CN112877469A

CN112877469A - 人H组轮状病毒的Real-time PCR检测方法

Info

Publication number: CN112877469A
Application number: CN201911199412.1A
Authority: CN
Inventors: 段招军; 庞立丽; 李丹地
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种人H组轮状病毒Real‑time PCR定量检测方法，Real‑time PCR定量检测的上游引物F包括SEQ ID No.1以及与SEQ ID No.1至少有70％同源性的序列；下游引物R包括SEQ ID No.2以及与SEQ ID No.2至少有70％同源性的序列；探针包括SEQ ID No.3以及与SEQ ID No.3至少有70％同源性的序列。Real‑time PCR循环条件为：48‑55℃反转录5‑8min，95℃PCR起始活化20s‑50s，95℃变性10‑20s，55‑65℃退火和延伸50‑70s，进行35‑45个循环，每个循环后检测荧光信号。本方法能快速有效地检测人H组轮状病毒感染。本发明的检测方法具有较高的检测灵敏度和特异性，操作简单，应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域H组轮状病毒监测和H组轮状病毒感染疾病预防和控制提供了可行的技术支持。

Description

人H组轮状病毒的Real-time PCR检测方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及人H组轮状病毒的Real-time PCR检测方法。

背景技术

轮状病毒(rotaviruses,RVs)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，主要通过粪-口途径传播，是世界范围内引起婴幼儿严重腹泻的主要病原。据统计每年有超过200万腹泻患儿由轮状病毒感染引起住院，大约50万例婴幼儿因轮状病毒感染而死亡。针对轮状病毒腹泻的治疗目前尚无特效药物，一般是对症治疗，接种疫苗可以起到保护作用，是预防轮状病毒感染的有效手段。新的轮状病毒流行株的不断出现给轮状病毒疫苗的研发和使用带来了巨大挑战。

目前已鉴定出9组轮状病毒(从轮状病毒A到轮状病毒I)，第10组轮状病毒RVJ也已经有报道。其中A、B、C及H组能感染人和动物；而D～G组和I、J组则仅在动物中发现。曾经在猪、人和蝙蝠中检测到H组轮状病毒。近些年来，多个国家报道猪H组轮状病毒。H组轮状病毒的核酸电泳图型和血清学分析与早先发现引起成人腹泻的轮状病毒截然不同，因而称为新成人轮状病毒。

轮状病毒的检测方法主要有电镜技术、酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerasechain reaction,RT-PCR)和实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)等。尤其以PCR为基础的核酸扩增方法实验结果判定特异、敏感且快速，是最广泛使用的检测方法。目前，轮状病毒的检测主要基于A组轮状病毒，如real-time PCR，RT-PCR，ELISA方法等。尚没有检测H组轮状病毒的方法，检测方法的缺少，关于H组轮状病毒的报道还很少，阻碍了H组轮状病毒流行状况和疫苗技术的发展。因此，建立H组轮状病毒检测方法是重要的研究方向。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种人H组轮状病毒的Real-time PCR定量检测方法。本方法能快速有效地检测人H组轮状病毒感染。本发明的检测方法具有较高的检测灵敏度和特异性，操作简单，应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域H组轮状病毒监测和H组轮状病毒感染疾病预防和控制提供了可行的技术支持。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明提供一种人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测的上游引物F包括SEQ ID No.1以及与SEQ ID No.1至少有70％同源性的序列；下游引物R包括SEQ ID No.2以及与SEQ ID No.2至少有70％同源性的序列；探针包括SEQ ID No.3以及与SEQ ID No.3至少有70％同源性的序列。

