the micelle structure may further include components such as a marker and an inorganic particle in the hydrophobic core region.
  • the "polymersome” means a particle having a double layer membrane structure having a "hydrophilic region-hydrophobic region-hydrophobic region-hydrophilic region” and including a polymer or a copolymer in the hydrophobic and hydrophilic regions.
  • the polymer or copolymer may include artificially synthesized ones and lipids together, or artificially synthesized ones. Artificially synthesized is meant to include all polymers and copolymers except for naturally occurring lipids.
  • the polymersome includes both a single layer of a double layer membrane structure and a multi layer including two or more layers.
  • the polymersome may include a polymer or copolymer artificially synthesized from liposomes.
  • the polymersome may also include a single layer consisting of a bilayer type membrane and a multi-layer type including two or more single layers of the double layer.
  • the "colloidsome” means a colloidal particle having a size of 1 nm to 1000 nm or a structure in which the particle size is tightly packed.
  • a colloidal particle having a size of 1 nm to 1000 nm or a structure in which the particle size is tightly packed.
  • a structure in which the particle size is tightly packed may comprise a single layer and a bilayer. It also includes both single and multiple films.
  • the "droplet” means to exhibit a drop shape in the membrane structure particles. It includes monolayers and bilayers, and includes both monolayers and multilayers.
  • the rod shape refers to a straight shape such as a rod, rod or pole.
  • the spherical shape means a round shape, and includes both a perfect sphere and an incomplete sphere.
  • the ring shape generally means a shape in which a center is empty in a spherical or circular shape.
  • the flat form refers to a thin flat plate, a plate shape.
  • the plate-shaped probe may be in the form of a plate-like probe coated on or outside the substrate or carrier.
  • Probes of the present invention can be classified according to the components constituting the probe or a method of reacting with an active virus.
  • the probe comprises an amphiphilic particle comprising a marker; Organic-inorganic particles; Antibodies; Aptamers; And combinations thereof; Can be.
  • the "amphiphilic particle comprising a marker” may be an amphipathic probe including a marker therein that can determine whether the probe and the active virus react.
  • Amphiphilic is also called amphipathic and means that it has both hydrophilic and hydrophobic properties.
  • the form of the amphipathic probe is not particularly limited as long as it exhibits amphipathy.
  • the "marker” refers to a substance that can determine whether the probe reacts with the active virus.
  • the type of the marker is not particularly limited, and may be used without limitation as long as the characteristic changes according to the change before and after the reaction of the probe, and the marker capable of confirming the changed characteristic through a test or the like.
  • the marker capable of determining whether the probe is fused may be selected from the group consisting of self-quenched dyes, fluorescent dyes, electrochemiluminescent materials, and combinations thereof. .
  • the self-quenching dye refers to a material that exhibits quenching when dyes (sel-quenched dyes) are located adjacent to each other, and exhibits fluorescence by dequenching when the aggregated dyes are released and spread. .
  • the self-quenching dye is 3,3-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio; Dioc), 3,3-diooctadecyl-5,5-di ( 4-sulfophenyl) oxacarbocyanine sodium salt (3,3 -dioctadecyl-5,5-di (4-sulfophenyl) oxacarbocyanine sodium salt), 4- (4- (dihexadecylamino) styryl) -N- Methylpyridinium iodide (4- (4- (dihexadecylamino) styryl) -N-methylpyridinium iodide; DiA; 4-Di-16-ASP), 4- (4- (didecylamino) styryl) -N- Methylpyridinium iodide (4- (4- (didec
  • the electrochemiluminescent material includes, but is not limited to, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) [Ru (bpy) 32+].
  • the fluorescent dye refers to a material having fluorescence, a material having the property of absorbing the wavelength included in the light to change the color light to re-radiate.
  • Fluorescent dyes are also referred to as luminescent dyes, fluorescent dyes well known in the art can be used without limitation.
  • the fluorescent dye is Texas red, fluorescein, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl), luminol It may be at least one selected from the group consisting of a compound containing a fullerene and an aromatic group.
  • a phosphorescent dye means a material that exhibits a luminance effect by changing and re-radiating wavelengths absorbed in the illumination light.
  • sulfide minerals X m Z n
  • Z is a non-metal element
  • alkaline earth metal sulfide but is not limited thereto.
  • the amphiphilic particle means a particle having a region showing hydrophilicity and a region showing hydrophobicity.
  • Amphiphilic particles can be used without limitation as long as they are particles having a hydrophilic region and a hydrophobic region.
  • Amphiphilic particles include hydrophilic polymers, hydrophobic polymers, lipid polymers, and combinations thereof. The polymer may be included in the form of a copolymer.
  • the hydrophilic polymer is polyalkylene glycol (PAG), polyacrylic acid (PAA), polyacrylonitrile (PAN), polyethylene oxide (PEO), polyvinylacetate (PVAc), polyvinyl alcohol (PVA) At least one selected from the group consisting of polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide and hydrophilic polyamino acids and derivatives thereof.
  • hydrophilic polymers include (mono) methoxypolyethyleneglycol, (mono) acetoxypolyethyleneglycol, polyethyleneglycol, copolymers of polyethylene and propyleneglycol, polyvinylpyrrolidone, polyglutamine, polyglutamic acid, polythreonine, poly At least one selected from the group consisting of asparagine, polyarginine and polyserine.
  • the hydrophilic polymer includes a derivative thereof.
  • the derivative of polyethylene glycol may be methoxy polyethylene glycol (mPEG).
  • the hydrophobic polymer may be used without limitation so long as it is a material capable of forming amphiphilic particles together with the hydrophilic polymer.
  • the hydrophobic polymer may be one or more selected from the group consisting of polyesters, polyanhydrides, hydrophobic polyamino acids, polyorthoesters, and polyphosphazines.
  • the polyamino acid is at least one in the group consisting of polyleucine, polyisoleucine, polyvaline, polyphenylalanine, polyproline, polyglycine, polytryptophan, polyalanine, polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, and polymethionine It includes.
  • the hydrophobic polymer includes a derivative thereof.
  • lipid or “lipid polymer” includes phospholipids, lipoproteins, glycolipids, cationic lipids, and the like, as long as they can form a bilayer membrane structure, but is not limited thereto.
  • the lipids include both naturally derived derivatives and synthesized lipid derivatives.
  • the phospholipids include glycerophos pholipids and sphingophospholipids (Phosphosphingolipids).
  • the glycerophospholipid may be a diacrylglyceride structure, specifically phosphatidate (Phosphatidic acid, PA), lecithin (lecithin, Phosphatidylcholine (PC), cephalin) and phosphinositides (Phosphoinositides).
  • the cephalin phospholipids include phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE).
  • the phosphoinositides phospholipids include phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol phosphate (PIP), phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2), and phosphatidyl inositol triphosphate; do.
  • the sphingophospholipids include ceramide phosphorylcholine (Sphingomyelin, SPH), ceramide phosphorylethanolamine (Sphingomyelin, Cer-PE) and ceramide phosphoryllipid.
  • the synthetic phospholipid derivative is not limited to the kind, but in one embodiment 1,2-didodecanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (EPC, 1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3- ethylphosphocholine), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn Glycerol-3-phosphoethanolamine (POPE, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-phospho- L-serine (POPS, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) and combinations thereof may be selected.
  • EPC 1,
  • Amphiphilic particles according to one embodiment of the present invention can be prepared using a known method freely.
  • a method of dispersing an amphiphilic block copolymer including a hydrophilic region and a hydrophobic region in an aqueous solution and applying ultrasonic waves a method of dispersing or dissolving the organic solvent in an organic solvent and then extracting or evaporating the organic solvent with excess water, and an organic solvent.
  • Prepared by dispersing or dissolving in water, and dialysis with excess water, dispersing or dissolving in an organic solvent, strongly evaporating the solvent using a homogenizer or a high pressure emulsifier, or thin film hydration. can do.
  • Probes having various structures and shapes may be formed by the type of polymer used in the amphiphilic particles and a manufacturing method.
  • the amphiphilic particle may be a particle having a membrane structure, specifically, micelles, polymersomes, colloidsomes, vesicles, liposomes , Droplets, and combinations thereof.
  • the amphiphilic particles when the amphiphilic particles satisfy a mass fraction of 0.25 to 0.40 calculated according to Equation 1 below, the amphiphilic particles exhibit a polymersome morphology and the mass fraction is greater than 0.40 and not more than 0.70 Amphiphilic particles exhibit a micelle structure.
  • Mass fraction mass of hydrophilic polymer / (mass of hydrophilic polymer + mass of hydrophobic polymer)
  • the amphiphilic particles exhibit a polymersome form when the mass% satisfies 25% to 40%, and the amphiphilic particles when the mass% is greater than 40% and 70% or less. Represents a micelle structure.
  • the size of the amphiphilic particles is not limited.
  • Amphiphilic particles can be nano or microparticles, for example the average particle diameter of the amphiphilic particles can be 50 to 10000 nm.
  • the probe may be an "organic or inorganic particle".
  • the reaction of the active virus or the activated surface protein and the probe lowers the stability in the solution of the probe, thereby causing aggregation. Therefore, the virus can be detected using the organic-inorganic particle probe of the present invention depending on the presence or absence of the reaction.
  • organic-inorganic particle means a particle including an organic material and an inorganic material.
  • the surface of the core (or shell) of the inorganic material may be in the form of a coating or bonded organic material.
  • the form of the organic-inorganic particles is not proposed, and may be in the form of rod, sphere, cylinder, flat, oval or ring type according to one embodiment.
  • the inorganic material may be made of a metal, and the metal may be, for example, gold, silver, a mixture containing them, and a combination thereof. Preferably gold, silver and combinations thereof.
  • the organic material may be a stabilizer of an inorganic material.
  • the term stabilizer means a substance for preventing agglomeration of particles, and is used in combination with a dispersant.
  • the stabilizer may preferably be a stabilizer of the metal.
  • the stabilizer may be included regardless of its type so long as the inorganic material is well dispersed in a solvent.
  • the stabilizer may be a surfactant.
  • Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB, Hexadecyltrimethylammonium bromide), Tetradecyl trimethyl ammonium bromide (TTAB), dodecyltrimethylammonium bromide (DTABpolyoxy Tween) (20) sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate), Tween 80 (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate) and Triton X-100 may be one or more selected from the group consisting of.
  • CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
  • TTAB Tetradecyl trimethyl ammonium bromide
  • DTABpolyoxy Tween (20) sorbitan monolaurate
  • Tween 40 polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate
  • Tween 80 polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate
  • Triton X-100 may be one or more selected from the group consist
  • the organic-inorganic particles may further comprise an amphiphilic polymer.
  • the amphiphilic polymer may be in a state in which an amphiphilic polymer is bonded to the surface of the organic-inorganic particles, or may be coated with an amphiphilic polymer layer or an amphiphilic polymer shell structure.
  • the organic-inorganic particles further comprising an amphiphilic polymer may further include a functional group layer between the amphiphilic polymer and the surface of the organic-inorganic particles.
  • the functional group layer may be a structure that combines a compound having a functional group that is well bonded to the surface of the inorganic particles, and bonds the polymer layer to the compound.
  • the compound having the functional group may be used as long as the -SH bond is possible on the surface of the inorganic particle, for example, cysteamine may be used, but is not limited thereto.
  • the inorganic particles are gold
  • the organic-inorganic particles comprising the amphiphilic polymer may further comprise a functional group for initiating amino acid polymerization between the functional group layer and the bond of the amphiphilic polymer.
  • the functional group may be NH 2 .
  • the amphiphilic polymer may be in the form of an A-B amphiphilic block copolymer comprising a hydrophilic A block and a hydrophobic B block or a triple block copolymer of B-A-B type.
  • the amphiphilic polymer may be a lipid.
  • the hydrophilic A block is a hydrophilic polymer comprising polyalkylene glycol (PAG), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, polyacrylic acid (PAA), It may be at least one selected from the group consisting of polyacrylonitrile (PAN), polyethylene oxide (PEO), polyvinylacetate (PVAc), hydrophilic polyamino acid and derivatives thereof.
  • PAG polyalkylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PAA polyvinylpyrrolidone
  • PAA polyacrylamide
  • PAA polyacrylic acid
  • PAN polyacrylonitrile
  • PEO polyethylene oxide
  • PVAc polyvinylacetate
  • the hydrophilic A block is monomethoxypolyethylene glycol, monoacetoxy polyethylene glycol, polyethylene glycol, copolymer of polyethylene and propylene glycol, polyglutamine, polyglutamic acid, polythreonine, polyasparagine, polyarginine and polyserine and poly At least one selected from the group consisting of vinylpyrrolidone.
  • Hydrophilic A blocks have a number average molecular weight of 200 to 50,000 Daltons or 1,000 to 20,000 Daltons.
  • the hydrophobic B block can be a hydrophobic polymer. Specifically, it may be at least one selected from the group consisting of polyesters, polyanhydrides, hydrophobic polyamino acids, polyorthoesters, and polyphosphazines.
