KR910008626B1

KR910008626B1 - 항생물질 l 17054의 순수 제제의 제조 방법

Info

Publication number: KR910008626B1
Application number: KR1019840001457A
Authority: KR
Inventors: 말라바르바 아드리아노; 보르기 안젤로; 스트라졸리니 파올로; 카바예리 브루노; 코로네이 카롤리나
Original assignee: 그루포 레페티드 에스. 피. 에이.; 레나토 스가르비
Priority date: 1983-03-22
Filing date: 1984-03-21
Publication date: 1991-10-19
Also published as: IE57117B1; ES530816A0; AU567550B2; ATE38676T1; ES8504838A1; IE57118B1; KR840008163A; DE3473148D1; IE840691L; EP0119575B1; DK161284A; AU567549B2; IE840692L; KR910008645B1; US4645827A; EP0119574B1; US4650855A; AU2589784A; CA1238041A; AU2589884A

Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 L 17054의 순수 제제의 제조 방법

제1도는 항생물질 L 17054의 자외선 흡수 스펙트럼.

제2도는 항생물질 L 17054의 적외선 흡수 스펙트럼.

제3도는 항생물질 L 17054의¹H NMR 스펙트럼.

본 발명은 항생물질 L 17054라고 임의로 명명한 순수한 항생물질 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 이 항생물질은 테이코플라닌 A₂를 화학적으로 처리하여 얻는다. 테이코플라닌은 동화원(assimilable source)인 탄소, 질소 및 무기염을 함유하는 배지 중에서 균주 악티노플라네스 테이코미세티쿠스〔Actinoplanesteichomyceticus nov. sp. ATCC 31121(이 균주는 1983년 5월 19일자로 한국과학기술원에 기탁번호 제 830519-07911호로 기탁되고, 1983년 6월 7일자 특허출원 제2517호와 관련해서 1983년 6월 21일자로 대한민국 특허청에 미생물 수탁번호 통지서를 제출한 바 있음)를 배양시켜서 얻는 항생물질(구명칭, 테이코마이신)의 국제 비독점 명칭(INN)이다(미합중국 특허 제4,239,751호 참조). 상기 특허에 기재된 방법에 의하면, 테이코플라닌 A₁,A₂및 A₃을 함유하는 항생물질 혼합물은 분리시킨 발효액을 적당한 수불용성 유기용매로 추출하고, 이 추출 용매로부터 통상의 방법에 의하여 석출시켜서 회수한다. 이어서, 단리된 항생물질 복합체의 주요 인자인 테이코플라닌 A₂는 상기 항생물질 혼합물을 세파덱스(Sephadex)

상에서 칼럼 크로마토그라피시킴으로써 분리시킨다. 영국 특허 제2,121,401호에는 실제로 항생물질 테이코플라닌 A₂는 밀접하게 관련된 5개의 공생성 인자들의 혼합물이라고 기재되어 있다.

놀라웁게도, 본 발명자들은 테이코플라닌 A₂, 그의 각 인자들 또는 혼합물들을 항생물질 L 17054로 명명한 다른 항균 유도체로 변형시킬 수 있음을 발견했다. 이 변형은 반드시 화학적 변형이다. 더욱 구체적으로, 테이코플라닌 A₂, 그의 각 구성 인자들 또는 구성 인자들의 혼합물로부터 선택되는 항생물질을 온화하게 조절하여 산 가수분해시킴으로써 항생물질 L 17054를 얻는다. 이때 가수분해 매질중의 산 농도가 중요한 변수임을 발견하였다. 일반적으로, 1N 미만의 염산 농도가 유용하게 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 염산의 농도는 0.1N 내지 0.8N인 것이 바람직하며, 적합한 염산 농도는 약 0.5N이다.