具体的，方案1，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测中：

上游引物F为：ACGCATTAGTTGGAAGAG，即SEQ ID No.1；

下游引物R为：GCTGGAAGTAAAGTTAGTGA，即SEQ ID No.2；

探针序列为：FAM-CAGGAGCCGTAACATTCA-MGB，即SEQ ID No.3。

方案2，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测中：

上游引物F为：ACAGGTATAATTACGATTATCC，即SEQ ID No.4；

下游引物R为：GCTGGAAGTAAAGTTAGTG，即SEQ ID No.5；

探针序列为：FAM-AGACCAGGAGCCGTAACATTCAA-TAMRA，即SEQ ID No.6。

方案3，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测中：

上游引物F为：CGCATTAGTTGGAAGAGC，即SEQ ID No.7；

下游引物R为：AGCTGGAAGTAAAGTTAGTG，即SEQ ID No.8；

探针序列为：FAM-AGACCAGGAGCCGTAACATTCA-TAMRA，即SEQ ID No.9。

方案4，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测中：

上游引物F为：AGTTGGAAGAGCAACAGG，即SEQ ID No.10；

下游引物R为：GAGCTGGAAGTAAAGTTAG，即SEQ ID No.11；

探针序列为：FAM-CAGGAGCCGTAACATTCAA-MGB，即SEQ ID No.12。

进一步的方案，Real-time PCR的循环条件为：48-55℃反转录5-8min，95℃PCR起始活化20s-50s，95℃变性10-20s，55-65℃退火和延伸50-70s，进行35-45个循环，每个循环后检测荧光信号；

进一步的方案，Real-time PCR的循环条件为：50℃反转录5min，95℃PCR起始活化20s，95℃变性15s，60℃退火和延伸60s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。

进一步的方案，Real-time PCR定量检测的反应体系中，上游引物F和下游引物R的浓度分别为0.4-0.9μmol/L；

优选的，上游引物F和下游引物R的浓度分别为0.4μmol/L。

进一步的方案，Real-time PCR定量检测的反应体系中，Real-time PCR定量检测的反应体系中，探针的浓度为0.1-0.25μmol/L；

优选的，所述探针的浓度为0.2μmol/L。

进一步的方案，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法包括以下步骤：

(1)将人H组轮状病毒感染传代细胞进行培养；

(2)提取人H组轮状病毒RNA基因组并扩增VP6基因；

(3)构建VP6基因载体并进行体外转录，并将转录后的RNA纯化；

(4)筛选Real-time PCR定量检测的反应条件，建立标准曲线。

进一步的方案，步骤(1)中，将冻存的人H组轮状病毒解冻融化，加入10ug/ml不含EDTA的胰蛋白酶活化病毒，37℃孵育。

进一步的方案，步骤(1)中，被激活的人H组轮状病毒感染传代细胞后，添加含10ug/ml胰蛋白酶的细胞培养液，37℃孵育进行扩大培养；

优选的，所述传代细胞包括MA104细胞。

用细胞直接培养轮状病毒很困难，至今分离成功率仅为40％～70％。在体外培养病毒需要经过胰蛋白酶处理，胰蛋白酶通过裂解体外衣壳蛋白VP4从而增强病毒感染性，所以培养轮状病毒用胰蛋白酶激活很重要。轮状病毒的分离培养以前多采用原代细胞，后来引进易感细胞系恒河猴肾传代细胞MA104，成功分离到适应于细胞培养的多种轮状病毒细胞株，所以本实验选用MA104细胞进行J19轮状病毒的培养，显微镜下观察，正常的MA104细胞为梭形，贴细胞瓶壁生长，细胞之间界限分明；细胞经J19病毒感染后，2天即可出现细胞病变，病变的速度与接种病毒的量及浓度有关，量越大浓度越高，细胞病变加快，反之则病变缓慢。

为了使H组轮状病毒在细胞中传代和复制，在细胞培养液中加入胰蛋白酶可以使病毒数量提高。主要原因在于胰酶对轮状病毒表面蛋白VP4的作用，VP4是一种病毒粘附蛋白，与轮状病毒的毒性有关，能抑制病毒吸附到宿主细胞上。但VP4对胰酶敏感，经胰蛋白酶消化后，VP4可裂解为VP5和VP8两个多肽，这样可以暴露出VP5和VP8与细胞受体相结合的位点，从而提高了病毒入侵细胞和病毒感染的能力，也增强了病毒的繁殖能力。需要指出的是，接种病毒时加入的胰蛋白酶浓度也是关键，经过多次接种并加入不同胰酶浓度于病毒中，经比较发现，适合病毒在细胞中传代和复制的胰蛋白酶浓度为10ug/mL最佳。

