WO2019132418A1 - 투석 여과 방법 - Google Patents

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WO2019132418A1
WO2019132418A1 PCT/KR2018/016343 KR2018016343W WO2019132418A1 WO 2019132418 A1 WO2019132418 A1 WO 2019132418A1 KR 2018016343 W KR2018016343 W KR 2018016343W WO 2019132418 A1 WO2019132418 A1 WO 2019132418A1
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WO
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buffer
concentration
protein
dialysis filtration
sodium
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Application number
PCT/KR2018/016343
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English (en)
French (fr)
Inventor
홍민성
전규종
이동우
권병오
Original Assignee
㈜셀트리온
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Definitions

  • the present invention relates to a dialysis filtration method of a solution containing a protein, a method for producing a protein preparation using the solution, and a protein preparation using the same.
  • Subcutaneous administration products are more difficult to develop than intravenous administration products. The reason is that when a large amount of protein medicine is injected into the subcutaneous tissue, the subcutaneous tissue is pressurized to cause pain. Therefore, to alleviate this pain, the protein concentration should be increased from less than 2 times to more than 5 times that of conventional intravenous doses.
  • the most frequently used method for increasing the protein concentration of a protein drug and converting it into a buffer of the desired formulation is the Tangential Flow Filtration (TFF) method.
  • TFF Tangential Flow Filtration
  • the tangential flow filtration method is widely used because it can convert and concentrate a protein into a buffer of a desired formulation using only a relatively simple mechanical device and a membrane.
  • a problem to be solved by the present invention is to provide a dialysis filtration method for buffer conversion of a solution containing a protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a protein preparation using the above method.
  • Another object to be solved by the present invention is to provide a protein preparation prepared using the above method.
  • a method for preparing a protein-containing sample comprising the steps of: a) performing a primary dialysis filtration with a target buffer to be formulated containing a salt in a protein- And b) performing a second dialysis filtration with water or a dilution solution of 200 mM or less.
  • the dialysis filtration method may be a tangential flow filtration method.
  • the protein is not particularly limited, but may be a protein having an isoelectric point (pI) of 8 or more.
  • the pH after step a) is 1.0 or more lower than the antibody isoelectric point (pI).
  • the protein-containing sample may have an electrical conductivity of 0.1 to 100 ms / cm.
  • the salt of step a) may comprise a compound comprising a halogen element and a Group 1 or Group 2 metal element.
  • salt is selected from the group consisting of NaCl, NaF, NaBr, KF, KCl, KBr, MgF 2, MgCl 2, MgBr 2, CaF 2, CaCl 2 and CaBr 2 It can be one.
  • the salt may be treated at a concentration of 10 to 200 mM.
  • the target buffer is selected from the group consisting of citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, phosphoric acid, sodium phosphate, sulfuric acid, sodium sulfate, hydrochloric acid, potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate, sodium hydroxide, (3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propane sulfonate), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) May be any one or more of the buffer solutions selected from the above.
  • water in step b), may be purified water having an electrical conductivity of 1 ms / cm or less.
  • the diluting solution of 200 mM or less in step b) is selected from the group consisting of citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, phosphoric acid, sodium phosphate, sulfuric acid, sodium sulfate, hydrochloric acid, potassium chloride, potassium sulfate, (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid and CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] - 1-propane sulfonate).
  • step a) or step b) may be carried out one or more times as required.
  • the method may further comprise concentrating the protein concentration of the protein-containing sample to 50 mg / ml or more.
  • the present invention can proceed quickly and effectively in establishing a buffer conversion and concentration process of a sample containing a protein.
  • FIG. 1 shows a buffer conversion step and a concentration step of a sample containing a protein using a tangential flow filtration method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing pH fluctuations during the secondary buffer conversion of Examples 1 to 3 and Comparative Example 3.
  • FIG. 2 is a graph showing pH fluctuations during the secondary buffer conversion of Examples 1 to 3 and Comparative Example 3.
  • the present invention can proceed quickly and effectively in establishing a buffer conversion and concentration process of a sample containing a protein.
  • Objective buffer &quot refers to a buffer that is ultimately desired to be formulated. For example, if the buffer of the final formulation is sodium acetate, this is the destination buffer.
  • Dilute solution &quot means a solution of 200 mM or less that can be used as a buffer.
  • the diluting solution is used for diluting the objective buffer.
  • Dialysis filtration refers to a method in which colloidal particles or molecules, which are difficult to separate by ordinary filtration, are filtered by dialysis using a membrane, a sulfate, a bladder, a colodion, or the like.
  • Tangential flow filtration &quot means a buffer conversion and concentration method using " tangential flow filtration " and " membrane ".
  • "Tangential flow filtration” is one of several filter methods, in which the fluid flow direction and the pressure on the membrane are tangential.
  • &Quot; Membrane &quot is the material necessary for filtration using tangential flow filtration. Depending on the principle of size exclusion, materials larger than the size of the membrane pores are not filtered and have the ability to filter materials smaller than the size of the membrane pores.
  • Membranes &quot are commercially available under a variety of names from a number of companies, including: Delta Regenerated Cellulose, Omega PES, Cadence Single Use Membrane (marketed by Pall corporation, Fort Washington, NY), Biomax PB, Ultracel PLC Ultracel PL membrane, Pellicon (marketed by Merck, Darmstadt, Germany), Polyethersulfone Ultrafilter, Sartocon, Hydrosart (available from Sartorius, Göttingen, Germany).
  • Membrane materials usable in the tangential flow filtration method of the present invention can include, but are not limited to, all commercially available membrane materials.
  • Pellicon is used as a tangential flow filtration membrane.
  • Antibody &quot refers to an immunoglobulin molecule consisting of four polypeptide chains in which two heavy chains and two light chains are linked to each other by disulfide bonds. Other naturally occurring antibodies with altered structures, such as camelid antibodies, are also included in this definition.
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region and a heavy chain constant region.
  • the heavy chain constant region consists of three domains (CH1, CH2 and CH3).
  • Each light chain consists of a light chain variable region and a light chain constant region.
  • the light chain constant region consists of one domain (CL).
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region can be further subdivided into a hypervariable region called the complementarity determining region (CDR), which is disposed with a more conserved region called the framework region (FR).
  • CDR complementarity determining region
  • FR framework region
  • Each heavy chain variable region and light chain variable region consists of three CDRs and four FRs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • EGF Epidermal growth factor
  • EGFR receptor epidermal growth factor receptor
  • human EGF is composed of 53 amino acids (Exp Cell Res., 284 1): 2-13, 2003).
