DE69829285T2

DE69829285T2 - Diagnose von autoimmun-nebennierenkrankheit

Info

Publication number: DE69829285T2
Application number: DE69829285T
Authority: DE
Inventors: Jadwiga Thornhill FURMANIAK; Rees Bernard Saint Mellons SMITH
Original assignee: RSR Ltd
Current assignee: RSR Ltd
Priority date: 1997-11-28
Filing date: 1998-11-27
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-11-28
Also published as: ATE290694T1; US6342394B1; EP0990155A1; JP2001510578A; DE69829285D1; GB9725105D0; WO1999028752A1; EP0990155B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose offener, subklinischer oder potentieller Autoimmunnebennierenkrankheiten. Beispiele von Autoimmunnebennierenkrankheiten sind unter anderem die Addisonsche Krankheit (AD) sowie das autoimmune Polyglandularsyndrom (APS) Typ I und Typ II.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Hauptautoantigens bei Autoimmunnebennierenkrankheiten, das humane Steroid 21-Hydroxylase (21-OH) und der Epitope an dem 21-OH-Molekül, die mit 21-OH Autoantikörpern (Ab) im Serum eines Patienten reagieren. Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Aminosäuresequenzen des 21-OH-Peptids, die für die 21-OH Ab-Bindung wichtig sind, und Verfahren zur Verwendung solcher Sequenzen für die Diagnose und Vorhersage der Entwicklung von Autoimmunnebennierenkrankheiten.
Der Nebennierenkortex der oberen Nierendrüsen produziert steroide Hormone, wie etwa Cortisol und Aldosteron. Daneben werden auch Androgene (wie etwa Testosteron) durch den Nebennierenkortex sekretiert. Anzeichen und Symptome der Addisonschen Krankheit hängen mit der Insuffizienz des Nebennierenkortex zusammen und beinhalten niedrigen Blutdruck, Muskelschwäche, erhöhte Hautpigmentation und Elektrolytinstabilität. Die Schwere der Symptome hängt ab vom Ausmaß des Nebennierenversagens, und diese Störung führt unbehandelt unvermeidlich zur adrenokortikalen Krise und als Folge davon zum Tod.
Unter den verschiedenen Ursachen der Addisonschen Krankheit ist gegenwärtig das autoimmune Geschehen am verbreitetsten. Autoantikörper gegen den Nebennierenkortex wurden zuerst 1957 mittels der Komplement bindungstechnik beschrieben. 1988 wurde mittels Addisonseren aus Nebennierenmikrosomen ein nebennierenspezifisches 55 kDa-Protein immunabgelagert. Nachfolgend konnte gezeigt werden, dass dieses Protein das humane Steroid 21 Hydroxylase war und als Hauptnebennierenautoantigen bei verschiedenen Formen von Autoimmunnebennierenkrankheiten identifiziert werden konnte. Die Messung von 21-OH Ab ist ein nützliches Diagnosewerkzeug bei Fällen des Verdachts auf oder offenkundigen Nebennierenversagens, und 21-OH Ab können nützliche Marker einer Progression in Richtung auf eine autoimmune Addisonsche Krankheit bei Patienten mit anderen organspezifischen Autoimmunkrankheiten sein, wie etwa Diabetes Typ I, besonders bei Kindern.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Autoantikörperbindungsstellen an 21-Hydroxylase zum größten Teil konformativ sind und durch das zentrale und die C-terminalen Abschnitte des Proteins gebildet werden. Die US 5376533 beschäftigt sich zum Beispiel mit der Identifikation von Epitopen von 21-OH und offenbart hierzu rekombinante Fragmente A, B und C (umfassend das gesamte Gen des 21-OH-Enzyms). Es wurde festgestellt, dass Fragment B, namentlich Aminosäurennummern 164–356 von 21-OH, eine maximale Reaktivität (83 %) bei im Patientenserum anwesenden Autoantikörpern zeigte, und so wurde Fragment B auch ausgedrückt als Dreikomponentenfragmente, namentlich Fragmente D (Aminosäurenummern 164–271 von 21-OH), E (Aminosäurenummern 272–356 von 21-OH) und F (Aminosäurenummern 197–298 von 21-OH). Die größte Reaktivität wurde bei Fragment E, namentlich Aminosäurenummern 272–356 von 21-OH, wie oben genannt, festgestellt. Die US 5376533 identifizierte auch einen hochkonservierten Abschnitt von 21-OH als Aminosäurenummern 338–360 von 21-OH.
