CN102965451B

CN102965451B - 一种a组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针

Info

Publication number: CN102965451B
Application number: CN201210360340.6A
Authority: CN
Inventors: 莫秋华; 伍碧梅; 赵俊华; 杨泽; 谭华; 林继灿; 杜田
Original assignee: Zhuhai International Travel Health Care Centre
Current assignee: Shenzhen Total Test Technology Co Ltd
Priority date: 2012-09-25
Filing date: 2012-09-25
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-09-25
Also published as: CN102965451A

Abstract

本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）技术的肠道病原体快速检测技术。具体提供了一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其一对引物和一条分子信标探针。所述试剂盒包括含有上述引物和探针的2×实时NASBA反应液、5×酶混合液及阳性对照模板、阴性对照和空白对照。所述引物和探针序列是序列编号为SEQIDNO：1～3所示的序列，能特异性扩增和检测A组轮状病毒VP6基因。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，可应用于临床和口岸的常规检测和疾病防控领域。

Description

一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针

技术领域

本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术的肠道病原体快速检测技术。具体涉及A组轮状病毒实时NASBA等温扩增快速检测试剂盒；还涉及所述试剂盒中使用的对于A组轮状病毒VP6基因具有特异性的引物对和分子信标探针。

背景技术

A组轮状病毒（Rotavirus，RV）是世界范围内引起婴幼儿重症腹泻的最主要病原，占儿科肠道感染病因的50%以上，其基因组由11个不连续的双链RNA基因片段组成，其中VP6基因编码的结构蛋白所存在的抗原性差异是轮状病毒分组的依据。A组轮状病毒也是导致发展中国家婴幼儿死亡的主要病因之一，资料显示，全世界每年约有60万5岁以下儿童的死亡与A组轮状病毒感染有关。因此，一套简便快速、特异性强的A组轮状病毒检测技术，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。

目前，针对轮状病毒的检测，经典的方法有电镜观察、病毒分离培养、核酸杂交、酶联免疫等。电镜观察不但敏感度低、而且价格昂贵、设备和技术条件要求甚高，无法应用于临床常规检测和大规模的流行病学调查；病毒分离培养法的缺陷是操作繁琐，耗时很长，通常需要一周左右的时间才能观察到细胞病理变化，不适于快速检测和临床紧急病情处理；核酸杂交及酶联免疫检测因技术本身的限制，其灵敏度均比较低，漏检率高。

随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合，基于核酸扩增的技术发展迅速，日新月异。如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种检测RNA类病毒的简便、准确的常规技术。但是，基于PCR的技术是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，且灵敏度仍有待提高。之后，无需电泳分析的实时荧光RT-PCR成为更快捷的一种核酸扩增和RNA病毒检测技术。该技术利用荧光探针实现对靶核酸的特异性检测，利用荧光信号的积累实现实时监测PCR扩增反应的全过程从而能实时分析检测结果。由于实时荧光RT-PCR仍需要有反转录步骤和变性、退火及延伸等三个温度点进行几十次升降温循环，每个温度点和时间也需精确设定，整个反应仍需耗时2～2.5小时以上。

近年来，一种新型的核酸扩增技术—等温扩增技术实现在恒温条件下的检测。如DNA环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP）应用的比较广泛，也有相关专利申请，但LAMP技术需要使用4条引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，虽然提高了特异性，但针对变异大的病毒核酸分子在设计上非常困难。