  • EGF has also been reported to play an important role in the regeneration of skin and hair (J Dermatol Sci., 72 (2): 81-86, 2013).
  • the isoelectric point of EGF has several types of pI 4.0 - pI 4.55 (The Journal of Biological Chemistry, 259 (5): 3047-3052, 1984).
  • Halogen element refers to the five elements in the periodic table, F (fluorine), Cl (chlorine), Br (bromine), I (iodine), and At (astatine).
  • Group 1 metal element &quot refers to a chemical element belonging to the first group of the periodic table, H (hydrogen), Li (lithium), Na (sodium), K (potassium), Rb (rubidium), Cs ).
  • Group 2 metal element refers to the elements of the second group of elements in the periodic table Be (beryllium), Mg (magnesium), Ca (calcium), Sr (strontium), Ba (barium) and Ra (radium).
  • a method for preparing a protein-containing sample comprising the steps of: a) performing a primary dialysis filtration with a target buffer to be formulated containing a salt in a protein-containing sample; And b) performing a second dialysis filtration with water or a dilution solution of 200 mM or less.
  • the water refers to a solution having an electrical conductivity of 1 ms / cm or less with purified water using reverse osmosis or distillation to remove contaminants from pure water.
  • the diluted solution refers to a dilute solution of a solution usable as a buffer, more preferably a diluted target buffer.
  • the buffer conversion method may be a dialysis, and may be a tangential flow filtration method.
  • the tangential flow filtration method can use a membrane, and any commercially available membrane material can be used.
  • a pellicon membrane is used as the membrane.
  • the protein may be used without limitation, such as EGF. More preferably, the protein may have an isoelectric point (pI) of 8 or more. In the case of a protein having an isoelectric point of less than 6, the protein may be unsuitable for the dialysis filtration method of the present invention because the protein is negatively charged in the buffer of pH 5-6 have. More preferably, the protein may be an antibody, specifically, but not exclusively, trastuzumab or infliximab.
  • the pH after step a) is 1.0 or more lower than the antibody isoelectric point (pI). In one embodiment of the invention, the pH after step a) may be at least 1.0, at least 1.5, at least 2.0, at least 2.5, at least 3.0, at least 3.5, at least 4.0, at least 4.5 lower than the antibody isoelectric point (pI).
  • Example 1 of the present invention the pH prior to step a) was 6.0, but the pH after step a) was found to be 4.5 (see example 1) and the pH after step a) was lower than the antibody isoelectric point 1.0 or more.
  • the protein-containing sample may have an electrical conductivity of 0.1 to 100 ms / cm.
  • the salt of step a) may be a compound containing any one selected from the group consisting of a halogen element, a Group 1 metal element and a Group 2 metal element.
  • salt is selected from the group consisting of NaCl, NaF, NaBr, KF, KCl, KBr, MgF 2, MgCl 2, MgBr 2, CaF 2, CaCl 2 and CaBr 2 But is not limited thereto. More preferably, the salt may be NaCl, KCl, MgCl 2 or CaCl 2, may be more preferably MgCl 2 or CaCl 2.
  • the salt has a concentration of 10 to 200 mM, a concentration of 20 to 180 mM, a concentration of 30 to 160 mM, a concentration of 40 to 140 mM, a concentration of 50 to 120 mM, a concentration of 60 to 110 mM , A concentration of 70 to 110 mM, and a concentration of 80 to 110 mM.
  • concentration of 10 to 200 mM a concentration of 10 to 200 mM
  • concentration of 20 to 180 mM a concentration of 30 to 160 mM
  • a concentration of 40 to 140 mM a concentration of 50 to 120 mM
  • a concentration of 60 to 110 mM a concentration of 60 to 110 mM
  • a concentration of 70 to 110 mM a concentration of 80 to 110 mM.
  • the target buffer is selected from the group consisting of citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, phosphoric acid, sodium phosphate, sulfuric acid, sodium sulfate, hydrochloric acid, potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate, sodium hydroxide, (3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propane sulfonate), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) But it is not limited thereto.
  • the target buffer which can be used for producing the protein preparation may be any one or more selected from the group consisting of citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, phosphoric acid and sodium phosphate.
  • the target buffer was set to sodium acetate, and buffer conversion was attempted with sodium acetate buffer in sodium phosphate buffer.
  • the target buffer is set to sodium citrate, and buffer conversion from sodium phosphate buffer to sodium citrate buffer is attempted.
  • water in step b), may be purified water having an electrical conductivity of 1 ms / cm or less.
  • the diluent solution of step b) below 200 mM is selected from the group consisting of citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, phosphoric acid, sodium phosphate, sulfuric acid, sodium sulfate, hydrochloric acid, potassium chloride, potassium sulfate, , Tris, MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) and CHAPS (3- (3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1 -propane sulfonate), but the present invention is not limited thereto. More preferably, the diluting solution of step b) is a buffer such as the target buffer used in step a) above, and may be a diluted solution thereof.
  • the diluent solution that can be used to produce the protein preparation may be at least one selected from citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, phosphoric acid, and sodium phosphate.
  • step a) or step b) may be carried out one or more times, but is not limited thereto.
  • the method may further comprise concentrating the protein concentration of the protein-containing sample to 50 mg / ml or more.
  • unwanted chemicals concentrate in the concentration process of protein-containing samples, making it difficult to convert them to the desired buffer composition.
  • the two-step dialysis filtration method including the salt treatment process of the present invention it is possible to easily convert to the target buffer composition.
  • Pellicon membranes were used for preparations containing trastuzumab (pI 8.4, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was intended to be replaced with sodium acetate buffer (25 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • the buffer-converted trastuzumab was concentrated to a target protein concentration of 222 g / L and added until the sodium acetate concentration reached 25 mM.
  • the formulation of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • Example 2 Two-step Buffer Transformation of Infliximab (Sodium Phosphate to Sodium Acetate)
  • Pellicon membranes were used for preparations containing infliximab (pI 8.2, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was intended to be replaced with sodium acetate buffer (10 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • the buffer-converted infliximab was then concentrated to a target protein concentration of 222 g / L and added until the sodium acetate concentration was 10 mM.
  • the formulation of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • Pellicon membranes were used for preparations containing trastuzumab (pI 8.4, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was to be replaced with sodium citrate buffer (25 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • PH 4.5 containing 20 mM sodium citrate and 100 mM sodium chloride was subjected to primary dialysis filtration by an 8-fold buffer conversion volume followed by the addition of 8-fold volume buffer conversion volume (pH 3.2) to a buffer containing 1 mM sodium citrate And the dialysis filtration was performed as much as the second dialysis.