In der WO 94/25604 wurden weiterhin Epitop-Regionen identifiziert, die für Aminosäurenummern 1–127 von 21-OH, Aminosäurenummern 227–480 von 21-OH und Aminosäurenummern 434–480 von 21-OH stehen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden nun spezifische Regionen der 21-OH Sequenz festgestellt, die für die Autoantikörperbindung bei Patienten mit verschiedenen Formen von autoimmunen Nebennierenkrankheiten wichtig sind, und die vorliegende Erfindung gibt daher eine Peptidsequenz an, welche die Konformation der Primärstruktur einer Epitopregion von 21-OH repräsentiert, mit der Autoantikörper interagieren, die als Antwort auf 21-OH erzeugt werden, wobei die Peptidsequenz aus einer der folgenden besteht:
Aminosäurenummern 335 bis 339 von 21-OH; oder
Aminosäurenummern 391 bis 405 von 21-OH; oder
Aminosäurenummern 406 bis 411 von 21-OH.
Noch spezifischer kann eine Peptidsequenz, wie von der vorliegenden Erfindung angegeben, aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen bestehen:
AHLDETVWERPHEFW
AHLDETVWEQPHEFR
PDRFLE
PYKDR
TYKDR;
wie jeweils gewonnen aus humanem oder bovinem 21-OH und wie weiter erläutert unter Bezugnahme auf 4.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose offener, subklinischer oder potentieller Autoimmun-Nebennierenkrankheit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zurverfügungstellen einer Probe Körperflüssigkeit von einem Subjekt;
(b) Zurverfügungstellen eines oder mehrerer monoklonaler, polyklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen 21-OH oder eines oder mehrerer Fragmente davon, der/die mit einer Epitop-Region von 21-OH interagiert/interagieren, wie im Wesentlichen oben beschrieben;
(c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Peptidsequenz, im Wesentlichen wie vorstehend als durch die vorliegende Erfindung angegeben beschrieben, und dem Antikörper, wie durch Schritt (b) zur Verfügung gestellt, so dass die Peptidsequenz mit entweder in der Probe enthaltenen Auto-Antikörpern gegen 21-OH oder dem durch Schritt (b) zur Verfügung gestellten Antikörper interagieren kann; und
(d) Beobachten des Ausmaßes der Interaktion der Peptidsequenz mit den Auto-Antikörpern, um ein Anzeichen für die Anwesenheit solcher Auto-Antikörper in der Probe zu erhalten und damit eine Diagnose der offenen, subklinischen oder potentiellen Autoimmun-Nebennierenkrankheit zu stellen.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein durch den obigen Schritt (b) zur Verfügung gestellter Antikörper zu einer festen Phase immobilisiert werden; alternativ kann wenigstens eine Epitop-Region, wie durch eine oben beschriebene Peptidsequenz angegeben und durch die vorliegende Erfindung angegeben, in eine feste Phase immobilisiert werden. Die feste Phase kann ein magnetisches oder nicht magnetisches Material sein.
Ein Antikörper, wie durch Schritt (b) zur Verfügung gestellt, kann ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper sein, üblicherweise umfassend humane Antikörper, Nagetierantikörper, oder Kaninchenantikörper, oder kann ein rekombinanter Antikörper oder Teile oder Fragmente derselben sein.
Eine relevante Epitop-Region oder Regionen, wie durch eine erfindungsgemäße Peptidsequenz angegeben und in einem hierin beschriebenen Verfahren verwendet, kann direkt markiert werden; alternativ kann bei einigen Ausführungsformen die Epitop-Region oder Regionen indirekt markiert werden (zum Beispiel durch Binden der Epitop-Region oder Regionen an markierte monoklonale Antikörper).