  • the hydrophobic B blocks are polyleucine, polyisoleucine, polyvaline, polyphenylalanine, polyproline, polyglycine and polymethionine, polytryptophan, polyalanine, polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, polydi Oxan-2-one, copolymer of polylactide and glycolide, copolymer of polylactide and dioxan-2-one, copolymer of polylactide and caprolactone, and copolymer of polyglycolide and caprolactone It may be one or more selected from the group consisting of. Hydrophobic B blocks have a number average molecular weight of 50 to 50,000 Daltons, or 200 to 20,000 Daltons.
  • the organic-inorganic particles may be prepared by reacting an inorganic material in an ionic state with a reducing agent capable of reducing the inorganic material in the presence of an amphiphilic polymer as a stabilizer.
  • Stabilizers used in the preparation of organic-inorganic particles include, but are not limited to, cetyl trimethylammonium bromide.
  • the organic-inorganic particles further include an amphiphilic polymer layer, it is preferable to have a double layer structure that can act as a stabilizer of the organic-inorganic particles.
  • the size of the organic-inorganic particles is not limited and may be nano or micro size.
  • the average particle diameter of the organic-inorganic particles may be 50 to 1000 nm.
  • the organic-inorganic particles of the present invention can be prepared using an emulsion method, thin film hydration method or dialysis method, and specific manufacturing conditions are generally used depending on the type of organic material, inorganic material and polymer. It can be carried out by changing within the range.
  • the organic-inorganic particles of the present invention may further comprise a marker in order to more clearly determine whether the reaction with the virus.
  • the probe may be an "aptamer".
  • aptamer refers to a substance capable of binding to a target molecule in the form of a single, double-stranded DNA or RNA.
  • the probe may be an "antibody".
  • antibody refers to a substance capable of binding to a target molecule as a protein coupled with an amino acid and oligosaccharide.
  • the target molecule may be an active virus, an activated surface protein, a protein representing the antigenicity of the active virus, or a combination thereof.
  • the aptamer or the antibody may specifically bind to a target molecule, and preferably may have a structure capable of complementarily binding to a target molecule.
  • the virus can be detected depending on the presence or absence of a specific binding reaction between the active virus, the activated surface protein and / or the antigenic protein of the active virus and the aptamer or antibody.
  • the target molecule may be a membrane fusion protein present in the surface protein of the virus.
  • the influenza virus may be a fusion peptide of hemagglutinin (HA).
  • Aptamers or antibodies for detection of the fusion peptide of HA comprise complementary structures or sequences capable of specifically binding to the fusion peptide.
  • corona virus may be a spike protein
  • paramyxovirus may be F protein.
  • the aptamer or antibody may further include metal particles or markers to more easily or clearly identify the binding reaction with the target molecule.
  • aptamers or antibodies can be prepared and selected using known methods.
  • methods for confirming binding of aptamers or antibodies are well known in the art. For example, when the aptamer or the antibody is used to bind to the gold particles, when the aptamer or the antibody bound to the gold particle is bound to the fusion peptide of the virus, a change in color appears as the size of the particle changes. By observing such a change in color, an active virus can be detected.
  • the kit or composition of the present invention may include only one type of the probe or two or more types of probes together.
  • the kit or composition may further comprise an acidic substance of pH 6 or below.
  • an acidic substance having a pH of 6 or less may be an acidic solution
  • an acidic solution of the pH range may be included in the kit, or may be prepared and used directly when used.
  • An acid solution having a pH of 6 or less can be used without limitation as long as it satisfies the above pH conditions.
  • Commercially available stock solutions may be used or may be prepared and used directly.
  • a stock solution, which is a concentrated acidic solution may be used after dilution in water to pH 6 or less.
  • the acidic solution may be pH 4 to 6 or pH 5 to pH 5.7. Since the range is similar to the pH range in the host cell, the detection efficiency can be enhanced.
  • kits and compositions of the present invention may further comprise a reaction aid.
  • the reaction adjuvant may be a reaction adjuvant of the biomolecule to assist the reaction of the biomolecule and the virus, or may be a reaction aid to assist the reaction of the probe and the target molecule. As one specific example, it may be an adjuvant that assists the reaction of the protease and the surface protein, or an adjuvant that assists the reaction of the probe with a target molecule including an active virus-activated surface protein or an antigenic protein of the active virus. .
  • the term "adjuvant" is meant to include all if it can increase the detection sensitivity and / or specificity of the virus through the above action. Examples of increasing the detection sensitivity and / or specificity of the virus include acting to speed up the reaction, lowering the minimum value at which the reaction occurs, or inhibiting the reaction other than the reaction of the surface protein with the biomolecule, but the mechanism is limited. It doesn't work. Adjuvants include any and all types so long as the detection sensitivity and / or specificity can be increased according to the type of biomolecule and the surface protein reacting with the biomolecule.
  • the adjuvant may be a ketone.
  • the ketone compounds include, but are not limited to, for example, phenylethyl chloromethyl ketone, tosyl phenylalanyl fluoromethyl ketone (TPCK, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone) and combinations thereof.
  • TPCK tosyl phenylalanyl fluoromethyl ketone
  • ketone may be further included as an adjuvant in detecting influenza virus.
  • HA hemagglutinin
  • the present invention relates to a virus detection method.
  • the detection method of the present invention includes contacting a sample biomolecule and contacting a sample in contact with the biomolecule with a probe. Specifically, contacting a sample obtained from the individual with a biological molecule that specifically reacts with the surface protein of the virus; And contacting a sample in contact with the biomolecule with a probe that reacts with a virus activated by the biomolecule.
  • the detection method of the present invention can detect a virus by confirming whether or not a reaction occurs by the contact.
  • the active virus can be detected by checking whether a fusion reaction between the active virus and the probe is performed using the principle that the fusion peptide present in the surface protein of the active virus fuses the cell membrane of the endosome.
  • the active virus can be detected by checking whether the fusion peptide present in the surface protein of the active virus lowers the stability of the probe by checking whether the probe is aggregated.
  • a method of confirming the presence or absence of a reaction may measure a signal or a change of a probe caused by the reaction.
  • the change or signal that occurs when the active virus reacts with the probe may include fluorescence intensity, luminescence intensity, phosphorescence intensity, absorbance intensity, electrical signal, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) signal, and FET ( field-effect transistor), color, and degree of dispersion of the probe may be, but are not limited thereto.
  • a self-quenching dye when used as a marker for determining whether or not a probe is reacted, when a fusion occurs with the probe by an active virus, a marker such as a self-quenching dye supported in the probe may be It is emitted and dequenching causes fluorescence. Therefore, by measuring the change in fluorescence intensity, it is possible to detect whether the virus is infected.
  • fluorescent dyes it may also include electrochemiluminescent materials such as tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) [Ru (bpy) 32+]), in which case the color change can be observed with the naked eye.
  • electrochemiluminescent materials such as tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) [Ru (bpy) 32+]), in which case the color change can be observed with the naked eye.
  • Viruses can also be detected by measuring electrical signals using nanogap sensors.
  • the electrical signal may be measured by measuring a change in current or by using a field-effect transistor (FET).
  • FET field-effect transistor
  • the nanogap sensor refers to a sensor including an electrode having a gap gap of about 100 nm or less.
  • a fluorescent dye as a marker for determining whether or not the probe is reacting
  • the fluorescent dye is released inside the probe to be located in the nanogap of the nanogap sensor. do.
  • Viruses can also be detected by measuring surface enhanced Raman spectroscopic signals.
  • a substrate that can be combined with a sample can be used.
  • the substrate may be nanoparticles, colloids, liquid phase, but is not limited thereto.
  • fluorescent dyes when used as markers to determine whether the probes are fused, when the probes are fused by an active virus, the fluorescent dyes inside the probes are released. After the released fluorescent dye is combined with the substrate, metal particles are introduced again into the fluorescent dye bonded with the substrate.
  • Raman spectroscopy can be amplified by introducing metal particles such as gold and silver. Thereafter, by measuring the Raman spectrum of the fluorescent dye with a Raman spectroscopy, it is possible to detect whether the virus is infected.
  • the virus may be detected by checking the aggregation of the probe, that is, the change in the degree of dispersion. For example, when the organic-inorganic particles are used as the probe, aggregation of the particles occurs as the stability of the organic-inorganic particles is lowered by the active virus.
  • the fusion peptide present in the active virus attracts a stabilizer or an amphiphilic polymer such as a surfactant present around the organic-inorganic particles, the organic-inorganic particles as the stability of the organic material is lowered Agglomeration between them occurs.
  • a stabilizer or an amphiphilic polymer such as a surfactant present around the organic-inorganic particles
  • the organic-inorganic particles as the stability of the organic material is lowered Agglomeration between them occurs.
  • Such aggregation can be easily observed with the naked eye, and thus it can be easily detected whether or not the virus is infected.
  • At least one or more steps can be performed under conditions of pH 6 or below.
  • it may be performed under acidic conditions of pH 4 to pH 6, pH 5 to pH 5.5.
  • performing in an acidic condition can provide conditions very similar to the environment in the host cell, there is an advantage that can increase the detection accuracy.
  • FIG. 3 A schematic diagram of the influenza detection method according to an embodiment of the present invention is shown in FIG. 3.
  • a sample obtained from an individual is placed in a well with purine and / or trypsin to activate the influenza virus present in the sample.
  • a probe according to an embodiment of the present invention.
  • influenza virus is present, the reaction of the active influenza virus and the probe occurs by the fusion peptide, and the presence or absence of influenza virus can be determined by measuring a signal that changes depending on the reaction.
  • the reaction of the active influenza virus with the probe may be fusion or aggregation.
  • the reaction of the active influenza virus and the probe and the signal changing accordingly are as described above.
  • sample means that which has been taken to represent the parent for detection of the virus.
  • the sample can be a saliva, oral mucosa or manure sample.
  • the present invention also provides a biomolecule that specifically reacts with a surface protein of a virus; And a probe that reacts with a virus activated by the biomolecule. All of the contents described above with respect to the virus detection kit and the virus detection method may be applied or mutatis mutandis to the virus detection composition.
  • amphiphilic bilayer particles such as the surface of the host cell
  • mPEG-b-PLA copolymer is used to form an amphiphilic particle in the form of micelles or polymersomes containing a marker therein.
  • mPEG-b-PLA Poly lactic acid
  • DiO Ex: 484 nm
  • Dil Em: 565 nm
  • Amphiphilic particles carried with quenched dye were prepared.
  • Polymer mass was prepared by mass fraction of the molecular weight of mPEG polymer and polylactide (PLA polymer) was 0.3, and the micelle was prepared by mass ratio of 0.7.
  • the shape of the prepared amphiphilic particles was confirmed by a transmission electron microscope (TEM) image.
  • the spherical particles of the micelle form having a hydrophobic core and a hydrophilic shell, and the polymer-shaped spherical particles having a hydrophilic core and a hydrophilic shell surrounded by a hydrophobic membrane.
  • the size of the prepared amphiphilic particles was measured using a dynamic light scattering (DLS) method.
  • DLS dynamic light scattering
  • the size of the amphiphilic particle was found to be 36.79 ⁇ 1.52 nm for micelles, 122.12 ⁇ 2.50 nm for polymersomes.
  • the molecular weight of the polymersome was 6700 g / mol
  • the prepared micelles had a molecular weight of 4500 g / mol.
  • Gold chloride trihydrate (Sigma Aldrich), a gold ion, was added as a stabilizer to the hexadecyltrimethylammonium bromide (Sigma Aldrich) and the reducing agent sodium borohydride (Sigma Aldrich) as a stabilizer.
  • a solution was prepared, a stabilizer hexadecyltrimethylammonium bromide, Gold chloride trihydrate (Sigma Aldrich), silver nitrate (Sigma Aldrich), L-ascorbic acid (L-ascorbic acid) L-Ascorbic acid, Sigma Aldrich) and the seed solution were sequentially added to prepare organic-inorganic particles in the form of rods on which the surface of the gold particles was coated with stabilizer hexadecyltrimethylammonium bromide.
  • the organic-inorganic particles and the amphiphilic polymer were reacted to prepare an amphiphilic polymer.
  • THF tetrahydrofuran
  • phosphatidylcholine, cholesterol, and monophosphoryl lipid A are mixed at 5: 2: 0.02 parts by weight so that a total of 10 mg of organic material is dispersed in 1 mL of chloroform (Chloroform, CF), and then CF After evaporating, 40 ⁇ g of DiO (Ex: 484 nm) and Dil (Em: 565 nm) were added to the formed film with a self-quenching dye (available from Avanti), hydrated at 60 ° C. for 12 hours, and stirred for 12 hours. Liposome particles carrying a self-quenched dye were prepared by dialysis.
  • Triton X-100 which decomposes the bilayer structure with anionic surfactants to disintegrate the particles. Fluorescence intensity was measured with a hybrid multi-mode microplate reader (Synergy H4, BioTek, USA).
  • the low pathogenic influenza virus was supplied by Green Cross Veterinary Medicine and the high pathogenic virus was provided by Hanoi University of Agriculture.
  • the fluorescence change of the prop was not observed in the enzyme-free group and the non-acidic experimental group.