  • the buffer-converted trastuzumab was concentrated to a target protein concentration of 142 g / L and added until the concentration of sodium citrate reached 25 mM.
  • the formulation of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • Example 4 Two-step buffer conversion (using sodium phosphate ⁇ sodium acetate) using magnesium chloride of a trastuzumab preparation.
  • Pellicon membranes were used for preparations containing trastuzumab (pI 8.4, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was intended to be replaced with sodium acetate buffer (25 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • the buffer-converted trastuzumab was concentrated to a target protein concentration of 67 g / L and added until the sodium acetate concentration reached 25 mM.
  • the formulation of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • Pellicon membranes were used for preparations containing trastuzumab (pI 8.4, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was intended to be replaced with sodium acetate buffer (25 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • Trastuzumab was dialyzed to a formulation containing 50 mg / ml (50 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0) with a buffer containing 25 mM sodium acetate (pH 4.55) by 10 times the buffer conversion volume.
  • the buffer-converted trastuzumab was concentrated to a target protein concentration of 200 g / L, and the composition of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • Comparative Example 2 1 step buffer conversion of trastuzumab using distilled water (sodium phosphate ⁇ sodium acetate)
  • Pellicon membranes were used for preparations containing trastuzumab (pI 8.4, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was intended to be replaced with sodium acetate buffer (25 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • the preparation 50 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0
  • 50 mg / ml of trastuzumab was subjected to dialysis filtration for 10 times buffer conversion volume with distilled water. Subsequently, the buffer-transformed Trastuzumab was concentrated to a target protein concentration of 222 g / L and sodium acetate buffer was added until the concentration reached 25 mM.
  • the formulation of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • the sodium acetate concentration reached the target buffer concentration of 25 mM.
  • the sodium phosphate buffer was detected to be 32.8 mM, and it was confirmed that the sodium phosphate buffer was not completely removed.
  • the one-step buffer conversion method using purified water It is not effective.
  • Pellicon membranes were used for preparations containing trastuzumab (pI 8.4, 150 kDa) and buffer conversion and protein concentration were performed using tangential flow filtration.
  • the buffer conversion was intended to be replaced with sodium acetate buffer (25 mM) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0).
  • the preparation (50 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0) containing 50 mg / ml of trastuzumab was subjected to primary dialysis filtration with a volume of 10 mM buffer conversion volume of 40 mM sodium acetate. Thereafter, secondary dialysis filtration was carried out with 5 mM acetic acid at a 10 times buffer conversion volume. Next, the buffer-converted trastuzumab was concentrated to a target protein concentration of 200 g / L.
  • the formulation of the final buffer conversion and concentration was as follows.
  • Protein concentration was carried out using a Vivaspin 20 (MWCO 3,000) membrane and a ultra high-speed centrifuge (3500 g) for the preparation containing epidermal growth factor (EGF, 6.2 kDa).
  • the buffer composition was subjected to protein concentration in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5).
  • the initial concentration of epidermal growth factor was 4.6 mg / ml, which was 19.54 mg / ml after the first concentration and was concentrated to 46.63 mg / ml after the second concentration.
  • the sodium ion concentration increases due to the affinity between the negative charge of the epidermal growth factor and the positive charge of the sodium ion, and the composition is as follows.
  • the non-antibody protein can also be used as a buffer conversion target.
  • Example 1 As shown in Table 9, in Example 1, the pH fluctuation width of pH 3.7 to 4.05 was shown. In Example 2, the pH fluctuation width of pH 3.73 to 4.13 was shown. In Example 3, the pH fluctuation width was 3.92 To 4.21 (see Fig. 2). That is, Examples 1 to 3 showed a small pH fluctuation of 0.4 or less. On the other hand, in the case of Comparative Example 3, the pH fluctuation width was measured to be 0.63, and it was confirmed that the pH fluctuation width was larger than in Examples 1 to 3 (see Fig. 2). When the pH fluctuation is large, the stability of the protein preparation can be greatly impaired, which is inappropriate for use in the buffer conversion step.
  • the buffer conversion method according to the embodiment of the present invention is effective as a buffer conversion method for producing a stable high-concentration protein preparation because the pH fluctuation is very small.

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Abstract

본 발명은 2 단계의 투석 여과를 통한 버퍼 변환 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질을 포함하는 용액의 투석 여과 방법, 이를 이용한 단백질 제제의 제조 방법 및 이를 이용한 단백질 제제에 관한 것이다. 본 발명은 단백질을 함유하고 있는 시료의 버퍼 변환 및 농축 공정을 설립하는데 빠르고 효과적으로 진행 할 수 있으며, 단백질 의약품 제형을 원하는 버퍼와 원하는 농도로 효율적으로 생산할 수 있다. 또한, 각 단계별로 pH 변동성이 적어 단백질 안정성을 유지하는데 효과적이다.

Description

투석 여과 방법
본 발명은 2 단계의 투석 여과를 통한 버퍼 변환 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질을 포함하는 용액의 투석 여과 방법, 이를 이용한 단백질 제제의 제조 방법 및 이를 이용한 단백질 제제에 관한 것이다.
시중에 판매되고 있는 단백질 의약품은 비경구 투여용 제품이 대부분이며, 그 중에서도 정맥 투여용 제품이 가장 많다. 하지만, 주기적으로 투여 해야 하는 단백질 의약품 특성상 정맥 투여 방법 보다는 피하 투여 방법이 사용 편리성 측면에서 환자들에게 우호적이다. 이에 따라, 여러 제약회사에서 기존 정맥 투여용 제품을 피하 투여용 제품으로 전환하여 개발하고 있는 추세이다.
피하 투여용 제품은 정맥 투여용 제품보다 개발하기 까다롭다. 그 이유는 다량의 단백질 의약품을 피하에 주입할 경우, 피하 주위 조직에 압력을 주어 통증을 유발시킨다. 따라서, 이 통증을 경감시키기 위해 단백질 농도를 기존 정맥 투여용 제품 보다 적게는 2배에서 많게는 5배까지 증가시켜야 한다.
단백질 의약품의 단백질 농도를 높이고 원하는 제형의 버퍼로 변환하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 방법은 접선유동여과(TFF, Tangential Flow Filtration) 방법이다. 접선유동여과 방식은 비교적 간단한 기계 장치와 멤브레인(Membrane)만을 사용하여 단백질을 원하는 제형의 버퍼로 변환하고 농축시킬 수 있기 때문에 많이 사용한다.