당 업자들에게 명백한 바와 같이, 실질적으로 같은 산성 조건, 예를들면 비슷한 강도의 다른 무기산 또는 유기산을 비슷한 농도로 사용하여 비슷한 결과를 얻을 수 있다. 반응 온도는 사용된 무기산의 강도와 반응시간에 따라 달라질 수 있다. 상기 반응은 70°-90℃에서 특히 약 0.5N 염산을 사용하여 행할 때 양호한 결과를 얻을 수 있다. 이어서 반응 시간은 특정 반응 조건 즉, 산의 형태와 농도 및 반응 온도에 따라서 크게 달라진다. 일반적으로, 반응은 약 45-90분 이상에서 완료된다.

일반적으로, 본 발명의 방법은 단일의 무기산을 사용해서 행하는 것이 바람직하지만, 단일의 가수분해제로 처리하는 경우, 상기한 것과 유사한 반응 조건을 얻기 위하여 서로 다른 산의 혼합물을 사용할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 대체의 가능성과 적당한 가수분해제 혼합물은 본 출원에 기재된 것과 당 업계에 일반적으로 알려진 것에 기초해서 적당한 반응 온도와 반응시간을 선택할 수 있는 전문가들에게 명백한 것이다. 각 반응 단계는 공지의 방법으로 TLC 또는 바람직하게는 HPLC에 의하여 모니터한다. 또한, 항생물질 L 17054의 영향을 받기 쉬운 미생물을 사용하는 생물학적 분석 시험(예, 자동 생물 분석)과 관련한 크로마토그라피법을 사용하는 것이 편리할 수 있다. 항생물질 L 17054를 형성하는 화합물은 일반적으로 고농도 무기산에 대해 불용성이고, 침전한다. 당 업계에 알려진 바와 같이 비(非)용매를 첨가하여 침전을 촉진시킬 수 있다. 이어서, 회수된 조생성물은 크로마토그라피 특히, 분배 칼럼 크로마토그라피로 정제하는 것이 적합하다. 이 경우에 있어서, 적합한 흡착제는 균일한 입도의 실리카겔이다.

용출제는 아세토니트릴과 물의 혼합물이 적합하지만, 비슷한 극성을 갖는 용매의 용출 혼합물을 사용하는 것이 편리할 수 있다. 적합한 용출제 혼합물은 아세토니트릴과 물의 약 85 : 15에서 약 70 : 30까지의 선형구배 혼합물이다. 유속은 약 357㎖/시간이 적합하다. 용출 혼합물을 칼럼에 통과시키기 전에, 물의 함량을 (1％에서 15％까지) 증가시키면서, 아세토니트릴과 물의 혼합물을 사용하여 칼럼을 전개했다. 용출은 크로마토그라피 분석, 적합하기로는 HPLC에 의해서 모니터했다.

수집된 분획물을 항생물질 함유량에 따라서 모았다. 이어서, 순수한 항생물질 L 17054를 다음과 같은 공지의 방법, 예를들면 비용매에 의한 침전, 여과 또는 용매 추출, 소용적으로 농축 및 침전등의 방법으로 회수했다.

사용될 수 있는 다른 편리한 정제 방법으로 역상 분배 크로마토그라피를 들 수 있다. 이 경우에, 적합한 흡착제는 균일한 입도의 실란화 실리카 겔이며, 입도 0.06-0.2㎜의 실란화 실리카 겔이 적합한 흡착제이다. 용출제는 포름산암모늄 수용액과 아세토니트릴의 혼합물이 적합하다. 포름산암모늄 수용액은 0.2％ 포름산암모늄 수용액이 적합하지만, 비슷한 극성을 갖는 용출 혼합물을 사용하는 것이 편리하다. 적합한 용출제 혼합물은 0.2％ 포름산암모늄 수용액과 아세토니트릴(95 : 5 내지 약 80 : 20의 비율)의 선형 구배 혼합물이다. 용출은 통상의 분석법, 적합하기로는 HPLC 분석에 의해서 모니터했다.

항생물질 L 17054를 함유하는 분획물을 한데 모으고, 휘발성 물질을 진공 항서 증류 제거하고, 잔류 수용액은 물 중에서 제조한 실란화 실리카 겔 칼럼에 충전하는 것이 적합하다. 이어서, 이 컬럼은 물로 완전히 세척한 후, 아세토니트릴과 물(1 : 1)의 혼합물로 전개하는 것이 적합하다. 항생물질 L 17054의 순순한 제제는 최종적으로 상기 공지의 방법으로 회수했다.