  • both acidic conditions were met, FluSome and purine co-treated, FluSome and trypsin co-treated, and FluSome, purine and trypsin co-treated under acidic conditions. It was confirmed that the fluorescence was detected by dequenching the self-quenched dye, which means that the highly pathogenic influenza virus can be specifically detected using acidic conditions, hematoglutinin degrading enzyme and FluSome.
  • Example 3 The various highly pathogenic influenza virus is detected using a verify FluSome
  • the high pathogenic influenza virus was detected in the same manner as in Experiment 2 by varying the type of high pathogenic influenza virus. All experiments were performed under the same acidic condition (pH 5.5), and a total of five H5N1 type viruses were used as the highly pathogenic influenza virus.
  • FluSome and highly pathogenic influenza virus according to Preparation Example 1 were used to measure the change in fluorescence intensity according to the concentration of the virus.
  • Experimental group was used to set the high pathogenic influenza virus treatment group, high pathogenic influenza and feces mixed treatment group, and as a control group fecal solution treatment group (fecal Sln), DPBS treatment group and fecal treatment group (10 groups according to the type of fecal experiment) ) Is set. All experimental and control groups under the same pH conditions (pH 5.5) were measured for fluorescence intensity changes after treatment with Purine.
  • Virus treatment group (dilution factor) 1/2 1 1/2 2 1/2 3 1/2 4 1/2 5 1/2 6 1/2 7 Fluorescence intensity 118354 123582 130596 150609 131845 154367 111607 Virus treatment group (dilution factor) 1/2 8 1/2 9 1/2 10 1/10 4 1/10 5 1/10 6 1/10 7 Fluorescence intensity 11563 12011 11673 11868 12109 11807 11597 Virus treatment group (dilution factor) 1/10 8 1/10 9 1/10 10 Fluorescence intensity 12038 10169 11439 Virus + Fecal Treatment Group (Dilution Ratio) 1/10 1 (50 ⁇ l virus + 50 ⁇ l fecal) 1/10 2 (50 virus virus + 50 ⁇ fecal) 1/10 3 (50 virus virus + 50 ⁇ fecal) 1/10 4 (50 ⁇ l virus + 50 ⁇ l fecal) 1/10 5 (50 virus virus + 50 ⁇ fecal) 1/10 6 (50 virus virus + 50 ⁇ fecal) 1/10 7 (50 ⁇
  • Purine with an organic-inorganic particle probe comprising an amphiphilic polymer prepared by the method of Preparation Example 3, and an enzyme that specifically degrades hemagglutinin of influenza virus to confirm the detection efficacy of the influenza virus of the organic-inorganic particles , Trypsin and TPCK (N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone) -trypsin was used to confirm the detection efficacy of low pathogenic influenza virus.
  • Trypsin and TPCK N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone
  • an untreated enzyme organic particle particle stock solution containing an amphiphilic polymer
  • a purine treated group, a trypsin treated group, and a TPCK-trypsin treated group were set as experimental groups. All experimental conditions were performed under pH 5.5, and after treatment with the low pathogenic virus in the control group and each experimental group, the change before and after the virus treatment was visually observed and the result is shown in FIG. 8.
  • control group did not show a clear change, but in the TPCK-trypsin-treated group, the stability of the organic-inorganic particles containing amphiphilic polymer by the virus is lowered due to aggregation and precipitation and lumps It was clearly visible that it was formed.
  • Organic-inorganic particle probe prepared according to the method of Preparation Example 2, and enzymes that specifically degrade hemagglutinin of influenza virus, purine, trypsin, and TPCK (N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)- Trypsin was used to detect high pathogenic influenza viruses (H5N1, H5N6) using rapid kits.
  • G1 and G2 confirm the detection of high pathogenic influenza
  • G3 confirms the detection of low pathogenic influenza virus.
  • Ketone was used as an enzyme adjuvant, and a probe (FluSome) prepared according to the method of Preparation Example 1 was used, except that the ketone was further included.
  • the group treated with the ketone with the enzyme adjuvant is shown as Try-TPCK.
  • the Raman signal was changed according to the presence of the 2-naphthalenthiol-gold conjugate in the trypsin and trypsin-TPCK treated groups in the low pathogenic and high pathogenic virus experimental groups as compared to the control group without the virus. I could confirm it. In case of purine, it was confirmed that the Raman signal was changed only in the presence of a highly pathogenic virus.
  • FluSome prepared by supporting fluorin dye (Sigma) in place of the self-quenching dye in Preparation Example 1 was reacted with a virus sample.
  • the luminol released was peroxidized in an alkaline aqueous solution, and the fluorescence change was measured using a hybrid multi-mode microplate reader (Synergy H4, BioTek, USA) (Ex: 303 nm, Em: 425 nm).
  • Luminol exhibits a violet-blue fluorescence by peroxidation reaction in alkaline aqueous solution, and thus the presence of virus can be detected by fluorescence change measurement.
  • liposomes as amphiphilic particles
  • purine can detect the presence of a high pathogenic influenza virus
  • trypsin can detect the presence of a low pathogenic / high pathogenic influenza virus.

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Abstract

본 발명은 바이러스 검출용 키트, 바이러스검출용 조성물 및 바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 저가의 비용으로 바이러스 바이러스를 단시간 내에 고효율로 검출할 수 있다.

Description

바이러스 검출용 키트
본 발명은 바이러스 검출용 키트, 바이러스 검출방법 및 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
바이러스는 세균보다 크기가 작은 전염성 병원체이다. 유전물질인 RNA 또는 DNA와 그 유전물질을 둘러싸고 있는 단백질로 구성된다. 바이러스는 숙주의 종류에 따라서 식물 바이러스, 동물 바이러스 및 세균 바이러스(파지)로 구분할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우 핵산의 종류에 따라 DNA바이러스 아문과 RNA바이러스 아문으로 나뉘며, 이들은 다시 강, 목, 과로 세분화된다.
이러한 바이러스 중에서, 조류 인플루엔자는 닭, 오리, 또는 야생 조류에서 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus)의 감염으로 인해 발생하는 급성 바이러스성 전염병이며 드물게 사람에서도 감염증을 일으킨다. 조류 인플루엔자 바이러스는 병원성에 따라 고병원성, 저병원성 및 비병원성의 3 종류로 구분되며, 2003년 말부터 2008년 2월까지 사람에게 전염될 수도 있는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(highly pathogenic avian influenza A, H5N1)의 인체 감염 사례가 640건 이상 보고되었다. 조류 인플루엔자는 조류의 높은 폐사율과 산란율 저하로 막대한 경제적 피해를 야기하며, 인체 감염 가능성이 높은 것은 아니지만, 인체에 감염되는 경우 높은 사망률을 나타낸다. 근본적인 백신 개발이 어렵고, 확산 속도가 매우 빠르므로 조기 진단을 통해 질병의 확산 및 경제적 손실을 최소화하는 것이 필요하다.
이와 같은 바이러스의 진단 방법으로는 효소 결합 면역 흡수 검정법(ELISA), 효소 면역 검정법(EIA) 및 면역 형광 검정법(IFA) 등의 면역학적 검출방법과 RT-PCR에 의한 RNA 검출방법 등이 알려져 있으나, 이러한 방법은 바이러스 진단에 과도한 시간이 소요되거나, 고가의 검사 비용이 필요하거나, 비특이적 반응으로 인한 특이도 및 민감도가 저하되는 등의 문제가 있다.
따라서, 저비용으로 단시간 내에 효율적으로 바이러스를 검출하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 단시간 내에 효율적으로 바이러스의 검출이 가능한 바이러스 검출용 키트, 바이러스의 검출방법 및 바이러스 검출용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하는 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 저가의 비용으로 바이러스를 단 시간 내에 고효율로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 인플루엔자 바이러스 검출방법의 모식도를 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자(FluSome)의 형상을 관찰한 TEM 이미지를 보여주는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자의 평균 입경을 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자의 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 효과를 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자를 이용하여 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자를 이용하여 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따른 유무기 입자를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따른 유무기 입자를 이용한 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10은 표면 증강 라만 산란 신호 측정을 통하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11은 육안으로 색의 변화를 관찰함에 의하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 예에 따른 리포좀을 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스를 포함하여 모든 바이러스는 숙주 세포 침입을 위하여 숙주 세포에 결합하는 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA), 성숙한 비리온(virion)들이 숙주 세포로부터 빠져나오는 데에 관여하는 뉴라미니다아제(neuraminidase), 수소 이온 농도의 균형을 조절하는 M2 이온 채널, 바이러스의 유전 정보를 간직하고 있는 RNP(Ribonucleoprotein) 등으로 이루어져 있다.
본 발명자들은 위에서 기술한 바이러스의 공통된 특성에 기초하여, 바이러스를 조기에 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 연구하였다. 그 결과, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자를 통하여 바이러스를 활성화하고, 이렇게 활성화된 바이러스와 반응하여 상기 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 프로브를 이용하여, 간단한 방법으로 바이러스를 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용한 용어 "바이러스"는 편성 세포 내 기생체(obligatory intracellular parasite)로서 핵산으로 DNA 또는 RNA을 갖고, 증식은 핵산으로 시작되고 2분열법으로 증식되지 않으며 ATP 생산에 필요한 효소계를 갖고 있지 않은 것을 의미한다. 본 발명의 바이러스는 노출 바이러스(naked virus)와 외막 바이러스(enveloped virus)를 포함하고, 구체적으로 본 발명의 일 예에 따른 바이러스는 외막 바이러스(enveloped virus) 일 수 있다.
상기 외막 바이러스는 구체적으로 헤르페스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus) 및 헤파드나바이러스(hepadnavirus)를 포함하는 DNA 바이러스와 플라비바이러스(flavivirus), 토가바이러스(togavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 헤파티티스 D(hepatitis D), 오소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 분야바이러스(bunyavirus), 필로바이러스(filovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus)를 포함하는 RNA 바이러스에 속하는 것이면 모두 포함한다.
상기 오소믹소바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 이사바이러스(isavirus), 소고토바이러스(thogotovirus) 및 퀴아란자바이러스(quaranjavirus) 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.
상기 코로나바이러스는 알파코로나바이러스(alphacoronavirus), 베타코로나바이러스(betacoronavirus), 감마코로나바이러스(gammacoronavirus) 및 델타코로나바이러스(deltacoronavirus) 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.
상기 파라믹소바이러스는 파라믹소바이러스, 루불라바이러스, 모빌리바이러스 및 뉴모바이러스 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.
상기 바이러스는 핵산과 이를 둘러싸고 있는 단백질을 포함한다. 이와 같은 바이러스의 단백질은 바이러스 유전체를 보호하고, 바이러스 입자가 세포에 흡착 및/또는 융합하는데 관여하며, 바이러스의 항원성을 결정하고, 바이러스의 형태를 유지하는 구조 단백질(structural protein)과 단백질과 핵산 등을 합성하는데 관련되는 단백질인 비구조 단백질(non-structural protein)을 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어 "바이러스의 표면 단백질"은 상기 구조 단백질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 "표면 단백질"은 바이러스의 특이 항원성을 가지고, 바이러스가 세포에 흡착 및/또는 융합하는데 관여하는 외막(envelop)에 존재하는 외재성 단백질은 모두 포함한다. 일 예로, 본 발명의 바이러스는 당단백질(glycoprotein)일 수 있고, 세포에의 융합(fusion)에 관여하는 융합 단백질(fusion protein)일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 바이러스의 표면 단백질은 헤마글루티닌(HA), 스파이크 단백질(spike protein) 또는 F 단백질(F protein) 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 숙주세포의 세포막에 흡착하여 막융합을 일으키는 표면 단백질을 포함하는 것 일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바이러스는 비활성형 상태로 존재하는 표면 단백질이 생체 분자에 의하여 활성형으로 변하면, 숙주세포의 세포막과 흡착 및/또는 막융합을 일으키는 성질을 갖는 표면 단백질을 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, "바이러스"는 인플루엔자 바이러스 또는 고병원성 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 "바이러스의 표면 단백질"로 당단백질인 헤마글루티닌(HA)을 포함한다. 헤마글루티닌은 하나의 폴리펩티드(전구체 HA0)로 발현된 후, 단백질 가수분해에 의하여 HAO의 절단 부위(cleavage site)가 HA1 및 HA2로 나누어지면, 산성 조건 하에서 소수성 아미노산 잔기들로 구성된 융합 펩타이드(fusion peptide)가 활성화된다. HA는 인플루엔자 바이러스의 병원성 정도에 따라 절단 부위의 아미노산과 융합 펩타이드의 아미노산 구성이 다르다.