기존 단백질 농도가 상대적으로 낮은 혈관 투여용 제품의 버퍼를 변경하고자 할 때에는, 변환하고자 하는 버퍼로 기존 버퍼를 변환하고 목표 농도까지 단백질을 농축시키면 원하는 버퍼와 목표 단백질 농도로 단백질 의약품을 손 쉽게 생산할 수 있었다. 하지만, 피하 투여용 제품과 같이, 단백질 농도가 높아지게 되면 상대적으로 전하를 띄는 단백질과 버퍼 내에 포함되어 있는 화학 물질이 정전기적으로 상호 작용하여 원하는 버퍼로 완전히 버퍼 변환을 하는 것이 어려워진다. 또한, 단백질과 정전기적으로 상호 작용하고 있던 잔류 화학 물질들이 단백질이 농축됨에 따라 함께 농축되는 현상이 발생하게 된다. 이에 따라, 목표 농도로 단백질을 농축할 때, 버퍼 변환 시 사용하였던 버퍼에 있는 몰 수의 화학 물질 보다 더 높은 몰 수의 화학 물질이 포함되어 있는 현상이 발생하게 된다.
즉, 고농도 단백질 의약품의 버퍼를 원하는 버퍼로 완전히 변환하는 것이 매우 어렵고 까다롭기 때문에, 최근, 보다 빠르고 쉽게 원하는 버퍼로 변환할 수 있는 공정 개발이 절실히 필요하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 단백질을 포함하는 용액의 버퍼 변환을 위한 투석 여과 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 방법을 이용하여 단백질 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 방법을 이용하여 제조된 단백질 제제를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일 구현예에서 a) 단백질 함유 시료에 염(salt)을 포함하는 제형화 하고자 하는 목적 버퍼로 1차 투석 여과를 실시하는 단계; 및 b) 물 또는 200 mM 이하의 희석 용액으로 2차 투석 여과를 실시하는 단계를 포함하는 투석 여과 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 투석 여과 방법은 접선유동여과(Tangential Flow Filtration) 방식일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질은 특별히 한정되지 않으나, 등전점(pI)이 8 이상인 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a) 이후의 pH는 항체 등전점(pI) 보다 1.0 이상 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질 함유 시료는 전기전도도가 0.1 내지 100 ms/cm일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 염은 할로겐 원소와 1족 또는 2족의 금속 원소를 포함하는 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 염(salt)은 NaCl, NaF, NaBr, KF, KCl, KBr, MgF2, MgCl2, MgBr2, CaF2, CaCl2 및 CaBr2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 염은 10 내지 200 mM의 농도로 처리할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 목적 버퍼는 시트르산, 시트르산 나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산, 인산나트륨, 황산, 황산나트륨, 염산, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화 나트륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 버퍼 용액일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)에서 물은 전기전도도 1 ms/cm 이하의 정제된 물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)의 200 mM 이하의 희석 용액은 시트르산, 시트르산 나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산, 인산나트륨, 황산, 황산나트륨, 염산, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화 나트륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 a) 또는 단계 b)는 필요에 따라 1회 이상 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b) 이후에, 단백질 함유 시료의 단백질 농도를 50mg/ml 이상으로 농축 시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서 상기 방법을 이용한 단백질 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예에서 상기 방법을 이용하여 제조된 단백질 제제를 제공한다.
본 발명은 단백질을 함유하고 있는 시료의 버퍼 변환 및 농축 공정을 설립하는데 빠르고 효과적으로 진행 할 수 있다. 또한, 단백질 의약품 제형을 원하는 버퍼와 원하는 농도로 효율적으로 생산할 수 있으며, 각 단계별로 pH 변동성이 적어 단백질의 안정성을 유지하는데 효과적이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 접선 유동 여과방식을 이용한 단백질을 함유하고 있는 시료의 버퍼변환 단계 및 농축 단계를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1 내지 3 및 비교예 3의 2차 버퍼변환 시 pH 변동을 나타낸 그래프이다.
고농도 단백질 의약품의 버퍼를 원하는 버퍼로 완전히 변환하는 것이 매우 어렵고 까다롭기 때문에, 최근, 보다 빠르고 쉽게 원하는 버퍼로 변환할 수 있는 공정 개발이 절실히 필요하였다 이에, 본 발명은 2 단계의 투석 여과를 통한 버퍼 변환 방법을 완성하였다.
본 발명은 단백질을 함유하고 있는 시료의 버퍼 변환 및 농축 공정을 설립하는데 빠르고 효과적으로 진행 할 수 있다. 또한, 단백질 의약품 제형을 원하는 버퍼와 원하는 농도로 효율적으로 생산할 수 있으며, 각 단계별로 pH 변동성이 적어 단백질의 안정성을 유지하는데 효과적이다.
본 발명을 보다 용이하게 이해하기 위하여, 본 발명에서 사용된 용어가 하기에 정의된다.
“목적 버퍼”는 최종적으로 제형화 하고자 하는 버퍼를 말한다. 예를 들어, 최종 제형의 버퍼가 아세트산나트륨이라면, 이것이 목적 버퍼가 된다.
“희석 용액”은 버퍼로서 사용 가능한 200mM 이하의 용액을 의미한다. 본 발명에서 희석 용액은 목적 버퍼를 희석하는 용도로 사용된다.
“투석 여과”는 보통의 여과법으로 분리하기 어려운 콜로이드 입자나 분자를 멤브레인, 황산지, 방광 막, 콜로디온 따위를 이용하여 투석을 써서 압력을 주어 거르는 방법을 의미한다.
“접선유동여과(Tangential Flow Filtration) 방식”은“접선 유동 여과” 와“멤브레인”을 사용하는 버퍼 변환 및 농축 방법을 의미한다. “접선 유동 여과”는 여러 가지 필터 방법 중 하나로 유체 흐름 방향과 멤브레인에 걸리는 압력이 접선을 이루게 만드는 방법이다. “멤브레인”은 접선 유동 여과 방식을 사용하여 여과하기 위해 필요한 물질이다. 크기배제의 원리에 따라 멤브레인 공극의 크기보다 큰 물질은 여과되지 않고 멤브레인 공극의 크기보다 작은 물질은 여과시키는 능력을 갖는다. “멤브레인”은 다음과 같은 다수의 회사로부터 다양한 명칭 하에 시판된다: Delta Regenerated cellulose, Omega PES, Cadence Single use membrane (Pall corporation 에서 시판, 미국 뉴욕 주 포트워싱턴), Biomax PB, Ultracel PLC Ultracel PL membrane, Pellicon (Merck 에서 시판, 독일 다름슈타트), Polyethersulfone Ultrafilter, Sartocon, Hydrosart(Sartorius 에서 시판, 독일 괴팅겐).
