DE19619418C1 - Peptide des Antigens Sm-D und ihre Verwendung, insbesondere für die Diagnostik des SLE - Google Patents
Peptide des Antigens Sm-D und ihre Verwendung, insbesondere für die Diagnostik des SLEInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Peptide des Antigens Sm-D, die von
Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten erkannt werden,
insbesondere von Antikörpern, die in Körperflüssigkeiten von
Patienten auftreten, die am systemischen Lupus erythematodes
(SLE) erkrankt sind.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Peptide
und ihrer Folgeprodukte für die Diagnostik von SLE in vitro,
sowie ihre Verwendung als Vakzine zur Erzeugung von
Toleranzmechanismen und die Bereitstellung immunogener und
antigener Kompositionen und von Testkits.
Außerdem betrifft sie Antikörper, die durch diese Peptide in
vivo induziert werden sowie ein Verfahren zur Bestimmung von
Anti-Sm-D-Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten.
Es ist bekannt, daß viele Autoantigene in enger räumlicher
Beziehung zueinander stehen. So bilden z. B. die Sm- und die
verschiedenen RNP-Proteine einen Ribonukleoproteinkomplex, der
im Kern eukarioter Zellen vorhanden ist (snRNP). Anti Sm-
Antikörper erkennen verschiedene Proteine des snRNP-Komplexes,
die als B′, B, D, E, F und G bezeichnet werden. Dieser Komplex
spielt wahrscheinlich eine zentrale Rolle beim Splicen der
prä-mRNA, wobei das Sm-D-Protein ein wichtiges
Regulationsprotein darstellt, indem es die Bindung
verschiedener RNA′s regulieren soll.
Welche Mechanismen zur Autoantikörperbildung führen, ist
letztlich noch ungeklärt. Auffällig ist, daß für den
Zellzyklus besonders wichtige Regulationszentren Ziel der
Autoantikörper beim SLE und ihm verwandten Syndromen sind. Bei
der Entstehung von Autoimmunerkrankungen sollen im allgemeinen
besonders wichtige Regionen von Autoantigenen erkannt werden
und ihre physiologische Funktion stören.
Bloom und Mitarbeiter konnten an Untersuchungen vom
Hybridomzellinien nachweisen, daß mittels Hybridomtechnik
produzierte Anti-Sm-Ak auch DNA erkennen können (Bloom, D.D.
et al, J. Immunol. 1993; 150 (4): 1579-1590). Die Autoren
schlußfolgerten daraus, daß für die Bildung von Anti-Sm-Ak
nicht das Sm-D-Protein allein als Antigen wirkt. Vielmehr wird
angenommen, daß sowohl das Sm-D-Autoantigen als auch die DNA
- möglicherweise als Komplex - das autoimmune Agens bilden.
Bisher konnte noch keine Bindungsfähigkeit des Sm-D-Proteins
mit der DNA festgestellt werden. Die physiologische und
pathophysiologische Bedeutung des Sm/DNA-Komplexes ist bisher
nicht bekannt.
Lebrun und Mitarbeiter führten Immunisierungsversuche an
bestimmten Mäusestämmen mit DNA durch, die sie mit einem
argininreichen Fusionsprotein koppelten und dadurch eine
Lupusnephritis erzeugen konnten (Lebrun, P. et al, Lupus 1994;
3: 47-53). Auch sie schlußfolgerten, daß bestimmte, an die
DNA-bindende Proteine notwendig sind, um eine autoimmune
Reaktion zu erzeugen.
Für den systemischen Lupus erythematodes (SLE) gelten neben
den Antikörpern (Ak) gegen native oder Doppelstrang-DNA
(dsDNA) Anti-Sm-Ak als diagnostischer Marker. Außerdem wird
ihnen eine pathogenetische Rolle bei der Entstehung von
Organschädigungen zugeschrieben. Der Nachweis der Anti-Sm-Ak
gelingt in Europa (im Gegensatz zu den Anti-dsDNA-Ak) nur bei
relativ wenigen Patienten, während sie in den USA bei ca.
einem Drittel der Patienten mit SLE bestimmt werden können.