본 발명의 다른 일 예에 따르면, "바이러스"는 코로나 바이러스 일 수 있다. 코로나 바이러스는 표면 단백질로 스파이크 단백질(spike protein)을 포함하고, 상기 스파이크 단백질은 S1과 S2 부위를 포함한다. 스파이크 단백질의 S1 부위가 숙주세포에 결합하면, 단백질 분해 효소(protease)에 의하여 S1과 S2로 절단되고, S2의 끝 부분에 있는 소수성 부위가 노출되어 활성화 된다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, "바이러스"는 파라믹소 바이러스 일 수 있다. 파라믹소 바이러스는 표면 단백질로 HN 단백질(HN protein)을 포함한다. HN 단백질은 바이러스를 숙주세포에 부착 또는 흡착시키는 부착(또는 흡착) 단백질로, 바이러스 비활성 상태에서는 전구체(precursor) HN0로 존재하나, 가수분해에 의하여 C-말단에서 아미노산 잔기가 제거되면 활성화 된다. 또한, 파라믹소 바이러스는 표면 단백질로 F 단백질(F protein)을 포함한다. F 단백질은 바이러스 비활성 상태에서 전구체 F0로 존재하나 생체분자에 의하여 F1과 F2로 절단된 후, 새로운 N-말단 형태의 F1으로 활성화 된다. 상기 F 단백질은 절단부위에 다염기성 잔기를 갖는 것과 단일염기성 잔기를 갖는 것으로 모두 포함한다. 바람직하게는 다염기성 잔기를 갖는 F 단백질 일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "반응"은 어떤 물질이 다른 물질과 접촉하여 상태, 색, 형상 또는 화학 결합 등의 물리 및/또는 화학적 상태의 변화가 일어나는 것 또는 그 현상을 의미한다.
일 구체 예에서 바이러스의 표면 단백질이 생체 분자와 반응하는 경우 바이러스의 표면 단백질이 변화되어 융합 펩타이드 등을 형성하는 등의 활성화된 바이러스로 상태 변화가 일어난다. 다른 구체 예에서 활성화된 바이러스와 프로브의 반응은 융합반응 또는 응집반응 일 수 있다.
상기 융합반응은 한 구체예에 따라, 활성형 바이러스와 본 발명의 프로브의 일부가 결합되는 현상 일 수 있다. 융합반응은 융합에 의하여 프로브 내부의 물질 등이 밖으로 배출되는 현상까지 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 엔도좀의 세포막을 융합하는 원리를 이용하여, 활성형 바이러스와 프로브의 융합 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.
상기 응집반응은 용액 안에서 분자 또는 입자 등이 서로 달라붙어 뭉치는 현상을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 응집반응은 검출대상인 바이러스에 의하여 본 발명의 프로브의 안정성이 낮아져 프로브끼리 서로 뭉쳐서 응집 및/또는 침전되는 현상을 의미한다.
본 발명에서 사용한 용어, "생체 분자(biomolecule)"는 생물의 구조, 기능, 정보전달 등에 필요한 분자를 의미한다. 상기 생체 분자는 기능, 정보전달 등을 수행하기 위한 특이적 구조 및/또는 부위를 포함할 수 있다. 이러한 생체 분자의 특이적 구조는 분자간 결합 반응을 통하여 반응을 일으키는 원동력이다. 생체 분자는 아미노산과 단백질, 당과 탄수화물, 지방산과 지질, 및 뉴클레오티드와 핵산 등을 포함하고, 생체 내에서 만들어진 것 및/또는 인위적으로 합성된 것을 모두 포함한다. 본 발명의 일 예에 따르면, "생체 분자"는 약 62개 내지 2500개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질인 효소일 수 있다.
하나의 구체 예에서, 상기 효소는 단백질 분해 효소일 수 있다. 일 예로 최초 합성된 형태로는 비활성화되어 있으나, 특정 부위가 제거(또는 절단)되면 활성을 나타내는 단백질에서 단백질 분해 효소는 상기 특정 부위를 절단(cleave)하여 비활성화 단백질을 활성화시킨다. 단백질 분해 효소는 특정 부위를 절단할 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용할 수 있다.
일 구체예에서 단백질 분해 효소는 퓨린(furin), 트립신(trypsin), 세린(serine), 엔도프로테아제(endoprotease) 및 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 단백질 분해 효소는 유도체 또는 개질 된 형태를 모두 포함한다. 예를 들어, 단백질 분해 효소는 재조합 인간 퓨린, 재조합 마우스 퓨린, 트립신-EDTA, 아세틸화된 트립신, TPCK-트립신(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone-trypsin), 아크릴릭 트립신(Trypsin-acrylic), 퓨린형 프로테아제(Furin like protease), 켁스2 프로테아제(Kex2 proteases), 막통과 세린 프로테아제 (Transmembrane protease serine), TMPRSS2, TMPRSS4, 트립타아제 클라라(Tryptase clara), 플라즈민(plasmin), 세린계 프로테아제(serine protease), 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin like endoprotease), 카복시펩티다아제(carboxypeptidase) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 구체예에서 트립신이 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)과 반응하는 경우, 트립신의 효소 분해 작용은 His57-Asp102-Ser195 위치에서 일어나며, 퓨린의 효소 분해 작용은 His194-Asp153-Ser368 위치에서 일어난다. 트립신은 고병원성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 모두 분해할 수 있기 때문에, 트립신을 이용하여 고/저병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다. 또한, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌만을 분해할 수 있기 때문에, 퓨린을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다.
다른, 일 구체예에서 단백질 분해효소와 코로나 바이러스의 표면 단백질이 반응하는 경우, 가수분해 효소의 작용은 S1 과 S2의 부위의 경계에서 일어난다. 따라서, 상기 가수분해 효소의 작용에 의하여 절단 후 S2의 소수성 부위가 노출됨에 따라 코로나 바이러스가 활성화 되어, 본 발명의 프로브를 이용하여 검출할 수 있다.
또 다른 일 구체예에서, 파라믹소 바이러스의 표면 단백질과 반응하는 생체분자는 C-말단(Carboxyl side)의 아르기닌 잔기에서 절단이 가능한 단백질 분해효소 또는 카르복시펩티다아제(carboxylpeptidase) 일 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 R-X-K/R-R 배열 포함하는 F 단백질을 인식하여 절단할 수 있다. 구체적인 예로, 퓨린 또는 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin-like endoprotease) 일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "활성형 바이러스" 또는 "활성화된 바이러스"는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자에 의하여 바이러스의 표면 단백질이 활성화된 바이러스를 의미한다. 여기서 바이러스의 표면 단백질이 활성화되었다는 것은 바이러스의 표면 단백질이 숙주세포 및/또는 프로브와 반응, 예를 들어 특이적으로 반응할 수 있는 상태로 변화되었다는 것을 의미한다. 여기서 "바이러스의 활성화"는 비활성형 바이러스가 상기 활성형 바이러스로 변환되는 과정을 의미한다. 바이러스가 감염을 일으키기 위해서는 바이러스의 활성화 과정이 필수적으로 요구되므로, 상기 활성형 바이러스의 존재 여부를 검출함으로써, 바이러스에 의한 감염 여부를 판별할 수 있다.
하나의 구체 예에서, 바이러스 표면 단백질이 활성화된 것이란 바이러스의 표면단백질에 존재하는 융합단백질 또는 융합펩타이드가 숙주세포의 막 또는 본 발명의 프로브의 표면과 융합 반응을 일으킬 수 있는 상태임을 의미한다.
하나의 구체 예에서, 인플루엔자 바이러스의 경우, 활성화된 바이러스란 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)이 효소에 의해 분해되어, 비활성 형태에서 헤마글루티닌의 내부에 존재하는 융합 펩타이드가 노출된 형태로 변환된 것을 의미한다. 즉, 상기 HA의 절단 부위를 특이적으로 분해하는 효소에는 퓨린 및/또는 트립신이 포함된다. 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌만을 분해할 수 있기 때문에, 인플루엔자 바이러스의 HA가 퓨린에 의하여 분해되는 경우 상기 인플루엔자 바이러스는 고병원성을 나타낸다. 또한, 트립신은 고병원성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 모두 분해할 수 있기 때문에, 트립신에 의하여 분해되는 경우에는 고병원성 또는 저병원성을 나타내게 된다. 저병원성 인플루엔자 바이러스의 절단 부위는 C-말단이 -R-로 이루어지며, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 절단 부위는 R/K-R-K-K-R로 이루어진다.
HA의 절단 부위를 특이적으로 분해하는 효소에 의하여 HA가 활성화되면, HA의 재배열이 일어나 HA 내의 융합 펩타이드가 바깥쪽으로 노출되어 활성형 바이러스가 된다. 이와 같이, 산성 조건 하에서 활성화된 인플루엔자 바이러스가 본 발명의 일 예에 따른 프로브와 만나면, 인플루엔자 바이러스의 융합 펩타이드에 의하여 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응이 일어나게 된다. 프로브의 반응에 따라 변하는 신호를 측정함으로써 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.
다른 구체 예에서, 코로나 바이러스의 경우 활성화된 바이러스란 표면 단백질인 스파이크 단백질(S protein)이 생체분자에 의해 비활성 형태에서 스파이크 단백질의 내부에 존재하던 소수성 부위가 노출된 형태로 변환된 것을 의미한다. 구체적으로, 스파이크 단백질의 S1 부분이 숙주세포와 결합하면, 단백질 분해효소(protease)에 의하여 S1과 S2로 절단되고, S2의 끝 부분에 있는 소수성 부위가 노출되어 바이러스가 활성화 된다. 상기 S2에서 노출된 소수성 부위가 숙주세포의 세포막 내 소수성 영역에 부착되고, 다른 한쪽은 바이러스 외막과 결합된 상태에서 S2 부위의 가운데가 접히는 구조변형(conformation change)이 일어나면서 막 융합이 일어 나게 된다. 따라서, 본 발명의 프로브와 활성화된 코로나 바이러스가 만나면 반응하면, 프로브의 안정성에 변화가 일어나 다양한 신호를 발생되고, 상기 변화를 측정함으로써 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 파라믹소바이러스에서 활성화된 바이러스란 HN 단백질이 생체분자에 의하여 C-말단의 잔기가 제거된 상태를 의미한다. 구체적으로, HN 단백질은 불활성화 상태(HN0)를 유지하고 있다가 C-말단의 약 90개의 잔기가 제거되면, HN 단백질이 활성화 되어 숙주세포 또는 표적의 막에 파라믹소바이러스가 부착하게 된다. 또한, 활성형 파라믹소바이러스는 F 단백질이 생체분자에 의하여 F1과 F2로 절단된 상태를 의미한다. 비활성형 파라믹소바이러스에서 F 단백질은 전구체 F0 상태에서, 생체분자와 만나면 F1과 F2로 절단되고, 숙주세포의 세포막과 융합할 수 있는 활성형 바이러스가 된다. 즉, SS-결합쇄 F1과 F2를 함유하는 활성 표면 단백질을 형성하고, 광범위한 소수성을 나타내는 F1의 N-말단 잔기를 숙주세포의 세포막 또는 타겟의 세포막에 고정하면서 막 융합이 시작된다. 따라서, 파라믹소바이러스는 본 발명의 생체분자가 표면 단백질과 반응하여 활성화 되고, 다시 활성화된 바이러스가 본 발명의 프로브와 반응하여, 프로브의 변화를 일으키게 된다. 따라서 상기 변화를 측정함으로써 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명에서, "프로브"는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하여, 상기 바이러스 또는 활성형 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브는 바이러스 이외의 물질 또는 비활성형 바이러스와 비교하여 활성형 바이러스와의 반응 능력이 월등히 우수하거나, 활성형 바이러스와 특이적으로 반응하여, 활성형 바이러스의 존재 여부를 유의하게 검출할 수 있는 물질이면 모두 포함되고, 그 종류 및 형태는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 상기 프로브는 "검출인자"와 혼용하여 사용된다.
본 발명의 프로브는 검출 대상 바이러스 또는 바이러스의 표면 단백질의 종류에 따라 다양한 구조 또는 형태를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 프로브는 막(membrane) 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "막(membrane) 구조"란 막 또는 쉘(shell)에 의하여 내부가 둘러싸여 있는 구조를 의미한다. 베지클(vesicel), 인공세포(artificial cell) 또는 마이크로캡슐 같은 캡슐 형태의 입자(encapsulation particle)는 그 종류를 제한하지 않고 모두 포함한다. 본 명세서에서 상기 막 구조는 쉘(shell) 구조와 혼용하여 사용한다. 상기 막 구조는 상기 내부에는 유체 또는 별도의 구성을 포함하는 구조까지 포함한다.
상기 막(membrane)은 단일층(mono layer) 또는 이중층(bilayer) 구조를 포함한다. 상기 단일층(mono layer)은 "소수성 영역-친수성 영역"을 포함하는 막 구조로, 일 구체예로 수용성 용액 내에서 소수성 코어와 친수성 쉘을 포함하는 구조일 수 있다. 상기 이중층(bilayer)은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 포함하는 막 구조이다. 일 구체예로, 상기 이중층(bilayer)은 상기 단일층(mono layer) 2 개가 결합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 이중층(bilayer)은 친수성 코어와 상기 친수성 코어를 둘러싸고 있는 소수성 영역 및 상기 소수성 영역을 둘러싸고 있는 친수성 쉘을 포함하는 구조일 수 있다.