수용액으로부터 순수한 항생물질 L 17054를 회수하기 위한 적합한 방법은 용액의 pH를 약 3.5로 조절하고, 아세톤과 같은 비용매를 첨가하여서 목적하는 생성물을 침전시키는 것이다.

[항생물질 L 17054의 물리화학적 특성]

항생물질 L 17054는 다음과 같은 특성을 지닌다.

a)

b)pH〉8.0의 물, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 프로필렌 글리콜 및 메틸셀로솔브 중에 자유롭게 용해되고, 메탄올 중에 약간 용해되고, 에틸에테르 및 아세톤 중에는 거의 불용성임.

c) 첨부 도면 제1도에 나타낸 것과 같은 자외선 흡수 스팩트럼을 가지며, 이것은 다음과 같은 최대 흡수치를 갖는다.

-0.1N 염산에서

-0.1N 수산화나트륨에서

-pH 7.4의 인산염 완충액에서

d) 첨부 도면 제2도에 나타낸 것과 같은 적외선 흡수 스팩트럼(뉴졸)을 가지며, 이것은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝^-1)를 갖는다 : 3700-2000, 2970-2850(뉴졸), 1655, 1610, 1595, 1515, 1490, 1460(뉴졸), 1375(뉴졸), 1300, 1230, 1145, 1060, 1020, 970, 890, 850, 820.

e) 시료를 불활성 분위기 하에서 약 140℃에서 미리 건조시킨 후 (중량 손실=7.8％) 원소 분석을 행한 결과, 다음과 같은 대략적인 백분율 조성(평균치)를 나타냈다 : 탄소 55.46％, 수소 4.50％, 질소 7.20％, 염소 4.67％, 화분 0.2％.

f) TLC 시스템에서 다음의 Rf치를 나타냈다.

가시화 : 254㎚의 자외선 ; 3％ 에탄올성 닌히드린 ; 1％ 메탄올성 플루오레스카민.

g) 체류시간(t_R)=8.3분[150×4.0㎜ Zorbax

ODS(5-6㎛) 칼럼(Zorbax

)는 옥타데실실란 실리카 겔 매트릭스에 대한 듀퐁사의 상표임)을 사용하고, 용액 A중에서 용액 B를 0％에서 50％까지 선형 구배하여 유속 2㎖/분으로 40분 이내 용출시키는 HPLC(내부 표준물 : 3,5-디히드록시톨루엔, t_R=5.60분)로 분석했음]

용액 A는 0.1N 수산화나트륨으로 pH 6.0이 되도록 완충시킨 25mM NaH₂PO₄/아세토니트릴(9/1)이고, 용액 B는 0.1N 수산화나트륨으로 pH 6.0이 되도록 완충시킨 25mM NaH₂PO₄/아세토니트릴(3 : 7)임

h)¹H NMR 스펙트럼은 시료농도 20㎎/㎖로 60℃에서 DMSO-d₆을 사용하여 270MH_Z의 NMR로 기록하였으며, 그 결과를 제3도에 나타냈다(내부 표준물, TNS,δ=0.00ppm). D₂O에서의 교환 및 선택적인 스핀 작용 제거(decoupling) 실험 후 얻은¹H NMR 데이터의 일부는 다음과 같다(δppm, 다중도) : 1.88, s; 2.85, d; ∼3.5, dd; 3-4; 4.20, d; 4.48, d; 4.50, d; 4.62, s; 4.96, ddd; 5.18, d; 5.31, s; 5.35, d; 5.39, s; 5.68, d; 5.71, s; 6.20, d; 6.41, s; 6.51, s; 6.56, s; 6.74, d; 6.77, s; 6.80, s; 6.80, d; 6.98, d; 7.08, s; 7.15, d; 7.21, d; 7.28, d; 7.35, d; 7.50, d; 7.56, d; 7.64, d; 7.73, d; 7.86, s; 8.42, d.