进一步的方案，步骤(2)中以人H组轮状病毒RNA基因组为模板扩增VP6基因采用的引物为：

上游引物：ATGGAGCAGCAACTAGAACC，即SEQ ID No.13

下游引物：TACAACATTAGGTGGAGACG，即SEQ ID No.14。

进一步的方案，标准曲线的直线方程为：y＝-3.344x+37.763，其中y为Ct值，x为模板浓度log10的值，曲线回归系数R2＝0.999,曲线的扩增效率E＝99.10％。

进一步的方案，Real-time PCR定量检测人H组轮状病毒的最小拷贝数为1.0×10⁰拷贝/ul。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本方法能快速有效地检测人H组轮状病毒感染，且具有较高的检测灵敏度和特异性，操作简单，应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域H组轮状病毒监测和H组轮状病毒感染疾病预防和控制提供了可行的技术支持。

本发明的方法检测到的H组轮状病毒的最小拷贝数为1.0×10⁰拷贝/ul，因此灵敏度较高。利用建立起的荧光定量一步RT-PCR方法，对H组轮状病毒样本，以及A组轮状病毒、诺如病毒(norovirus)、星状病毒(astrovirus)、腺病毒(adenovirus)等容易引起人类腹泻的病毒核酸进行检测，发现只有H组轮状病毒有荧光信号，其他病毒均无荧光信号，说明该方法特异性较好。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1接毒后48h细胞CPE(20倍)；

图2为荧光定量针对不同浓度H组轮状病毒RNA标准品的检测结果；

图中，按照从左到右的顺序各曲线对应的RNA浓度分别为1.31×10⁹、1.31×10⁸、1.31×10⁷、1.31×10⁶、1.31×10⁵、1.31×10⁴、1.31×10³、1.31×10²、1.31×10¹、1.31×10⁰拷贝/μl；

图3为RT-PCR定量检测方法的标准曲线；

图4为特异性扩增曲线；

图5为批内重复性扩增曲线。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

为了实现人H组轮状病毒感染传代细胞进行培养，首先培养传代细胞。传代细胞包括但不限于MA104细胞。下面以人H组轮状病毒J19病毒感染MA104细胞进行培养为例进行阐述。

1.1 培养MA104细胞

1.1.1 复苏细胞

(1)从液氮罐中取出所需细胞冻存管，放入37℃温水中来回晃动使其快速融化，800rpm/min离心3min。

(2)倒掉细胞冻存液。

(3)配制含10％FBS细胞培养液，即1mLFBS+9mL1640，实际用量按照每次实验所需具体量计算。

(4)吸取6mL细胞培养液于一个25cm²的细胞瓶。

(5)在25cm²的细胞瓶中吸取1mL细胞培养液轻轻吹打细胞，吹打完毕将细胞悬液再吸回25cm²的细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱。

(6)二氧化碳培养条件：温度为37℃，二氧化碳含量为5％。

(7)次日给细胞换液，即吸掉旧的培养液，加入6mL含10％FBS的培养液。

1.1.2 传细胞

(1)待细胞长成致密的单层，铺满细胞瓶80％左右可以传下一代，以1:5的比例传代。

(2)吸弃旧的培养基。

(3)吸取2～3mLPBS清洗细胞一次，吸弃清洗液。

(4)吸取2ml的含DETA胰蛋白酶于细胞瓶，常温消化细胞3～4min，此时细胞开始分散、变圆，吸弃该胰蛋白酶。

(5)配制100mL含10％FBS的细胞培养液1640。

(6)吸取30mL的10％FBS 1640于一个75cm²细胞瓶中。

(7)从30mL的10％FBS 1640里吸取10mL轻轻吹打经胰蛋白酶(含DETA)消化好的细胞。

(8)将上述的细胞悬液再吸回75cm²的细胞瓶中，用移液器上下吹打，形成均匀的细胞悬液。

(9)将混合均匀的30mL细胞悬液分装到75cm²的细胞瓶中，15mL/瓶。

(10)将细胞放入37℃二氧化碳培养箱培养三天，待细胞长成致密单层，铺满细胞瓶80％左右，以1：5的比例传下一代。

1.2 J19毒株感染MA104细胞

(1)从-80℃冰箱拿出预留的J19毒株，使其在室温下解冻融化，加入10ug/ml不含EDTA的胰蛋白酶激活病毒(即1mL J19病毒+4uL0.25％胰蛋白酶)，每次病毒和胰蛋白酶的用量按实验需要计算，放入37℃二氧化碳培养箱1h。