Als Ursache wird eine andere ethnische Zusammensetzung der
Bevölkerung angesehen. (Abuaf, N. et al, Eur. J. Clin. Invest.
1990; 20: 354-359).
Es gibt verschiedene Nachweisverfahren für die Bestimmung von
Anti-Sm-Ak.
Relativ spezifische Verfahren für den Nachweis von Anti-Sm-Ak
sind die Immundiffusion und Gegenstromelektrophorese, jedoch
sind diese wenig sensitiv und zudem zeitaufwendig und teuer.
Mittels Immunoblotting können Anti-Sm-Ak je nach dem
verwendeten Antigensubstrat auch in Europa in ca. 30% der
SLE-Patienten nachgewiesen werden (Riemekasten, G. und F.
Hiepe, Z. ärztl. Fortbild. 1992; 86: 217-222). Durch dieses
Verfahren ist es möglich, Anti-Sm-Ak besser zu charakteri
sieren. So reagieren Anti-Sm-Ak-positive Patienten u. a. mit
den B′B-Proteinen sowie mit den Proteinen D,E,F und G eines
kleinen nuklearen Ribonukleoproteinkomplexes (snRNP). Während
Anti-B′B-Ak nicht so spezifisch für den SLE sind, gelten
Antikörper insbesondere gegen das D-Protein als SLE-spezifisch.
Diese Immunoblotting-Methode hat jedoch den Nachteil, daß sie
einen erheblichen Zeitaufwand erfordert und teuer ist. Darüber
hinaus wird viel Erfahrung bei der Auswertung benötigt.
Es werden deshalb in vielen Laboratorien kommerziell
erhältliche ELISA-Techniken für den Nachweis von Sm-Ak
verwendet, die sich durch eine hohe Sensitivität und durch
eine relativ einfache Durchführbarkeit bei hohem
Probendurchsatz auszeichnen. Diese Tests werden beispielsweise
auf der Basis von aus Thymusextrakten gereinigtem Sm als
Festphasen-Antigen (WO 90/10229) und rekombinant hergestelltem
Sm-Antigen (Rokeach, L.A. et al, Clin. Immunol. and
Immunopathol. 1992; 65 (3): 315-324) durchgeführt. Rokeach und
Mitarbeiter konnten erstmals die cDNA des Sm-D-Proteins
isolieren und zeigen, daß sie ein aus 119 AS bestehendes
Protein kodiert. Außerdem wurden verschiedene Peptide des
Sm-D-Antigens beschrieben.
Damit waren die Grundlagen für die Entwicklung von ELISA′s auf
der Basis von synthetisierten Peptiden geschaffen, vgl. EP 0
295 719, in dem die Anwendung von kloniertem Sm-D zur
Diagnostik des SLE beschrieben wurde.
Eine Vielzahl dieser z. T. auch kommerziell erhältlichen Tests
sind jedoch relativ instabil, zeitaufwendig und aufgrund von
falsch positiven Ergebnissen infolge von Kreuzreaktionen
weniger spezifisch (WO 90/10229).
Um die Hauptepitope des Sm-D-Proteins zu ermitteln, wurden von
James und Mitarbeitern das ganze SmD-Protein in überlappende
Oktapetide zerlegt und die Reaktivitäten im ELISA gegenüber 15
SLE-Seren untersucht (James et al, Clin. exp. Immunol. 1994;
98: 419-426). Es wurden 5 Epitope gefunden, Hauptepitope waren
ebenfalls am C-terminalen Ende sowie Epitope der AS 37-53, der
AS 69-76 und der AS 5-12. Barakat und Mitarbeiter fanden 3
Regionen des SmD-Proteins (Region 1. bis 20. AS, 44. bis 67.
AS und 97. bis zur 119. AS) mit denen zuvor im Immunoblotting
nachgewiesene Anti-SmD-Ak-positive Seren reagieren (Barakat et
al, Clin. exp. Immunol. 1990; 81: 256-262). 67% der insgesamt
18 Anti-SmD-Ak-positiven Seren reagierten mit dem Peptid 1-20,
89% mit dem Peptid 44-67 und nur 33% mit dem Peptid 97-119.