본 발명의 접선 유동 여과 방식에 사용 가능한 멤브레인 물질은 상기 시판되는 멤브레인 물질을 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 접선 유동 여과 방식 멤브레인으로 Pellicon 을 사용하였다.
“항체”는 2개의 중쇄(Heavy Chain) 및 2개의 경쇄(Light Chain)가 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 4개의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 면역글로불린 분자를 가리킨다. 기타 변화된 구조를 갖는 자연 발생 항체, 예를 들어 카멜리드 항체도 이 정의에 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)으로 이루어진다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은, 골격 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역과 함께 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 이들은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 하기의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 안형국
“표피성장인자 (EGF; Epidermal growth factor)”는 수용체 EGFR (Epidermal growth factor receptor)에 결합하여 세포성장, 증식, 분화를 촉진하며, 인간 EGF는 53개의 아미노산으로 이루어진다 (Exp Cell Res., 284(1):2-13, 2003). 또한 이와 같은 EGF는 피부 및 헤어의 재생에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다 (J Dermatol Sci., 72(2):81-86, 2013). EGF의 등전점은 pI 4.0 - pI 4.55의 여러 종류가 있다 (The Journal of Biological Chemistry, 259(5):3047-3052, 1984).
“할로겐 원소”는 주기율표 제 17족 원소 가운데 F(플루오르), Cl(염소), Br(브롬), I(아이오딘), At(아스타틴)의 다섯을 통틀어 이르는 말이다.
“1족 금속원소”는 주기율표의 첫 번째 족에 속하는 화학 원소, H(수소), Li(리튬), Na(나트륨), K(칼륨), Rb(루비듐), Cs(세슘) 및 Fr(프랑슘)을 통틀어 이르는 말이다.
“2족 금속원소”는 주기율표의 제2족 원소 Be(베릴륨), Mg(마그네슘), Ca(칼슘), Sr(스트론튬), Ba(바륨) 및 Ra(라듐)을 통틀어 이르는 말이다.
본 발명의 다양한 측면은 본원에 추가로 상세히 기술한다.
본 발명의 일 구현예에서 a) 단백질 함유 시료에 염(salt)을 포함하는 제형화 하고자 하는 목적 버퍼로 1차 투석 여과를 실시하는 단계; 및 b) 물 또는 200mM 이하의 희석 용액으로 2차 투석 여과를 실시하는 단계를 포함하는 투석 여과 방법을 제공한다.
상기 물은 순수한 물로 오염 물질을 제거하기 위해 역삼투압 또는 증류 방법을 이용하여 정제된 물로 전기전도도 1ms/cm 이하의 용액을 의미한다.
상기 희석 용액은 버퍼로 사용 가능한 용액의 희석 용액을 의미하며, 보다 바람직하게는 희석된 목적 버퍼일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 버퍼 변환 방법은 투석일 수 있고, 그 중에서도 접선유동여과(Tangential Flow Filtration) 방식일 수 있다. 상기 접선 유동 여과 방식은 멤브레인을 이용할 수 있으며, 시판되는 멤브레인 물질을 모두 사용 가능하다. 본 발명의 일 구현예에서는, 멤브레인으로 pellicon 멤브레인을 사용한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질은 EGF 등 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 등전점(pI)이 8 이상인 단백질일 수 있는데, 등전점이 6 미만인 단백질의 경우, pH 5~6 사이의 버퍼에서 단백질이 음성 전하를 띄기 때문에 본 발명의 투석 여과 방법에 적합하지 않을 수 있다. 보다 바람직하게 상기 단백질은 항체일 수 있으며, 구체적으로는 트라스트주맙 또는 인플릭시맙일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a) 이후의 pH는 항체 등전점(pI) 보다 1.0 이상 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 단계 a) 이후의 pH는 항체 등전점(pI) 보다 1.0 이상, 1.5 이상, 2.0 이상, 2.5 이상, 3.0 이상, 3.5 이상, 4.0 이상, 4.5 이상 낮을 수 있다.
본 발명의 실시예 1에 따르면, 단계 a) 이전의 pH는 6.0이었으나, 단계 a) 이후의 pH는 4.5 로 확인되어(실험예 1 참고), 단계 a) 이후 pH는 항체 등전점(pI 8.4)보다 1.0 이상 낮게 확인되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단백질 함유 시료는 전기전도도가 0.1 내지 100 ms/cm일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 염은 할로겐 원소, 1족 금속 원소 및 2족의 금속 원소로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 염(salt)은 NaCl, NaF, NaBr, KF, KCl, KBr, MgF2, MgCl2, MgBr2, CaF2, CaCl2 및 CaBr2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게 염은 NaCl, KCl, MgCl2 또는 CaCl2 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 MgCl2 또는 CaCl2 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 염은 10 내지 200 mM 의 농도, 20 내지 180 mM 의 농도, 30 내지 160 mM의 농도, 40 내지 140 mM의 농도, 50 내지 120 mM의 농도, 60 내지 110 mM의 농도, 70 내지 110 mM의 농도, 80 내지 110 mM의 농도로 처리될 수 있다. 상기 염을 10 mM 미만으로 처리할 경우, 버퍼 변환이 제대로 되지 않는 부작용이 있을 수 있으며, 200 mM 농도 초과로 처리할 경우, 잔류 염의 농도가 높아져 삼투압이 높아지는 부작용이 있을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 목적 버퍼는 시트르산, 시트르산 나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산, 인산나트륨, 황산, 황산나트륨, 염산, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화 나트륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 버퍼 용액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단백질 제제를 생산하는데 사용 가능한 목적 버퍼로는 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산 및 인산나트륨 중에서 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 목적 버퍼를 아세트산나트륨으로 설정하여, 인산 나트륨 버퍼에서 아세트산나트륨 버퍼로 버퍼 변환을 시도하였다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서는 목적 버퍼를 시트르산나트륨으로 설정하여, 인산나트륨 버퍼에서 시트르산나트륨 버퍼로 버퍼 변환을 시도하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)에서 물은 전기전도도 1ms/cm 이하의 정제된 물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b)의 200mM 이하의 희석 용액은 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산, 인산나트륨, 황산, 황산나트륨, 염산, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화나트륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게 상기 단계 b)의 희석 용액은 상기 단계 a)에 사용된 목적 버퍼와 같은 버퍼이고, 이의 희석된 용액일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단백질 제제를 생산하는데 사용 가능한 희석 용액으로는 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산 및 인산나트륨 중에서 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 a) 또는 단계 b)는 필요에 따라 1회 이상 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 b) 이후에, 단백질 함유 시료의 단백질 농도를 50mg/ml 이상으로 농축 시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 대부분, 단백질 함유 시료의 농축 과정에서 원치 않는 화학 물질이 농축되어, 목표하는 버퍼 조성으로의 변환이 어렵다. 하지만, 본 발명의 염 처리 과정을 포함하는 2단계 투석 여과 방법을 이용하면, 목표하는 버퍼 조성으로 손쉽게 변환이 가능하다.
