KR0153808B1

KR0153808B1 - 단일클론항체를 이용한 재조합 인간 에리스로포이에틴의 정제 방법

Info

Publication number: KR0153808B1
Application number: KR1019940032994A
Authority: KR
Inventors: 오명석; 김현수; 이동억; 하병집; 유리안; 김석준; 박완제; 이상옥
Original assignee: 김정순; 제일제당주식회사
Priority date: 1994-12-06
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 1998-10-15
Also published as: KR960023080A

Abstract

본 발명은 인간 에리스로포이에틴 단백질을 에리스로포이에틴에 특이적인 결합능력을 갖는 단일클론항체가 부착된 컬럼, 하이드록시아파타이트 컬럼, 이 온교환수지 컬럼에 순서대로 차례로 통과시킴으로써 에리스로포이에틴 중합체, 엔도톡신, 이종단백질, 누출된 단일클론항체 및 DNA등의 불순물이 제거된 극히 순수한 상태로 재조합 에리스로포이에틴을 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

단일클론항체를 이용한 재조합 인간 에리스로포이에틴의 정제 방법

제1도는 정제된 에리스로포이에틴을 은 염색한 결과를 나타낸 것이다.

제2도는 정제된 에리스로포이에틴의 웨스턴 분선 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 인간 에리스로포이에틴(이하, EPO로 약칭한다)의 정제방법에 관한 것이다.

좀더 구체적으로, 본 발명은 인간 EPO에 특이적 결합능력을 갖는 단일 클론항체를 이용하여 생물학적 활성을 갖는 인간 EPO를 생산 및 분비할 수 있도록 EPO를 코드화하는 유전자로 형질전환된 세포주의 배양액으로부터 인간 EPO단백질을 순순하게 정제하는 방법에 관한 것이다.

EPO는 고등 생물체내에서 적혈구 형성을 자극하는 순환 당단백질로서 적혈구 형성 자극이자로 불리운다.

인간 적혈구의 수명은 약 120일이므로 전체 적혈구 중 약 1/120이 매일 세망내피 조직계 내에서 파괴되는 동시에 일정 수의 적혈구가 매일 생성되어 건강한 사람은 체내 적혈구의 농도가 거의 일정하게 유지되는데, 이러한 적혈구의 생성은 골수에서 적아구의 성숙 및 분화에 의하여 이루어지며 이때 EPO는 덜 분화된 세포에 작용을 함으로써 적혈구로의 분화를 유도하는 작용을 한다(참조:Guyton, Textbook of Medical Physiology, pp 42-50, 1986). 따라서, EPO는 빈혈, 특히 신장성 빈혈의 임상적 치료에 유용한 치료제로 이용된다.

따라서, 이와 같이 유용하게 이용되는 EPO를 대량으로 생산하는 것이 필요하며 대량 생산을 위해서는 유전자 재조합 법을 이용할 수밖에 없는데, 유전자 재조합 법에 의해 생산된 단백질을 인체에 사용하기 위해서는 극히 엄격한 안전성 확인 절차를 거쳐야 하며, 그러기 위해서는 극히 고순도의 정제 과정이 필요하게 된다.

여러가지의 정제 방법 중에서도 정제하고자 하는 단백질에 특이적인 단일클론항체를 이용하는 정제 방법은 효율면에 있어 다른 정제방법에 비해 우월하며, 그 효과는 재조합 알파인터페론 정제시 이미 입증된 바 있다(참조:대한민국 특허 공고 88-1757호). 그러나 상기 방법은 정제를 위해 담체에 부착된 단일클론항체가 시료 용리시 소량 누출되고, 누출된 단일클론항체는 마우스 유래의 단백질이므로 인체에 항원으로 작용할수 있으며, 이러한 면역 작용은 약물을 투여받은 환자에게 아나필락시 쇼크와 같은 급성 알러지 반응을 유발시킬 수도 있다는 문제점을 가지고 있따. 또한, 일본 설인유업에 의한 방법(참조:JBC, vol, 259, 2707-2710, 1984)에서도 단일클론항체를 이용하여 EPO를 정제하고 있는데, 이 방법의 정제하고 있는 조 EPO는 유전자 재조합 법이 아닌 뇨(Urine)로 부터 얻어진 것으로서 정제하고자 하는 대상이 상이하여 방법의 효율 면에서도 정제후의 순도 및 수율이 저조하여 산업적으로 적용하기에는 문제가 있다.