165 SLE-Seren wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität im ELISA
mit den Peptiden 1-20, 44-67 und 97-119 getestet, wobei
positive Reaktionen in 59%, 37% und 1% auftraten. Sabbatini
und Mitarbeiter fanden positive Reaktionen gegen die Region
95-119 in 25% der 48 SLE-Seren im ELISA ( Sabbatini, A. et
al, J. Rheumatol. 1993; 20: 1679-1683).
Bei all diesen Untersuchungen wurden kurzkettige Peptide
verwendet, und die Anzahl der positiven Resultate bei SLE-
Seren schwankte für das C-terminale Ende zwischen 1% und 33
% im ELISA. Damit bringen diese synthetisch hergestellten
Peptide gegenüber den kommerziell erhältlichen Tests keinen
wesentlichen Vorteil. Mit diesem Epitopmapping können nur
lineare Epitope erfaßt werden. Die Reaktivität bei
Autoimmunerkrankungen ist jedoch gegen intakte Autoantigene
gerichtet (Tan, E.M., J. Exp. Med. 1994; 179: 1083-1086).
Bei einer möglichen Verwendung der gesamten Sm-D-Antigene
besteht die Gefahr, daß wichtige Epitope durch Sekundär- und
Tertiärstruktur für die Antikörper nicht mehr zugänglich sind.
Außerdem kann durch Bindung von Teilen des Sm-D-Antigens an
andere Autoantigene, vorzugsweise DNA, eine neue Konformation
entstehen.
Ein Nachweis einer Reaktivität der Anti-La-Ak, die gegen ein
Konformationsepitop gerichtet ist, konnte mittels verschieden
langer Peptidketten des La-Proteins als Festphasenantigen im
ELISA durch Rischmueller und Mitarbeiter erbracht werden
(Rischmueller, M. et al, Clin. exp. Immunol. 1995; 101:
39-44).
In WO 91/18920 sind Peptide des Sm-D-Antigens bestehend aus 15
bis 40 Aminosäuren und ihre Verwendung für die Diagnostik des
SLE beschrieben. Diese bekannten Peptide, deren Aminosäuren
hauptsächlich N-terminal orientiert sind, weisen jedoch nur
eine niedrige Frequenz positiver Reaktionen auf (ca. 30%
positive Reaktionen).
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, spezifische
Peptide des Antigens Sm-D bereitzustellen, wobei diese Peptide
und ihre Folgeprodukte für die Diagnose von SLE besonders gut
geeignet sein sollen.
Desweiteren lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, auf der
Basis dieser Peptide einen einfachen, schnell durchführbaren
und sicheren Test zur Diagnose von SLE zu entwickeln, d. h. den
Prozentsatz von echt-positiven zu falsch-positiven Resultaten
zu senken.
Außerdem besteht die Aufgabe darin, Antikörper und
Anti-Idiotyp-Antikörper bilden oder binden zu können, die in ihrer
Spezifität den Autoantikörpern von SLE-Patienten entsprechen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der
Ansprüche realisiert.
Überraschend wurden solche Peptide, die ein
Konformationsepitop bilden und Autoantikörper binden können,
wie sie beim systemischen Lupus erythematodes (SLE) vorkommen,
in Peptiden des Proteins Sm-D mit 35 bis 45
Aminosäuresequenzen gefunden.
Es handelt sich erfindungsgemäß um die Peptide
Besonders bevorzugt ist das Peptid aus 37 Aminosäuren mit der
Struktur
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR.
Die Synthese der Peptide erfolgt nach an sich üblichen
Verfahren (Atheron, E. and R. C. Sheppard, In Solide Phase
Synthesis - A Practical Approach, IRL Press at Oxford
University Press, 1989).
Die Spezifitäts- und Aktivitätsprüfung dieser Peptide wird
mittels "Enzyme-linked immunsorbent assay" (ELISA)
durchgeführt.