상기 막(membrane) 구조는 단일막(single membrane)및 단일막을 2 이상 있는 다중막(multi membrane)을 모두 포함한다. 일 예로, 단일막을 갖는 입자가 다시 하나의 단일막으로 둘러싸인 경우, 다중막을 갖는 입자가 될 수 있다. 상기 단일막 및 다중막은 단일층 및 이중층과 구별되는 개념이다. 구체적으로, 이중층(bilayer) 구조의 막을 하나만 포함하는 입자는 단일막을 갖는 것이며, 단일층(monolayer) 구조의 막을 포함하는 입자를 다시 단일층 구조의 막이 둘러싸고 있는 입자는 다중막 구조의 입자를 의미한다.
상기 막 구조를 갖는 프로브는 본 발명이 속하는 통상의 방법에 의하여 제조될 수 있고, 일 구체예에 따라 미세용액화 장비를 이용한 미세유동화 방법(microfludization), 초고압 균질법(High-pressure homogenization), 에멀전법(Emulsion method) 또는 초음파 등을 이용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 막구조를 갖는 입자는 그 종류에 제한되지 모두 본 발명의 프로브에 포함될 수 있다. 일 구체예로 베지클(vesicle), 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
상기 "마이셀(micelle) "은 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 입자를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 마이셀은 계면활성제의 마이셀 또는 고분자 자기조립 마이셀 일 수 있다. 자기조립에 의한 마이셀의 경우 공중합체를 형성하는 고분자의 종류에 따라 다양한 형태를 띌 수 있고, 그 형태에 제한을 받는 것은 아니다. 상기 마이셀은 단일층(monolayer)을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다. 상기 마이셀은 그 형태의 제한은 없으나, 일 예에 따라 구형, 타원형(ellipsoid) 또는 실리더형(cylinder)을 포함한다. 상기 마이셀 구조의 프로브는 소수성 코어 영역에 표지자 및 무기 입자와 같은 구성을 더 포함할 수 있다.
상기 "폴리머좀(polymersome)"은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 갖는 2중층 막 구조를 갖고, 상기 소수성 및 친수성 영역에 고분자 또는 공중합체를 포함하는 입자를 의미한다. 상기 고분자 또는 공중합체는 인위적으로 합성된 것과 지질(lipid)을 함께 포함하거나, 인위적으로 합성된 것 포함하는 것 일 수 있다. 상기 인위적으로 합성된 것은 자연적으로 발생하는 지질(lipid)을 제외한 모든 고분자 및 공중합체를 포함하는 의미이다. 상기 폴리머좀은 이중층 막구조의 단일막 및 단일막을 2이상 포함하는 다중막을 모두 포함한다.
상기 폴리머좀은 리포좀과 구분하여 인위적으로 합성된 고분자 또는 공중합체를 포함할 수 있다. 상기 폴리머좀은 이중층 형태의 막으로만 이루어진 단일막 및 상기 2중층의 단일막을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다.
상기 "리포좀(liposome)"은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 입자를 의미한다. 양친매성의 생체막을 모방한 지질막을 갖는 것이라면, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다. 리포좀을 형성하는 방법은 당업계에 잘 알려져있고, 통상적으로 인지질을 염류 수용액 중에 현탁하거나, 인지질을 포함하는 수용액을 초음파 처리 등을 하여 수득할 수 있으나, 제조방법에 의하여 본 발명이 제한되지 않는다.
상기 "콜로이드좀"은 1nm 내지 1000nm 크기의 콜로이드상 입자 또는 상기 입차가 치밀하게 패킹된 구조물을 의미한다. 막을 형성하는 친수성 및 소수성 영역의 고분자의 종류에 따라서 단일층 및 이중층을 포함할 수 있다. 또한 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.
상기 "액적(droplet)"은 상기 막 구조 입자 중에서 물방울 모양의 형태를 나타내는 것을 의미한다. 단일층 및 이중층을 포함하고, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.
본 발명의 프로브는 형태(shape)에 따라서 구분할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프로브의 형태(shape)는 로드(rod), 구, 링(ring), 판(flat), 실린더, 타원형, 막으로 둘러싸인 형태 및 이들의 조합을 포함한다.
상기 로드(rod)형태는 막대, 봉 또는 장대와 같은 일직선 모양의 형태를 총칭하는 의미이다. 상기 구 형태는 둥근 모양의 형태를 의미하는 것으로, 완전 구형과 불완전 구형을 모두 포함한다. 상기 링(ring) 형태는 일반적으로 구 또는 원형의 모양에서 가운데가 비어있는 형태를 의미한다. 상기 판(flat) 형태는 얇고 평평한 모양의 평판, 판상의 형태를 의미한다. 일 구체예에 따라, 판 형태의 프로브는 기재 또는 담체의 상부 또는 외부에 판 형의 프로브가 코팅 된 형태 일 수 있다.
본 발명의 프로브는 상기 프로브를 구성하는 성분 또는 활성형 바이러스와 반응하는 방법에 따라서 구분할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 프로브는 표지자를 포함하는 양친성 입자; 유무기 입자; 항체; 압타머; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것; 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, "표지자를 포함하는 양친성 입자"는 상기 프로브와 활성형 바이러스의 반응여부를 판별할 수 있는 표지자를 내부에 포함하는 양친성 프로브일 수 있다. 양친성 이란 양친매성이라고도 하며, 친수성과 소수성의 성질을 모두 가진 것을 의미한다. 상기 양친성 프로브의 형태는 양친성을 나타내기만 하면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 "표지자"는 프로브와 활성형 바이러스의 반응여부를 판별할 수 있는 물질을 의미한다. 표지자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 프로브의 반응 전 후의 변화에 따라 특성이 변화하고, 시험 등을 통하여 상기 변화된 특성을 확인할 수 있는 표지자이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 프로브의 융합 여부를 판별할 수 있는 표지자는 자기-소광된 염료(self-quenched dye), 형광 염료(dye), 전기화학발광 물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
본 발명에서, 자기-소광된 염료는 염료(sel-quenched dye)가 서로 인접한 위치에 있는 경우에는 소광 작용이 일어나고, 뭉쳐있는 염료가 방출되어 퍼지게 되면 탈소광 작용에 의하여 형광이 나타나는 물질을 의미한다.
한 구체예에서, 자기-소광된 염료는 3,3-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼클로레이트(3,3 -Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate; Dio; Dioc), 3,3-디옥타데실-5,5-디(4-설포페닐)옥사카보시아닌 소듐염(3,3 -dioctadecyl-5,5 -di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine sodium salt), 4-(4-(디헥사데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-(4-(dihexadecylamino)styryl)-N-methylpyridinium iodide; DiA; 4-Di-16-ASP), 4-(4-(디데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-(4-(Didecylamino)Styryl)-N-Methylpyridinium Iodide; 4-Di-10-ASP), 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌 퍼클로레이트(1,1 -dioctadecyl-3,3,3,3 -tetramethylindocarbocyanine perchlorate; Dil), 1,1-디옥타데실-6,6-디(4-설포페닐)-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌 (1,1 -Dioctadecyl-6,6 -Di(4-Sulfophenyl)-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine), 4,4-디이소티오시아나토스틸벤-2,2-디설폰산 디소듐염(4,4 -diisothiocyanatostilbene-2,2 -disulfonicacid disodium salt; DIDS), 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도트리카보시아닌 이오다이드(1,1 -dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyanine iodide; DiR), 1,1-디올레일-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌(1,1 -dioleyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine), 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로다민 (Trtramethylrhodamine), 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine) 및 알로피코시아닌 (allopicocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 형광 염료의 평균 입경은 200nm 이하, 또는 50nm 내지 10000nm일 수 있다.
한 구체예에서, 전기화학발광 물질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄 (II) [Ru(bpy)32+]을 포함한다.
본 발명에서 형광 염료(dye)는 형광을 나타내는 물질로, 광에 포함된 파장을 흡수하여 색광을 바꾸어 재방사하는 성질을 갖는 물질을 의미한다. 형광 염료는 발광염료 라고도 하며, 당업계에 잘 알려져 있는 형광 염료를 제한없이 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 형광 염료는 텍사스 레드(Texas red),플루오레세인(fluorescein), 4-클로로-7-니트로벤조퓨라잔(4-chloro-7-nitrobenzofurazan; NBD-Cl), 루미놀(luminol), 플러렌(fullerene) 및 방향족기를 포함하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
한 구체예에서, 인광 염료는 조명광 안에서 흡수한 파장을 바꾸어 재방사함으로써 광휘성 효과를 나타내는 물질을 의미한다. 일 예로, 황화광물(XmZn X는 금속원소, Z는 비금속원소) 또는 알칼리토금속의 황화물 일 수 있으나, 그 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 양친성 입자는 친수성을 나타내는 영역과 소수성을 나타내는 영역을 갖는 입자를 의미한다. 양친성 입자는 친수성 영역 및 소수성 영역이 있는 입자이기만 하면 제한 없이 이용 가능하다. 양친성 입자는 친수성 고분자, 소수성 고분자, 지질 고분자 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 고분자는 공중합체 형태로 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 친수성 폴리아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 및 그 유도체를 포함한다. 예를 들어, 친수성 고분자는 (모노)메톡시폴리에틸렌글리콜, (모노)아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌 및 폴리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 친수성 고분자는 그 유도체를 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리에킬렌글리콜의 유도체는 메톡시 폴리에틸렌글리콜(mPEG)일 수 있다.
한 구체예에서, 소수성 고분자는 친수성 고분자와 함께 양친성 입자를 형성할 수 있는 물질이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 소수성 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 일 수 있다. 상기 폴리아미노산은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함한다. 또한 상기 소수성 고분자는 그 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "지질" 또는 "지질 고분자"는 이중층의 막 구조를 형성할 수 있는 것이라면 인지질, 지질단백질, 당지질, 양이온성 지질 등을 모두 포함하며, 그 종류에 제한되지 않는다. 또한, 상기 지질은 자연적으로 유도되어 얻어진 것 및 합성된 지질 유도체를 모두 포함한다. 상기 인지질(phospholipids)은 글리세로인지질(glycerophos pholipids) 및 스핑고인지질(spingophospholipid, Phosphosphingolipid)을 포함한다. 상기 글리세로인지질은 다이아크릴글리세라이드 구조를 갖는 것일 수 있고, 구체적으로 포스파티산(phosphatidate, Phosphatidic acid, PA), 레시틴(lecithin, Phosphatidylcholine, PC), 세팔린(cephalin) 및 포스포이노시티드류(Phosphoinositides)를 포함한다. 상기 세팔린 인지질은 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS) 및 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE)을 포함한다. 또한, 상기 포스포이노시티드류 인지질은 포스파티딜이노시톨(Phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(Phosphatidylinositol phosphate, PIP), 포스파티딜이노시톨 이인산(Phosphatidylinositol bisphosphate, PIP2) 및 포스파티딜이노시톨 삼인산(Phosphatidylinositol triphosphate, PIP3)을 포함한다. 상기 스핑고인지질은 세라마이드 포스포리콜린(Ceramide phosphorylcholine, Sphingomyelin, SPH), 세라마이드 포스포리레타노라민(Ceramide phosphorylethanolamine, Sphingomyelin, Cer-PE) 및 세라마이드 포스포리피드(Ceramide phosphoryllipid)를 포함한다.
상기 합성 인지질 유도체는 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 일 구체예로 1,2-다이도데카노이-sn-글리세로-3-포스포콜린(EPC, 1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에타놀라민(POPE, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자는 공지된 방법을 자유롭게 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 친수성 영역과 소수성 영역을 포함하는 양친성 블록 공중합체를 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해 시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 용매를 증발시키는 방법, 또는 얇은 필름 수화법(Thin film hydration) 등을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 양친성 입자에 사용되는 고분자의 종류, 제조방법에 의하여 다양한 구조 및 형태를 갖는 프로브가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 양친성 입자는 막 구조를 가진 입자일 수 있고, 구체적으로 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 구조 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 양친성 입자가 하기 식 1에 따라 계산된 질량 분율(mass fraction)이 0.25 내지 0.40을 만족할 때, 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량 분율이 0.40 초과 0.70 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.
[식 1]
질량 분율(mass fraction)=친수성 고분자의 질량/(친수성 고분자의 질량 + 소수성 고분자의 질량)
또한, 상기 질량 분율을 질량 %(percent)로 나타내는 경우, 질량%가 25% 내지 40%을 만족할 때, 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량%가 40% 초과 70% 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.
한 구체예에서, 양친성 입자의 크기는 제한되지 않는다. 양친성 입자는 나노 또는 마이크로 입자일 수 있으며, 예를 들어 양친성 입자의 평균 입경은 50 내지 10000 nm일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "유무기 입자"일 수 있다.
상기 유무기 입자 프로브의 경우, 활성형 바이러스 또는 활성화된 표면 단백질과 프로브의 반응에 의하여 상기 프로브의 용액 내 안정성이 낮아져 응집이 일어나게 된다. 따라서 상기 반응의 유무에 따라서 본 발명의 유무기 입자 프로브를 이용하여 바이러스를 검출 할 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "유무기 입자"는 유기물질과 무기물질을 포함하는 입자를 의미한다. 구체적으로, 무기물질로 이루어진 코어의 표면(또는 쉘)에 유기물질이 코팅 또는 결합되어 있는 형태의 입자일 수 있다. 상기 유무기 입자의 형태는 제안되지 않고, 한 구체예에 따라 로드(rod)형, 구형, 실린더형, 판(flat)형, 타원형 또는 링 형 등의 형태 일 수 있다.
