CN110157679B - 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向CD38的嵌合抗原受体CAR‑CD38和/或靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR‑BCMA，对肿瘤细胞的靶向识别性广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，扩大了其广谱杀伤性。本发明还提供了该靶向性T淋巴细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法 和应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种浆细胞不正常增生，致使 侵犯骨髓的一种恶性肿瘤。为发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞病，常伴有多发 性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害及细菌性感染。近年来发病率有增 高及发病年龄有提前趋势。
CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经 过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤， 以达到清除恶性肿瘤细胞的目的。虽然CAR-T技术在白血病、骨髓瘤、淋巴瘤 等血液系统肿瘤中取得了显著的疗效，但是在复杂的肿瘤微环境中(例如多种 肿瘤抗原同时出现)，其对肿瘤细胞的识别、杀伤能力大大降低，限制了其临床 应用。因此，有必要提供对肿瘤细胞靶向性较强的CAR-T技术，以用于白血病 等恶性肿瘤的治疗中。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种针对多发性骨髓瘤的靶向性T淋巴细胞及其制 备方法和应用。该T淋巴细胞可靶向至肿瘤细胞的两个肿瘤靶点，对肿瘤细胞 的靶向性高、识别性较广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，扩大了该T细 胞的广谱杀伤性。
第一方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向CD38的嵌合抗 原受体CAR-CD38和/或靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，其中，所述CA R-CD38包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD38的单链抗体、胞外铰链区、 跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺 次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸 序列；其中，所述靶向CD38的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述靶向性T淋巴细胞，可以为带CAR-CD38和CAR-BCMA的双靶 点嵌合抗原受体T细胞(即，靶向CD38和BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞)， 也可以为带CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-BCMA的嵌合抗原受体T 细胞的混合，也可以为带CAR-CD38和CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细 胞、带CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞 的混合。
此时，所述靶向性T淋巴细胞，既可以识别表面表达有CD38抗原蛋白的 肿瘤细胞，也可以识别表面表达有BCMA抗原蛋白的肿瘤细胞，当然对同时有 CD38抗原蛋白和BCMA抗原蛋白的肿瘤细胞的识别性也较好，避免肿瘤细胞 出现逃逸。
其中，当所述靶向性T淋巴细胞为带CAR-CD38和CAR-BCMA的双靶点CA R-T时，嵌合抗原受体CAR-CD38和CAR-BCMA的分布位置不作限定，可以是交 替分布(例如ABAB…，AABABB…)或依次分布(例如AAAA…BBB…)，但 两者之间并无共价连接，此时它们相应的CD38单链抗体和BCMA单链抗体之间 也并无共价连接，这样可使它们保持较好的识别能力。
上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CD38的单链抗体或 所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸 序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨 基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区 的氨基酸序列的氨基端相连。
上述提及的CD38是一种单链Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表达于骨髓瘤、淋巴瘤 等，在恶性浆细胞中表达量较高。而BCMA是肿瘤坏死因子受体TNF超家族的成 员，广泛存在于多发性骨髓瘤(MM)细胞及血液系统B系恶性肿瘤表面，在绝 大多数正常细胞及器官中都不表达。因此，选用CD38、BCMA作为多发性骨髓 瘤的靶点，能有效避免多发性骨髓瘤细胞出现免疫逃逸，尤其是避免多发性骨 髓瘤细胞出现CD38免疫逃逸的现象。
可选地，所述靶向CD38的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示 的核苷酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4 所示的核苷酸序列。本发明所述靶向CD38的单链抗体保留有对CD38抗原的亲和 活性，能够高效识别表面表达有CD38抗原的肿瘤细胞。类似地，所述靶向BCMA 的单链抗体也保留有对BCMA抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有BCMA 抗原的肿瘤细胞。
可选地，所述靶向CD38的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并 碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:3所示 的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:3具有碱基简并性质的核苷酸 序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。所述靶向BCMA 的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。
本发明中，所述CAR-CD38中的胞外铰链区用于促进所述靶向CD38的单链 抗体与肿瘤细胞上的CD38结合；类似地，所述CAR-BCMA中的胞外铰链区用于 促进所述靶向BCMA的单链抗体与肿瘤细胞上的BCMA结合。
可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、C D5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸 序列。进一步地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核 苷酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:9 所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范 围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序 列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。
本发明中，所述CAR-CD38中的跨膜区用于固定所述靶向CD38的嵌合抗原 受体CAR-CD38；类似地，所述CAR-BCMA中的跨膜区用于固定所述靶向BCM A的嵌合抗原受体CAR-BCMA。
可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨 膜区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基 酸序列。进一步地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：12所示的 核苷酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，保护 范围还应该保护与SEQ ID NO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸 序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:11。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存 时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、C D27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRS F19L信号区中的一种或多种的组合。
在本发明一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的4 -1BB信号区和CD3ζ信号区。相应地，所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’ 端顺次连接的4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
在本发明另一实施方式中，所述胞内信号区还可以为从氨基端到羧基端顺 次连接的CD27信号区和CD3ζ信号区。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：13所示的氨基 酸序列。进一步地，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的 核苷酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，保 护范围还应该保护与SEQ ID NO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷 酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:13。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基 酸序列。进一步地，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的 核苷酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列，保 护范围还应该保护与SEQ ID NO:16具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷 酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。