Erfindungsgemäße Antikörper, die gegen Konformationsepitope
des Sm-D-Antigens gerichtet sind, sind dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide des
Antigens Sm-D erkennen können, insbesondere die oben genannten
Peptide a) bis k). Ihre Herstellung erfolgt nach an sich
üblichen Verfahren durch
- - Immunisierung von Mäusen oder Immunisierung von Milzzellen in vitro mit den erfindungsgemäßen Peptiden
- - Isolierung der Milzzellen und Fusionierung mit Krebszellen zu Hybridomzellen; Selektion positiver Klone
- - Isolierung der Antikörper.
Diese Antikörper werden sowohl in verschiedenen
immunologischen Testsystemen, in unterschiedlichen
ELISA-Testsystemen, in der Durchflußcytometrie und im Western Blot
eingesetzt.
Erfindungsgemäße Anti-Idiotyp-Antikörper, welche gegen
Antikörper gebildet werden, die gegen Konformationsepitope des
Sm-D-Antigens gerichtet sind und die die erfindungsgemäßen
Peptide erkennen, sind dadurch charakterisiert, daß sie auf
spezifische Art die Autoantikörper des SLE in biologischen
Flüssigkeiten erkennen. Ihre Herstellung erfolgt ebenfalls
nach an sich bekannten Verfahren durch Immunisierung mit den
entsprechenden Autoantikörpern.
Antigene Kompositionen enthalten erfindungsgemäß ein oder
mehrere dieser erfindungsgemäßen Peptide, bevorzugt das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR, und sind dadurch
charakterisiert, daß sie mit den Autoantikörpern, wie sie in
biologischen Flüssigkeiten beim SLE vorkommen, spezifisch
reagieren und sind ggf. an verschiedene Träger, wie
Polystyren, chemisch aktiviertes Polystyren, aktivierte
Sepharosen, Zellulosen und ähnliche gekoppelt, die die
Antigenität noch verbessern können.
Immunogene Kompositionen enthalten ein erfindungsgemäßes
Peptid oder eine Verbindung dieses Peptids mit einem
Trägermolekül oder einem anderen Auto-Ag, vorzugsweise DNA,
bevorzugt das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR,
und induzieren die
Produktion der Antikörper, die fähig sind, Autoantigene beim
SLE zu erkennen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von
Anti-Sm-D-Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten wird durchgeführt,
indem mindestens eines der erfindungsgemäßen Peptide, das ggf.
an ein Trägermaterial gekoppelt ist, oder auch ein
Anti-Idiotyp-Antikörper mit den biologischen Flüssigkeiten unter
Bedingungen, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion zulassen, in
Kontakt gebracht wird und der Nachweis dieser Antigen-
Antikörper-Reaktion durch physikalische oder chemische
Methoden erfolgt.
Gemäß der Erfindung werden die Peptide in einem Testkit für
die Bestimmung von Anti-Sm-D-Antikörpern verwendet.
Dieser Testkit ist gekennzeichnet, durch
- - mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid oder einer Verbindung dieses Peptids mit einem Trägermolekül, bevorzugt das Peptid VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR,oder auch ein erfindungsgemäßer Anti-Idiotyp-AK, der adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden ist,
- - einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
- - ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgN, IgA oder gegen mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist, und einem Enzym,
- - einen Puffer zum Verdünnen des Konjugats, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
- - einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
- - eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
- - eine Stopp-Lösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.
Mit der Entwicklung dieses neuen Testkits auf der Basis der
erfindungsgemäßen Peptide lassen sich Verlaufsbeurteilungen
relativ einfach und schnell durchführen.
Mit dem erfindungsgemäßen Test, der ein 35-45 Aminosäuren
langes Peptid des Sm-D an der festen Phase enthält, lassen
sich Anti-Sm-Ak mindestens ebenso häufig nachweisen wie
Anti-dsDNA-Ak. Die Titer der Antikörper korrelieren gut mit der
Aktivität des SLE, so daß dieser Test neben den
Krankheitssymptomen die Verlaufsbeurteilung und Einschätzung
des Therapieerfolges ermöglicht. Somit können aufwendige Tests
ersetzt werden.
Überraschend weisen die erfindungsgemäßen Peptide eine
außergewöhnlich hohe Frequenz von positiven Reaktionen auf.
Sie liegt z. B. für das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR
bei über 67%, wodurch
analoge bekannte Peptide (positive Reaktionen bei ca. 30%)
deutlich übertroffen werden (vgl. Abb. 1).