核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术是另一种快速等温扩增技术，它克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA病毒的检测。与PCR不同，NASBA是在AMV反转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶等三种酶的共同协作下，在41～42℃，由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。其中一条引物其5’端具有被T7 RNA聚合酶识别的启动子序列。在NASBA基础上结合分子信标（molecular beacon）探针可以建立实时NASBA（Real-time NASBA）等温扩增技术。该技术具有以下优点：（1）等温扩增：反应在同一恒温体系条件下进行；（2）快速高效、灵敏度高：实时NASBA反应是一种无需升降温的连续快速扩增，也不需RT-PCR反应中第一阶段15～30分钟的反转录过程，整个反应时间短、单链RNA产物积累迅速，可以在60～90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增10⁹倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA。例如目前针对A型禽流感病毒所有亚型研发的NASBA/ECL检测试剂盒，其正式发表的实验数据显示，NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感10～1000倍，比常规PCR方法也敏感许多；（3）特异性高、实时检测：反应不需高温变性，即使有双链DNA污染也不会被扩增，而通过分子信标探针的检测进一步提高了特异性和灵敏度，也实现了实时检测和结果分析；（4）设计简单：它只需设计1对引物和1条探针来识别靶RNA的3个不同区域，对于检测变异度高的病毒核酸来说，设计上相对LAMP技术更为容易。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于实时NASBA（Real-time NASBA）技术的对A组轮状病毒VP6基因具有特异性检测作用的引物；本发明还提供了一种基于实时NASBA（Real-time NASBA）技术的对A组轮状病毒VP6基因具有特异性检测作用的分子信标探针；此外本发明还提供了一种利用上述引物对和分子信标探针基于实时核酸序列依赖性扩增（Real-time NASBA）技术检测A组轮状病毒的检测试剂盒。

本发明一种A组轮状病毒检测用引物所采用的技术方案是，本发明包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的碱基序列表示如下：

正向引物F1：5’-AACATCATGCWACRGTWGGACT-3’；

反向引物R1：

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA-3’。

所述反向引物R1的5’端的25个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端22个碱基是与A组轮状病毒VP6基因靶RNA互补的特异性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸变异位点使用简并碱基。

本发明一种A组轮状病毒检测用分子信标探针所采用的技术方案是，所述分子信标探针的碱基序列表示如下：

分子信标探针P1：

5’-FAM-CGATCGTATGCNRTACCRGTTGGACCCGATCG-DABCYL-3’，

所述分子信标探针P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL，病毒核酸变异位点使用简并碱基。

本发明一种A组轮状病毒检测用试剂盒所采用的技术方案是，所述试剂盒至少包括2×实时NASBA反应液和5×酶混合液，所述2×实时NASBA反应液包含有如上所述的正向引物F1和反向引物R1以及分子信标探针P1。

所述2×实时NASBA反应液包括如表1所示的组分：

表1 2×实时NASBA反应液

表2 5×酶混合液

所述5×酶混合液包括如下组分：

所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。所述阳性对照为A组轮状病毒体外转录的VP6基因RNA片段。所述阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水。所述空白对照为无核酸酶的超纯水。

本发明的有益效果是：本发明通过提供一种对A组轮状病毒VP6基因具有特异性的一对引物和一条分子信标探针，及包含上述引物对和分子信标探针的试剂盒，来检测离体标本中是否存在A组轮状病毒VP6基因，进而确定离体标本中是否存在A组轮状病毒。本发明所述检测试剂盒具有以下优点：① 等温扩增：避免了普通PCR对温度循环的特殊要求所带来的种种不便；②特异性强：通过精心设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，同步识别A组轮状病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性；③灵敏高效：由于NASBA自身的扩增特点，使得检测灵敏度进一步提高，拷贝数为个位的模板可被检出；④扩增效率高：可以在60－90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增约10⁹倍；⑤实时检测：NASBA扩增结束后马上可以分析数据获得检测结果。

附图说明

图1是实施例四中，A组轮状病毒采用本发明实时NASBA检测试剂盒进行灵敏度分析的结果显示，其中，1：7×10¹¹拷贝；2：7×10¹⁰拷贝；3：7×10⁹拷贝；4：7×10⁸拷贝；5：7×10⁷拷贝；6：7×10⁶拷贝；7：7×10⁵拷贝；8：7×10⁴拷贝；9：7×10³拷贝；10：7×10²拷贝；11：7×10¹拷贝；12：7×10⁰拷贝；13：NTC（阴性对照）；

图2是实施例四中，A组轮状病毒采用实时RT-PCR检测试剂盒进行灵敏度分析的结果显示，其中，1：7×10¹¹拷贝；2：7×10¹⁰拷贝；3：7×10⁹拷贝；4：7×10⁸拷贝；5：7×10⁷拷贝；6：7×10⁶拷贝；7：7×10⁵拷贝；8：7×10⁴拷贝；9：7×10³拷贝；10：7×10²拷贝；11：7×10¹拷贝；12：7×10⁰拷贝；13：NTC（阴性对照）；