(2)从细胞间拿出已长满的MA104细胞到接毒间，显微镜观察细胞状态，用15ml细胞基础培养液1640清洗细胞三次，5mL/次。

(3)加入2ml已活化的病毒液于75cm²细胞瓶，再加入2mL1640细胞基础培养液，以使病毒没过整个细胞面。放入二氧化碳培养箱吸附1h，期间每20min晃动一次细胞瓶，使其均匀覆盖细胞面；设立对照，即将一瓶生长良好的MA104细胞加入2ml含10ug/mL胰蛋白酶的1640及2ml 1640基础液作为阴性对照，37℃，5％二氧化碳培养箱培养4～6d。

(4)配制10ug/mL的细胞培养液(1mL细胞基础培养液+4uL胰蛋白酶)。

(5)每个细胞瓶分别补加11mL含10ug/ml胰酶的细胞培养液。

(6)将细胞放入37℃二氧化碳培养箱培养3～4d左右，每天观察细胞病变效应(cytopathogenic effect，CPE)，90％CPE时细胞脱落、飘起，即可以收获病毒，放-80℃冻存。

(7)将收获的病毒反复冻融三次，分装于50ml离心管，3000rpm，4℃离心1h，上清用0.22um滤膜过滤，存放于-80℃冰箱冻存备用。

结果：在用10ug/mL胰蛋白酶活化J19病毒后，接种J19病毒48小时后的细胞出现了很明显的病变，主要表现为细胞伸长、肥大并出现拉网的现象，随着时间的延长，细胞逐渐从培养瓶脱落(见图1中A)，而MA104对照细胞呈致密单层，细胞透亮饱满呈梭形状(图1中B)。

实施例二人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测

1.RNA标准品的制备

(1)J19病毒RNA的提取

取200μl轮状病毒J19株病毒液，按照QIAGEN公司

viral RNA mini kit试剂盒说明书操作，提取病毒RNA基因组，-80℃保存。

(2)一步法扩增标准品目的基因的RT-PCR

以引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，对J19病毒RNA进行一步法RT-PCR扩增，引物序列如表1所示。扩增H组轮状病毒J19株VP6基因片段，大小为657bp，引物送由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1

引物	序列号	核苷酸序列
			上游引物	SEQ ID NO:13	ATGGAGCAGCAACTAGAACC
下游引物	SEQ ID NO:14	TACAACATTAGGTGGAGACG

PCR按照QIAGEN公司的One-Step RT-PCR Kit试剂盒说明书操作，反应体系为50μl，组成如表2：

表2

(3)PCR产物的克隆和鉴定

经琼脂糖凝胶电泳后，切取目的片段，按照QIAGEN公司凝胶回收试剂盒(QIAquickGel Extraction Kit)操作说明回收、纯化PCR产物。PCR片段克隆至pGEM-T Easy vector，转化DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37℃培养14-16小时。从蓝白斑筛选平板上挑取白色单克隆，增菌后用High-Speed Plasmid Mini Kit试剂盒提取质粒。将质粒用EcoRI单酶双切鉴定后，鉴定合格的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司测序鉴定。

(4)体外转录

将质粒用Sal I酶切割，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒回收纯化。用体外转录Thermo Fisher Scientific公司试剂盒(MEGA script T7 Kit)对线性质粒进行体外转录。操作参考说明书。转录产物按照Thermo Fisher Scientific公司试剂盒(MEGAclear Kit)说明书纯化。纯化后的标准品RNA保存于-80℃备用。