Durch die Erfindung kann die Diagnose eines SLE mit hoher
Sicherheit gestellt werden. Die Erfindung ist jedoch nicht nur
für die Diagnose des SLE, sondern darüber hinaus auch für eine
Therapiekontrolle (Monitoring) sowie zur Produktion von
Medikamenten gegen SLE hervorragend geeignet.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Peptide und ihre
Folgeprodukte als Vakzine zur Erzeugung von Toleranz
mechanismen verwendet werden.
Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert,
die die Erfindung aber nicht auf diese beschränken sollen.
Um ein Konformationsepitop zu erfassen, wurden 4 verschiedene
Peptide des Sm-D-Proteins synthetisiert.
- 1. Peptid 83-99 mit folgender Sequenz: VEPKVKSKKREAVAGRG
- 2. Peptid 95-119 mit folgender Sequenz: VAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR
- 3. Peptid 105-119 mit folgender Sequenz: GRGRGRGRGRGGPRR
- 4. Peptid 83-119 mit folgender Sequenz: VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR
Die Synthese der Peptide erfolgte nach der Methode, die
erstmals von Atherton (vgl. oben) beschrieben wurde. Zur
300A C18 Revers phase-Säule benutzt. Die Fluß-Rate betrug 100
ml/min.
Diese Peptide wurden mit einem ELISA getestet.
Für die Beschichtung wurden Polystyren-Platten (Nunc,
Dänemark) mit je 96 Wells verwendet. Die Beschichtung erfolgte
mit 10 µg/ml, wobei 50 µl je Well verwendet wurden. Als
Benetzungsmedium diente 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,5.
Die Benetzung erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Nach
dreimaligem Waschen mit dem Waschpuffer (PBS-Tween 0,1%, pH
7,2) wurden die Platten entweder weiter verwendet oder bei -
20°C eingefroren.
Vor Wiederverwendung nach dem Einfrieren wurden die Platten
erneut 3× gewaschen.
Vor dem Auftragen der Proben erfolgt eine Vorblockierung der
Platten mit je 100 µl/Well Probenpuffer (PBS-Tween, pH 7,2, im
Verhältnis 1 : 100 mit Trockenmilch) für eine Stunde bei
Raumtemperatur. Ohne einen Waschvorgang anzuschließen, erfolgt
die Probenauftragung (Serumverdünnung 1 : 100 in Probenpuffer)
mit je 50 µl/Well über 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Anschließend erfolgt 3× der Waschvorgang mit dem Waschpuffer.
Die Inkubation mit POD-markiertem Anti-Human-IgG erfolgt in
einer Verdünnung von 1:1000 in Probenpuffer jeweils 50 µl/Well
über 2 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird wiederum
3× mit dem Waschpuffer gewaschen.
Die Färbung der Antigen-Antikörperreaktion erfolgt mit 10 ml
Citratpuffer, pH 5,0, 5 µl H₂O₂ und 5 mg Orthophenylendiamin
(OPD) jeweils 50 µl/Well über 1-3 Minuten. Das Stoppen erfolgt
mit 150 µl/Well Stopplösung (100 ml 1M H₂SO₄, 0,36 mg
Natriumsulfit). Die Farbintensität oder optische Dichte
(Extinktionen) wurde bei 495 mm gemessen. Wie bei jedem
anderen ELISA ist die resultierende Farbe der Reaktion
proportional der Anzahl der konjugierten Antikörper, welche am
Testantikörper gebunden wurden. In den meisten Fällen ist die
Anzahl der gebundenen konjugierten Antikörper linear bezogen
auf die Anzahl der an das Antigen gebundenen Antikörper.
Es wurde ein Standardserum zur Erstellung einer Eichkurve
verwendet, welches in Vorversuchen besonders gut reagierte.
Die Konzentration diesem Standardserums in einer Verdünnung
von 1 : 100 wurde mit 10 000 Einheiten definiert. Diese
Eichkurve wird auf jede Platte aufgetragen, und jedes Serum
wurde doppelt bestimmt.