ⅰ) 전위차 적정치는 메틸셀로솔브 : 물(4 : 1)의 혼합 용매 중에 과량의 0.01N HCI을 함유하는 피시험 화합물의 용액을 0.01N NaOH로 적정시킬 때, 상기 용매 중에서 pH 1/2치가 5.0(1당량), 7.0(1당량) 및 11(5당량)인 적정 기울기를 나타냈다.

j) 염을 형성할 수 있는 산으로서의 기능을 가짐.

k) 염을 형성할 수 있는 염기로서의 기능을 가짐.

l) 2종류의 당 잔기 D-만노오스와 N-아세틸-D-글루코사민을 가짐.

상기 물리화학적 데이터를 기초로 하고, 반코마이신 및 리스토세틴과 같은 구조가 알려진 다른 글리코펩티드성 항생물질과 비교해 볼 때, 항생물질 L 17054는 시험적으로 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다.

상기 식중, R'은 다음 구조식

의 기임.

미합중국 특허 제4,239,751호에서는 항생물질 8327 인자 A의 소구성 성분을 개시하고 있으며, 이 구성 성분을 테이코마이신 인자 A₃으로 명명했다. 이 특허에는 항생물질 8327 인자 A의 크로마토그라피법적 분리에 의한 수득 방법, 이 항생물질의 종이 크로마토그라피에서의 거동 및 시험관내 활성만이 기재되어 있다. 본 발명자들은 항생물질 L 17054가 테이코마이신 인자 A₃과 극히 유사한 크로마토그라피 특징을 가짐을 발견했다. 그러나, 이 두 화합물 사이의 정성적인 차이는 이 화합물들의 항균 활성이 크게 다르다는 사실에 있다. 특히, 항생물질 L 17054는 시험관내에서 대부분의 균주에 대하여 테이코마이신 A₃보다 약 5배나 높은 항그람양성균 활성을 갖는다. 그외에, 물리화학적 데이터는 항생물질 L 17054는 순수하고, 균일한 화합물임을 증명해주고 있다.

항생물질 L 17054는 산 및 염기와 각각 염을 형성할 수 있는 염기 및 산으로서의 기능을 가지므로, 이것을 공지의 방법으로 제약상 허용될 수 있는 산 및(또는) 염기 부가 염으로 전환시킬 수 있다. 산 부가염은 공지방법에 의해 무기산 또는 약간 강한 산, 일반적으로 예를들면 할로겐화수소산, 황산, 인산, 질산, 아세트산, 시트르산, 아스파르트산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산, 술파닐산을 사용하여 제조하는 것이 적합하다.

알칼리 금속염, 알칼리토 금속염, 암모늄염 및 유기 암모늄염(예, 알칼암모늄염)과 같은 염기 부가염은 공지의 방법으로 제조된다. 경우에 따라서는, 제조의 용이성 및 바람직한 용해도 특성에 비추어볼 때, 이러한 염기 부가염이 적합할 수 있다. 또한 염기 부가염은 리신, 아르기닌 또는 글리신염과 같은 염기성 아미노산 부가염도 포함한다.

항생물질 L 17054와 그 염의 특성이 유사함에 비추어서, 항생물질 L 17054의 생물학적 활동도를 다룰 때에 본 출원에 기재된 것은 또한 이 항생물질의 제약상 허용되는 그의 염에도 적용된다.

항생물질 L 17054의 시험관내 항균 활성은 마이크로 적정 시스템의 2배 희석법을 사용하여 측정하였으며, 그람양성균에 대하여 주로 활성을 나타냈다. 이소센시테스트 배지(옥소이드)와 토드-히위트(Todd-Hewitt) 배지(디프코)를 포도상구균속(Staphylococci)과 연쇄상 구균속(Streptococcus) 각각에 사용하였다. 배지는 최종 접종물이 약 10⁴콜로니 형성 단위/1ml(CFU/ml)가 되도록 희석하였다. 최소 억제 농도(MIC)는 37℃에서 18-24시간 배양 후, 뚜렷한 성장이 보이지 아니하는 최저 농도를 뜻한다. 얻어진 결과를 하기 표 1에 요약했다.