2.TaqMan PCR引物和探针的设计

根据GenBank中J19病毒VP6序列(NC_007553.1)，使用Primer premier 5设计荧光定量PCR引物和探针，引物序列可以为表3-表6的方案所示。扩增H组轮状病毒J19株VP6基因保守区间，大小为104-133bp，引物和探针送由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表3方案1

引物	序列号	核苷酸序列
			荧光定量PCR上游引物	SEQ ID NO:1	ACGCATTAGTTGGAAGAG
荧光定量PCR下游引物	SEQ ID NO:2	GCTGGAAGTAAAGTTAGTGA
			荧光定量PCR探针	SEQ ID NO:3	FAM-CAGGAGCCGTAACATTCA-MGB

表4方案2

表5方案3

表6方案4

引物	序列号	核苷酸序列
			荧光定量PCR上游引物	SEQ ID NO:10	AGTTGGAAGAGCAACAGG
荧光定量PCR下游引物	SEQ ID NO:11	GAGCTGGAAGTAAAGTTAG
			荧光定量PCR探针	SEQ ID NO:12	FAM-CAGGAGCCGTAACATTCAA-MGB

3.荧光定量一步RT-PCR反应条件的优化

荧光定量一步RT-PCR反应按照Thermo Fisher Scientific公司的

FastVirus 1-Step Master Mix试剂盒说明书操作，反应体系为25μl，荧光定量RT-PCR反应体系包括：

Fast Virus 1-Step Master Mix、荧光定量PCR上游引物、荧光定量PCR下游引物、探针、RNA样品、DEPC ddH₂O。其中，上游引物、下游引物和探针可以选用方案1-方案4(表3-表6)的任一种方案。

具体的，以采用表3即方案1中的引物和探针进行荧光定量RT-PCR反应为例，Real-time PCR的循环条件可以为：48-55℃反转录5-8min，95℃PCR起始活化20s-50s，95℃变性10-20s，55-65℃退火和延伸50-70s，进行35-45个循环，每个循环后检测荧光信号。

以体外转录的RNA为标准品，分别对荧光定量RT-PCR反应体系中上游引物和下游引物浓度(0.4～0.9μmol/L)，探针浓度(0.1～0.25μmol/L)，退火温度(55～65℃)，循环数(35～45个循环)进行优化，通过比较Ct值、熔解曲线、荧光强度和扩增效率判定优化结果。

经试验条件筛选，得到最佳上游引物和下游引物浓度分别是0.4μmol/L，探针浓度是0.2μmol/L，最佳退火温度是60℃，循环数为40个。

最优的Real-time PCR的循环条件为：50℃反转录5min，95℃PCR起始活化20s，95℃变性15s，60℃退火和延伸60s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。

另外，采用方案2-4即表4-表6的引物方案进行荧光定量RT-PCR反应，采用的Real-time PCR的循环条件与上述方案类似。

4.标准曲线的绘制

用超微量分光光度计测定体外转录H组轮状病毒RNA的浓度，根据核酸拷贝数计算公式，计算出RNA拷贝数约为1.31×10¹²拷贝/μl。

拷贝数计算公式：

(6.02*10²³)×(ng/μl×10^-9)/(RNA长度×340)＝拷贝数/μl

对RNA标准品依次进行10倍倍比稀释，利用优化的荧光定量PCR反应条件，绘制标准曲线。

(1)动力学曲线

如图2所示，RNA浓度是1.31×10⁹、1.31×10⁸、1.31×10⁷、1.31×10⁶、1.31×10⁵、1.31×10⁴、1.31×10³、1.31×10²、1.31×10¹、1.31×10⁰拷贝/μl，对应的循环阈值分别为7.52、10.85、14.24、17.79、21.15、24.55、27.86、31.60、34.65、36.94。

(2)标准曲线

如图3所示，标准曲线的直线方程为：y＝-3.344x+37.763，其中y为Ct值，x为模板浓度log10的值。曲线回归系数R2＝0.999，这说明在标准品稀释质量浓度范围内具有良好的线性关系。曲线的扩增效率为E＝99.10％。