图3是实施例四中，A组轮状病毒采用普通RT-PCR技术进行灵敏度分析的结果显示，其中，1：7×10¹¹拷贝；2：7×10¹⁰拷贝；3：7×10⁹拷贝；4：7×10⁸拷贝；5：7×10⁷拷贝；6：7×10⁶拷贝；7：7×10⁵拷贝；8：7×10⁴拷贝；9：7×10³拷贝；10：7×10²拷贝；11：7×10¹拷贝；12：7×10⁰拷贝；13：NTC（阴性对照）；M：100bp DNA Marker；

图4是实施例五中，实时NASBA检测试剂盒检测A组轮状病毒的特异性分析结果显示，其中，1：A组轮状病毒；2：B组轮状病毒；3：GII型诺如病毒；4：星状病毒；5：扎如病毒；6：柯萨奇病毒A16型；7：阴性对照；8：空白对照（H₂O）。

具体实施方式

下面通过具体的A组轮状病毒检测过程来对本发明进行说明。

实施例一：实时NASBA引物和探针的设计

根据血清学反应的不同将轮状病毒分为不同的组（group），每个组内又可分为不同的血清型（serotype）。至今为止已报道有七个轮状病毒组（A组～G组）。A组轮状病毒是婴幼儿重症腹泻的主要病原体。轮状病毒组抗原是由VP6基因决定，而VP7基因和VP4基因分别决定了G血清型和P血清型。因此，选择VP6基因的核酸高度保守序列作为实时NASBA引物和探针设计的靶序列对于检测A组轮状病毒具有代表性。首先从美国NCBI的基因库下载100条A组轮状病毒VP6基因的DNA序列，然后利用分子生物学软件DNAMAN 6.0（Lynnon Corporation，Quebec，Canada）对下载的序列进行同源比对分析，寻找高度同源的保守序列作为引物和探针设计的候选区，同时结合软件Oligo 7.56（Molecular Biology Insights, Inc. USA）进行引物和探针的设计。设计思想是：综合考虑对A组轮状病毒检测的特异性和通用性（在病毒核酸变异位点用简并碱基处理）、引物和探针设计应遵循的普遍性原则（如Tm值、3’末端自由能、GC含量、避免出现内部结构及形成二聚体等），以及反向引物加上T7噬菌体启动子序列后的影响等。对于设计出的引物和探针合成回来后再通过100份A组轮状病毒婴幼儿临床腹泻标本的RT-PCR实验和NASBA实验进行筛选验证，最后本发明优选出如下引物和探针：

正向引物F1：

5’-AACATCATGCWACRGTWGGACT-3’，序列编号为SEQ ID NO：1；

反向引物R1：

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA-3’，序列编号为SEQ ID NO：2；

分子信标探针P1：

5’-FAM-CGATCGTATGCNRTACCRGTTGGACCCGATCG-DABCYL-3’，序列编号为SEQ ID NO：3。

上述反向引物R1的5’端的25个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端22个碱基是与A组轮状病毒VP6基因靶RNA互补的特异性序列，引物3’端的病毒核酸变异位点使用简并碱基；

上述分子信标探针P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的20个碱基是与A组轮状病毒VP6基因互补的特异性序列，其中病毒核酸变异位点使用简并碱基。

上述一对引物和扩增区内部的分子信标探针共识别A组轮状病毒VP6基因的3个不同区域，从而充分保证扩增的特异性，探针涉及的病毒核酸变异位点则采用简并碱基。为避免反向引物过长而影响扩增效率，本发明只使用了25个碱基的T7噬菌体启动子序列，实验结果显示T7 RNA聚合酶对其识别后的转录效率仍非常高。为保证引物和探针的质量，委托大连宝生物工程有限公司以HPLC的纯度标准进行合成。