이에 따라 본 발명자들은 유전자 재조합 법에 의해 생산된 다량의 EPO를 단일클론항체를 이용하여 정제하는 방법을 개발함에 있어서, EPO를 투여받는 환자에세 전혀 면역 반응을 일으키지 않는 동시에 인체에 적용할 수 있는 정도의 고순도로 정제할 수 이는 효율적인 방법을 찾기 위해 부단히 연구해 온 결과, EPO에 대해 특이적 결합력을 갖는 특정의 단일클론항체를 부착시킨 컬럼 크로마토그래피 법을 기타 불순물을 제거할 수 있는 기존의 공지된 크로마토그래피법과 결합시켜 EPO를 정제하게 되면 이와 같은 목적을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명의 구성을 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 인간 EPO단백질을 EPO에 특이적인 결합능력을 갖는 단일 클론항체가 부착된 컬럼, 하이드록시아파타이트 컬럼, 이온교환수지 컬럼에 순서대로 차례로 통과시킴으로써 EPO중합체, 엔도톡신, 이종단백질, 누출된 단일클론항체 및 DNA등의 불순물이 제거된 극히 순수한 상태로 재조합 EPO를 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서 원료 물질로 사용한 조 EPO액으로는 EPO를 코드화하는 유전자에 의해 형질전환된 진핵세포를 소태아 혈청이 5%포함된 DMEM:F12 혼합배지에서 3일간 배양한 배양액 10ℓ를 원심분리(Sorvall, 4, 000rpm, 15분)한다음 얻어진 상등액을 사용하였는데, 이때 진핵세포로는 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포가 바람직하고, 특히 EPO를 코드화하는 유전자에 의해 형질전환되고 이에 따라 기탁이 완료된 CHOEp-cfc33(기탁번호:KCLRF-BP-00007)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 용액중의 단백질 함량은 혈청 알부민을 표준물질로 하여 브랜드포드 방법(참조:Bradford, M, M. Anal. Biochem. 72, 248-254-1976)에 따라 측정하며, 정제도는 라에믈리 방법(참조:Laemmli, U.K., Nature227, 680-683, 1970)에 따라 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후 은 염색(Silvers-taining)하여 확인한다. 이때 필요하다면, β-머캅토 에탄올이 들어있지 않은 비환원 조건하에서 측정할 수도 있다.

한편, 본 발명자들은 재조합 인간 EPO를 정제하기에 특히 유용한 단일 클론항체를 신규로 제조하여 사용하였다. 따라서. 그 제조 방법을 간단히 설명하면 다음과 같고, 이는 하기 참고예에 의해 보다 구체적으로 설명된다.

인간 EPO에 대해 특이적 결합능력을 갖는 단일클론항체를 얻기 위해서는 먼저 이를 생산할 수 있는 융합 세포주를 제조해야 한다. 따라서, 일정한 기간을 두고 2회에 걸쳐 EPO로 면역시킨 동물의 비장세포와 골수종 세포의 일종인 8-아조구아닌(8-Azoguanine)내성을 나타내는 형질세포 NS-O(참조 : Galfre, G and Milstein, c.Methods Enzymol.73, 3, 1981)를 융합시키고, 일정한 선별 과정을 거쳐 항체생산 안정성이 확인된 2개의 융합 세포주를 분리하였으며, 분리된 2개의 융합 세포주를 각각 cfc-6및 cfc-9로 명명하고 이를 1994년 10월 26일자로 서울대학교 의과대학 부설 한국 세포주 연구 재단(Korean Cell Line Research Foundation Directro)에 부다페스트 조약하의 기탁을 완료하였다. 기탁번호는 각각 KCLRF-BP-00008 및 KCLRF-BP-00009이다. 한편, 인간 EPO에 대한 단일 클론항체는 상기에서 수득된 융합 세포주 cfc-6 또는 cfc-9를 적당한 배지에서 배양하고 이 배지로 부터 암모늄 설페이트 침전법 및 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 분리함으로써 수득한다.

