CN105087828A - 一种a型轮状病毒的荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法，以克隆轮状病毒VP6基因并体外转录形成RNA为标准品，在此基础上建立的TaqMan探针荧光定量PCR的检测方法；属于分子生物学领域；该方法包括以轮状病毒VP6基因为靶基因，设计引物和探针，设计实验找到最优条件下的退火温度、引物浓度、探针浓度；在引物外围再设计一对引物，并扩增片段，用该片段构建重组质粒，以构建好的重组质粒体外线性化后作为模板，转录获得RNA，十倍梯度稀释后做为标准品，进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线，并验证该方法的重复性，稳定性和灵敏性；用建立的Taqman荧光定量PCR，并对临床样品进行检测，该方法具有稳定性强、特异性好、假阳性低灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法。
背景技术
轮状病毒，属于呼肠孤病毒科，是一种由11条双链RNA片段构成的无包膜病毒，外层由3层蛋白壳包被（外衣壳，内衣壳，核衣壳）。轮状病毒的发病遍及全球各地，他是导致全球婴幼儿腹泻和死亡率最高的病原体。保守估计，截止到2008年，五岁以下的婴幼儿中，每年因轮状病毒引起的死亡接近453000，其中绝大多数的在发展中国家。轮状病毒总共有七个种，以英文字母编号，A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的，而超过90%的人类轮状病毒感染案例也都是该种造成的。
轮状病毒颗粒共由六个病毒蛋白（viralprotein，VP）构成。这些“结构性”的蛋白质分别被称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7。除了结构性蛋白之外，还有六个非结构性蛋白质（nonstructuralprotein，NSP），这六个非结构蛋白仅仅在轮状病毒感染的细胞中制造，而没有构成病毒的结构。这六个非结构性蛋白分别称为NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5与NSP6。其中vp6蛋白由第6号基因编码，占编码病毒蛋白总量的51%，在不同血清型间具有高度保守性（87%-99%），是内衣壳的主要组成成分。Vp6蛋白不仅具有转录酶的活性，在轮状病毒的复制过程中发挥巨大作用，而且决定了轮状病毒种的特异性，根据RV抗原VP6的差异可将其分成七个种。VP6蛋白在轮状病毒感染的诊断上是一个重要的检测指标，且在疫苗的开发上具有潜在的价值。
目前，轮状病毒的主要检测方法包括病变检测、电镜观察、ELISA、PAGE电泳以及RT-PCR。由于某些RV的基因型病变不明显或非致细胞病变，从而使得病变检测方法的检出率受到影响；ELISA受到主观因素影响较大，出现假阳性概率较大；PAGE的灵敏性不高且不能保证RNA的完整性；电镜方法实验操作繁琐且灵敏度不高；常规的RT-PCR易污染且不能定量。荧光定量PCR方法可以有效地克服以上方法的不足，具有速度快、特异性强、灵敏性高、重复性好的特点。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法；本发明的方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好假阳性低等特点。
为了实现上述目的，本发明技术方案如下：
（1）将轮状病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下外围引物扩增基因片段：上游引物：5’-AGGAAGCTTGTATGTATGGATGAAATGGC-3’，下游引物：5’-AGGGAATTCTAATGGAAGCTACCGTGAAA-3’；
（2）将基因片段构建重组质粒并进行纯化，纯化后的克隆载体体外转录酶进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值，并根据如下公式换算成RNA拷贝数：拷贝数（copise/ul）=质粒浓度（g/μl）×阿式常数/RNA分子量；阿式常数为6.02×1023，RNA分子量=一个碱基的分子量（340）×重组RNA总长度（bp）；
（3）将已知拷贝数的RNA做十倍梯度稀释，配制拷贝数为103-109copies∕μl的溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；
（4）收集临床轮状病毒粪便样本，并提取样本的RNA；
（5）按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中轮状病毒的含量，其中定量检测的引物和探针为：
上游引物：5’-TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA-3’，
下游引物：5’-TGCTAACAGAGTTTCATTTGCG-3’，
探针：5’-（FAM）TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC(TAMRA)-3’。
荧光定量PCR检测采用试剂盒为OneStepPrimeScriptRTPCRKit（TaKaRa，RR064A），反应体系为：
ExTaqHS0.4μl
PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.4μl
ROXReferenceDyeⅡ0.5μl
上游引物（10μM）0.5μl
下游引物（10μM）0.5μl
探针（5μM）1.2μl
2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10μl
RNaseFreedH2O1.5μl
模板5μl
总体积20μl
荧光定量PCR扩增条件为：
42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃34s；45个循环。
本发明的优点和技术效果如下：
PCR技术作为一种新兴的分子检测技术,通过实时监测荧光信号积累能够对未知样本中病毒载量进行准确定量,不仅操作快捷简便,具有高度灵敏度和特异性,而且可防止传统PCR普遍存在的污染问题，对临床样本进行快速、大批量检测,为RV的诊断、检疫、食品安全检验和病原生物学、分子流行病学研究提供了一种新的方法。