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Peptidsequenz nach der vorliegenden Erfindung, die zum Beispiel mit ¹²⁵I markiert ist, mit keinem (im Wesentlichen wie nachstehend detaillierter beschrieben), einem oder mehrere monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörpern gegen 21-OH inkubiert werden, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Die Antikörper in Schritt (b) wie vorstehend beschrieben sind gerichtet gegen Epito-Regionen auf 21-OH wie gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt, namentliche eine der folgenden Aminosäuresequenzen: Aminosäurenummern 355 bis 339 von 21-OH; oder Aminosäurenummern 391 bis 405 von 21-OH; oder Aminosäurenummern 406 bis 411 von 21-OH. Die in Schritt (b) zur Verfügung gestellten Antikörper eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung binden sich an Epitop-Regionen von 21-OH, wie durch eine Peptid-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben, wodurch die nachfolgende Bindung von Autoantikörpern im Patientenserum an die Epitop-Regionen verhindert wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann demnach eine Mischung eines markierten Epitops von 21-OH, wie durch eine erfindungsgemäße Peptidsequenz angegeben, und einem in Schritt (b) zur Verfügung gestellten Antikörper mit der Probe Körperflüssigkeit von einem Patienten (typischerweise mit Autoantikörpern gegen 21-OH) in Kontakt gebracht werden. Die Fähigkeit eines bestimmten Antikörpers gegen eine Epitop-Region, wie in Schritt (b) verwendet, zum Vermindern der Bin dung von 21-OH Autoantikörpern an 21-OH kann die Anwesenheit von Autoantikörpern gegen dieselbe Epitop-Region wie das bestimmte, in Schritt (b) verwendete Antikörper anzeigen.
Ein Antikörper, wie in Schritt (b) zur Verfügung gestellt, welches selbst markiert sein kann, wird selektiert nach Reaktivität mit Epitop-Regionen, wie durch eine im Wesentlichen wie vorstehend beschriebene, erfindungsgemäße Peptidsequenz angegeben, wobei die relevanten Epitop-Regionen namentlich angegeben sind durch Aminosäurenummern 335 bis 339 von 21-OH; oder Aminosäurenummern 391 bis 405 von 21-OH; oder Aminosäurenummern 406 bis 411 von 21-OH.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet des Beobachten der Reaktivität von Autoantikörpern gegen 21-OH in der Körperflüssigkeit (wie etwa Serum, Vollblut oder Fruchtwasser) eines Testsubjekts mit einer oder mehrerer der drei verschiedenen Epitop-Regionen wie angegeben durch eine Peptid-Sequenz im Wesentlichen wie vorstehend gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die Reaktivität mit den drei verschiedenen Epitop-Regionen, wie durch eine erfindungsgemäße Peptidsequenz angegeben, kann individuell oder in Kombination beobachtet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Komponenten der Reaktion, namentlich die relevanten Epitopen wie durch eine erfindungsgemäße Peptidsequenz angegeben, und monoklonale, polyklonale oder rekombinante Antikörper mittels geeigneter radioisotoper oder nicht isotoper Marker markiert werden. Geeignete isotopische Marker beinhalten ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C und ³H; geeignete nicht isotopische Marker beinhalten Enzyme, Farben, Gold, chemilumineszente Substanzen und fluoreszente Substanzen.
Die Reaktivität zwischen den verschiedenen Komponenten kann mittels einer Vielzahl von Verfahren beobachtet werden, darunter enzymver knüpfte Immunosorbenttests (ELISA), Fest- oder Flüssigphasenradioimmunotests (RIA), immunochromatographische Tests, Immunoausfällungstests oder dergleichen.