이와 같은 방법으로 수득된 인간 EPO에 대해 특이적인 단일클론항체는 본 발명에 따른 EPO의 정제 방법에 이용하기 위해 통상의 방법에 따라 컬럼의 레진에 부착시킨다. 이때 레진의 종류는 단일클론항체를 부착시켜 사용할 수 있는 것이면 어떤 것이든지 가능하나, 일반적으로 세파로스 레진을 이용하며, 본 발명에서는 세파로스 4B레진을 바람직하게 이용하였다.

본 발명에 따라 EPO를 정제함에 있어서 사용하는 컬럼 크로마토그래피법은 크로마토그래피를 수행하는 통상의 방법에 따라서 그 컬럼의 특성에 맞게 수행하며, 특히 이온교환수지 크로마토그래피법에 있어서는 QAE세파로스 및 SP-토요펄 컬럼 중에서 1종을 선택하여 택일적으로 수행하여도 동일한 효과를 얻을 수 있다.

결과적으로, 본 발명은 EPO에 대해 특이적인 결합능력을 갖는 단일클론항체를 이용한 크로마토그래피법을 하이드록시아파타이트 컬럼 및 이온교환수지 컬럼에 의한 크로마토그래피법과 결합시킨 점에 특징이 있는 것으로써, 본 발명의 방법에 따라 재조합 인간 EPO단백질을 정제하게 되면 간편한 정제과정을 통해서도 환자에게 투여시 전혀 면역 반응을 일으키지 않을 뿐아니라 환자에게 치료목적으로 적용할 수 있을 정도로 추분히 정제된 고순도의 단백질을 고수율로 수득 할 수 있는 효과를 지닌다. 예를들어, 본 발명에 따라 최종 정제된 EPO는 조 EPO액에 비해서 순도면에서 약 330배 이상으로 정제됨을 확인할 수 있었다.

더구나, 정제 과정을 거쳐 최종적으로 수득된 단백질에 대해 RIA및 LAL테스트를 적용하여 조사해본 결과 본 발명에 따라 정제된 EPO에는 정제 과정에서 누출될 수 있는 단일클론항체가 검출 한도내에서 전혀 존재하지 않는 것으로 나타났으며, 인체에 해를 끼지는 엔도톡신도 일만 단위의 EPO활성당 1EU이하로 검출되어 그 존재를 무시할 수 있을 정도였다. 따라서, 본 발명에 따라 정제된 제도합 인간 EPO는 치료 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다. 한편, 정제된 EPO의 은염색 결과 및 웨스턴 분석 결과는 각각 제1도 및 제2도에 나타내었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 의미로든 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1]

[융합 세포주 cfc-6 및 cfc-9의 제조]

순수 정제된 EPO로 생쥐를1차 면역시킨지 한달후 2차 면역을 시행하였으며, 2차 면역한지 3일후 생쥐로부터 비장세포를 10³개 취하여 DMEM 배지로 세척하였다. 또한 δ-아조구아닌(8-Azoguanine)내성을 나타내는 형질세포(NS-O)를 약 3.8x10⁷정도 채취하여 동일 배양액으로 세척하였다. 이들 2종의 세포를 함꼐 혼합한 다음, 50% Peg용액의(pH9.0) 0.5mL로 30초 동안 처리한후, 다시 50% PEG와 20% DMSO의 혼합 용액으로 30초 처리하여 세포용합 반응을 실시하였다.