需要说明的是，本发明中，所述CAR-CD38中的胞外铰链区、跨膜区和胞内 信号区的氨基酸序列，与所述CAR-BCMA中对应的胞外铰链区、跨膜区和胞内 信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。
在本发明一实施方式中，所述CAR-CD38的氨基酸序列包括如SEQ ID NO： 5所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-CD38的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序 列。
可选地，所述CAR-CD38的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:5 所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，保护范 围还应该保护与SEQ ID NO:17具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序 列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:5。
在本发明一实施方式中，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸 序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6 所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列，保护范 围还应该保护与SEQ ID NO:18具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序 列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:6。
本发明第一方面提供的靶向性T淋巴细胞，包括靶向CD38的嵌合抗原受 体CAR-CD38和/或靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，能识别两个肿瘤 靶点，增强了对肿瘤细胞的识别，避免肿瘤细胞逃逸。当CAR-CD38和/或CA R-BCMA与肿瘤细胞上相应的抗原蛋白结合后，所述靶向性T淋巴细胞的胞内 信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性地杀伤肿瘤细 胞，尤其是表达CD38和/或BCMA的肿瘤细胞，扩大了该T细胞的广谱杀伤性。 此外，CAR-CD38和CAR-BCMA还能较好地破坏肿瘤微环境，相互增强作用， 使靶向肿瘤的靶向性T淋巴细胞更好地发挥功能。由于所述CD38和BCMA的 单链抗体为人源化单链抗体，这使得该靶向性T细胞避免引起人机体的免疫反 应，具有持久的在体维持能力，如活性和杀伤力。
本发明所述靶向性T淋巴细胞可以高效识别并杀伤表达有CD38和/或BCMA 的肿瘤细胞，例如多发性骨髓瘤细胞，如RPMI 8226细胞和H929细胞。
第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括如第一方面所述的靶向 性T淋巴细胞中所述CAR-CD38和/或CAR-BCMA的编码基因。
可选地，当所述重组病毒载体含有CAR-CD38的编码基因和CAR-BCMA的 编码基因时，在所述重组病毒载体上所述CAR-CD38的编码基因和所述CAR-BC MA的编码基因之间，还包括一特殊序列，该特殊序列用于使所述CAR-CD38编 码基因和所述CAR-BCMA的编码基因在转录翻译后可以得到两个独立的蛋白C AR-CD38和CAR-BCMA。在采用这样的重组病毒载体转染CD3阳性T淋巴细胞 后，所得的靶向性T淋巴细胞为带CAR-CD38和CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受 体T细胞。进一步可选地，所述特殊序列可以是RBS序列、IRES序列、T2A序列 或其他蛋白酶序列等。
可选地，所述重组病毒载体带有所述CAR-CD38的编码基因，或者带有所述CAR-BCMA的编码基因。优选采用CAR-CD38编码基因的重组病毒载体与带CA R-BCMA编码基因的重组病毒载体分开或同时地共同感染T淋巴细胞，可得到如 本发明第一方面所述的靶向性T淋巴细胞，且感染效率较高，所得靶向性T淋巴 细胞能较充分地表达CAR-CD38和/或CAR-BCMA。
可选地，所述CAR-CD38的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序 列。
优选地，所述CAR-CD38的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序 列。如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列 相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地 指导所述嵌合抗原受体CAR-CD38表达到细胞表面。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸 序列。
优选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸 序列。如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序 列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好 地指导所述嵌合抗原受体CAR-BCMA达到细胞表面。
可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或 逆转录病毒载体。进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。在本发明第四 方面提供的制备方法的步骤(1)-(3)示出了所述重组病毒载体的制备过程。
本发明第二方面提供的所述重组病毒载体，具有较高的感染效率以及转录 效率，其中的CAR-CD38和/或CAR-BCMA的编码基因片段能通过基因重组插入 宿主基因组，得到上述靶向性T淋巴细胞，使其持续稳定地发挥靶向、杀伤效力。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所 述的重组慢病毒载体。
本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于组装如第二方面所述的重组病毒 载体，使其具有感染性。
可选地，所述宿主细胞包括但不限于HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞和COS7细胞。
第四方面，本发明提供了一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括：
(1)分别提供靶向CD38的嵌合抗原受体CAR-CD38的编码基因和靶向 BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的编码基因；
所述CAR-CD38的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基 因、靶向CD38的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码 基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’ 端顺次连接信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链 区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向CD38的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的 氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括 如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD38的编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因分别插 入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD38重组质粒和 pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-CD38重组质粒和所述 pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒进行包装，得到带CAR-CD38编码基因的第一 重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染 CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。
以CAR-CD38的编码基因为例，上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所 述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向CD38的单链抗体的编码基因的5’端 相连，所述靶向CD38的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区编码基因 的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端 相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-CD38或 CAR-BCMA表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切 割。而CAR-CD38的编码基因中信号肽与所述CAR-BCMA的编码基因中信号肽 的氨基酸序列可以相同，也可以不同，也可以是它们的信号肽的氨基酸序列相 同，而核苷酸序列不同。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:21所 示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，保护范围 还应该保护与SEQID NO:22具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列 对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:21。