Wie vorstehend beschrieben kann 21-OH in der Form einer erfindungsgemäßen Peptidsequenz, markiert zum Beispiel mit ¹²⁵I, mit einer Probe Körperflüssigkeit in Abwesenheit einer oder mehrerer monoklonaler, polylonaler oder rekombinanter Antikörper gegen 21-OH inkubiert werden. Die vorstehende Erfindung gibt daher weiterhin ein Verfahren an zur Diagnose von offener, subklinischer oder potentieller Autoimmun-Nebennierenkrankheit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zurverfügungstellen einer Probe Körperflüssigkeit von einem Subjekt;
(b) Inkontaktbringen der Probe mit einer gekennzeichneten Peptidsequenz, im Wesentlichen wie vorstehend als durch die vorliegende Erfindung angegeben beschrieben, so dass die Peptidsequenz mit in der Probe enthaltenen Auto-Antikörpern gegen 21-OH interagieren kann; und
(c) Beobachten des Ausmaßes der Interaktion der Peptidsequenz mit den Auto-Antikörpern, um ein Anzeichen für die Anwesenheit solcher Auto-Antikörper in der Probe zu erhalten und damit eine Diagnose der offenen, subklinischen oder potentiellen Autoimmun-Nebennierenkrankheit zu stellen.

Eine wesentliche Änderung in der Menge der Bindungen (eine wesentliche Zunahme oder eine wesentliche Abnahme) der Autoantikörper an eine relevante Epitop-Region, wie durch eine erfindungsgemäße Peptidsequenz angegeben, zeigt an, dass das Testsubjekt eine Autoimmunnebennie renkrankheit hat oder dass das Risiko besteht, dass eine solche Krankheit ausbrechen kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung einer Peptidsequenz, wie im Wesentlichen vorstehend als durch die vorliegende Erfindung angegeben beschrieben, zum Nachweis von als Antwort auf 21-OH erzeugten Autoantikörpern in einer Probe Körperflüssigkeit von einem Subjekt, wobei vorzugsweise der Nachweis von Autoantikörpern gegen 21-OH eine Diagnose der offenen, subklinischen oder potentiellen Autoimmunnebennierenkrankheit liefert.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern und werden nur als Beispiele angegeben:
1 ist eine schematische Darstellung der Restriktionsenzymorte auf 21-Hydroxylase;
2 ist eine schematische Darstellung einer experimentell erzeugten Serie von Löschungen in einer 21-Hydroxylase kodierenden cDNA;
3 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von Fab oder F(ab')₂-Fragmenten der in Tabelle 3 beschriebenen monoklonalen Antikörper; M21-OH1 (F(Ab)₂ 1), M21-OH3(Fab3), M21-OH5(F(Ab)₂5) und einer Mischung davon (Fab-Mischung), an ¹²⁵I-markierter 21-Hydroxylase gebunden an intakte 21-Hydroxylase-Autoantikörper in einem Pool von Patientenseren; und
4 ist ein Vergleich von Aminosäuresequenzen der Epitop-Regionen in humaner und boviner 21-Hydroxylase.
Plasmid-Konstruktionen
Das 21-Hydroxylase-Gen in voller Länge wurde in pYES2.0 (Invitro gen) geklont (pYES2/21-OH1) unterhalb des T7-Promoters. Sodann wurden mittels verschiedener Restriktions-Enzymorte verschiedene Löschungen und Verkürzungen im Gerüst des 21-Hydroxylase-Gens durchgeführt, und die modifizierten Gene wurden in pYES3 geklont, der vom pYES2.0 abstammt. Zusätzlich wurde Konstrukt-P21-OH14 mittels des Restriktions-Enzyms PpumI erzeugt.
Tabelle 1 zeigt die Reaktivität der humanen Steroiden 21-Hydroxylase in voller Länge und modifiziert mit monoklonalen Antikörpern.
Tabelle 1
Die 21-Hydroxylase-cDNA in voller Länge wurde in den KpnI-Ort von pTZ18F subgeklont (pND21-OH1), die von dem Vektor pTZ18R (Pharmacia Biotech) abstammt. Der Vektor pTZ18F enthielt einen speziell konstruierten, einzigartigen Linker in AccI und HindIII-Orte, welche in allen drei Gerüsten Stopp-Kodons aufwiesen, um die Beendigung der Translation aller eingefügten Gene sicherzustellen. Eine Serie von 21-Hydroxylase-Gen-Konstrukten, bei denen kurze Bereiche der Gensequenz entfernt waren (pND21-OH2-7), wurden aus diesem Konstrukt mittels eines Nested Deletion Kit (Pharmacia Biotech) (vergl. 1) erzeugt. Diese Konstrukte wurden mittels der Dideoxy-Termination-Methode mit Hilfe des Sequence Version 2.0-Kit (United States Biochemical) und des M13 (-40)-Sequenzierungs-Primers sequenziert.