[표 1]

또한, 생체내 실험에서도 본 발명의 화합물의 항균 활성이 확인되었다.

마우스에 화농연쇄상구균 C 203의 현탁액을 복강내로 투여해서 실험적으로 감염시켰다. 접종물은 미처리동물이 48시간 내에 패혈증으로 사망하도록 조정하였다. 동물을 감염시킨 후 즉시 본 발명의 화합물을 피하로 투여하기 시작하여 3일간 하루 1회씩 투여하였다. ED₅₀값은 각 투여량에서 생존 백분율에 기초해서 스피어만(Spearman)과 카버(Karber)의 방법(D.J.Finney "Statistical Methods in biological assay", Griffin, 524페이지, 1952)으로 제10일째 되는 날에 계산하였다. 상기 조건에서, 항생물질 L 17054의 ED₅₀값은 2.64㎎/㎏/일 이었다.

마우스(복강내)에서 항생물질 L17054의 대략적인 급성 독성은 당 업계에 알려진 방법으로 측정하며, 대략적인 LD₅₀은 복강내 투여로 마우스에 투여할 경우 약 1660㎎/㎏임이 발견되었다.

상기 사실에 비추어, 본 발명의 화합물은 병원균에 의한 전염성 질병을 치료 및 예방하기 위해서 인체 의약품 및 수의약품에 사용하는 항균제의 유효 성분으로서 효과적으로 사용할 수 있다. 상기 병원균은 상기 유효 성분에 의해 영향을 받기 쉽다. 본 발명의 화합물은 경구, 국소 또는 비경구로 투여할 수 있다. 그러나, 비경구 또는 국소 투여가 적합하다. 특히 바람직한 것은 근육내 투여에 적합한 제약 조성물이다. 투여 경로에 따라서, 본 발명의 화합물은 여러 가지 투여 형태로 제제할 수 있다. 적당한 약제의 제제는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Handbook, Mack Publishing Company, U.S.A. 제15판(1975)]와 같은 간행물을 참조하여, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자가 제조할 수 있다.

국소 투여의 경우에, 본 발명의 화합물은 코, 목 또는 기관지 등의 점막을 통하여 흡수하기에 적합한 형태로 제조할 수 있으며, 액상 분무제 또는 흡입제, 로젠지제 또는 인두용 페인트제의 형태로 편리하게 제조할 수 있다. 눈 또는 귀에 투약하기 위하여, 액상 또는 반액상 형태로 제제할 수 있다. 국소 투여용은 연고제, 크림제, 로숀제, 페인트제 또는 분말제와 같은 소수성 또는 친수성 기재로 제제할 수 있다. 주사용 조성물은 현탁액제, 용액제 또는 유성 또는 수성 매질 중의 에멀젼제와 같은 형태로 제조할 수 있으며, 이 주사용 조성물은 방부제, 현탁화제, 안정화제 및(또는) 분산제와 같은 조제(助劑)를 함유해도 좋다.

별법으로서, 유효 성분은 운반시 멸균수와 같은 적당한 부형제를 이용하여 재구성하기 위한 분말 형태로 제조할 수 있다. 유효 화합물은 직장내, 질내 또는 요도내에 투여할 수 있는 좌약 형태로 제제할 수 있다. 부형제로는 이러한 약제에 통상적으로 사용하는 것들, 즉 폴리비닐피롤리돈, 코코아 버터, C₁₂-C₁₈지방산의 트리클리세리드, 폴리에틸렌 글리콜 및 계면 활성제와 같은 것이 사용될 수 있다. 화합물의 투여량은 감염의 심도, 환자의 특성 및 체중, 유효 성분이 투여되는 약제의 형태, 투여 방식, 환자의 일반적인 건강 상태 및 연속 투여 사이의 간격에 따라서 변한다. 상기한 변수를 고려해서, 때때로 투여량을 변경시킬 필요가 있다. 일반적으로, 항생물질 L 17054 및 그의 제약상 허용되는 염의 1일 투여량은 체중 1㎏당 유효 성분 약 0.1 내지 20㎎이 1일 유효하며, 특히, 1일 2-4회 분할해서 투여하는 것이 적합하다. 특히 바람직한 약제는 투여 단위체 당 유효 성분 약 5 내지 약 250㎎을 함유하는 투여 단위체 형태로 제조한 것들이다.