Der Normbereich (NB) wurde definiert mit: NB = Mittelwert der
Normalseren plus dem zweifachen Wert der Streuung der
Normalseren (n=106). In erfindungsgemäßen Testsystem lag der
Normwert nach dieser Berechnung bei einer aus der
Standardkurve errechneten Konzentration von 223 Einheiten.
Abb. 1 zeigt die schematische Darstellung der Peptide und ihre
Reaktivität bei den 40 SLE-Seren sowie bei den 50 gesunden
Probanden.
Die Grenze zum Normalbereich wurde aus der mittleren
Extinktion der 106 Blutspender plus dem zweifachen Wert der
Streuung ermittelt. Unter Verwendung der relativ kurzen
Peptide 83-99 und 95-119 werden im ELISA positive Reaktionen
nur in jeweils 4% bzw. 25% der untersuchten Seren gemessen.
Wird dagegen das Peptid mit der AS 83-119 als
Festphasenantigen verwendet, so kommt es zum deutlichen
Anstieg der positiven Reaktionen auf ca. 70% aller untersuchten
SLE-Seren (Abb. 1).
Überraschend zeigte sich, daß die Verwendung längerer Peptide
als Festphasenantigen im ELISA eine deutliche qualitative
Verbesserung gegenüber bisher beschriebenen Assays erbringt.
Es wurden insgesamt 176 SLE-Seren, 89 Seren von
HIV-infizierten Patienten, 25 MCTD-Seren, 28 Seren von Patienten
mit einer rheumatischen Atthritis, 15 Seren mit einem Sjögren-
Syndrom, 20 Seren mit einer progressiven Sklerodermie (PSS),
30 Seren von Patienten mit einer Lyme-disease, 20 Hepatitis
B-positive Patienten, 25 Seren mit Colitis ulcerosa und 105
Blutspender getestet.
Antikörper gegen das Peptid 83-119 ließen sich in 67,3% aller
untersuchten SLE-Seren nachweisen. Damit ist der ELISA
hochspezifisch für den SLE. Vereinzelt treten positive
Reaktionen auch bei der MCTD oder der RA auf, hohe
Konzentrationen werden jedoch nahezu nur beim SLE erreicht
(Abb. 2).
Bei Verwendung eines kommerziellen Anti-Sm-ELISA (Sm-Elias)
ließen sich Anti-Sm-Ak nur in 10% der Seren nachweisen (Abb.
3).
Vergleicht man SLE-Seren mit negativen Anti-dsDNA-Ak mit
solchen mit Anti-dsDNA-Ak, so lassen sich die Antikörper gegen
das SmD-Peptid in signifikant höheren Titern bei
Anti-dsDNA-Ak-positiven Patienten nachweisen (Abb. 4). Die Reaktivitäten
im ELISA scheinen weiterhin abhängig zu sein von der
Krankheitsaktivität. Um diese Beobachtung zu überprüfen,
wurden 6 Patienten im Verlauf untersucht. Die Abb. 5 zeigt den
Verlauf einer typischen Patientin und den Einfluß der Therapie
auf den Autoantikörper-Titer. Bei einer Patientin waren die
Anti-Peptid-Antikörper nachweisbar, obwohl die Anti-dsDNA-Ak
negativ waren.
Mit der Entwicklung dieses neuen Testes mit dem Peptid 83-119
an der festen Phase lassen sich Verlaufsbeurteilungen relativ
einfach und schnell durchführen. Damit stellen sie eine gute
Alternative zu den bisherigen aufwendigen Test dar.