Tabelle 2 zeigt die verschiedenen Konstrukte und die Reaktivität des humanen Steroids 21-Hydroxylase voller Länge und in modifizierter Form mit monoklonalen Antikörpern.
Tabelle 2
Antikörper gegen 21-Hydroxylase
Bei RSR Limited wurde eine Platte von 5 Maus-monoklonalen Antikörpern (Mabs), gezüchtet zu Human-Rekonbinant-21-Hydroxylase ausgedrückt in Echerichia coli, und in der Versuchsreihe verwendet. 21-Hydroxylase-Mab-IgG wurde mittels Affinitäts-Chromatographie mit einem Prosep-A (Bioprocessing Limited) gereinigt und die gereinigten IgG- Präparate wurden entweder mit Pepsin (Sigma) mit einem Enzym/Proteinverhältnis von 1:10 oder Mercuripapain (Sigma) mit einem Enzym/Proteinverhältnis von 1:10 behandelt und durch eine Prosep-A-Säule geführt, um alle intakten IgG- oder Fc-Fragmente aus dem Fab bzw. F(ab')₂ zu entfernen. IgG- und Fab-Kontrollpräparate wurden aus einem TSH-Rezeptor (TSHR)-Maus-monoklonalen Antikörper (RSR Limited) gewonnen. Kaninchen-Antikörper gegen 21-Hydroxylase von RSR Limited wurde bei einigen Experimenten auch als Kontrolle verwendet. Serum wurde gewonnen von 21-Hydroxylase Ab-positiven Patienten (n=25), wobei: APS-Typ I (n=5), APS-Typ II (n=5), isolierte Addison'sche Krankheit (n=5), 21-Hydroxylase-Ab-positive Patienten mit normaler Nebennierenfunktion (potentielle AD; n=5) und 21-Hydroxylase-Ab-positive Patienten mit beeinträchtigter Nebennierenfunktion (subklinische AD; n=5) (vergl. Tabelle 3). Pool-positives Serum präpariert aus zehn 21-Hydroxylase-Ab-positiven Patienten mit AD (21-Hydroxylase Ab-Pegel im Bereich zwischen 7 und 22 Einheiten/mL) wurde bei einigen Experimenten verwendet. Pool-Serum von zwanzig gesunden Blutspendern wurde als Negativ-Kontrolle verwendet.
Immunofluoreszenz-Studien
Klassische indirekte Immunofluoreszenz-Tests wurden mittels dünner Cryosektionen humanen und bovinen Nebennierengewebes und fluoreszinem Isothiozyanat-konjugiertem Anti-Maus-IgG durchgeführt.
Analyse der Reaktiviteät von 21-OH Mab mit modifizierten 21-OH Proteinen
Modifizierte ³⁵-S-markierte 21-Hydroxylase-Proteine mit verschiedenen Auslöschungen und Kürzungen (siehe Tabellen 1 und 2, sowie 1) wurden in dem in vitro-Transskriptions/Translations-System (TnT; Promega) und wurden in einem Immuno-Abscheidungstest (IPA) zur Abschätzung der 21-Hydroxylase-Mab-Bindung verwendet. Die TnT-Reaktionen wurden mit einem Methionin-freien Kaninchen-Retikulytlysat in Anwensenheit von ³⁵-S-Methionin (10Ci/L; Amersham) durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann durch eine 0,5 × 16 cm-Säule Sephadex G50 (Pharmacia) geführt, eluiert mit 150 mmol/L Tris-Puffer pH8,3, enthaltend (pro Liter) 200 mmol NaCl, 10 mL Tween 20 und 10 g bovines Serum-Albumin (nachstehend Tris-Puffer genannt); 1 mL-Fraktionen wurden gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden auf Reaktivität mit 21-OH-Antikörpern mittels IPA getestet, so weit verdünnt, dass man eine 30.000 Zähler/min pro 50 μL erhielt, und in Aliquots bei –70°C gelagert. Die Synthese von Proteinen, die durch die verschiedenen Konstrukte kodiert waren, wurde ermittelt durch Analyse mit Polyacrylamid-Gel (9%) in Natriumdodecylsulphat (SDS), gefolgt durch Autoradiographie.