DMEM배지로 세포들을 3회 세척하고, 96웰(well)플레이트에 웰 당 2.5x10⁴의 세포수가 되게 가하였다. 이때 배양액으로는 일정량의 HAT(하이 포크산틴 10⁴M, 아미노프테린 6x10⁷M, 티미틴 1.6x10^-6M)가 첨가되고 5%의 송아지 혈청이 포함되어 있는 DMEM을 사용하였다. 세포융합 반응을 수행한지 2주일 후부터 각 웰 내의 배양액에서 EPO에 대한 특이 항체의 존재 여부를 검색하였고, 이를 위한 검색방법으로는 극소량의 항체를 검출할수 있는 ELISA방법을 사용하였다. 이와 같은방법을 통해 1, 000개 정도의 융합 세포주를 얻었으며, 이로 부터 고역가로 단일클론항체를 분비하는 30개의 세포를 분리하였다.

그러나, 1차 클록속에는 항체생산 세포 뿐만아니라, 다른세포들도 포함되어 있어서 다른 세포들의 과잉성장으로 말미암은 항체생산 세포의 희석 가능성이 있다. 따라서, 클론들이 자라는 웰로 부터 가능한 한 빨리 항체생산 세포를 분리해 내야 하므로 본 발명에서는 서브클로닝 방법으로 소프트 아가로스(soft agarose)방법을 사용하였다. 즉, 0.8%의 아가로오스 HAT가 포함되어있는 배양액에 가하고, 여기에 1차 클론들을 첨가하여 2주 동안 배양하였다. 2주일 후무작위로 20개씩을 선정하여 EPO에 대한 특이항체의 생산여부를 확인 하였고, 세포주 중에서 6개월 후까지 항체생산 안정성이 확인된 2개주를 분리하여 각각 cfc-6 및 cfc-9로 명명하였고 이를 1994년 10월 26일자로 서울대학교 의과대학 부설 한국 세포주 연구 재단(Korean Cell Line Research Foundation Director)에 부다 페스트 조약하의 기탁을 완료하였다(기탁 번호; KCLRF-BP-00008 및 KCLRF-BP-00009).

[참고예 2]

[인간 에리스로포이에틴에 대해 특이적 결합력을 갖는 단일 클론항체의 제조]

참고예 1의 방법에 따라 생성된 융합 세포주 cfc-6 및 cfc-9를 각각 5%송아지 혈청이 포함된 RPMI 1640배지에서 배양하였다. 배양액을 1ℓ씩 모은 후 4℃에서 10분간 10, 000rpm(Sorvall)으로 원심분리하여 세포를 제거하였다. 2M Tris 액을 이용하여 상등액을 pH8로 조정한 다음 50%가 되도록 암모늄 설페이트를 가하여 용액중의 항체 단백질을 침전시킨다. 침전물을 원심분리하여 수거한 후 50㎖ 완충용액(50mM Tris-HCl+100mM NaCl, pH 7.2)에 녹여서, 동일한 완충용액으로 투석(Diafiltration)하였다. 동일 완충용액 100㎖로 DEAE Affi-Gel Blue(Bio Rad 사)컬럼을 평형화 시킨후 투석여액을 통과시켰다. 역시 동일한 완충용액 100㎖로 컬럼을 세척한후, 용리용액(50mM Tris-HCl+500mM NaCl, pH7.2)70㎖로 용리시켜 정제된 상태의 항체 단백질을 수득하였다.

[실시예 1]

[EPO 단일클론항체가 부착된 세파로스 4B컬럼에 의한 EPO의 정제]

건조된 CNBr 30g으로 활성화시킨 세파로스 4B(Pharmacia사)에 1mM염산 6ℓ를 부어서 스웰링(swelling)시켰다. 완충용액(0.1M NAHCO₃+0.5M NaCl, pH 8.3)으로 겔을 3회 세척한 후, 150㎖의 동일 완충용액 속에 겔을 넣어두었다. 여기에 융합 세포주cfc-6으로 부터 얻어진 항 EPO단일클론항체를 정제하여 450㎖넣은 후 전제부피를 200㎖로 맞추고 4℃에서 밤새 진탕하였다. 상등액을 따라낸 후, 방해 완충용개(1M에탄올아민, ph 8.0)에 넣고 16시간동안 4℃에서 방치하였다.