5.荧光定量一步RT-PCR法特异性检测

利用建立起的荧光定量一步RT-PCR方法，对H组轮状病毒样本，以及A组轮状病毒、诺如病毒(norovirus)、星状病毒(astrovirus)、腺病毒(adenovirus)等容易引起人类腹泻的病毒核酸进行检测，验证该方法的特异性。

如图4所示，荧光定量方法扩增结果表明，只有H组轮状病毒有荧光信号，其他病毒均无荧光信号，说明该方法特异性较好。

6.荧光定量一步RT-PCR法重复性检测

选取10⁷～10⁵拷贝/μl范围的H组轮状病毒RNA标准品，进行荧光定量一步RT-PCR法检测，每个稀释度平行重复3次进行检测，作为批内重复试验，计算各稀释度Ct值的平均值和变异系数(Coefficient of Variation，CV)，以平均反应体系的稳定性。并选取10⁷～10⁵拷贝/μl范围的H组轮状病毒RNA标准品，在同一周内选取三天分别进行检测，作为批间重复试验，计算每次实验中Ct值的平均值和变异系数，以检验此种方法的重复性。

批内重复试验结果显示，每个稀释度RNA的3个平行反应管Ct值的变异系数在0.5％以下(图5，表7)。由此证明此方法对H组轮状病毒检测的批内重复性良好。

表7

批间重复试验结果显示，每个稀释度RNA在三次实验中Ct值的变异系数均在1％以下(表8)。由此证明此方法对H组轮状病毒检测的批间重复性良好。

表8

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测的上游引物F包括SEQ ID No.1以及与SEQ ID No.1至少有70％同源性的序列；下游引物R包括SEQ ID No.2以及与SEQ ID No.2至少有70％同源性的序列；探针包括SEQ ID No.3以及与SEQ ID No.3至少有70％同源性的序列。

2.根据权利要求1所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，Real-time PCR的循环条件为：48-55℃反转录5-8min，95℃PCR起始活化20s-50s，95℃变性10-20s，55-65℃退火和延伸50-70s，进行35-45个循环，每个循环后检测荧光信号；

优选的，Real-time PCR的循环条件为：50℃反转录5min，95℃PCR起始活化20s，95℃变性15s，60℃退火和延伸60s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，Real-time PCR定量检测的反应体系中，上游引物F和下游引物R的浓度分别为0.4-0.9μmol/L；

优选的，上游引物F和下游引物R的浓度分别为0.4μmol/L。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，Real-time PCR定量检测的反应体系中，探针的浓度为0.1-0.25μmol/L；

优选的，所述探针的浓度为0.2μmol/L。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将人H组轮状病毒感染传代细胞进行培养；

(2)提取人H组轮状病毒RNA基因组并扩增VP6基因；

(3)构建VP6基因载体并进行体外转录，并将转录后的RNA纯化；

(4)筛选Real-time PCR定量检测的反应条件，建立标准曲线。

6.根据权利要求5所述的人H组轮状病毒的培养和免疫荧光定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，将冻存的人H组轮状病毒解冻融化，加入10ug/ml不含EDTA的胰蛋白酶活化病毒，37℃孵育。

7.根据权利要求5所述的人H组轮状病毒的培养和免疫荧光定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，被激活的人H组轮状病毒感染传代细胞后，添加含10ug/ml胰蛋白酶的细胞培养液，37℃孵育进行扩大培养；

优选的，所述传代细胞包括MA104细胞。

8.根据权利要求5所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中以人H组轮状病毒RNA基因组为模板扩增VP6基因制备RNA标准品采用的引物为：

上游引物：ATGGAGCAGCAACTAGAACC，

下游引物：TACAACATTAGGTGGAGACG。

9.根据权利要求5所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，标准曲线的直线方程为：y＝-3.344x+37.763其中y为Ct值，x为模板浓度log10的值，曲线回归系数R2＝0.999,曲线的扩增效率E＝99.10％。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种用于人H组轮状病毒Real-time PCR定量检测方法，其特征在于，Real-time PCR定量检测人H组轮状病毒的最小拷贝数为1.0×10⁰拷贝/ul。