实施例二：A组轮状病毒实时NASBA检测体系的建立与优化

针对实时NASBA检测体系一些重要的影响因素进行条件的优化。

1. 方法

（1）K⁺浓度：按照表1的反应体系配制2×实时NASBA反应液，固定其它参数，分别调节K⁺的终浓度至40mM、60mM、80mM、100mM、120mM、240mM，以A组轮状病毒VP6基因体外转录RNA为模板进行实时NASBA等温扩增。实验结束后比较不同K⁺浓度对扩增效率和荧光曲线的影响。

（2）dNTP/NTP的浓度组合：按照表1的反应体系配制2×实时NASBA反应液，固定其它参数，分别调节dNTP/NTP的终浓度至0.1mM/1.6mM、0.2mM/1.6mM、0.4mM/1.6mM、0.2mM/0.4mM、0.2mM/0.8mM、0.2mM/2.0mM，以A组轮状病毒VP6基因体外转录RNA为模板进行实时NASBA等温扩增。实验结束后比较不同dNTP/NTP的浓度组合对扩增效率和荧光曲线的影响。

（3）海藻糖浓度：按照表1的反应体系配制2×实时NASBA反应液，固定其它参数，分别调节海藻糖的终浓度至0.05mM、0.10mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM、0.30mM，以A组轮状病毒VP6基因体外转录RNA为模板进行实时NASBA等温扩增。实验结束后比较不同海藻糖浓度对扩增效率和荧光曲线的影响。

（4）甜菜碱浓度：按照表1的反应体系配制2×实时NASBA反应液，固定其它参数，分别调节甜菜碱的终浓度至0.05mM、0.10mM、0.15mM、0.20mM、0.30mM、0.40mM，以A组轮状病毒VP6基因体外转录RNA为模板进行实时NASBA等温扩增。实验结束后比较不同甜菜碱浓度对扩增效率和荧光曲线的影响。

（5）引物和探针的浓度比：按照表1的反应体系配制2×实时NASBA反应液，固定其它参数，分别调节引物和探针的浓度比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，以A组轮状病毒VP6基因体外转录RNA为模板进行实时NASBA等温扩增。实验结束后比较不同引物和探针的浓度比对扩增效率和荧光曲线的影响。

2. 结果：针对每个动力学优化实验，系统比较实时NASBA反应所获得的荧光增长曲线情况，结果发现当K⁺浓度选用120mM、dNTP/NTP的浓度组合选用0.2mM/1.6mM、海藻糖浓度选用0.15mM、甜菜碱浓度选用0.20mM、引物和探针的浓度比为2∶1时，通过90分钟的NASBA等温扩增所得的扩增效果最佳。因此选用上述最优条件确定为试剂盒各组分的组成。

实施例三：检测A组轮状病毒的实时NASBA试剂盒的组成和检测方法

1. 试剂盒的组成（保存于-20℃）

（1）2×实时NASBA反应液：其组分为：120mM Tris-HCl (pH8.0)、240mM KCl、20mM MgCl2、24mM DTT、4mM spermidine、0.4mM dNTP、3.2mM NTP、0.3mM海藻糖、0.4mM甜菜碱、30% DMSO、0.8μM正向引物F1、0.8μM反向引物R1、0.4μM分子信标探针P1；其中正向引物F1是序列编号为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反向引物R1是序列编号为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，分子信标探针P1是序列编号为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

（2）5×酶混合液：其组分为：1.5 U/μL AMV反转录酶、6 U/μL T7 RNA转录酶、0.0625 U/μL RNAase H酶、5 U/μL Ribonuclease Inhibitor、20 mg/mL BSA、8 mM 山梨醇（sorbitol）；