항 EPO단일클론항체가 부착된 세파로스 4B 100㎖를 컬럼에 충진 시킨후, 완충용액(50mM소듐 포스페이트+0.15M NaCl, pH 7.0)0.5ℓ를 사용하여 평형화 시켰다. 조 EPO액 2ℓ중에는 EPO가 총 2, 954, 000단위 함유되어 있고 총 단백질 양은 4, 208㎎을 함유하고 있다. 조 EPO액을 컬럼에 통과시킨후, 컬럼을 완충용액(50mM소듐 포스페이트+0.5M NaCl, pH 7.0)300㎖를 사용하여 세척하였다. 용리용액(0.1M 시트르산)82㎖를 사용하여 EPO를 용리시킨후 즉시 용리된 용액의 pH를 8.0으로 조절하였다. 회수된 EPO의 총활성은 2, 600, 000단위로서 88%의 회수율을 나타냈고 단위역가는 65.1단위/㎍으로서 순도가 약93배 증가하였다.

[실시예 2]

[하이드록시아파타이트 컬럼에 의한 EPO의 정제]

하이드록시아파타이트(Bio Rad사)50㎖를 컬럼에 충진시킨 후, 완충 용액(20mM 소듐 포스페이트, pH 7.0)0.3ℓ를 사용하여 평형화 시켰다. 실시예1의 단일클론항체가 부착된 세파로스 컬럼의 용출 용액을 동일한 완충용액으로 평형화시킨 다음 컬럼에 통과시켰다. 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH 7.0)120㎖를 사용하여 컬럼을 세척하였다. 이 세척된 분획 즉, 레진에 흡착되지 않고 빠져나온 분획에 EPO단백질 1, 846, 000 단위가 함유되어 있는 것으로 측정되었으므로 이로 부터 수율은 71%로 계산되었다. 또한, 단위역가는 151.4단위/㎍로 측정되었는데, 이는 조 EPO액을 기준으로 할때 순도가 216배 가량 증가된 것이다.

한편, 여기서 모아진 분획은 둘로 나누어 하기 실시예 3과 4에서 각각 사용하였다.

[실시예 3]

[QAE세파로스 컬럼에 의한 EPO의 정제]

QAE세파로스(Pharmacia사)100㎖를 컬럼에 충진시킨 후, 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH 7.0)0.5ℓ를 사용하여 평형화 시켰다. 하이드록 시아파타이트 컬럼 크로마토그라피에서 얻어진 EPO단백질 함유 분획을 컬럼에 통과 시킨후 mM의 NaCl이 포함된 완충용액 250㎖를 사용하여 컬럼을 세척하였다. 세척이 끝난 후, 용리용액(50mM소듐 포스페이트+200mM NaCl)150㎖를 사용하여 EPO를 용리시켰다. 수득된 EPO는 총 757, 000 단위로서 이로 부터 수율은 82%로 계산되었다. 또한, 단위 역가는 232단위/㎍로 측정되었는데, 이는 조 EPO액을 기준으로 할때 순도가 330배 가량 증가된 것이다.

[실시예 4]

[SP-토요펄 컬럼에 의한 EPO의 정제]

SP-토요펄(토요하스사)50㎖를 컬럼에 충진시키고 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH 5.1)300㎖를 사용하여 컬럼을 평형화 시켰다. 하이드록 시아파타이트 컬럼 크로마토그라피에서 얻어진 EPO단백질 함유 분획을 동일한 완충용액으로 평형화시킨 후 컬럼에 통과시켰다. 40mM의 NaCl이 포함된 완충용액 100㎖를 사용하여 컬럼을 세척하였다. 세척이 끝난 후, 용리용액(20)mM소듐 시트레이트, pH 5.1+200mM NaCl)150㎖를 사용하여 EPO를 용리시켰다. 수득된 EPO는 총 738, 000단위로서 이로 부터 수율은 82%로 계산되었다. 또한, 단위 역가는 235단위/㎍로 측정되었는데, 이는 조 EPO액을 기준으로 할 때 순도가 335배 가량 증가된 것이다.