본 발명의 다른 일 구현예에서 상기 방법을 이용한 단백질 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예에서 상기 방법을 이용하여 제조된 단백질 제제를 제공한다.
이하, 실시 예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 트라스트주맙 제제의 2단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 아세트산나트륨)
트라스트주맙(pI 8.4, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 아세트산나트륨 버퍼(25mM)로 교체하고자 하였다.
실험은 도 1에 표시된 순서에 따라 진행 되었다. 20mM 아세트산나트륨 및 100mM 염화나트륨을 포함하는 버퍼(pH 4.5)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 1차 투석 여과를 진행 하였고, 뒤이어, 1mM 아세트산나트륨을 포함하는 버퍼(pH 4.0)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 2차 투석 여과를 진행하였다.
그 후, 버퍼 변환된 트라스트주맙을 목표 단백질 농도 222g/L로 농축하였고, 아세트산나트륨의 농도가 25mM가 될 때까지 첨가해 주었다. 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
트라스트주맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후의 화학물질 농도
단계 아세트산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 54.7 mM 50 mg/ml
1차 투석 여과 후 3.5 mM 미검출 50 mg/ml
2차 투석 여과 후 1.1 mM 미검출 50 mg/ml
농축 후 1.5 mM 미검출 222 mg/ml
버퍼 첨가 후 25 mM 미검출 200 mg/ml
목표치 25 mM 미검출 200 mg/ml
표 1 의 결과에서 볼 수 있듯, 20mM 아세트산 및 100mM 염화나트륨을 포함하는 버퍼로 1차 투석 여과를 실시했을 때, 아세트산나트륨의 농도는 3.5mM로 측정되었다. 그 후, 1mM 아세트산 버퍼로 2차 투석 여과를 실시했을 때, 아세트산나트륨 농도는 1.1mM로 측정되었다. 또, 농축 후의 아세트산나트륨의 농도는 1.5mM로 아세트산나트륨 버퍼의 농도 1mM와 크게 다르지 않았다. 기존 트라스트주맙 제제가 가지고 있었던 인산나트륨은 모든 샘플에서 검출 되지 않은 것으로 미루어 보아, 버퍼가 인산나트륨에서 아세트산나트륨으로 완전히 변환된 것을 확인하였다.
실시예 2: 인플릭시맙 제제의 2단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 아세트산나트륨)
인플릭시맙(pI 8.2, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 아세트산나트륨 버퍼(10mM)로 교체하고자 하였다.
실험은 도 1에 표시된 순서에 따라 진행 되었다. 20mM 아세트산나트륨 및 100mM 염화나트륨을 포함하는 버퍼(pH 4.5)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 1차 투석 여과를 진행 하였고, 뒤이어, 1mM 아세트산나트륨을 포함하는 버퍼(pH 4.0)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 2차 투석 여과를 진행하였다.
그 후, 버퍼 변환된 인플릭시맙을 목표 단백질 농도 222g/L로 농축하였고, 아세트산나트륨의 농도가 10mM이 될 때까지 첨가해 주었다. 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
인플릭시맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후 화학물질의 농도
단계 아세트산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 54.7 mM 50 mg/ml
1차 투석 여과 후 3.3 mM 미검출 50 mg/ml
2차 투석 여과 후 1.1 mM 미검출 50 mg/ml
농축 후 1.4 mM 미검출 222 mg/ml
버퍼 첨가 후 8.9 mM 미검출 200 mg/ml
목표치 10 mM 미검출 200 mg/ml
표 2 의 결과에서 볼 수 있듯, 20mM 아세트산 및 100mM 염화나트륨을 포함하는 버퍼로 1차 투석 여과를 실시했을 때, 아세트산나트륨의 농도는 3.3mM로 측정되었다. 그 후, 1mM 아세트산 버퍼로 2차 투석 여과를 실시했을 때, 아세트산나트륨 농도는 1.1mM로 측정되었다. 또, 농축 후의 아세트산나트륨의 농도는 1.4mM로 아세트산나트륨 버퍼의 농도 1mM와 크게 다르지 않았다. 기존 인플릭시맙을 포함하는 제제가 가지고 있었던 인산나트륨은 모든 샘플에서 검출 되지 않은 것으로 미루어 볼 때, 버퍼가 인산나트륨에서 아세트산나트륨으로 완전히 변환된 것을 확인하였다.
실시예 3: 트라스트주맙 제제의 2단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 시트르산나트륨)
트라스트주맙(pI 8.4, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 시트르산나트륨 버퍼(25mM)로 교체하고자 하였다.
20mM 시트르산나트륨 및 100mM 염화나트륨을 포함하는 버퍼(pH 4.5)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 1차 투석 여과를 진행 하였고, 뒤이어, 1mM 시트르산나트륨을 포함하는 버퍼(pH 3.2)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 2차 투석 여과를 진행하였다.
그 후, 버퍼 변환된 트라스트주맙을 목표 단백질 농도 142 g/L로 농축하였고, 시트르산나트륨의 농도가 25mM가 될 때까지 첨가해 주었다. 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
트라스트주맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후의 화학물질 농도
단계 시트르산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 54.7 mM 50 mg/ml
1차 투석 여과 후 22.1 mM 미검출 48 mg/ml
2차 투석 여과 후 6.5 mM 미검출 47 mg/ml
농축 후 17.9 mM 미검출 142 mg/ml
버퍼첨가 후 42.2 mM 미검출 136 mg/ml
목표치 25 mM 미검출 136 mg/ml
표 3 의 결과에서 볼 수 있듯, 20mM 시트르산 및 100mM 염화나트륨을 포함하는 버퍼로 1차 투석 여과를 실시했을 때, 시트르산 농도는 22.1 mM로 측정되었다. 그 후, 1mM 시트르산 버퍼로 8 배 2차 투석 여과를 실시했을 때, 시트르산 농도는 6.5 mM로 측정되었다. 또, 농축 후의 시트르산의 농도는 17.9 mM로 단백질이 농축됨에 따라서 시트르산 농도가 높아짐을 확인하였다. 기존 트라스트주맙을 포함하는 제제가 가지고 있었던 인산나트륨은 모든 샘플에서 검출 되지 않은 것으로 미루어 보아, 버퍼가 인산나트륨에서 시트르산나트륨으로 완전히 변환된 것을 확인하였다.