Die IPA wurde mittels eines 96-Loch-Filtrationsplatten-Systems mit Filtern von 0,45 μm (Porengröße) (Multiscreen, Millipore UK Limited), wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Aliquots von 50 μL von ³⁵-S-21-OH wurden mit Aliquots von Antikörpern (50 μL) für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Jedem Mikrotiterloch wurde dann 50 μL Anti-Maus-IgG-Agarose (Sigma), verdünnt fünffach in Tris-Puffer zugegeben, und die Proben wurden für eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Platte wurde dann auf eine Absaugeinheit (Milipore UK) aufgebracht, und die an Anti-Maus-IgG-Agarose gebundenen Immunkomplexe wurden dreimal mit 200 μL von Tris-Puffer gewaschen. Nach diesem Waschen wurde der Boden aller Löcher in Violen eingebracht, die 1 mL Szintillationsflüssigkeit (Ultima Gold, Packard) enthielten, und die Radioaktivität wurde in einem Szintillationszähler gezählt. Eine negative Kontroll-Mab wurde in jeden Test einbezogen, sowie auch Kaninchen-21-Hydroxylase-Ab als Kontrolle. Alle Experimente wurden zweifach durchgeführt, und die Bindung an jedes modifizierte 21-Hydroxylase-Protein wurde in zwei separaten Experimenten durchgeführt.
Wirkungen von Fab oder F(ab')₂-Präparaten auf die Bindung intakter monoklonaler 21-OG-IgG und 21-OH-Abs an ¹²⁵I-21-OH
Weitere Analyse der durch die 21-Hydroxylase-Mab und durch 21-Hydroxylase-Abs erkannten Epitope wurde mittels einer Technik durchgeführt, welche die Fähigkeit des Proteins A zur Bindung an intakte Antikörper ausnutzt, die mit ¹²⁵-I-markierten Antigenen komplexiert sind, jedoch nicht an Fab oder F(ab')₂, das an markiertes Antigen gebunden ist.
Fab oder F(ab')₂-Präparate in verschiedenen Verdünnungen wurden für sieben Stunden bei 4°C mit ¹²⁵-I markierter 21-Hydroxylase (30.000 cpm/50μL) inkubiert. Intakte 21-Hydroxylase-Antikörper (entweder 50 μL 21-OH-Mab-IgG oder 50 μL Patienten-Serum in geeigneter Weise in Testpuffer verdünnt) wurden dann hinzugefügt und die Inkubation für achtzehn Stunden bei 4°C fortgesetzt. ¹²⁵-I-markierte 21-Hydroxylase, die entweder an intakter 21-Hydroxylase-Mab oder 21-Hydroxylase Ab gebunden war, wurde durch Hinzufügung von festem Protein A separiert.
Computer-Analyse der Epitop-Region-Aminosäuresequenzen
Die kompletten cDNA-Sequenzen humaner und boviner 21-Hydroxylase wurden in Aminosäuresequenzen mittels der Computer-Software DNASIS Version 2.1 (Hitachi Software Engineering America Limited) übersetzt. Die Aminoräuresequenzen der Epitop-Regionen bei sowohl hunmaner als auch boviner 21-Hydroxylase wurden mittels des Clustal-Verfahrens abgeglichen.
Statistische Verfahren
Statistische Analysen wurden mittels der Software SPSS for Windows durchgeführt. Die statistische Signifikanz von Unterschieden der Wirkung von Fab oder F(ab')₂-Präparaten auf 21-Hydroxylase-Ab-Bindung zwischen Patientengruppen mit unterschiedlichen Formen von Autoimmun-Nebennieren-Krankheiten wurde mittels Mann-Whitney-U-Test ermittelt.
Ergebnisse
Bei Tests durch Immunofluoreszenz reagierten IgGs von allen fünf Mabs mit humanem Nebennierengewebe und zeigten für Nebennieren-Cortex-Antikörper typische positive Verfärbungsmuster. Mab 1 und 2 zeigten positive Verfärbungen bei Verwendung von bovinem Nebennierengewebe, wohingegen Mab 3, 4 und 5 bei bovinem Nebennierengewebe in dem Immunofluoreszenz-Test negativ waren.