[실시예 5]

[정제된 EPO중의 단일클론항체 검출]

최종적으로 정제된 EPO에 정제 과정 중에 사용된 단일클론항체(마우스IgG)가 누출되었는지의 여부를 RIA(Radio Immuno Assay)방법으로 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다. 96웰 플라스틱판에 시료와 기준시료를 각각 다른 오도로 100㎕씩 차례로 가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 여기에 완충용액(10mM 소듐 포스페이트+0.7M NaCl+0.02%NaN₃, pH 7.4)을 200㎕씩 차례로 가한다음 37℃에서 1시간동안 방치하였다. 이를 다른 완충용액(10mM 소듐 포스페이트+0.7M NaCl+1, 5mM MgCl₂+2mM β-머캅토에탄올+0.05%NaN₃+0.05% 트윈 20)으로 세척하고, 양의 항-마우스 Ab(Sheep anti-mouse Ab)-I¹²⁵를 100㎕씩 가한후 37℃에서 2시간 동안 방치하였다.

동일 완충용액으로 5회 세척한 후 방사능 측정기(Gamma Counter)를 사용하여 방사능의 세기를 측정하였다. 표준곡선을 그린후, 시료의 방사능 세기를 표준곡선에 대입하여 누출된 쥐 항체의 양을 검사하였다. 그 결과, 정제도중 누출된 항체는 단일클론항체의 검출 한계까지 전혀 검출되지 않았다.

[실시예 6]

[정제된 EPO중의 앤도톡신 검출]

최종 정제된 EPO에 엔도톡신이 함유되어 있는지 여부를 LAL(Limulus Amebocyte Lysate)테스트로 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.

엔도톡신은 LAL에 존재하는 전구효소(proenzyme)의 활성화를 촉매하며 활성화된 효소는 다시 무색의 기질인 Ac-I-E-G-R-pNA로 부터 p-니트로아 닐리드를 절단해 내는 작용을 촉매하는데, 이때 활성화의 초기속도는 존재하는 엔도톡신의 농도에 비례하므로 이를 이용하여 엔도톡신의 양을 측정하였다. 즉, 최종 정제된 EPO와 표준시료를 각각 100㎕씩 취하여 37℃로 항온화되고 파이로겐이 없는(pyrogen-free)것은로 확인된 튜브에 넣은 후, 각각의 듀브에 LAL을 100㎕씩 가하고 잘 혼합하였다. 10분 경과후에 다시 기질용액 200㎕를 가하고 잘 혼합하였다. 3분경과후 50%초산용액 20㎕를 가하고, 405nm에서 각 튜브의 흡광도를 측정한후, 표준곡선을 그렸다. 정제액의 흡광도값을 표준 곡선에 대입하여 엔도톡신의 양을 계산하였다. 검출된 엔도톡신의 양은 1만 단위의 EPO활성당 1EU이하로 측정되었다.

Claims

에리스로포이에틴을 함유하는 세포배양액을 융합세포주인 cfc-6(기탁번호:KCLRF-BP-00008)또는 cfc-9(기탁번호:KCLRF-BP-00009)로부터 형성된 에리스로포이에틴에 대한 단일클론항체를 부착시킨 세파로스 칼럼, 하이드록시아파타이트 칼럼, 이온교환수지 칼럼에 순서대로 통과시킴을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 분리 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 세포배양액의 형질전환된 진핵세포의 배양액인 방법.
제2항에 있어서, 형질전환된 진핵세포가 CHOEp-cfc33(기탁번호:KCLRF-BP-00007)인 방법.
제1항에 있어서, 이온교환수지 칼럼이 QAE세파로스 칼럼 및 SF-토요펄 칼럼 중에서 선택된 방법.