CN113564233A

CN113564233A - 一种人β-类胰蛋白酶mRNA RT-PCR检测用引物探针组和试剂盒

Info

Publication number: CN113564233A
Application number: CN202110890718.2A
Authority: CN
Inventors: 吴善东; 程雷; 刘奕; 吴周杰; 蒋学翰; 雷薇; 王吉萍
Original assignee: Hangzhou Zheda Dixun Biological Gene Engineering Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Zheda Dixun Biological Gene Engineering Co Ltd
Priority date: 2021-08-04
Filing date: 2021-08-04
Publication date: 2021-10-29
Also published as: NL2030974A; NL2030974B1; AU2021106577A4; ZA202200489B

Abstract

本发明涉及一种人β‑类胰蛋白酶mRNART‑PCR检测用引物探针组和试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明所述引物探针组包括引物TPSB‑F、引物TPSB‑R和探针T‑Probe，所述引物TPSB‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物TPSB‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针T‑Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明针对人TPSB建立的TaqMan实时荧光定量一步法RT‑PCR检测引物探针组，为该蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。

Description

一种人β-类胰蛋白酶mRNA RT-PCR检测用引物探针组和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种人β-类胰蛋白酶mRNA RT-PCR检测用引物探针组和试剂盒。

背景技术

肥大细胞在过敏反应中被激活，释放包括类胰蛋白酶在内的炎症介质，这一过程导致过敏反应的症状和体征。类胰蛋白酶具有促进气道的修复、调节气道平滑肌细胞的张力和反应性、刺激肥大细胞的活化等作用。目前，类胰蛋白酶在cDNA和蛋白水平被分为三类：α、β、γ，其中β含量最高。发生过敏反应后，血液循环中β-类胰蛋白酶(TPSB)水平的短暂升高有助于识别和评估过敏反应的程度，测定β-类胰蛋白酶水平短暂升高的样品应在发生过敏反应后15分钟至3小时采集。血液中短暂的β-类胰蛋白酶水平升高提示药物、昆虫毒液或食物引起过敏反应，长期持续的β-类胰蛋白酶水平升高则提示肥大细胞增生症或血液肿瘤。鼻腔分泌物中β-类胰蛋白酶水平(或浓度)升高提示活动性过敏性鼻炎或是过敏性鼻炎患者正在变应原激发试验。

现在市场上对于TPSB的检测仍使用酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测其在体液中的含量，尚未见检测TPSB mRNA的商业化试剂盒。ELISA方法在检测过程中存在着检测范围小和灵敏度低的问题，且其准确性也存在问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用引物探针组和试剂盒。本发明针对人TPSB建立的TaqMan实时荧光定量一步法RT-PCR检测引物探针组，为该蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。

本发明提供了一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用引物探针组，所述引物探针组包括引物TPSB-F、引物TPSB-R和探针T-Probe，所述引物TPSB-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述引物TPSB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针T-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的是，所述探针T-Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。

优选的是，还包括内参基因的引物GAPDH-F、引物GAPDH-R和探针G-Probe，所述引物GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物GAPDH-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述探针G-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的是，所述探针G-Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团；探针G-Probe标记的荧光报告基团与探针T-Probe标记的荧光报告基团不同。

优选的是，所述荧光报告基团包括FAM或JOE，所述淬灭基团包括BHQ1。

本发明还提供了一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组、PCR反应液、酶混合液、β-类胰蛋白酶标准品、ROX参比染料和无核酶水。

优选的是，所述PCR反应液包括dNTPmix、MgCl₂和缓冲液。

优选的是，所述酶混合液包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将引物探针组、PCR反应液、酶混合液、标准品或待测样品、ROX参比染料和无核酶水混合后，进行荧光定量扩增。

优选的是，以20μL计，所述试剂盒的反应体系包括：引物探针组2μL、PCR反应液10μL、酶混合液0.5μL、ROX参比染料0.1μL、标准品或待测样品5μL和无核酶水2.4μL；所述荧光定量扩增的条件为：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，扩增40个循环。

本发明提供了一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用引物探针组。与免疫学检测方法相比，本发明所述引物探针组用于检测时，灵敏度高，可以检测低浓度(10copies/μL)的临床样本，能够更灵敏地探测到TPSB的含量变化，检测范围可跨越至少6个数量级，增加了检测结果的准确性，从而更早期、更准确、更快速地对治疗效果进行动态监测和疗效评估。