실시예 4: 트라스트주맙 제제의 염화 마그네슘을 이용한 2단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 아세트산나트륨)
트라스트주맙(pI 8.4, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 아세트산나트륨 버퍼(25mM)로 교체하고자 하였다.
20mM 아세트산나트륨 및 50mM 염화 마그네슘을 포함하는 버퍼(pH 4.4)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 1차 투석 여과를 진행 하였고, 뒤이어, 1mM 아세트산나트륨을 포함하는 버퍼(pH 3.9)로 8배의 버퍼 변환 볼륨만큼 2차 투석 여과를 진행하였다.
그 후, 버퍼 변환된 트라스트주맙을 목표 단백질 농도 67 g/L로 농축하였고, 아세트산나트륨의 농도가 25mM가 될 때까지 첨가해 주었다. 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
트라스트주맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후의 화학물질 농도
단계 아세트산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 57.8 mM 50 mg/ml
1차 투석 여과 후 21.9 mM 미검출 37 mg/ml
2차 투석 여과 후 1.6 mM 미검출 34 mg/ml
농축 후 2.2 mM 미검출 67 mg/ml
버퍼 첨가 후 28.2 mM 미검출 58 mg/ml
목표치 25 mM 미검출 58 mg/ml
표 4 의 결과에서 볼 수 있듯, 20mM 아세트산 및 50mM 염화 마그네슘을 포함하는 버퍼로 1차 투석 여과를 실시했을 때, 아세트산 농도는 21.9mM로 측정되었다. 그 후, 1mM 아세트산 버퍼로 8 배 2차 투석 여과를 실시했을 때, 아세트산 농도는 1.6mM로 측정되었다. 또, 농축 후의 아세트산나트륨의 농도는 2.2mM로 아세트산 이온 농도 1mM와 크게 다르지 않았다.기존 트라스트주맙을 포함하는 제제가 가지고 있었던 인산 이온은 모든 샘플에서 검출 되지 않은 것으로 미루어 보아, 버퍼가 인산나트륨에서 시트르산나트륨으로 완전히 변환된 것을 확인하였다.
비교예 1: 트라스트주맙 제제의 1단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 아세트산나트륨)
트라스트주맙(pI 8.4, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 아세트산나트륨 버퍼(25mM)로 교체하고자 하였다.
트라스트주맙을 50 mg/ml 포함하는 제제(50mM 인산나트륨 버퍼, pH 6.0)에 25mM 아세트산나트륨(pH 4.55)을 포함하는 버퍼로 10배의 버퍼 변환 볼륨만큼 투석 여과를 진행하였다.
그 후, 버퍼 변환된 트라스트주맙을 목표 단백질 농도 200g/L로 농축하였고, 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
트라스트주맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후 화학물질의 농도
단계 세트산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 54.7 mM 50 mg/ml
투석 여과 후 23.9 mM 3 mM 50 mg/ml
농축 후 51 mM 9 mM 200 mg/ml
목표치 25 mM 미검출 200 mg/ml
표 5의 결과에서 볼 수 있듯, 투석 여과 후 아세트산나트륨 농도가 23.9mM로 목표하는 버퍼인 25mM 아세트산나트륨에 근접하였으나, 농축 과정을 거친 후 아세트산나트륨 농도가 51mM로 급격히 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 인산나트륨도 온전히 제거가 되지 않아서, 농축 후에 9mM의 인산나트륨이 잔존함을 확인할 수 있었다.따라서, 1단계의 투석 여과를 거치는 버퍼 변환 방법의 경우, 버퍼가 완전히 변환된 고농도 단백질 제제를 생성하는데 있어서 효과적이지 않음을 확인하였다.
비교예 2: 증류수를 이용한 트라스트주맙의 1단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 아세트산나트륨)
트라스트주맙(pI 8.4, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 아세트산나트륨 버퍼(25mM)로 교체하고자 하였다.
트라스트주맙을 50 mg/ml 포함하는 제제(50mM 인산나트륨 버퍼, pH 6.0)에 증류수로 10배 버퍼 변환 볼륨만큼 투석 여과를 진행하였다. 그 후, 버퍼 변환된 트라스트주맙을 목표 단백질 농도 222g/L로 농축하였고, 아세트산나트륨 버퍼를 농도가 25mM가 될 때까지 첨가해 주었다. 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
트라스트주맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후 화학물질의 농도
단계 아세트산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 54.7 mM 50 mg/ml
투석 여과 후 0.27 mM 10.2 mM 50 mg/ml
농축 후 0.69 mM 32.8 mM 222 mg/ml
버퍼 첨가 후 25 mM 32.8 mM 200 mg/ml
목표치 25 mM 미검출 200 mg/ml
표 6의 결과에서 볼 수 있듯, 버퍼 첨가 후, 아세트산나트륨 농도는 25mM로 목표하는 버퍼 농도가 되었다. 하지만, 인산나트륨 버퍼가 32.8mM 검출되어, 인산나트륨 버퍼가 완전히 제거되지 않았음을 확인할 수 있었다.따라서, 정제수를 이용한 1단계 버퍼 변환 방법의 경우, 버퍼가 완전히 변환된 고농도 단백질 제제를 생성하는데 있어서 효과적이지 않음을 확인하였다.
비교예 3: 아세트산을 이용한 트라스트주맙 제제의 2단계 버퍼 변환(인산나트륨 → 아세트산나트륨)
트라스트주맙(pI 8.4, 150kDa)을 포함하는 제제에 대하여 Pellicon 멤브레인을 사용하고, 접선 유동 여과방식을 이용하여 버퍼 변환 및 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 변환은 인산나트륨 버퍼(50mM, pH 6.0)에서 아세트산나트륨 버퍼(25mM)로 교체하고자 하였다.
트라스트주맙을 50 mg/ml 포함하는 제제(50mM 인산나트륨 버퍼, pH 6.0)에 아세트산나트륨 40mM로 10배 버퍼 변환 볼륨만큼 1차 투석 여과를 진행하였다. 그 후, 아세트산 5mM로 10배 버퍼 변환 볼륨만큼 2차 투석 여과를 진행하였다. 다음으로 버퍼 변환된 트라스트주맙을 목표 단백질 농도 200g/L로 농축하였다. 최종적으로 버퍼 변환 및 농축이 완료된 제제의 조성은 아래와 같다.