对于所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因 序列，可参见本发明第一方面所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-CD38的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序 列所对应的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-CD38的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序 列。当然，所述CAR-CD38的编码基因也可包括与SEQ ID NO：19所示序列具有 碱基简并性质的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序 列所对应的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸 序列。当然，所述CAR-BCMA的编码基因也可包括与SEQ ID NO：20所示序列 具有碱基简并性质的核苷酸序列。
以CAR-CD38为例，SEQ ID NO：19与SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列 相比，多了连接肽的编码基因，但在嵌合抗原受体CAR-CD38表达到T细胞表面 时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的嵌合抗 原受体CAR-CD38的氨基酸序列(SEQID NO：5)中并未带有如SEQ ID NO： 21所示的氨基酸序列。CAR-BCMA的情况与之类似。
以CAR-CD38为例，所述CAR-CD38的编码基因序列插入到pWPXLD载 体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(E F1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD38的编码基因序列插入到pWP XLD载体时，所述CAR-CD38的基因序列的5’端还可加入起始密码子(如AT G)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入终止密码子与pW PXLD载体中EcoR1酶切位点相连。CAR-BCMA的情况与之相同。
可选地，步骤(3)中，所述“分别对所述pWPXLD-CAR-CD38重组质粒 和所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒进行包装，得到带CAR-CD38编码基因 的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒”，包括：
将所述pWPXLD-CAR-CD38重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细 胞，得到所述第一重组慢病毒；将所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒与包膜 质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第二重组慢病毒。
采用本发明所述的方式制备重组质粒及包装病毒，其中，所述 pWPXLD-CAR-CD38重组质粒和pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒上， CAR-CD38和CAR-BCMA的编码基因经过了密码子优化，且分子量适宜，重组 慢病毒的包装效率高，同时通过宿主细胞制得的病毒的浓度较高。相应地，采 用第一重组慢病毒和第二重组慢病毒来联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，这两 种重组慢病毒的用量较低，可降低实验成本。
本发明一实施方式中，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2， 所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病 毒糖蛋白衣壳可以协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如， 作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没 有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使 用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来 自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单 纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为 嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为 麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以 用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、 293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、 u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080 细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7 细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还 有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋 白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法， 即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol 基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质 粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人 细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于 同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也 有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细 胞中分离获得。所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐 带血和胎盘血等。进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个 月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体地，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：先将外周血单个核细 胞按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，并孵育一段时间后，放入磁铁进行筛 选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T 淋巴细胞。
其中，步骤(4)中，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒分开或 同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，包括：
先采用所述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再采用所述第二 重组慢病毒进行转染；或先采用所述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞 后，再采用所述第一重组慢病毒进行转染；或采用所述第一重组慢病毒和所述 第二重组慢病毒同时地转染CD3阳性T淋巴细胞。这里“联合转染”是指针对 同一组细胞进行。
进一步地，步骤(4)中，所采用的第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病 毒滴度之比是1：(0.5-2)。
本发明中，制备得到的所述靶向性T淋巴细胞包括带所述CAR-CD38和所述 CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T 细胞和带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞中的至少一种。可选地，所述靶 向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD38和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T 细胞，或者为带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌 合抗原受体T细胞的混合，或者带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带所 述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞中的一种或两种与所述双靶点嵌合抗原受 体T细胞的混合。
优选地，所述靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD38和所述CAR-BCMA的双 靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带 所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD38和所述 CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T 细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合。
此时，靶向性T淋巴细胞的表面具有两个独立的、未共价结合的嵌合抗原受 体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能 同时、高效地识别肿瘤细胞上的CD38和BCMA靶标。所述靶向性T淋巴细胞对 表达CD38和BCMA中一种或两种的肿瘤细胞均能识别和杀伤，可避免肿瘤细胞 出现靶点逃逸，提高了其靶向识别的广度和强度，以及杀伤广谱性，在复杂的 肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。