附图说明

图1为本发明提供的稀释操作过程图；

图2为本发明提供的TPSB mRNATaqMan实时荧光定量RT-PCR标准曲线；

图3为本发明提供的精密度检测结果图，其中1：1.0×10⁶copies/μL，2：1.0×10³copies/μL；

图4为本发明提供的准确度检测结果图；

图5为本发明提供的灵敏度检测结果图；

图6为本发明提供的临床样本检测结果图；其中1：阳性样本5GAPDH mRNA；2：健康对照3GAPDH mRNA；3：阳性样本5TPSB mRNA；4：健康对照3TPSB mRNA；5：空白对照NTC-GAPDHmRNA；6：空白对照NTC-TPSB mRNA；

图7为本发明提供的在引物、探针非最佳设计的情况下，低值精密度扩增曲线图；

图8为本发明提供的非最佳配比的酶混合液和最佳配比的酶混合液扩增结果。

具体实施方式

本发明提供了一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用引物探针组，所述引物探针组包括引物TPSB-F、引物TPSB-R和探针T-Probe，所述引物TPSB-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示：5'-CAGCGAGTGGGCATCGTT-3'，所述引物TPSB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5'-ATCCTTGACGTCCGGTCCC-3'，所述探针T-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5'-AGCCTGAGAGTCCGCGACCGAT-3'。

在本发明中，所述探针T-Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。在本发明中，所述荧光报告基团优选包括FAM或JOE，所述淬灭基团优选包括BHQ1。在本发明实施例中，所述探针T-Probe的5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团。

在本发明中，所述引物探针组还包括内参基因的引物GAPDH-F、引物GAPDH-R和探针G-Probe，所述引物GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5'-GACAACAGCCTCAAGATCATC-3'，所述引物GAPDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5'-CGCCACAGTTTCCCGGAG-3'，所述探针G-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：5'-ACTCATGACCACAGTCCATGCCAT-3'。在本发明中，所述探针G-Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团；探针G-Probe标记的荧光报告基团与探针T-Probe标记的荧光报告基团优选不同。在本发明中，所述荧光报告基团优选包括FAM或JOE，所述淬灭基团优选包括BHQ1。在本发明实施例中，所述探针G-Probe的5'端标记JOE荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团。

在本发明中，所述PCR反应液包括dNTP mix、MgCl₂和缓冲液；所述dNTP mix为脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，本发明所述dNTP mix优选购自ThermoFisher公司(货号：R0192)，工作浓度优选为0.1～1mM。在本发明中，MgCl₂的使用浓度优选为5～20mM；缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液，更优选为10～50mM Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH值优选为8.0。

在本发明中，所述酶混合液包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体。在本发明中，所述酶混合液中，Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的体积比优选为14:5:5:1，此比例能够获得最佳的扩增效果。在本发明中，Taq酶为耐热的Taq DNA聚合酶，利用其3'→5'聚合酶活性以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端；同时利用其5'→3'外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5'端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸，由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断；逆转录酶可将mRNA逆转录成cDNA以进行PCR反应；RNA酶抑制剂用来抑制外源性RNase的活性；Taq酶抗体是热启动PCR用抗Taq抗体，其与Taq酶结合后抑制DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，Taq酶抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，Taq酶恢复活性，实现PCR扩增。

在本发明中，所述β-类胰蛋白酶标准品优选为β-类胰蛋白酶的mRNA标准品，用于配制定量曲线。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将引物探针组、PCR反应液、酶混合液、标准品或待测样品、ROX参比染料和无核酶水混合后，进行荧光定量扩增。在本发明中，本发明所述试剂盒采用一步法RT-PCR技术定量检测方法，能够检测人血液、鼻腔分泌物、支气管冲洗液、唾液、泪液样本中TPSB mRNA的表达水平。

在本发明中，所述试剂盒的反应体系，以20μL计，优选包括：引物探针组2μL、PCR反应液10μL、酶混合液0.5μL、ROX参比染料0.1μL、标准品或待测样品5μL和无核酶水2.4μL。在本发明中，所述荧光定量扩增的条件优选为：42℃30min(逆转录)；95℃1min(预变性)；95℃5s，60℃31s，扩增40个循环。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种人β-类胰蛋白酶mRNA RT-PCR检测用引物探针组和试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到

实施例1

1.所涉及试剂及设备如下：

1.1试剂

1.1.1全血总RNA试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司，货号：5201050)