（3）阳性对照：为A组轮状病毒体外转录的VP6基因RNA片段；

（4）阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对照使用；

（5）DEPC水：为DEPC处理的无核酸酶的超纯水，作为空白对照使用。

2. 阳性对照品的制备

随机选择一份A组轮状病毒临床小儿腹泻样本，提取病毒RNA。设计VP6基因全长扩增引物RotaVP6_T7F1和RotaVP6_R1，利用RT-PCR技术扩增获得全长为1360bp的A组轮状病毒VP6基因片段。将获得的RT-PCR产物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司进行T-A克隆构建重组质粒pMD18-RotaV，并进行序列测定。测序结果与GenBank中随机选择的10条A组轮状病毒VP6基因序列进行同源比对分析，保证其同源性达到95%以上。阳性克隆菌株增菌后提取质粒DNA，以其为模板再利用上述引物RotaVP6_T7F1和RotaVP6_R1，通过PCR技术扩增获得1360bp的A组轮状病毒VP6基因片段，然后利用T7 RNA聚合酶进行体外转录获得单链RNA，转录后用DNase I消化去除其中的DNA分子，然后利用德国QIAGEN公司的试剂盒RNeasy MiniElute Cleanup kit进行过柱纯化。利用微量紫外分光光度计测定纯化后RNA的浓度，通过其分子量计算出拷贝数。分装后于-80℃保存，作为试剂盒的阳性对照。

上述引物RotaVP6_T7F1的序列为：

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGAGGTTCTGTATTCATTGTCA-3’；

引物RotaVP6_R1的序列为：

5’-GGTCACATCCTCTCACTACATC-3’。

3. 试剂盒的检测方法如下：

（1）提取样品的RNA，即模板RNA：本发明试剂盒未提供RNA样本提取试剂，用户可根据样本类型选用合适的商品化试剂盒提取病毒核酸，如德国QIAGEN公司的试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit（货号：57704）；

（2）按照以下方法配制反应液：反应体积为20μL；取10μL 2×NASBA反应液加入0.2ml光学PCR反应管，再加入6μL样本RNA（根据浓度适当调整，体积不足部分可用灭菌超纯水代替，使模板总体积为6μL）或阳性对照、阴性对照和空白对照，再取4μL 5×酶混合液加在PCR管管盖的内面，然后轻轻将管盖盖好，避免管盖上含酶的液滴滑入管内；

（3）反应预处理：将上述反应管置于恒温干浴器或普通PCR仪上，先后经65℃和42℃各加热3分钟后，将反应管短暂离心，让管盖上的酶混合液进入管内，轻弹混匀，再次短暂离心；

（4）上机检测：将预处理的反应管放入核酸扩增实时检测分析系统（Nuclisens EasyQ Analyzer (BioMérieux, Boxtel, The Netherlands)）或荧光PCR仪进行等温扩增和实时检测。反应条件是：41～42℃反应90分钟；如果选择在荧光PCR仪上进行扩增，则荧光检测通道选择FAM，根据不同仪器进行相应的设置，若为美国ABI公司的7500型荧光PCR仪，可以在42℃和41℃设置35秒～60秒的循环，每个循环检测一次荧光信号，循环数自定，使等温扩增累计时间达到90分钟即可；

（5）结果判定：根据检测样本的荧光信号值（WT Signal）判断结果。以阴性对照反应终点荧光信号值的1.2倍作为阳性荧光信号的阈值（threshold），阳性荧光曲线穿过阈值的时间点定义为阳性的时间点。首先是质控系统判断，即阳性对照WT Signal必须要大于阈值，空白对照小于阈值，否则系统检测无效。当系统检测是有效时，判断待检样本结果，当待检样本的WT Signal≥阈值时判断为阳性样本，当待检样本的WT Signal＜阈值时判断为阴性样本；

（6）注意事项：实验全过程都应使用无粉手套。为了避免实验中的交叉污染，在加模板的过程中，应首先加空白和阴性对照，其次加待检样本，最后加阳性对照。

实施例四：A组轮状病毒实时NASBA检测试剂盒的灵敏度分析

1．方法：

（1）样本处理：以上述体外转录的A组轮状病毒VP6基因的RNA作为检测用RNA模板，利用微量紫外分光光度计测定纯化后RNA的浓度，通过分子量计算出初始RNA模板的拷贝数为1.4×10¹¹/μL,然后将其依次做10倍梯度稀释至个位拷贝数，共计12个梯度，每个浓度梯度各取5μL作为模板用于扩增，拷贝数即为：7×10¹¹至7×10⁰。

（2）三组平行对照实验：分别选择本发明所述实时NASBA检测试剂盒、实时RT-PCR检测试剂盒（购自深圳市易瑞生物技术有限公司，批号：111204）和普通RT-PCR技术（基础试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR055A）对上述12个梯度稀释样本和1个阴性对照进行扩增检测。