상기 무기물질은 금속으로 이루어진 것일 수 있고, 상기 금속은 일 예로 금, 은, 이들을 포함하는 혼합물 및 그 조합일 수 있다. 바람직하게는 금, 은 및 이들의 조합 일 수 있다.
상기 유기물질은 무기물질의 안정화제 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 안정화제는 입자의 응집을 방지하기 위한 물질을 의미하며, 분산제와 혼용하여 사용된다. 상기 안정화제는 바람직하게는 금속의 안정화제 일 수 있다. 상기 안정화제는 무기물질이 용매 내에서 잘 분산된 상태로 유지되도록 하는 것이면 그 종류에 상관없이 포함되고, 일 예로, 계면활성제(surfactant) 일 수 있다.
상기 계면활성제의 구체적인 예에 제한되지 않고, 양이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 모두 포함한다. 구체적으로 세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드(Cetyl trimethylammonium bromide, CTAB, Hexadecyltrimethylammonium bromide), 테트라데실 트라이메틸암모늄 브로마이드(Tetradecyl Trimethyl Ammonium Bromide, TTAB), 도데실트라이메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide, DTAB), Tween 20(polyoxyethylene(20) sorbitan monolaurate), Tween 40(polyoxyethylene(20) sorbitan monopalmitate), Tween 80(polyoxyethylene(20) sorbitan monooleate) 및 Triton X-100로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 유무기 입자는 양친성 고분자를 더 포함할 수 있다. 상기 양친성 고분자는 유무기 입자의 표면에 양친성 고분자가 결합된 상태이거나, 양친성 고분자 층 또는 양친성 고분자 쉘(shell) 구조로 코팅된 상태 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 양친성 고분자를 더 포함하는 유무기 입자는 양친성 고분자와 유무기 입자의 표면 사이에 작용기층을 더 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 작용기 층은 무기입자의 표면에 결합이 잘되는 작용기를 갖는 화합물을 결합시키고, 상기 화합물에 고분자층을 결합하는 구조일 수 있다.
상기 작용기를 갖는 화합물은 무기입자 표면에 -SH 결합이 가능한 것이면 모두 사용할 수 있고, 일 예로 시스테아민(cysteamine)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 무기입자가 금인 경우, 금 입자의 표면에 SH 결합이 가능한 화합물을 결합하여 작용기층을 형성하고, 상기 작용기 와 양친성 고분자를 결합하는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자는 작용기층과 양친성 고분자의 결합 사이에 아미노산 중합을 개시하기 위한 작용기를 더 포함할 수 있다. 상기 작용기는 NH2 일 수 있다.
상기 양친성 고분자는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 타입의 양친성 블록 공중합체 또는 B-A-B 타입의 삼중 블록 공중합체 형태일 수 있다. 또한 상기 양친성 고분자는 지질 일 수 있다.
한 구체예에서, 친수성 A 블록은 친수성 고분자로 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아클릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 친수성 폴리아미노산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌 및 폴리세린 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 친수성 A 블록은 200 내지 50,000 달톤 또는 1,000 내지 20,000 달톤의 수 평균 분자량을 갖는다.
한 구체예에서, 소수성 B 블록은 소수성 고분자 일 수 있다. 구체적으로 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 소수성 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 소수성 B 블록은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신 및 폴리메티오닌, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 카프로락톤의 공중합체, 및 폴리글리콜라이드와 카프로락톤의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 소수성 B 블록은 50 내지 50,000 달톤, 또는 200 내지 20,000 달톤의 수 평균 분자량을 갖는다.
상기 유무기 입자는 안정제로서 양친성 고분자의 존재 하에서, 이온 상태의 무기물과 상기 무기물을 환원시킬 수 있는 환원제를 함께 반응시켜 제조할 수 있다. 유무기 입자 제조 시, 사용되는 안정제로 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유무기 입자가 양친성 고분자 층을 더 포함하는 경우 유무기 입자의 안정제 역할을 할 수 있는 이중층 구조를 갖는 것이 바람직하다.
한 구체예에서, 유무기 입자의 크기는 제한되지 않으며, 나노 또는 마이크로 크기일 수 있다. 예를 들어 유무기 입자의 평균 입경은 50 내지 1000 nm일 수 있다.
본 발명의 유무기 입자는 에멀젼 법, 얇은 막 수화법(Thin film hydration) 또는 투석 방법(dialysis)을 이용하여 제조될 수 있고, 구체적인 제조 조건은 유기물질 및 무기물질 그리고 고분자의 종류에 따라서 통상으로 사용되는 범위 내에서 변경하여 수행될 수 있다.
본 발명의 유무기 입자는 바이러스와의 반응 여부를 더욱 명확하게 판단하기 위하여, 표지자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "압타머(aptamer)" 일 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어, "압타머(aptamer)"는 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 표적분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "항체(antibody)" 일 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어, "항체(antibody)"는 아미노산과 당사슬로 결합된 단백질로 표적분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 상기 표적분자는 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성을 나타내는 단백질 및 이들의 조합 일 수 있다. 상기 압타머 또는 항체는 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것이고, 바람직하게는 표적분자에 상보적으로 결합할 수 있는 구조를 가진 것 일 수 있다.
상기 압타머 또는 항체의 경우, 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질 및/또는 활성형 바이러스의 항원성 단백질과 압타머 또는 항체의 특이적 결합 반응의 유무에 따라서 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 표적분자는 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 막 융합 단백질 일 수 있다. 또한 일 구체예에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 경우 헤마글루티닌(HA)의 융합 펩타이드일 수 있다. 상기 HA의 융합 펩타이드의 검출을 위한 압타머 또는 항체는 상기 융합 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 상보적 구조 또는 서열을 포함한다. 또한, 코로나 바이러스인 경우 스파이크 단백질일 수 있고, 파라믹소 바이러스인 경우 F 단백질 일 수 있다.
상기 압타머 또는 항체는 표적 분자와의 결합 반응을 더 용이 또는 명확하게 확인하기 위하여, 금속입자 또는 표지자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 압타머 또는 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법을 이용하여 압타머 또는 항체를 제조, 선별할 수 있다. 또한, 압타머 또는 항체의 결합 여부를 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 압타머 또는 항체를 금 입자에 결합하여 사용하는 경우, 금 입자에 결합된 압타머 또는 항체가 바이러스의 융합 펩타이드에 결합하게 되면, 입자의 크기 변화에 따라 색의 변화가 나타나게 된다. 이러한 색의 변화를 관찰함으로써, 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 키트 또는 조성물은 상기 프로브를 단일 종류만 포함하거나, 2 종류 이상의 프로브를 함께 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 키트 또는 조성물은 pH 6 이하의 산성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, pH 6 이하의 산성 물질은 산성 용액일 수 있으며, 상기 pH 범위의 산성 용액을 키트에 포함할 수도 있고, 사용시 직접 제조하여 사용할 수도 있다. pH 6 이하의 산성 용액은 상기 pH 조건을 만족하는 용액이면 제한 없이 사용할 수 있다. 시판되는 스톡 용액을 이용할 수도 있고, 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 진한 산성 용액인 스톡 용액(stock solution)을 pH 6 이하가 되도록 물에 희석하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 산성 용액은 pH 4 내지 6 또는 pH 5 내지 pH 5.7일 수 있다. 상기 범위가, 숙주 세포 내의 pH 범위와 유사하므로, 검출 효율을 높일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 키트 및 조성물은 반응 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 반응 보조제는 생체 분자와 바이러스의 반응을 도와주는 생체 분자의 반응 보조제 일 수 있고, 또는 프로브와 표적분자의 반응을 도와주는 반응 보조제 일 수 있다. 구체적인 일 예로, 단백질 분해 효소와 표면 단백질의 반응을 도와주는 보조제, 또는 프로브와 활성형 바이러스 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성 단백질을 포함하는 표적분자와의 반응을 도와주는 보조제 일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, 보조제는 상기 등의 작용을 통해서 바이러스의 검출 민감도 및/또는 특이도를 높일 수 있는 것이라면 모두 포함하는 의미이다. 상기 바이러스의 검출 민감도 및/또는 특이도를 높이는 것의 예로 반응의 속도를 빠르게 하거나, 반응이 일어나는 최소값을 낮추는 작용 또는 표면 단백질과 생체 분자의 반응 외에 다른 반응을 억제하는 작용이 있으나, 상기 메커니즘에 제한되지 않는다. 보조제는 생체 분자 및 이와 반응하는 표면 단백질의 종류에 따라서 검출 민감도 및/또는 특이도를 높일 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 모두 포함한다.
구체적인 일 예로 상기 보조제는 케톤 일 수 있다.
상기 케톤 화합물은 예를 들어 페닐에틸 클로로메틸 케톤, 토실 페닐알라닐 플로로메틸 케톤(TPCK, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 검출 시 보조제로 케톤을 더 포함할 수 있다. 이 경우, 다른 효소의 활성을 낮추고, 헤마글루티닌(HA) 분해 효소, 특히 트립신의 활성을 높여주어 키트의 민감도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명은 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 검출방법은 시료 생체 분자를 접촉시키는 단계 및 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 구체적으로 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계; 및 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 검출방법은 상기 접촉에 의하여 일어나는 반응의 여부를 확인함으로써 바이러스를 검출 할 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 엔도좀의 세포막을 융합하는 원리를 이용하여, 활성형 바이러스와 프로브의 융합 반응 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다. 다른 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 프로브의 안정성을 낮추는 원리를 이용하여, 프로브의 응집 반응 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명에서 반응의 여부를 확인하는 방법으로, 반응에 의한 프로브의 신호 또는 변화를 측정할 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스와 프로브가 반응하는 경우 나타나는 변화 또는 신호는, 형광강도, 발광강도, 인광강도, 흡광강도, 전기적 신호, 표면증강 라만 분광(surface-enhanced Raman spectroscopy; SERS) 신호, FET(field-effect transistor), 색 및 프로브의 분산도로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 자기-소광된 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 자기-소광된 염료와 같은 표지자가 방출되게 되고, 탈소광이 일어나 형광이 나타나게 된다. 따라서, 형광 강도의 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.
또한, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 형광 염료가 방출되게 되고, 형광 강도를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 형광강도 외에, 발광강도, 인광강도, 흡광강도 역시 형광강도와 마찬가지로 파장에 따라 달라지기 때문에, 이들을 측정하여 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 특히, 형광 염료 중에서, 루미놀이나 플러렌 등은 특별한 기기에 의한 형광 강도의 측정 없이, 육안으로도 색의 변화를 감지할 수 있다.
형광 염료 이외에도, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄 (II) [Ru(bpy)32+])과 같은 전기화학발광 물질을 포함할 수 있으며, 이 경우 육안으로 색의 변화 관찰이 가능하다.
또한, 나노갭 센서를 이용하여 전기적 신호를 측정함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 전기적 신호는 전류 변화를 측정하거나, 또는 FET (Field-effect transistor)를 이용하여 측정할 수도 있다. 나노갭 센서란 갭의 간격이 약 100nm 이하인 전극이 포함된 센서를 의미한다. 예를 들어, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내부의 형광 염료가 방출되어 나노갭 센서의 나노갭에 위치하게 된다. 이 때, 나노갭 센서에 미리 위치시킨 금, 은, 크롬, 티타늄, 백금, 구리, 팔라디움, ITO(indium tin oxide), 또는 알루미늄 등의 금속 입자의 전류 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 금속 입자의 평균 입경은 수 나노미터일 수 있으며, 예를 들어, 2 내지 4nm일 수 있다.
또한, 표면증강 라만 분광 신호를 측정하여 바이러스를 검출할 수 있다. 표면증강 라만 분광 신호를 측정하기 위하여, 시료와 결합 가능한 기재를 이용할 수 있다. 기재는 나노입자, 콜로이드, 액상 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 프로브의 융합 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내부의 형광 염료가 방출된다. 방출된 형광 염료를 기재와 결합시킨 후, 상기 기재와 결합된 형광 염료에 다시 금속 입자를 도입한다. 금, 은 등의 금속 입자를 도입함으로써, 라만 분광을 증폭시킬 수 있다. 그 후, 라만 분광기로 상기 형광 염료의 라만 스펙트럼을 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.
다른 예로, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 응집이 일어남에 따라 프로브의 응집 여부, 즉 분산도의 변화를 확인함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 예를 들어, 프로브로 유무기 입자를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 유무기 입자 의 안정성이 낮아짐에 따라 상기 입자의 응집이 일어나게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 활성형 바이러스에 존재하는 융합 펩타이드가 유무기 입자 주변에 존재하는 계면활성제 등의 안정화제 또는 양친성 고분자를 끌어당겨, 유기물질의 안정성이 떨어지게 됨에 따라 유무기 입자끼리의 응집이 일어난다. 이러한 응집 여부는 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있어, 손쉽게 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.