1.1.2 HiScribe T7 HighYield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs，货号：E2050S)

1.2主要仪器

1.2.1 AppliedBiosystems^TM7300荧光定量PCR仪：ThermoFisher，美国

1.2.2 -80℃低温冰箱：ThermoFisher，美国

1.2.3高速低温台式离心机：Eppendorf，德国

1.2.4 Qubit 3荧光计：ThermoFisher，美国

2.方法

2.1引物和探针设计

根据TPSB和GAPDH序列，利用Primer 6.0软件，设计荧光定量引物和探针，经过系列效果验证，获得了TPSB和GAPDH的引物对TPSB-F、TPSB-R、GAPDH-F、GAPDH-R和探针T-Probe、G-Probe(见表1)。引物、探针由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 TaqMan实时荧光定量PCR引物探针

2.2标准品制备

体外转录。采用pGM-T连接试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，货号：VT202-01]，以pGM-T为载体构建TPSB质粒DNA(委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建及合成)，将TPSB质粒DNA用HiScribe T7 High YieldRNA Synthesis Kit(NEWENGLAND BioLabs公司生产，货号：E2040S)体外转录成mRNA。

根据拷贝数计算公式：拷贝数＝[6.02×10²³×RNA浓度(ng/μL)×10^-9]/[RNA长度(bp)×340]，计算RNA初始拷贝数。用无核酶水稀释至1.0×10⁹copies/μL，即为TPSB标准品。

2.3全血RNA提取及稀释：EDTA抗凝全血样本用全血总RNA试剂盒提取全血总RNA，采用Qubit 3荧光计定量后，用无核酶水稀释至20ng/μL。

2.4 TaqMan实时荧光定量PCR

以标准品或全血RNA为模板，配制20μL体系如表2所示：

表2 20μL反应体系

扩增反应程序如表3所示：

表3扩增反应程序

2.5标准曲线的生成

将TPSB标准品按10倍梯度进行稀释，选择1.0×10⁷～1.0×10²copies/μL作为模板，每个稀释度2个重复，进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，生成标准曲线。稀释操作过程如图1所示，以50μL/管为例，每次稀释的过程，取5μL稀释前样品，加入到含有45μL水的新管中。

2.6精密度检测

选择1.0×10⁶copies/μL、1.0×10³copies/μL的标准品作为模板，每个浓度10个重复量，进行10次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，分别计算每个浓度对数值的变异系数进行统计学分析，分析该检测方法的精密度。

2.7准确度检测

选择1.0×10⁵copies/μL标准品作为模板，3个重复量，进行3次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，计算每个浓度对数值的绝对偏差，分析该检测方法的准确度。

2.8灵敏度检测

选择10.0copies/μL标准品作为模板，25个重复量，进行25次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，查看是否有扩增抬头，分析该检测方法的灵敏度。

2.10临床样本检测

取阳性样本和健康对照全血样本按照2.3步骤进行全血RNA提取和稀释，按照2.4步骤进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测。

3.实验结果

3.1标准曲线

将TPSB标准品按10倍梯度进行稀释，选择1.0×10⁷～1.0×10²copies/μL作为模板，每个稀释度2个重复，进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，生成标准曲线，TPSBmRNATaqMan实时荧光定量RT-PCR标准曲线如图2所示。以拷贝数对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，得到回归方程式：y＝-3.46x+38.261(R²＝0.996)，该回归方程的R²＝0.996，线性范围为1.0×10²～1.0×10⁷copies/μL。说明标准方程的拷贝数对数值与Ct值具有极高的相关性。

3.2精密度检测

选择1.0×10⁶copies/μL、1.0×10³copies/μL的标准品作为模板，每个浓度10个重复量，进行10次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，分别计算每个浓度对数值的变异系数进行统计学分析。精密度检测结果如表4和图3所示，结果显示，每个浓度对数值的变异系数分别为0.765％、2.547％，小于5％，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有极好的精密度。

表4精密度检测结果

3.3准确度检测

选择1.0×10⁵copies/μL标准品作为模板，3个重复量，进行3次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，计算每个浓度对数值的绝对偏差。结果如图4和表5所示，结果显示，每个浓度对数值的绝对偏差分别为-0.115、-0.079、-0.103，在±0.5范围内，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有极好的准确度。