제약 조성물의 대표적인 제조예는 다음과 같다.

비경구용 용액제는 항생물질 L 17054의 나트륨염 100㎎을 주사용 멸균수 2ml 중에 용해시켜서 제조한다.

비경구용 용액제는 항생물질 L 17054의 나트륨염 250㎎을 주사용 멸균수 3ml 중에 용해시켜서 제조한다

국소용 연고제는 항생물질 L 17054 200㎎, 폴리에틸렌 글리콜 4000(U.S.P.) 600㎎ 및 폴리에틸렌 글리콜 400(U.S.P.) 1.2g으로 제조한다.

본 발명의 화합물은 의약품으로서의 활성 이외에도, 동물 성장 촉진제로서도 사용될 수 있다. 이 목적을 위하여, 본 발명의 화합물은 적당한 사료에 첨가해서 경구로 투여할 수 있다. 사용되는 정확한 농도는 정상적인 양의 사료를 급식할 때에 유효 성분을 성장 촉진에 유효한 양으로 제공하기에 필요한 농도이다. 동물 사료에 본 발명의 화합물을 첨가하는 것은 유효량의 유효 성분을 함유하는 적당한 사료 프리믹스를 만들고, 이것을 완전한 정량의 사료에 혼합하는 것이 바람직하다. 다른 방법으로는, 유효 성분을 함유하는 중간 농축물 또는 사료 보충물을 사료에 혼합시킨다. 이러한 사료 프리믹스 및 완전한 정량의 사료를 제조하고, 이를 급식하는 방법은 참고 문헌 ["Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 또는 "Livestock Feeds and Feeding", O and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977]에 기재되어 있다.

[실시예 1]

[항생물질 L 17054의 제조]

테이코플라닌 5g을 80℃로 예열시킨 0.5N 염산 수용액 60ml에 격렬하게 교반하면서 첨가했다. 교반을 계속하고, 온도를 약 80℃에서 30분 동안 유지했다. 이어서, 이 혼합물을 급속하게 여과하고, 여액을 0°-5℃로 냉각한 후, 여기에 6N 염산 10ml를 첨가했다. 생성된 현탁액의 온도를 0°-5℃로 유지하면서 약 15분 동안 교반했다. 침전물을 모으고, 차가운 1N HCI 20ml로 세척한 후, 에틸 에테르로 세척하고, 감압 하실온에서 건조시켜 조 항생물질 L 17054 4.5g을 얻었다.

[실시예 2]

[조 항생물질 L 17054의 정제]

상기 실시예에서 얻어진 조 항생물질 L 17054 7.5g을 90% 메탄올 500ml에 용해하고, 이 용액에 실리카겔(Merck 0.06-0.2)을 첨가하고, 용매를 완전히 증발 제거했다. 잔류물을 아세토니트릴에서 제조한 실리카 겔 칼럼(400g)에 충전했다. 칼럼을 물의 함량을 증가(0%-15%)시키면서 아세토니트릴과 물의 혼합물로 용출하고, 용출된 분획물을 버렸다. 이어서, 칼럼을 357ml/시간의 유속으로 아세토니트릴과 물의 혼합물을 85 : 15에서 약 70 : 30(v/v)으로 선형 구배로 용출하여 전개했다. 분획물을 25ml씩 모았다. 항생물질 L 17054를 함유하는 분획물(분획물 350 내지 400개)을 합쳤다. 이 합친 분획물에 n-부탄올을 첨가하고, 이 혼합물을 농축해서 물로 포화시킨 부탄올 용액을 얻었다. 이 용액을 약 10℃로 냉각시킨 후, 침전물이 형성되기 시작했다. 침전이 완료된 후, 고상물을 여과시켜 분리하고, 아세톤으로 세척한 후 다시 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜서 순수한 항생물질 L 17054를 얻었다. 또한, 상기 모액을 농축시켜 완전히 물을 제거하고, 아세톤/에틸 에테르로 석출시킴으로써 순수한 항생물질 L 17054를 얻었다.