在本发明另一实施方式中，当所需靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD38的 嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合时，也可 以采用以下方式制得：采用上述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，得到 带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞；采用上述第二重组慢病毒转染CD3阳 性T淋巴细胞，得到带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞；然后将这两种嵌 合抗原受体T细胞进行混合。
本发明第四方面提供的靶向性T淋巴细胞的制备方法中，采用带CAR-CD38 编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒分 别或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，可使得制得的靶向性T淋巴细胞上 嵌合抗原受体CAR-CD38和/或CAR-BCMA的表达效率更高，以具有较好的肿 瘤识别、杀伤能力。
第五方面，本发明提供了一种如本发明第一方面所述的靶向性T淋巴细胞、 如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第三方面所述的宿主细胞或 如本发明第四方面所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和/或治 疗恶性肿瘤的药物中的应用。
特别地，适用于表达CD38和/或BCMA的恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤的预 防、诊断和治疗。
所述应用可以具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所 述的靶向性T淋巴细胞或采用如第二方面所述的重组病毒载体转染得到的靶向 性T淋巴细胞或采用如第四方面所述的制备方法所制得的靶向性T淋巴细胞，如 本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞中的 一种或多种。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而 易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-CD38重组质粒的质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒的质粒图谱。
图3为本发明实施例提供的靶向性T淋巴细胞治疗肿瘤小鼠的效果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这 些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向CD38的嵌合抗原受体CAR-CD38的基因序列
分别制备信号肽、靶向CD38的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB 信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-CD38中，信号肽的编码基因如SEQ ID NO：22所示，靶向CD38的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：3所示，CD8α 铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：12所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：14所示，所述CD3ζ 信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向CD38的单链抗体、CD8α铰链区、CD8 跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起， 得到CAR-CD38的编码基因，该CAR-CD38的编码基因如SEQ ID NO：19所示。
(2)制备靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的基因序列
分别制备信号肽、靶向BCMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB 信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-BCMA所用的信号肽的编码基因如 SEQ ID NO：22所示，靶向BCMA的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：4所示， CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：12所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQID NO：14所示，所述CD3ζ 信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向BCMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8 跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起， 得到CAR-BCMA的编码基因，该CAR-BCMA的编码基因如SEQ ID NO：20所示。
(3)构建pWPXLd-CAR-CD38重组质粒和pWPXLd-CAR-BCMA重组质 粒
将CAR-CD38的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切 位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD38 的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD38的编码基因的5’端可加入 起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入 终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物 凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的 pWPXLd-CAR-CD38重组质粒。
将CAR-BCMA的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切 位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。其中当所述 CAR-BCMA的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-BCMA的编码基 因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相 连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相 连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。 经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如 图2所示的pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒。
(4)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三 者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过 滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤， 与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速 离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离 心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻 反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光 法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱， 得到带CAR-CD38的第一重组慢病毒。
将pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三 者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过 滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤， 与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速 离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离 心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻 反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光 法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱， 得到带CAR-BCMA的第二重组慢病毒。
(5)靶向性T淋巴细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌 症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分 离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞 的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的 细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，同时加入与CD3 阳性细胞数相应的病毒滴度的带CAR-CD38的第一重组慢病毒和带 CAR-BCMA的第二重组慢病毒进行共同培养，其中第一重组慢病毒与第二重组 慢病毒的用量(滴度)之比是1：1。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种， 培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶 向性T淋巴细胞，即CAR-CD38单阳性T淋巴细胞和CAR-BCMA单阳性T淋 巴细胞，CAR-CD38/CAR-BCMA双阳性T淋巴细胞细胞，并将其保存在回输专 用的细胞冻存液中。
效果实施例