表5准确度检测结果

3.4灵敏度检测

选择10.0copies/μL标准品作为模板，25个重复量，进行25次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，查看是否有扩增抬头。灵敏度检测结果如表6和图5所示，结果显示，共计25次检测出结果，达100％，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有很高的灵敏度，最低检出拷贝数＜10copies/μL。

表6灵敏度检测Ct值结果

33.112	33.655	34.996	33.374	33.072
					35.019	33.432	34.864	35.830	34.680
33.495	37.118	33.542	33.172	34.855
					33.883	34.704	34.883	34.509	33.579
37.455	33.027	34.572	32.982	33.334

3.5临床样本检测

本发明和国外应用较广的ImmunCAP^TM TPSB试剂比对结果如表7和图6所示：

表7比对结果

本发明采用全血RNA进行检测，ImmunCAP^TM TPSB试剂采用血清进行检测。

以上结果表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有较高的特异性，同时比进口荧光酶免法试剂更好的灵敏度。

对比例1

采用其它非最佳引物、探针进行扩增的结果

将本发明所用体系中的引物、探针替换成其它非最佳引物、探针。扩增体系、程序与实施例1相同。结果如图7，在采用非最佳的TPSB引物、探针，如：

TPSB-F：TGCAGCGAGTGGGCATCGT(SEQ ID NO.7)；

TPSB-R：TCTGGGCGGTGTAGAACTGT(SEQ ID NO.8)；

T-Probe：(FAM)-CACTTCTGCGGGGGCTCCCTC(SEQ ID NO.9)-(BHQ1)。

低值精密度的浓度对数值的变异系数结果超出5％，达10.267％。

表8非最佳引物、探针低值精密度的浓度对数值的变异系数结果

理论拷贝数	拷贝数对数值均值	SD	C.V
				1.0×10<sup>3</sup>	2.504	0.257	10.267％

对比例2

酶混合液效果比较

用非最佳配比的酶混合液(Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的体积比为11:4:3:1)和最佳配比的酶混合液分别扩增3例全血RNA样本，扩增用引物和探针、扩增体系、程序与实施例1相同。结果如图8所示，采用非最佳的酶混合液配比的扩增结果如图8中的A所示，采用最佳的酶混合液配比的扩增结果如图8中的B所示。不同配比的酶混合液浓度会影响样本的扩增效果，扩增效果不佳的就会导致所测得的最终浓度结果有偏差、不准确。所以要采用最佳配比的酶混合液。两者(非最佳配比的酶混合液和最佳配比的酶混合液)相比之下，非最佳的酶混合液配比的扩增结果的Ct值相对延后3个循环数以上，且最佳的酶混合液配比下同一样本的重复结果更具一致性，相差更小。可见最佳酶混合液的扩增效果均较好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司

<120> 一种人β-类胰蛋白酶mRNA RT-PCR检测用引物探针组和试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcgagtgg gcatcgtt 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atccttgacg tccggtccc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcctgagag tccgcgaccg at 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacaacagcc tcaagatcat c 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgccacagtt tcccggag 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actcatgacc acagtccatg ccat 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcagcgagt gggcatcgt 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctgggcggt gtagaactgt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacttctgcg ggggctccct c 21

Claims

1.一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括引物TPSB-F、引物TPSB-R和探针T-Probe，所述引物TPSB-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述引物TPSB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针T-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针T-Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，还包括内参基因的引物GAPDH-F、引物GAPDH-R和探针G-Probe，所述引物GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物GAPDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述探针G-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述探针G-Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团；探针G-Probe标记的荧光报告基团与探针T-Probe标记的荧光报告基团不同。

5.根据权利要求2或4所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM或JOE，所述淬灭基团包括BHQ1。

6.一种人β-类胰蛋白酶mRNART-PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述引物探针组、PCR反应液、酶混合液、β-类胰蛋白酶标准品、ROX参比染料和无核酶水。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括dNTPmix、MgCl₂和缓冲液。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体。

9.权利要求6、7或8所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将引物探针组、PCR反应液、酶混合液、标准品或待测样品、ROX参比染料和无核酶水混合后，进行荧光定量扩增。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，以20μL计，所述试剂盒的反应体系包括：引物探针组2μL、PCR反应液10μL、酶混合液0.5μL、ROX参比染料0.1μL、标准品或待测样品5μL和无核酶水2.4μL；

所述荧光定量扩增的条件为：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，扩增40个循环。