[실시예 3]

[실란화 실리카 겔 칼럼 크로마토그라피에 의한 항생물질 L 17054의 정제]

실시예 1에서 얻은 조 항생물질 L 17054 3g을 0.2% HCOONH₄수용액과 CH₃CN(95 : 5(v/v))의 혼합물 150ml에 현탁시켰다. 이 현탁액에 1N NaOH를 첨가해서 pH를 약 7.5로 조절하고, 생성물을 용해시켰다. 생성된 용액을 동일한 용매 혼합물에서 제조된 0.06-0.2mm 실란화 실리카 겔 Merck 150g을 함유하는 칼럼에 충전했다. 이 칼럼을 0.2% 포름산암모늄 수용액에서 아세토니트릴을 5%(v/v)에서 21%(v/v)로의 선형 구배로 용출시켜 전개하고, 분획물을 20ml씩 모으고, 이 분획물을 HPLC로 모니터했다. 항생물질 L 17054를 함유하는 분획물(70 내지 96개)을 혼합하고, 아세토니트릴을 진공하에서 제거했다. 잔류하는 수용액을 증류수 중의 실란화 실리카 겔 10g을 함유하는 칼럼에 충전했다. 염이 완전히 제거될 때까지 증류수로 세척한 후, 생성물을 CH₃CN와 H₂O의 혼합물(1 : 1(v/v))로 용출했다. 한데 모은 용액을 소용적으로 진공 농축하고, 1N 염산을 사용하여 pH 3.5로 산성화시킨 후, 아세톤을 첨가해서 상기 항생물질을 석출시켰다. 실온에서 건조시킨 후, 순수한 항생물질 L 17054 0.9g을 얻었다.

Claims

테이코플라닌 A₂, 그의 순수 인자 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 항생물질을 HPLC 또는 TLC로 모니터하면서, 온화하게 산 가수분해로 처리한 후, 항생물질 L 17054를 회수 및 정제하거나, 이 항생물질을 제약상 허용되는 그의 염으로 전환시키는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특징을 갖는 하기 구조식의 항생물질 L 17054 또는 제약상 허용되는 그의 염의 제조방법.

상기 식중, R'는 다음 구조식
의 기임.

a) 비선광도

b) pH〉8.0의 물, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 프로필렌 글리콜 및 메틸셀로솔브 중에 자유롭게 용해되고, 메탄올 중에 약간 용해되고, 에틸에테르 및 아세톤 중에는 거의 불용성임.

c) 다음과 같은 최대 흡수치를 가지는 자외선 흡수 스펙트럼 :

-0.1N 염산에서

-0.1N 수산화나트륨에서

-pH 7.4의 인삼염 완충액에서

d) 다음과 같은 최대 흡수치(㎝^-1)를 가지는 적외선 흡수 스펙트럼(뉴졸) : 3700-2000, 2970-2850(뉴졸), 1655, 1610, 1595, 1515, 1490, 1460(뉴졸), 1375(뉴졸), 1300, 1230, 1145, 1060, 1020, 970, 890, 850, 820.

e)시료를 불활성 분위기 하에서 약 140℃에서 미리 건조시킨 후 (중량 손실=7.8％) 원소 분석을 행했으며, 이것은 다음과 같은 대략적인 백분율 조성(평균치)를 나타냄 : 탄소 55.46％, 수소 4.50％, 질소 7.20％, 염소 4.67％, 화분 0.2％.

f) TLC 시스템에서는 다음의 Rf치를 나타냄 :