Tabelle 3 zeigt die Charakteristika von Maus-monoklonalen Antikörpern gegen 21-Hydroxylase.
Tabelle 3
F(ab')₂-Fragmente wurden isoliert aus Mab 1 und 5, wohingegen Fab-Fragmente aus Mab 3 und der TSHR-Mab isoliert wurden, und diese Präparate wurden in den Bindungshemmungs-Studien mit allen fünf Mabs verwendet. Diese Studien zeigten, dass die 21-Hydroxylase-Mabs in drei Gruppen zu klassifizieren waren.

Gruppe I: Mab 1 und 2, die an dieselbe Epitop-Region (ER1) an 21-Hydroxylase banden;
Gruppe II: Mab 3 und 4, die beide an eine andere Region (ER2) banden; und
Gruppe III: Mab 5, welche eine dritte Region (ER3) erkannte.

Hemmungs-Studien mit gepoolten Patientenseren und Fab- oder F(ab')₂-Präparaten repräsentativ für jede Mab-Gruppe (Mab 1, 3 und 5) legten nahe, dass 21-Hydroxylase-Abs-Epitope auf 21-Hyxdroxylase erkennen, die ähnlich denen sind, die durch die Mabs erkannt werden (2).
Die Bindung der Ab in gepoolten Patientenseren an ¹²⁵-I-21-Hydroxylase wurde nur leicht gehemmt (bis 15%) durch Mab 1 F(ab')₂, doch bis zu 52% bei Mab 3 Fab und bis zu 74% durch Mab 5 F(ab')₂ (siehe 2). Eine Kombination dreier Fab oder F(ab')₂ (Fab-Mischung) hemmte die 21-Hydroxylase-Bindung durch Ab in einem gepoolten Patientenseum um bis zu 88%. Die Kontroll-Fab hemmte die Bindung von Patienten-Ab an ¹²⁵-I-21-Hydroxylase bis zu 15% (2).
Fab oder F(ab')₂-Präparate von Mab 1, 3 und 5 wurden auch in Hemmungs-Studien mit individuellen 21-Hydroxylase-Ab-positiven Seren verwendet. Die Resultate dieser Studien sind untenstehend in Tabelle 4 aufgeführt und als eine prozentuale Hemmung von ¹²⁵-I-21-Hydroxylase-Bindung relativ zur Bindung von Ab in Abwesenheit von Fab oder F(ab')₂-Präparaten aufgeführt. Tabelle 4

ACA-Titer: = Nebennieren-Cortex-Autoantikörper (gemessen durch Immunofluoreszenz)
21-OHAb: = 21-OH-Autoantikörper-Pegel gemessen durch Immuno-Ablagerungstests nach Tanaka et al.; J. Clin Endocr. Metab 82 (1997) Seiten 1440–1446.

Bei der Mehrzahl der Patienten wurde die Bindung von Ab an ¹²⁵-I-21-OH nicht oder nur teilweise durch Mab 1 F(ab')₂ gehemmt, mit einer mittleren Hemmung von 15% ± 12,7 (Mittelwert ± SD, n=25; Bereich 0–50%). Allerdings verursachte im Falle der Seren von drei Patienten (1 in der Gruppe APS Typ II und 2 in der Gruppe AD) Mab 1 F(ab')₂-Hemmung von Ab-Bindung von 50%, 30% bzw. 47% (siehe Tabelle 4). Mab 3 Fab resultierte in der Hemmung von Ab-Bindung ¹²⁵-I-21-Hydroxylase bei allen 25 getesteten Patientenseren mit einer mittleren Hemmung von 54% ± 14,5 (Mittelwert ± SD, n=25; Bereich 27–75%) (siehe Tabelle 4).
Mab 5 F(ab')₂ hemmte auch die Ab-Bindung an ¹²⁵-I-21-Hydroxylase bei allen 25 Patientenseren mit einer mittleren Hemmung von 76% ± 12,4 (Mittelwert ± SD, n=25; Bereich 35–92%) (siehe Tabelle 4).