效果实施例一：评估本发明靶向性T淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明实施例一制得的靶向性T淋巴细胞(实验组)与未经制备的T 淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–CD38的T细胞(CD38CAR–T单 独组)以及具有单独的CAR–BCMA的T细胞(BCMA CAR–T单独组)进行比 较，在体外将上述四组效应细胞与靶细胞(H929细胞)按数量比为1:10、1:3、 1:1、3:1和10:1的比例，在37℃、5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18 小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况。结果发现，经过本发明所述的方法制备的靶向性T淋巴细胞的肿瘤杀伤力远远高于其他对照组，这说 明经本发明方法制备的靶向性T淋巴细胞具有超强的肿瘤杀伤能力。
效果实施例二，评估本发明靶向性T淋巴细胞对小鼠体内肿瘤细胞杀伤情 况
将经过本发明方法制备的靶向性T淋巴细胞(实验组)与未经制备的T淋 巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–CD38的T细胞(CD38CAR–T单独 组)以及具有单独的CAR–BCMA的T细胞(BCMA CAR–T单独组)，在小鼠 多发性骨髓瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个细胞(n＝9)，得到小鼠的 生存曲线。从小鼠的生存曲线可知，本发明提供的靶向性T淋巴细胞在注入小 鼠体内35天后，仍能使小鼠存活率能稳定在80％左右，远远超过阴性对照组和 以上两个单独组。这表明提供的靶向性T淋巴细胞能够更好地保护小鼠免于因多发性骨髓瘤导致的死亡。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
245 250
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala
180 185 190
Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggaggcgga ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 360
ggatctgggg gaggcggaag cgaggtgcag ctgttggagt ctgggggagg cttggtacag 420
cctggggggt ccctgagact ctcatgtgca gtctctggat tcacctttaa cagctttgcc 480
atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc tattagtggt 540
agtggtggtg gcacatacta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac 600
aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgta 660
tatttctgtg cgaaagataa gattctctgg ttcggggagc ccgtctttga ctactggggc 720
cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc tcc 753
<210> 4
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 60
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 360
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 420
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 480
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 540
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 600
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 660
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 720
ggcacatccg tgaccgtgag cagc 744
<210> 5
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
260 265 270
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
275 280 285
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
290 295 300
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
305 310 315 320
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
325 330 335
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
340 345 350
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
355 360 365
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
385 390 395 400
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
405 410 415
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
420 425 430
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
435 440 445
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
450 455 460
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 6
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala
180 185 190
Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 7
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
100 105 110
Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
275 280 285
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
370 375 380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn
385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
405 410 415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425 430
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
435 440 445
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
450 455 460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 8
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala
20 25 30
Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro
145 150 155 160
Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro
180 185 190
Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu
195 200 205
Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu
210 215 220
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 17
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggaggcgga ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 360
ggatctgggg gaggcggaag cgaggtgcag ctgttggagt ctgggggagg cttggtacag 420
cctggggggt ccctgagact ctcatgtgca gtctctggat tcacctttaa cagctttgcc 480
atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc tattagtggt 540
agtggtggtg gcacatacta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac 600
aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgta 660
tatttctgtg cgaaagataa gattctctgg ttcggggagc ccgtctttga ctactggggc 720
cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 780
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 840
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 900
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 960
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1020
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1080
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 1140
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1200
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1260
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1320