트라스트주맙 제제의 버퍼 변환 및 농축 후 화학물질의 농도
단계 아세트산 이온 농도 인산 이온 농도 항체 농도
투석 여과 전 0 mM 54.7 mM 50 mg/ml
1차 투석 여과 후 40 mM 1.2 mM 50 mg/ml
2차 투석 여과 후 10.2 mM 1.2 mM 50 mg/ml
농축 후 34.6 mM 3.8 mM 200 mg/ml
목표치 25 mM 미검출 200 mg/ml
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 농축 후 인산나트륨이 3.8mM 검출되어, 인산나트륨 버퍼가 완전히 제거되지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한, 아세트산나트륨 농도도 농축 후 34.6mM로 목표치인 25mM을 크게 웃도는 것을 확인할 수 있었다.따라서, 아세트산을 이용한 1단계 버퍼 변환 방법의 경우, 버퍼가 완전히 변환된 고농도 단백질 제제를 생성하는데 있어서 효과적이지 않음을 확인하였다.
비교예 4: 인산나트륨을 이용한 표피성장인자 (EGF)의 농축
표피성장인자(EGF, 6.2kDa)를 포함하는 제제에 대하여 Vivaspin 20 (MWCO 3,000) 멤브레인을 사용하고, 초고속 원심분리기(3500g)를 이용하여 단백질 농축을 진행하였다. 버퍼 조성은 20mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.5)에서 단백질 농축을 진행하였다.
표피성장인자의 초기 농도는 4.6 mg/ml 이었으며, 1차 농축 후 19.54 mg/ml 이었으며, 2차 농축 후 46.63 mg/ml로 농축하였다. 농축이 진행되면서 표피성장인자의 음전하와 나트륨이온의 양전하 사이의 친화력으로 인하여, 나트륨 이온 농도가 높아짐을 확인할 수 있으며, 그 조성은 아래와 같다.
표피성장인자의 농축 후 화학물질의 농도 결과
단계 나트륨 이온 농도 단백질 농도
농축 전 22 mM 4.6 mg/ml
1차 농축 후 37 mM 19.54 mg/ml
2차 농축 후 50 mM 46.63 mg/ml
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 표피성장인자 단백질 농도가 높아짐에 따라서 나트륨 이온 농도가 초기 (농축 전) 22 mM에서 1차 농축 후 37 mM, 2차 농축 후 50 mM로 점점 높아짐을 확인할 수 있었다. 표피성장인자의 등전점은 pI 4.0 내지 4.55인데 반하여, 농축 진행은 pH 7.5에서 진행되어 표피성장인자의 음전하와 나트륨이온의 양이온의 양전하 사이의 친화력으로 나트륨이온 농도가 높아짐을 확인할 수 있었다.따라서, 고농도 단백질 제형 제조 시, 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 단백질 농축을 진행하는 경우, 버퍼의 이온 농도가 변동되는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 실시예 1 내지 4에 제시된 2단계 투석 여과 방법을 이용하여, 항체 외 단백질 또한 버퍼 변환 대상으로 사용 될 수 있음을 예상할 수 있다.
실험예 1: 각 버퍼 변환 방법에 따른 pH 변동성 측정 실험
실시예 1 내지 3 및 비교예 3의 2차 투석 여과 단계별 pH 변동성 측정 실험을 진행하였다. pH는 pH 측정 기기를 이용하여 각 버퍼변환 볼륨 마다 측정하였고, 그 결과는 도 2 및 표 9에 표시하였다.
실시예 1 내지 3 및 비교예 3의 2차 버퍼변환 시, pH 변동
DF Volume 실시예1 2차 버퍼변환시 pH 값 실시예2 2차 버퍼변환시 pH 값 실시예3 2차 버퍼변환시 pH 값 비교예3 2차 버퍼변환시 pH 값
0 3.91 3.97 4.21 4.24
1 3.83 3.86 4.18 4.46
2 3.79 3.76 4.05 4.59
3 3.70 3.73 3.93 4.72
4 3.76 3.79 3.92 4.80
5 3.84 3.89 3.92 4.83
6 3.98 3.98 3.92 4.86
7 4.05 4.09 3.92 4.87
8 4.05 4.13 3.92 4.87
표 9에 보이는 바와 같이, 실시예 1의 경우, pH 3.7 ~ 4.05의 pH 변동 폭을 보였고, 실시예 2의 경우, pH 3.73 ~ 4.13의 pH 변동 폭을 보였으며, 실시예 3의 경우, pH 3.92 ~ 4.21의 pH 변동 폭을 보였다(도 2 참조). 즉, 실시예 1 내지 3은 0.4 이하의 적은 pH 변동폭을 보였다. 반면, 비교예 3의 경우, pH 변동폭이 0.63으로 측정되어, 실시예 1 내지 3에 비하여 pH 변동폭이 큰 것을 확인하였다(도 2 참조). pH 변동성이 큰 경우, 단백질 제제의 안정성을 크게 저해할 수 있어, 버퍼 변환 공정으로 사용하기에 부적절하다.
따라서, 본 발명의 실시예에 의한 버퍼 변환 방법은 pH 변동성이 매우 적으므로, 안정한 고농도 단백질 제제를 생산하기 위한 버퍼 변환 방법으로 효과적임을 확인하였다.

Claims (15)

  1. a) 단백질 함유 시료에 염(salt)을 포함하는 제형화 하고자 하는 목적 버퍼로 1차 투석 여과를 실시하는 단계; 및
    b) 물 또는 200 mM 이하의 희석 용액으로 2차 투석 여과를 실시하는 단계를 포함하는 투석 여과 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 투석 여과 방법은 접선유동여과(Tangential Flow Filtration) 방식을 이용하는 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 a) 이후 목적 버퍼의 pH는 항체 등전점(pI) 보다 1.0 이상 낮은 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 함유 시료는 전기전도도가 0.1 내지 100 ms/cm인 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 염은 할로겐 원소와 1족 또는 2족의 금속 원소를 포함하는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염은 NaCl, NaF, NaBr, KF, KCl, KBr, MgF2, MgCl2, MgBr2, CaF2, CaCl2 및 CaBr2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  8. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염은 10 내지 200 mM의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 목적 버퍼는 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산, 인산나트륨, 황산, 황산나트륨, 염산, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화 나트륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 버퍼 용액인 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)에서 물은 전기전도도 1 ms/cm 이하의 정제된 물인 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 200 mM 이하의 희석 용액은 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 인산, 인산나트륨, 황산, 황산나트륨, 염산, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 수산화 나트륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 단계 a) 또는 단계 b)는 필요에 따라 1회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 b) 이후에, 단백질 함유 시료의 단백질 농도를 50 mg/ml 이상으로 농축 시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 투석 여과 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 이용한 단백질 제제의 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 제조된 단백질 제제.
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