Die Häufigkeit der Anti-Peptid-Ak entspricht damit nahezu der
von Anti-dsDNA-Ak. Kürzlich konnten Reichlin und Mitarbeiter
eine Kreuzreaktivität der Anti-dsDNA-Ak mit dem Ak gegen das
Sm-D und A-Protein des snRNP nachweisen (Reichlin, M.A. et al,
J. Clin. Invest. 1994; 93: 443-449). Da nur eine geringe
Homologie zwischen den Aminosäuren besteht, wurde die Ursache
der Kreuzreaktionen auf mögliche Konformationsepitope zurück
geführt. Um eine mögliche Kreuzreaktivität der Anti-SmD(83-119)-
Ak mit anderen Autoantikörpern nachzuweisen, wurde eine
Affinitätschromatographie mit dem an Sepharose gebundenen
SmD(83-119)-Peptid durchgeführt und die Extinktionen in
unterschiedlichen ELISAs vor und nach Eluation der
Anti-Peptid-Ak gemessen (Abb. 6). Es kam zum signifikanten Abfall
sowohl im Anti-SmD-Peptid-ELISA als auch im ELISA zum Nachweis
von Anti-dsDNA-Ak und Antikörpern gegen Nukleosomen. Zwischen
diesen Autoantigenen scheinen demzufolge Kreuzreaktionen zu
bestehen.
Claims (14)
1. Peptide des Antigens Sm-D, bestehend aus 35 bis 45 Amino
säuren, die ein Konformationsepitop bilden und Autoantikörper
binden können, wie sie beim systemischen Lupus erythematodes
(SLE) vorkommen mit folgender Struktur:
2. Peptid gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Struktur
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR.
3. Antikörper, die gegen Konformationsepitope des Sm-D-Antigens
gerichtet und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein oder
mehrere Peptide des Anspruchs 1 erkennen.
4. Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie
das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRRerkennen.
5. Anti-Idiotyp-Antikörper nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß sie auf spezifische Art die Autoantikörper
des SLE in biologischen Flüssigkeiten erkennen.
6. Verwendung von einem oder mehreren Peptiden gemäß Anspruch 1
in antigenen Kompositionen, die dadurch charakterisiert sind,
daß sie mit den Autoantikörpern, wie sie in biologischen
Flüssigkeiten beim SLE vorkommen, spezifisch reagieren.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
antigene Komposition das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRRenthält.
8. Verwendung von einem oder mehreren Peptiden gemäß Anspruch 1
oder einer Verbindung dieses Peptids mit einem Trägermolekül in
immunogenen Kompositionen, die die Produktion der Antikörper,
die fähig sind, Autoantigene beim SLE zu erkennen, induzieren.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die
immunogene Komposition das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRRenthält.
10. Verwendung von einem oder mehreren Peptiden gemäß Anspruch
1 zur Bestimmung von Anti-Sm-D-Antikörpern in biologischen
Flüssigkeiten, indem man
- - biologische Flüssigkeiten mit mindestens einem Peptid oder einer Verbindung dieser Peptide mit einem Trägermolekül oder auch einem antiidiotypischen Antikörper in Kontakt bringt unter an sich üblichen Bedingungen, die eine Antigen- Antikörper-Reaktion zulassen und daß
- - man den Nachweis dieser Antigen-Antikörper-Reaktion oder einer Antikörper-Anti-Idiotyp-Antikörper-Reaktion durch physikalische oder chemische Methoden erhält.
11. Verwendung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
die Bestimmung von Anti-Sm-D-Antikörpern in einem Testkit
erfolgt, der charakterisiert ist durch
- - mindestens 1 Peptid oder einer Verbindung dieses Peptids mit einem Trägermolekül oder auch ein Anti-Idiotyp-AK adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden,
- - einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
- - ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder gegen mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist, und einem Enzym,
- - einen Puffer zum Verdünnen des Konjugats, der nicht ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
- - einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
- - eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
- - eine Stopp-Lösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der
Testkit das Peptid
VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRRenthält.
13. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Produktion von
Medikamenten gegen den SLE.
14. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 als Vakzine zur
Erzeugung von Toleranzmechanismen.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19619418A DE19619418C1 (de) | 1995-10-19 | 1996-05-14 | Peptide des Antigens Sm-D und ihre Verwendung, insbesondere für die Diagnostik des SLE |
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WO1991018920A1 (fr) * | 1990-06-06 | 1991-12-12 | Neosystem S.A. | PEPTIDES DE L'ANTIGENE Sm-D ET LEUR UTILISATION NOTAMMENT POUR LE DIAGNOSTIC DU LUPUS ERYTHEMATEUX DISSEMINE |
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Clin. Immunol. and Immunopathol. 1992, 65(3), S.315-324 * |
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