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1380
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1422
<210> 18
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 60
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 360
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 420
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 480
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 540
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 600
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 660
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 720
ggcacatccg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 780
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 840
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 900
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 960
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1020
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1080
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1140
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1413
<210> 19
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 360
gggaccaagg tggaaatcaa aggaggcgga ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 420
ggatctgggg gaggcggaag cgaggtgcag ctgttggagt ctgggggagg cttggtacag 480
cctggggggt ccctgagact ctcatgtgca gtctctggat tcacctttaa cagctttgcc 540
atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc tattagtggt 600
agtggtggtg gcacatacta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac 660
aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgta 720
tatttctgtg cgaaagataa gattctctgg ttcggggagc ccgtctttga ctactggggc 780
cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 900
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 960
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1020
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1080
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1140
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac 1200
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1260
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1320
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1380
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1440
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1482
<210> 20
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 120
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 180
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 240
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 300
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 360
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 420
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 480
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 540
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 600
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 660
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 720
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 780
ggcacatccg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1473
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (9)

1.一种靶向性T淋巴细胞，其特征在于，包括靶向CD38的嵌合抗原受体CAR-CD38和靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，其中，所述CAR-CD38包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD38的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；
其中，所述靶向CD38的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向性T淋巴细胞，其特征在于，所述CAR-CD38的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
3.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-2任一项所述的靶向性T淋巴细胞中所述CAR-CD38和CAR-BCMA的编码基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的重组病毒载体。
5.一种靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)分别提供靶向CD38的嵌合抗原受体CAR-CD38的编码基因和靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的编码基因；
所述CAR-CD38的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CD38的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向CD38的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD38的编码基因和所述CAR-BCMA的编码基因分别插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD38重组质粒和pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLD-CAR-CD38重组质粒和所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒进行包装，得到带CAR-CD38编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-BCMA编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性T淋巴细胞。
6.如权利要求5所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-CD38的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
7.如权利要求5所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所采用的第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。
8.如权利要求5所述的靶向性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向性T淋巴细胞为带所述CAR-CD38和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD38和所述CAR-BCMA的双靶点嵌合抗原受体T细胞、带所述CAR-CD38的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-BCMA的嵌合抗原受体T细胞的混合。
9.如权利要求3所述的重组病毒载体、如权利要求4所述的宿主细胞、如权利要求1-2任一项所述的靶向性T淋巴细胞或如权利要求5-8任一项所述的制备方法制得的靶向性T淋巴细胞在制备诊断和/或治疗表达CD38和/或BCMA抗原蛋白的恶性肿瘤的药物中的应用。
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