한 구체예에서, 적어도 하나 이상의 단계는 pH 6 이하의 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, pH 4 내지 pH 6, pH 5 내지 pH 5.5의 산성 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 인플루엔자 바이러스를 검출하는 경우, 산성 조건에서 수행하는 것이, 숙주 세포 내 환경과 매우 유사한 조건을 제공할 수 있어, 검출 정확도를 높일 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 인플루엔자 검출 방법에 대한 모식도를 도 3에 나타내었다. 요약하면, pH 6 이하, pH 4 내지 pH 6, 또는 pH 5 내지 pH5.5 하에서, 퓨린 및/또는 트립신이 존재하는 웰에 개체로부터 수득한 시료를 넣어 상기 시료 내에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 활성화한 후, 본 발명의 일 예에 따른 프로브를 처리한다. 인플루엔자 바이러스가 존재하는 경우, 융합 펩타이드에 의하여 활성형 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응이 일어나게 되고, 반응 여부에 따라 변하는 신호를 측정함으로써 인플루엔자 바이러스의 존재 유무를 알 수 있다. 상기에서 기술한 바와 같이, 활성형 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응은, 융합 또는 응집일 수 있다. 상기 활성형 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응 및 이에 따라 변하는 신호에 대하여는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용한 용어, "시료"는 바이러스의 검출을 위해 모체를 대표하도록 채취된 것을 의미한다. 한 구체예에서, 시료는 타액, 구강 점막 또는 분뇨 시료일 수 있다.
본 발명은 또한, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자; 및 상기 생체분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다. 상기에서 바이러스 검출 키트 및 바이러스 검출 방법에 대하여 기술한 모든 내용이 바이러스 검출용 조성물에도 적용 또는 준용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
[ 제조예 1] 자기- 소광된 염료(Self-quenched dye)가 담지된 숙주 세포 모방형 양친성 입자(FluSome) 형태의 프로브 제조
숙주 세포 표면과 같은 양친성의 이중층 입자를 제조하기 위하여, mPEG-b-PLA 공중합체를 이용하여, 표지자를 내부에 포함하고 있는 마이셀(Micelle) 또는 폴리머좀(Polymersome) 형태의 양친성 입자 형태의 프로브를 제조하였다.
구체적으로, mPEG-b-PLA(Poly lactic acid)를 2 mL에 분산시킨 후, 자기-소광된 염료로 DiO(Ex: 484nm) 및 Dil(Em: 565nm)를 용해하고, 과량의 물로 투석하여 자기-소광된 염료가 담지된 양친성 입자를 제조하였다. mPEG 고분자와 폴리락타이드(PLA 고분자)의 분자량의 질량분율이 0.3이 되게 하여 폴리머좀을 제조하였고, 상기 질량분율이 0.7 되게 하여 마이셀을 각각 제조하였다.
제조된 양친성 입자의 형상을 TEM(transmission electron microscope) 이미지로 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 마이셀 형태의 구형 입자 및 소수성 멤브레인으로 둘러 싸여있는 친수성 코어 및 친수성 쉘을 갖는 폴리머좀 형태의 구형 입자가 제조되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 제조된 양친성 입자의 크기를 DLS(dynamic light scattering) 법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 양친성 입자의 크기가 마이셀의 경우 36.79 ± 1.52 nm, 폴리머좀의 경우 122.12 ± 2.50 nm로 확인되었다.
또한, 상기 폴리머좀의 분자량은 6700 g/mol였고, 제조한 마이셀은 분자량이 4500 g/mol 였다.
또한, 상기 공중합체의 종류만 mPEG-b-폴리류신(poly leucine) 블록 공중합체로 변경하여 상기와 동일한 방법으로 양친성 입자 형태의 프로브를 제조하였다.
[ 제조예 2] 유무기 입자 프로브의 제조
골드이온인 골드 클로라이드 트리하이드레이트(Gold chloride trihydrate, Sigma Aldrich)에 안정제로 계면활성제인 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromide, Sigma Aldrich)와 환원제 소듐 보로하이드라이드(Sodium borohydride, Sigma Aldrich)를 첨가하여 시드 용액(seed solution)을 만들고, 안정제 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromide), 골드 클로라이드 트리하이드레이트(Gold chloride trihydrate, Sigma Aldrich), 환원제인 실버 니트레이트(Silver nitrate, Sigma Aldrich), L-아스코르브산(L-Ascorbic acid, Sigma Aldrich)과 상기 시드 용액을 순차로 첨가하여, 골드입자의 표면이 안정화제 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드로 코팅된 로드 형태의 유무기 입자를 제조하였다.
제조된 유무기 입자를 관찰한 결과 골드 나노 로드 형태였고, 입자의 크기는 평균 10 nm 였다.
[ 제조예 3] 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자 프로브의 제조
유무기 입자와 양친성 고분자를 반응시켜, 양친성 고분자를 포함하는 제조하였다.
구체적으로, 안정제로 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 존재 하에서 이온 상태의 금(gold)과 환원제를 반응시켜 제조예 2와 동일한 방법으로 유무기 입자를 제조하였다. 그 다음, 4-아미노티오페놀(4-Aminothiophenol)과 폴리페닐알라닌(polyphenylalanine)을 1 : 35 몰비로 포함하는 공중합체를 준비하고, 제조된 유무기 입자와 mPEG-pPhe(폴리페닐알라닌) 공중합체를 혼합 및 교반하여, 상기 골드나노로드 표면에 고분자를 접착시켜 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자를 제조하였다. 이를 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)에 녹여 회전하면서 THF를 증발시키고, 플라스크 벽면을 따라 얇은 필름을 형성시킨 다음, 상기 필름을 수화시켜 골드 나노로드-고분자가 자기조립화 된 마이셀 형태의 유무기 입자 프로브를 제조하였다.
[ 제조예 4] 리포좀 구조의 양친성 입자 프로브 제조
제조예 1의 양친성 입자 제조방법에서 하기 조건 외에 동일한 방법으로 제조하여 리포좀 형태의 프로브를 제조하였다.
구체적으로, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A; MPL)을 5:2:0.02 중량부로 혼합하여 유기물질이 총 10 mg 되도록 하여 클로로포름 (Chloroform, CF) 1mL에 분산시킨 후, CF를 증발시킨 다음에, 형성된 필름에 자기-소광된 염료(Avanti 구입)로 DiO(Ex: 484nm) 및 Dil(Em: 565nm) 40㎍을 넣고, 60℃에서 12시간 수화 시킨후 12시간 교반하고, 투석하는 방법으로 자기-소광된 염료가 담지된 리포좀 입자를 제조하였다.
[ 실험예 1] FluSome의 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 효과 확인
제조예 1의 방법에 의해 제조된 양친성 입자 형태의 프로브(FluSome)의 FRET 효과를 확인하기 위하여, 인플루엔자 바이러스가 없는 상태에서의 소광(quenching) 및 탈소광(dequenching) 효과를 확인하였다.
인플루엔자 바이러스가 없는 상태에서, 음이온성 계면활성제로 이중층 구조를 분해시켜 입자를 붕괴시키는 Triton X-100을 이용하여 탈소광 효과를 확인하였다. 형광 측정기 일종인 hybrid multi-mode microplate reader (Synergy H4, BioTek, USA)로 형광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 퓨린, 트립신, 또는 Triton X-100을 처리한 즉시 및 처리 2시간 후, 효소를 처리하지 않은 대조군, 퓨린 처리군 및 트립신 처리군은 형광 강도에 변화가 없는 반면에, Triton X-100을 처리한 군은 형광 강도에 변화가 있음을 확인할 수 있었다. 퓨린 및 트립신 처리군의 경우, 인플루엔자 바이러스가 없는 경우에는 퓨린 및 트립신을 처리하여도 바이러스의 활성화 및 융합 펩타이드에 의한 융합 작용이 일어나지 않기 때문에 아무런 변화가 없었다. 반면에, Triton X-100에 의하여 양친성 입자가 붕괴된 경우에는, 자기-소광된 염료의 탈소광으로 인하여 형광강도에 변화가 나타났다.
[ 실험예 2] FluSome을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 확인
제조예 1의 방법에 의해 제조된 양친성 입자 형태의 프로브(FluSome)의 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출 능력을 확인하는 실험을 실시하였다.
구체적으로, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해할 수 있는 퓨린(furin)과, 저병원성 및 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해할 수 있는 트립신(trypsin)을 이용하여 상기 효소 처리에 따라 고/저병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는지 확인하였다.
저병원성 인플루엔자 바이러스는 녹십자 수의약품에서, 고병원성 바이러스는 Hanoi university of agriculture에서 제공받아 사용하였다.
FluSome 단독 처리군(효소 미포함군)과 각각의 효소 처리군을 나누고, 산성 조건(pH 5.5) 여부에 따라 각 실험군의 형광 강도의 변화를 측정하였다. pH 5.5가 되도록, 산성 스톡 용액(stock solution)을 FluSome을 포함하는 용액에 혼합하였다. 형광 강도 측정 결과를 하기 표 1 및 도 5에 나타내었다. 하기 표 1에서 첫 번째 행은 고병원성 인플루엔자 바이러스, 두 번째 행은 저병원성 인플루엔자 바이러스(H3N2) 및 세 번째 행은 저병원성 인플루엔자 바이러스(H9N2)에 대한 형광 강도 측정 결과이다.
Flusome Flusome+Furin Flusome+Trypsin Flusome+Furin in pH5.5 Flusome+Trypsin in pH5.5 Flusome+ Furin+Trypsin in pH5.5 Flusome in pH 5.5 Flusome in pH 5.0
54.126 55.584 56.19 266.843 266.534 268.831 62.975 65.212
56.504 56.272 57.531 67.533 284.326 271.775 67.893 60.253
54.389 56.563 57.382 62.971 267.604 267.84 55.447 52.827
도 5 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 효소 미포함군, 비산성조건 실험군에서는 프로프의 형광 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 고병원성 인플루엔자 바이러스 실험군에서 산성 조건이 만족된 경우, FluSome과 퓨린을 함께 처리한 경우, FluSome과 트립신을 함께 처리한 경우, 및 산성 조건에서 FluSome, 퓨린 및 트립신을 함께 처리한 경우 모두에서 FluSome 내의 자기-소광된 염료가 탈소광되어 형광이 검출됨을 확인 하였고, 이는, 산성 조건, 헤마토글루티닌 분해효소 및 FluSome을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 의미한다.
[ 실험예 3] FluSome을 이용한 다양한 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출 확인
FluSome의 다양한 고병원성 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하고자, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 종류를 달리하여 실험예 2와 동일한 방법으로 FluSome의 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출 능력을 확인하였다. 모든 실험은 동일한 산성 조건(pH 5.5) 하에서 수행하였으며, 고병원성 인플루엔자 바이러스로 총 다섯 종류의 H5N1 타입 바이러스를 사용하였다.
형광 강도 측정 결과를 하기 표 2, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
Furin Trypsin
H5N1_01 3346 3417
H5N1_02 3304 3358
H5N1_03 3207 3185
H5N1_04 2948 3141
H5N1_05 3691 3504
H9N2 398 3376
CONTROL 318 374
BLANK 21 17
표 2 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 퓨린을 처리한 경우, FluSome 내의 자기-소광된 염료가 탈소광되어 형광이 검출됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7에 도시한 바와 같이, 다양한 고병원성 인플루엔자 바이러스에 퓨린 또는 트립신을 처리한 경우, 모두 570 nm 부근에서 형광이 검출 되었으며, 저병원성 인플루엔자 바이러스의 경우 트립신을 처리하였을 경우에만, 570 nm 부근에서 형광이 검출 됨을 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 검출 가능한 고병원성 인플루엔자 바이러스의 농도 확인
본 발명의 프로브를 이용하여 검출 가능한 인플루엔자 바이러스의 농도를 확인하고자, 제조예 1에 따른 FluSome 및 고병원성 인플루엔자 바이러스를 이용하여, 바이러스의 농도에 따른 형광 강도의 변화를 측정하였다. 실험군으로 고병원성 인플루엔자 바이러스 처리군, 고병원성 인플루엔자 및 분변의 혼합 처리군을 설정하고, 대조군으로 분변 용액 처리군(분변 Sln), DPBS 처리군 및 분변 처리군(분변의 종류에 따라 총 10개의 군을 실험)을 설정하였다. 모든 실험군 및 대조군을 동일한 pH 조건 (pH 5.5)하에서, 퓨린을 처리한 후의 형광 강도 변화를 측정하였다.
그 결과를, 하기 표 3에 나타내었다.