附图说明
图1为HRV-WA株型VP6外围基因片段RT-PCR电泳检测结果，其中M为Maker2000，“—”为阴性对照；
图2为不同退火温度下内围片段扩增电泳检测结果，其中M为Maker2000，“—”为阴性对照；
图3为不同引物浓度下内围片段扩增电泳检测结果；
图4为不同探针浓度扩增曲线；
图5为以109-103拷贝数为模板建立的标准曲线；
图6为以轮状病毒、EV71病毒、柯萨奇病毒A16为模板建立的TaqManPCR方法特异性分析曲线；
图7为TaqManPCR方法灵敏性分析曲线；
图8为组间重复性检测扩增曲线；
图9为临床样本检测结果。
具体实施方式
实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989）中所述的条件或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：以人轮状病毒（Rotavirus，购自武汉病毒所）VP6基因构建的RNA为标准品的TagMan探针荧光定量PCR方法
1、对人轮状病毒vp6基因片段的克隆并测序
1.1PCR引物的设计和PCR扩增
PCR引物是根据GenBank中下载的不同亚型的轮状病毒核酸序列，通过MEGA6软件比对，得到特异性保守序列，通过Primerpremier5.0设计引物，引物由大连宝生物公司合成，引物扩增长度为893bp；
外围上游引物：5’—AGGAAGCTTGTATGTATGGATGAAATGGC—3’（305bp-325bp）
外围下游引物：5’—AGGGAATTCTAATGGAAGCTACCGTGAAA—3’（1178bp-1197bp）；
以提取的人轮状病毒RNA为模板，一步法RT-PCR反应，10×OneStepRNAPCRBuffer5μl、Mgcl2（25Mm）10μl、dNTPMixture（各10mM）5μl、RNaseInhibitor（40U/μl）1μl、AMVRTase×L(5U/μl)1μl、AMV-OptimizedTag（5U/μl）1μl、外围上游特异性引物（20μM）1μl、外围下游特异性引物（20μM）1μl、轮状病毒总RNA1μl、RNaseFreedH2O24μl。以50μl反应体系，按以下件件进行RT-PCR反应：50℃30min、94℃2min；然后进行45个循环扩增94℃30sec、54℃30sec、72℃2min；72℃5min。-20℃冰箱保存备用。扩增产物大小为893bp，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。
1.2PCR产物通过胶回收产物纯化，将目的片段与PCDNA3.1+载体连接，将其转化JM109感受态细胞，进行测序验证。
2、TaqManPCR检测体系的建立
2.1TaqManPCR引物和探针的设计
根据重组质粒893bp的序列，利用Primerexpress.3.0设计引物和探针，目的片段长165bp，片段序列如SEQIDNO:1所示。
内围上游引物：5’—TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA—3’（891bp-914bp）
内围下游引物：5’—TGCTAACAGAGTTTCATTTGCG—3’（1034bp-1055bp）
探针：5’—（FAM）TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC(TAMRA)—3’（947bp-972bp）
引物和探针均由大连宝生物公司合成。
2.2PCR扩增及最适退火温度的确定
根据引物和探针的特点，分别设计退火温度50℃、52℃、54℃、56℃确定其最佳退火温度，采用下述反应体系和条件。以轮状病毒CDNA为模板应用PCR仪进行扩增。PermixTaq酶25μl、DEPC处理水16μl、上下游引物各2μl、模板5μl混合均匀。循环次数为40次，94℃2min；94℃30s，（50℃、52℃、54℃、56℃）30s，72℃1min，40个循环。72℃5min扩增；4℃备用。扩增产物用2%的琼脂糖电泳检测。通过电泳检测结果知：不同的退火温度下都能得到165bp的扩增片段，54℃条件下的特异性最好，因此，确定该检测体系的Tm=54℃（图2）。
2.3引物和探针浓度的确定
引物浓度：以相同条件下能检测到的模板浓度最低，扩增产物条带特异性强为标准。以100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L四个不同浓度的内围引物，分别用于同一个浓度的轮状病毒CDNA模板。反应体系为50μl:RealtimePCRMasterMix25μl、内围引物各2μl、DEPC水16μl、模板5μl混合均匀。循环次数为40个，94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，40个循环。72℃5min扩增；4℃备用。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。不同浓度引物下电泳结果为300nmol/L为最低浓度，该浓度能够很好地扩增片段（图3）。
探针浓度：以相同模板下CT值最小，ΔRn最大为探针选择标准。分别用200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L，三个探针浓度，以轮状病毒RNA为模板，反应体系为25μl，2×onestepRT-PCRBufferⅢ12.5μl、TakaraExTagHS0.5μl、上下游引物各0.5μl、不同浓度的探针0.5μl、轮状病毒RNA5μl、RNaseFreedH2O.5μl。反应条件：42℃5min，95℃10s；95℃5s、56℃45s。45个循环。观察扩增曲线，该探针浓度在300nmol/L时，CT值最小，且ΔRn最大扩增良好（图4）。
2.4克隆质粒的体外转录及拷贝数的测定
将克隆好的质粒，用大连宝生物公司DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化完成后用大连宝生物公司T7体外转录酶进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值（纯化以及体外转录步骤参见大连宝生物公司相关说明书），并根据如下公式换算成RNA拷贝数：