实时NASBA检测：采用实施例三所述检测方法进行试剂配制，各梯度稀释模板5μL，然后将反应管置于普通PCR仪（美国BIORAD公司C1000型PCR仪）上先后于65℃和42℃各加热3分钟后，将反应管短暂离心，让管盖上的酶混合液进入管内，轻弹混匀，再次短暂离心，接着将反应管置于荧光PCR仪（美国ABI公司7500型荧光PCR仪）上进行等温扩增和实时检测，设置反应条件为：（42℃ 25sec，41℃ 35 sec）×90个循环，荧光检测通道选择FAM，每个循环在41℃ 35 sec时采集一次荧光信号，整个等温扩增运行时间约90分钟。反应完成后观察荧光曲线图谱，设置荧光信号域值，分析本发明所述试剂盒所能检测到的模板拷贝数最低限和相应的扩增时间。

实时RT-PCR检测：按照试剂盒说明书进行试剂配制，各梯度稀释模板5μL，实时荧光RT-PCR的反应条件为：42℃ 15min；95℃ 1min；（95℃ 15sec，56℃ 35sec，72℃ 30sec）×40个循环，荧光检测通道选择FAM，每个循环在56℃退火时采集荧光信号，整个荧光RT-PCR运行时间约100分钟。反应完成后观察荧光曲线图谱，分析模板拷贝数最低检测限的Ct值（Cycle threshold，循环域值）。

普通RT-PCR检测：20μL RT-PCR反应体系中含有2×1 Step RT-PCR Buffer 10μL，20μM正向引物和反向引物各0.8μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8μL，各梯度稀释模板5μL。RT-PCR的反应条件为：50℃ 30min；94℃ 3min；（94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec）×35个循环，72℃ 7min。扩增片段大小为146bp。整个RT-PCR上机运行时间约150分钟。RT-PCR反应结束后，取5μL产物在2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳时间为40分钟，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果并拍照。

2．结果：三组平行对照实验的检测结果表明，本发明所述实时NASBA试剂盒可检测到拷贝数为个位（7×10⁰）的转录RNA，而且荧光增长曲线在第30个循环（等温扩增时间约30分钟）时就已达到域值荧光信号并上升进入指数扩增期，结果见图1；实时荧光RT-PCR反应的检测最低限为7×10¹，其Ct值为34，而PCR运行到第34个循环时所需时间约为90分钟，结果见图2；普通RT-PCR反应的检测最低限为7×10²，结果见图3。

从本实施例的灵敏度分析可以发现本发明所述实时NASBA检测试剂盒的灵敏度最高，可检测到个位数，即7拷贝/反应，而实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR分别能检测到十位数（70拷贝/反应）和百位数（700拷贝/反应）。

同时,本实施例也可发现本发明所述实时NASBA检测试剂盒的扩增效率非常高。由于NASBA反应不同于PCR的扩增模式（PCR理想的扩增模式是：Y=X×2ⁿ，其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数，n为扩增次数），它是以每1个cDNA分子最少可转录90个RNA分子的方式进行模板的扩增。因此，从检测所需时间分析，本发明所述实时NASBA检测试剂盒在等温扩增30分钟后就能观察到拷贝数为个位的转录RNA样本的阳性荧光增长曲线达到域值荧光信号，即阳性时间点为30分钟，反应速度远胜于实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR。可见，本发明所述实时NASBA检测试剂盒快速、高效，灵敏度高，能在快速应急检测和微量样本检测中发挥重要作用。

实施例五：A组轮状病毒实时NASBA检测试剂盒的特异性分析

1．样本：选择一组腹泻相关病毒的临床阳性RNA样本，依次编号，分别为1、A组轮状病毒，2、B组轮状病毒，3、GII型诺如病毒，4、星状病毒，5、扎如病毒，6、柯萨奇病毒A16型，7、阴性对照，8、空白对照（H₂O），均为本实验室保存。

2．方法：使用本发明所述实时NASBA检测试剂盒，采用实施例三所述方法对以上8份样本进行检测，观察该试剂盒是否会发生非特异性的检测结果。

3．结果：根据实时NASBA扩增的荧光图谱分析，本发明所述试剂盒仅对1号样本—A组轮状病毒的检测为阳性，其它病毒和阴性对照、空白对照的检测均为阴性，证明该方法有较好的特异性。结果见图4。