가시화 : 254㎚의 자외선 ; 3％ 에탄올성 닌히드린 ; 1％ 메탄올성 플루오레스카민.

g)체류시간(t_R)=8.3분[150×4.0㎜ Zorbax
ODS(5-6㎛) 칼럼(Zorbax
)는 옥타데실실란 실리카 겔 매트릭스에 대한 듀퐁사의 상표임)을 사용하고, 용액 A중에서 용액 B를 0％에서 50％까지 선형 구배하여 유속 2㎖/분으로 40분 이내 용출시키는 HPLC(내부 표준물 : 3,5-디히드록시톨루엔, t_R=5.60분)로 분석했음]

[여기서, 용액 A는 0.1N 수산화나트륨으로 pH 6.0이 되도록 완충시킨 25mM NaH₂PO₄/아세토니트릴(9/1)이고, 용액 B는 0.1N 수산화나트륨으로 pH 6.0이 되도록 완충시킨 25mM NaH₂PO₄/아세토니트릴(3 : 7)임]

h) 시료농도 20㎎/㎖로 60℃에서 DMSO-d₆을 사용하여 270MH_Z의 NMR로 기록했을때 제3도에 나타낸 것과 같은¹H NMR 스펙트럼을 가짐(내부 표준물, TNS,δ=0.00ppm). D₂O에서의 교환 및 선택적인 스핀작용 제거(decoupling) 실험 후 얻은¹H NMR 데이터의 일부는 다음과 같음(δppm, 다중도) : 1.88, s; 2.85, d; ∼3.5, dd; 3-4; 4.20, d; 4.48, d; 4.50, d; 4.62, s; 4.96, ddd; 5.18, d; 5.31, s; 5.35, d; 5.39, s; 5.68, d; 5.71, s; 6.20, d; 6.41, s; 6.51, s; 6.56, s; 6.74, d; 6.77, s; 6.80, s; 6.80, d; 6.98, d; 7.08, s; 7.15, d; 7.21, d; 7.28, d; 7.35, d; 7.50, d; 7.56, d; 7.64, d; 7.73, d; 7.86, s; 8.42, d.

i) 메틸셀로솔브 : 물(4 : 1)의 혼합 용매 중에서 과량의 0.01N HCI을 함유하는 피시험 화합물의 용액을 0.01N NaOH로 전위차 적정했을때, 상기 용매 중에서 pH1/2치가 5.0(1당량), 7.0(1당량) 및 11(5당량)인 적정 기울기를 나타냄.

j) 염을 형성할 수 있는 산으로서의 기능을 가짐.

k) 염을 형성할 수 있는 염기로서의 기능을 가짐.

l) 2종류의 당 잔기 D-만노오스와 N-아세틸-D-글루코사민을 가짐.
제1항에 있어서, 온화한 산 가수분해를 1N 이하 농도의 염산을 사용하여 행하는 방법.
제2항에 있어서, 온화한 산 가수분해를 0.1N 내지 0.8N 농도의 염산을 사용하는 행하는 방법.
제1항에 있어서, 온화한 산 가수분해를 약 0.5N의 염산을 사용하여 행하는 방법.
제1항에 있어서, 가수분해를 70℃ 내지 90℃의 온도에서 행하는 방법.
제1항에 있어서, 정제를 분배 크로마토그라피법으로 행하는 방법.
제1항에 있어서, 정제를 조절된 입도의 실리카 겔 또는 실란화 실리카 겔을 흡착제로 사용하는 분배 크로마토그라피법에 의하여 행하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제 과정이 흡착제로서 실란화 실리카 겔을 사용하고 용출제로서 0.2％의 포름산암모늄 수용액과 아세토니트릴의 혼합물을 사용하는 제1크로마토그라피 단계에 의해 이루어지거나, 또는 흡착제로서 실란화 실리카 겔을 사용하고 용출제로서 아세토니트릴과 물(1 : 1)의 혼합물을 사용하는 제2크로마토그라피 단계를 포함하는 분배 크로마토그라피법에 의하여 수행되는 방법.