拷贝数（copise/ul）=质粒浓度（g/μl）×阿式常数/RNA分子量。阿式常数为6.02×1023，RNA分子量=一个碱基的分子量（340）×重组RNA总长度（bp）。
2.5.TaqManPCR标准曲线的建立
将已知拷贝数的RNA按照109-103copies∕μl进行10倍梯度稀释，利用优化的荧光定量PCR（ABI7500）反应条件，绘制标准曲线（图5）。
2.6TaqManPCR方法特异性分析
分别以轮状病毒、EV71病毒、柯萨奇病毒A16为模板，按照20μl最佳反应体系，按照42℃5min，95℃10s；95℃5s、56℃45s，45个循环进行反应。结果显示该检测体系特异性良好，非目标病毒没有扩增曲线而轮状病毒有良好的扩增曲线（图6）。
2.7TaqManPCR方法灵敏性分析
将已知拷贝数的RNA进行十倍梯度稀释，选取107-100copies∕μl8个浓度的RNA为模板，以优化的荧光定量PCR反应条件进行反应。以CT值>35个循环为下线检测该该体系的灵敏性。通过扩增曲线可知，本检测体系可以检测到100copies/ul（图7）。
2.8TaqManPCR方法重复性、稳定性分析
该体系的重复性和稳定性从批间和组间两个方面来设计实验进行验证。
批间：不同批次间配置的109-103copies的RNA标准品，各批间不同时间检测三次（每5天一次），分别计算他们各自曲线相关系数的变异系数（见表1）。
表1.不同批次标准曲线相关系数的变异系数
组间：选取108、106、104拷贝的三个不同浓度的定量标准品，分别进行三次重复，计算他们各自的CT值变异系数（见表2），三次检测结果的拷贝数分别是0.35%、0.94%、0.96%,重复性好，变异系数小（见图8）。
表2.不同拷贝数RNA标准品的变异系数
2.9荧光定量PCR的初步应用
采集患儿新鲜粪便标本，放入离心管中，加入双抗和PBS磷酸缓冲液，3000r/min，离心30min后取上清，放入-80冰箱冻存备用。采用病毒RNA提取试剂盒提取上清中病毒的RNA,对病毒进行定量检测。进行定量PCR时设置阳性和阴性对照，阳性对照为定量标准品，阴性为无菌水，若CT值小于35，且出现良好的扩增曲线，则为阳性，表明样品中含有轮状病毒，若CT值大于35或无扩增曲线，则判定为阴性，表明样品中没有轮状病毒。阳性样品病毒定量，根据建立的标准曲线计计算病毒的含量。计算公式为：Y=10 (43.585-X)/3.585 ，Y:样品中病毒拷贝数，X:样品扩增CT值，样品1、2、3的CT值分别为22.53、27.43和29.58，求出样品的拷贝数分别为7.5×105、3.2×104、8.1×103（见图9）。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法
<160>6
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>165
<212>DNA
<213>人轮状病毒
<400>1
ttattatttcagttgatgcgtccacctaatatgacaccagctgttaatgcactgtttcca60
caagcacaaccttttcagcaccatgcaacagttggacttacattacgtattgaatctgcg120
gtttgtgaatcagtgcttgcggacgcaaatgaaactctgttagca165
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aggaagcttgtatgtatggatgaaatggc29
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
agggaattctaatggaagctaccgtgaaa29
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ttattatttcagttgatgcgtcca24
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tgctaacagagtttcatttgcg22
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tccacaagcacaaccttttcagcacc26
Claims (2)
1.一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）将轮状病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下外围引物扩增基因片段：上游引物：5’-AGGAAGCTTGTATGTATGGATGAAATGGC-3’，下游引物：5’-AGGGAATTCTAATGGAAGCTACCGTGAAA-3’；
（2）将基因片段构建重组质粒并进行纯化，纯化后的克隆载体体外转录酶进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值，通过OD值计算RNA拷贝数；
（3）将已知拷贝数的RNA做十倍梯度稀释，配制拷贝数为103-109copies∕μl的溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；
（4）收集临床轮状病毒粪便样本，并提取样本的RNA；
（5）按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中轮状病毒的含量，其中定量检测的引物和探针为：
上游引物：5’-TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA-3’，
下游引物：5’-TGCTAACAGAGTTTCATTTGCG-3’，
探针：5’-（FAM）TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC(TAMRA)-3’。
2.根据权利要求1所述的A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：构建重组质粒所使用的质粒是PCDNA3.1+。
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