바이러스처리군(희석배율) 1/21 1/22 1/23 1/24 1/25 1/26 1/27
형광강도 118354 123582 130596 150609 131845 154367 111607
바이러스처리군(희석배율) 1/28 1/29 1/210 1/104 1/105 1/106 1/107
형광강도 11563 12011 11673 11868 12109 11807 11597
바이러스처리군(희석배율) 1/108 1/109 1/1010
형광강도 12038 10169 11439
바이러스+분변 처리군(희석배율) 1/101(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/102(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/103(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/104(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/105(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/106(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/107(virus 50㎕+분변 50㎕)
형광강도 112252 10496 10690 10183 9376 9606 10637
바이러스+분변 처리(희석배율) 1/108(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/109(virus 50㎕+분변 50㎕) 1/1010(virus 50㎕+분변 50㎕)
형광강도 9901 9310 10132
분변 처리군 only 분변_01 only 분변_02 only 분변_03 only 분변_04 only 분변_05 only 분변_06 only 분변_07
형광강도 9111 10428 10791 12149 10273 11551 10651
분변 처리군 only 분변_08 only 분변_09 only 분변_10 분변 sin. DPBS(대조군)
형광강도 10734 9901 10014 11790 11412
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 바이러스만 처리하는 경우에는 1/2 내지 1/(27) 농도(희석배율)에서 형광강도가 변함을 확인할 수 있었다. 또한, 인플루엔자 바이러스와 분변이 혼합 처리된 군의 경우 1/10 이상에서 형광강도가 변함을 확인할 수 있었다. 이는 인플루엔자 바이러스가 1/2 내지 1/(27) 농도로 존재하는 경우, 또는 인플루엔자 바이러스가 분변과 혼합되어 1/10 이상 존재하는 경우, 검출이 가능함을 의미한다.
이와는 다르게, 분변만 있는 경우에는 형광강도의 변화가 없었다. 이는 형광 강도의 변화는 인플루엔자 바이러스에 의하여 일어난 것이며, 분변이 이에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
[ 실험예 5] 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출 확인
유무기 입자의 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하고자, 제조예 3의 방법에 의하여 제조된 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자 프로브와, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해하는 효소로 퓨린, 트립신 및 TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-트립신을 이용하여 저병원성 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하였다.
대조군으로, 효소 미처리군(양친성 고분자 포함하는 유무기 입자 입자원액)을 설정하였고, 퓨린 처리군, 트립신 처리군, TPCK-트립신 처리군을 실험군으로 설정하였다. 모든 실험 조건은 pH 5.5 하에서 수행하였으며, 대조군 및 각 실험군에 저병원성 바이러스를 처리한 후, 바이러스 처리 전 후의 변화를 육안으로 관찰하고, 그 결과를, 도 8에 도시하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 효소를 처리하지 않은 대조군은 뚜렷한 변화가 나타나지 않았으나, TPCK-트립신 처리군의 경우 바이러스에 의하여 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자의 안정성이 낮아져 응집이 일어나 침전 및 덩어리가 형성된 것을 육안으로 명확히 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 유무기 입자를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출 확인
헤마글루티닌 분해 효소에 의하여 활성화된 바이러스의 펩티드는 유무기 입자 프로브(GNR)이 표면에 있는 안정화제와 반응 하여 유무기 입자가 응집이 일어나게 하므로, 바이러스가 존재하는 경우 응집여부에 따라 빠르게 바이러스를 검출할 수 있다. 따라서, 이러한 유무기 입자의 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하는 실험을 수행하였다.
제조예 2의 방법에 따라 제조된 유무기 입자 프로브(GNR)와, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해하는 효소로 퓨린, 트립신 및 TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-트립신을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스(H5N1, H5N6)의 검출 효능을 rapid kit를 이용하여 확인하였다. G1, G2는 고병원성 인플루엔자의 검출을, G3는 저병원성 인플루엔자 바이러스의 검출을 확인 한 것이다.
또한, 음성 대조군(negative control)으로 효소가 없는 조건과, 비글의 코에서 채취한 콧물을 효소, pH solution을 넣은 조건에서 GNR을 넣은 후 반응을 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 프로브가 없는 음성 대조군 및 효소를 포함하지 않는 음성 대조군의 경우 색의 변화가 관찰되지 않았으나, G1, G2 실험군의 경우 모든 경우에 색의 변화가 육안으로 관찰되었고, G3인 저병원성 실험군의 경우 퓨린만 포함하는 경우에는 색의 변화가 낮은 것을 제외하고 육안으로 관찰될 수 있는 수준의 변화가 감지되었다. 따라서, 본 발명의 유무기 입자 프로브를 이용하는 경우 인플루엔자 바이러스의 존부를 빠르게 검출할 수 있음을 확인하였다.
[ 실험예 7] 효소 보조제 처리 유무에 따른 인플루엔자 바이러스 검출능 확인
바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해하는 효소의 보조제를 더 포함하는 경우 검출능의 변화를 확인하는 실험을 하였다.
효소 보조제로 케톤을 사용하였고, 제조예 1의 방법에 따라 제조된 프로브(FluSome)를 이용하였고, 케톤을 더 포함한 것을 제외하고는 실험예 2와 동일한 방법으로 실험하였다. 효소 보조제로 케톤을 처리한 군을 Try-TPCK로 나타내었다.
20=1 2-1=1/2 2-2=1/4 2-3=1/8 2-4=1/16 2-5=1/32 2-6=1/64 2-7=1/128 2-8=1/256 2-9=1/512
G1(H5N1_01) Furin 88103 87389 91459 91199 2863 3083 5692 2353 3800 4368
Trypsin 85807 99558 92991 92397 3195 2204 2338 5730 1916 3338
Try-TPCK 91665 91665 91665 93022 92688 1264 1461 1587 2424 3385
G2(H5N1_02) Furin 90707 90707 96631 90745 92015 1257 3699 1715 3169 1739
Trypsin 95223 95427 97742 97646 93160 4369 2889 1497 2920 3073
Try-TPCK 93914 94982 96922 99526 91492 2334 3837 1433 2096 2807
G3(H5N6) Furin 95180 98110 99975 93760 92978 6539 2526 5138 2533 5519
Trypsin 93049 94767 94093 94367 4976 4808 4921 5566 4803 1985
Try-TPCK 97286 98414 97552 94610 90354 93251 4996 2567 4725 4885
Without enzyme
G1 6623
G2 6868
G3 6724
Without Virus(콧물)
Furin 6226
Trypsin 6251
Try-TPCK 6238
그 결과를 표 4 내지 표 6에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 Try-TPCK를 처리한 경우가 퓨린이나 트립신 단독 처리군과 비교하여 검출능이 우수함을 확인할 수 있었다. 이는 효소 보조제가 헤마글루티닌 분해효소 외에 다른 효소의 활성을 줄임으로써 헤마글루티닌 분해효소의 활성을 높이기 때문인 것으로 판단되며, 따라서, 이는 효소 보조제를 사용함으로써 바이러스 검출능을 더욱 향상시켜, 적은 양의 바이러스까지 검출할 수 있어, 검출키트의 민감도를 높일 수 있다.
[ 실험예 8] 표면 증강 라만 산란 신호 측정을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 확인
표면 증강 라만 산란 신호 측정에 따른 인플루엔자 바이러스 검출을 확인하기 위하여, 제조예 1에서 자기 소광 염료를 대신하여 라만 리포터인 2-나프탈렌티올을 담지시켜 제조된 FluSome을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 방출된 2-나프탈렌티올을 나노 크기의 금과 컨쥬게이션한 후, 다음의 측정 조건 하에서 라만 산란 신호의 변화를 관찰하였다. 측정 조건: Laser:　785 nm, Power:　0.7 mW, Grating: 300 gr/mm, Hole:　500 um, Spectral range: 300 ~　1700 cm-1, Exposition time:　120 sec
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신과 트립신-TPCK 처리군에서 2-나프탈렌티올-금 컨쥬게이트의 존재에 따라 라만 신호가 변화된 것을 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 라만 신호가 변화된 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 표면 증강 라만 산란 신호를 측정함에 의하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 9] 육안 색 변화 관찰에 따른 인플루엔자 바이러스 검출 확인
육안으로 색의 변화를 관찰함에 의하여 인플루엔자 바이러스 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 제조예 1에서 자기 소광 염료를 대신하여 플러렌(TCI)을 담지시켜 제조된 FluSome을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 방출된 플러렌을 톨루엔 용액에 가하여 색의 변화를 관찰하였다. 플러렌은 탄소 원자가 구, 타원체, 원기둥 모양으로 배치된 분자를 의미한다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신과 트립신-TPCK 처리군에서 플러렌의 존재에 따라 색이 변화된 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 색이 변화된 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 플러렌을 이용한 육안 색변화 관찰에 의하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 의미한다.
[ 실험예 10] 형광 변화 측정에 따른 인플루엔자 바이러스 검출 확인
형광 염료를 이용하여 형광 변화를 측정함에 의하여 인플루엔자 바이러스 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 제조예 1에서 자기 소광 염료를 대신하여 형광 염료인 루미놀(Sigma)을 담지시켜 제조된 FluSome을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 방출된 루미놀을 알칼리성 수용액에서 과산화 반응 시켜, 하이브리드 다중-모드 마이크로플레이트 리더기(hybrid multi-mode microplate reader, Synergy H4, BioTek, USA)를 이용하여 형광 변화를 측정하였다(Ex: 303 nm, Em: 425 nm). 루미놀은 알칼리성 수용액에서 과산화 반응에 의하여 자청색의 형광을 나타내므로, 형광 변화 측정에 의하여 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있다.
그 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신과 트립신-TPCK 처리군에서 루미놀의 과산화에 따라 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다.
Control 저병원성 고병원성
Trypsin 3083 88115 78195
Trypsin-TPCK 2204 97654 94257
Furin 1916 2438 81248
이러한 결과는 루미놀을 이용한 형광 강도 측정에 의하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 의미한다.
[실험예 11] 리포좀을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 확인
양친성 입자로 리포좀을 이용하여 인플루엔자 바이러스 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 제조예 4에서 제조된 리포좀을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 실험예 3과 동일한 방법으로 형광 강도의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신 처리에 따라 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 양친성 입자로 리포좀을 이용하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 의미한다.

Claims (28)

  1. 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스 또는 파라믹소 바이러스인 바이러스 검출용 키트
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 바이러스의 표면 단백질은 헤마글루티닌(HA), 스파이크 단백질(spike protein) 또는 F 단백질(F protein) 인 바이러스 검출용 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자는 효소인 바이러스 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 효소는 퓨린, 트립신, 세린, 엔도프로테아제(endoprotease) 및 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 효소는 재조합 인간 퓨린, 재조합 마우스 퓨린, 트립신-EDTA, 아세틸화된 트립신, TPCK-트립신, 아크릴릭 트립신(Trypsin-acrylic) 퓨린형 프로테아제(Furin like protease), 켁스2 프로테아제(Kex2 proteases), 막통과 세린 프로테아제 (Transmembrane protease serine), TMPRSS2, TMPRSS4, 트립타아제 클라라(Tryptase clara), 플라즈민(plasmin), 세린계 프로테아제(serine protease), 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin like endoprotease) 및 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome) 또는 액적(droplet)인 바이러스 검출용 키트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 표지자를 포함하는 양친성 입자; 유무기 입자; 항체; 압타머; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것;인 바이러스 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 표지자는 자기-소광된 염료, 형광 염료, 전기화학발광 물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 바이러스 검출용 키트.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 양친성 입자는 친수성 고분자 및 소수성 고분자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리포스파진, 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 유무기 입자에서 무기물질은 금 및 은으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 유무기 입자에서 유기물질은 무기물질의 안정화제인 바이러스 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 무기물질의 안정화제는 계면활성제(surfactant) 인 바이러스 검출용 키트.
  16. 제8항에 있어서,
    상기 유무기 입자는 양친성 고분자를 더 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 양친성 고분자는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 타입의 양친성 블록 공중합체, B-A-B 타입의 삼중 블록 공중합체 또는 지질인 바이러스 검출용 키트.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 pH 6 이하의 산성 물질을 추가로 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 생체 분자의 반응 보조제를 추가로 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 생체 분자의 반응 보조제는 케톤인 바이러스 검출용 키트.
  21. 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 조성물.
  22. 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계 및
    상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하는 바이러스 검출방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 접촉은 pH 6 이하의 조건 하에서 수행되는 것인 바이러스 검출방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 형광 강도의 변화를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 표면 증강 라만 스펙트럼의 변화를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브에 흐르는 전류의 변화를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  27. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 색 변화를 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  28. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 응집여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190154687A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Kabushiki Kaisha Toshiba Detection device and detection method

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090044763A (ko) * 2007-11-01 2009-05-07 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) 경쟁적효소면역측정법을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스항체의 진단키트 및 이를 이용한 진단방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090044763A (ko) * 2007-11-01 2009-05-07 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) 경쟁적효소면역측정법을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스항체의 진단키트 및 이를 이용한 진단방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRANDENBURG, B. ET AL.: "Mechanisms of Hemagglutinin targeted Influenza Virus Neutralization", PLOS ONE, vol. 8, no. 12, 2013, pages e80034, XP055466591 *
GAMBOTTO, A. ET AL.: "Human Infection with Highly Pathogenic H5N1 Influenza Virus", THE LANCET, vol. 371, 2008, pages 1464 - 1475, XP022622971, DOI: doi:10.1016/S0140-6736(08)60627-3 *
MTITAL, A. ET AL.: "Kinetics of Influenza Hemagglutinin-mediated Membrane Fusion as a Function of Technique", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 303, 2002, pages 145 - 152, XP055466590 *
See also references of EP3244210A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190154687A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Kabushiki Kaisha Toshiba Detection device and detection method
US11169151B2 (en) * 2017-11-17 2021-11-09 Kabushiki Kaisha Toshiba Detection device and detection method

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