实施例六：A组轮状病毒实时NASBA检测试剂盒对临床样品的检测

1. 样本：从本实验室保存的300份婴幼儿腹泻粪便标本中随机选择20份进行检测。该批样本是2009年10月至2010年4月于珠海市妇幼保健院检验科收集并保存于-80℃。

2. 方法：采用双盲法将随机选择的20份标本打乱编号，再提取标本的病毒RNA，分别采用本发明的实时NASBA检测试剂盒和荧光RT-PCR技术进行检测，最后对比检测结果的符合率。

3. 检测步骤：

（1）病毒RNA提取：挑取黄豆大小的粪便标本于800μL生理盐水中振荡混匀，8000rpm离心5分钟，取200μL上清用于RNA提取，采用德国QIAGEN公司的试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit（货号：57704），按试剂盒说明书进行操作；

（2）实时NASBA检测：按实施例三的方法进行操作；

（3）荧光RT-PCR检测：采用深圳市易瑞生物技术有限公司的试剂盒（批号：111204）进行操作。

4. 检测结果：利用本发明提供的实时NASBA检测试剂盒检出13份A组轮状病毒阳性样本，检出率为65%，与实时RT-PCR的检测结果完全一致，两种方法的符合率为100%，检测结果见表3。

表3 20份临床腹泻样本检测结果

本发明可应用于临床和口岸的常规检测和疾病防控领域。

需要注意的是，上述仅以优选实施例对本发明进行了说明，并不能就此局限本发明的权利范围，因此在不脱离本发明思想的情况下，凡运用本发明说明书和附图部分的内容所进行的等效变化，均理同包含在本发明的权利要求范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海国际旅行卫生保健中心

<120> 一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)…(22)

<223> 正向引物F1

<400> 1

aacatcatgc wacrgtwgga ct 22

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)…(47)

<223> 反向引物R1

<400> 2

aattctaata cgactcacta tagggcagat ggttagyytg gtcctya 47

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)…（12）…(32)

<223> 分子信标探针P1

<400> 3

cgatcgtatg cnrtaccrgt tggacccgat cg 32

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)…(51)

<223> 根据PCR反应要求设计，用于制备阳性对照物的正链引物RotaVP6_T7F1

<400> 4

aattctaata cgactcacta tagggagatg gaggttctgt attcattgtc a 51

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)…(22)

<223> 根据PCR反应要求设计，用于制备阳性对照物的负链引物RotaVP6_R1

<400> 5

ggtcacatcc tctcactaca tc 22

Claims

1.一种A组轮状病毒检测用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的碱基序列表示如下：

正向引物F1：5’-AACATCATGCWACRGTWGGACT-3’；

反向引物R1：

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA-3’。

2.根据权利要求1所述的一种A组轮状病毒检测用引物，其特征在于：所述反向引物R1的5’端的25个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端22个碱基是与A组轮状病毒VP6基因靶RNA互补的特异性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸变异位点使用简并碱基。

3.一条A组轮状病毒检测用分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列表示如下：

分子信标探针P1：

5’-FAM-CGATCGTATGCNRTACCRGTTGGACCCGATCG-DABCYL-3’，

所述分子信标探针P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。

4.根据权利要求3所述的一条A组轮状病毒检测用分子信标探针，其特征在于：所述分子信标探针P1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的20个碱基是与A组轮状病毒VP6基因互补的特异性序列，其中病毒核酸变异位点使用简并碱基。

5.一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒至少包括2×实时NASBA反应液和5×酶混合液，所述2×实时NASBA反应液包含有如权利要求1所述的正向引物F1和反向引物R1以及如权利要求3所述的分子信标探针P1。

6.根据权利要求5所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述2×实时NASBA反应液包括如下组分：

。

7.根据权利要求5所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述5×酶混合液包括如下组分：

。

8.根据权利要求5所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。

9.根据权利要求8所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为A组轮状病毒体外转录的VP6基因RNA片段。

10.根据权利要求8所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。