Eine Kombination der drei Fab oder F(ab')₂-Präparate resultierte in praktisch vollständiger Hemmung von Ab-Bindung an ¹²⁵-I-21-Hydroxylase bei 24 von 25 Patienten mit einer mittleren Hemmung von 89,5% ± 4,6 (Mittelwert ± SD, n=24; Bereich 80–95%). Im Falle eines Patienten in der AD-Gruppe führte allerdings die Kombination dreier Fab- und F(ab')₂-Präparate nur zu einer Hemmung von 67% (siehe Tabelle 4).
Bei der Wirkung aller Fab- oder F(ab')₂-Fragmente auf die Ab-Bindung zwischen verschiedenen Patientengruppen traten keine statistischen Differenzen auf (p>0,05).
Bei Verwendung einer Kombination aller drei Fab oder F(ab')₂-Präparate traten jedoch statistisch signifikante Unterschiede zwischen der Hemmung von Ab-Bindung bei der Gruppe APS Typ II und der Gruppe potentielle AD auf (p=0,01), der AD-Gruppe und der Gruppe potentieller AD (p=0,01) und der Gruppe subklinischer AD und der Gruppe potentieller AD (p=0,01); zwischen den anderen Gruppen bestanden keine statistisch signifikanten Unterschiede (p>0,05).
Bei der IPA basierend auf ³⁵-S-markierter 21-Hydroxylase reagierten alle fünf Mabs mit 21-Hydroxylase in voller Länge und mit 21-Hydroxylase verkürzt entweder bei Aminosäure 448 oder 418 (aus Konstrukten p21-OH1, p21-OH2 und p21-OH3; Tabelle 1). Daneben reagierte Mab 5 mit 21-Hydroxylase verkürzt bei Aminosäure 381 (von Konstrukt p21-OH4) und mit 21-Hydroxylase mit der inneren Entfernung der Aminosäuren 382–414 (aus Konstrukt p21-OH12; Tabelle 1). Keine der 21-Hydroxylase-Mabs band sich an 21-OH, die bei entweder Aminosäure 335 oder Aminosäure 282 gekürzt war (von Konstrukten p21-OH14 bzw. p21-OH5; siehe Tabelle 1).
Weitere Studien wurden durchgeführt mittels modifizierter 21-Hydroxylase-Proteine, wobei kürzere Bereiche von Aminosäuren entfernt worden waren. Alle 21-Hydroxylase-Mabs reagierten mit 21-Hydroxylase mit den Aminosäuren 494–412 entfernt (aus Konstrukten pND21-OH2 und pND21-OH3; siehe Tabelle 2). Mab 1, 2 und 5 reagierten mit 21-Hydroxylase mit den Aminosäuren 494–406 entfernt (nach Konstrukt pND21-OH4; siehe Tabelle 2), wohingegen Mab 3 und 4 mit diesen modifizierten Proteinen nicht reagierten (siehe Tabelle 2). Mab 1–4 reagierten nicht mit modifizierten 21-Hydroxylase-Proteinen, die bei Aminosäuren 391, 360, 340 und 335 gekürzt waren (von Konstrukten pND21-OH5 – 8; Tabelle 2). Im Gegensatz dazu band sich Mab 5 an 21-Hydroxylase-Proteine, die bei Aminosäure 391, 360 und 340 verkürzt waren, jedoch nicht an 21-Hydroxylase gekürzt bei Aminosäure 335 (Tabelle 2).
Hieraus folgt, dass Amionosäuren 391–405, definiert als ER1, wichtig für die Bindung von Mab 1 und Mab 2 waren. Aminosäuren 406–411, definiert als ER2, waren wichtig für die Bindung von Mab 3 und Mab 4, und Ami nosäuren 335–339, definiert als ER3, erschienen wichtig für die Bindung von Mab 5.
Die Aminosäure-Sequenzen humaner und boviner 21-Hydroxylase wurden Computer-Analysen unterzogen, um die Sequenzen in den Epitop-Regionen ER1, 2 und 3 zu vergleichen. ER1 (AA 391–405), erkannt durch Mab 1 und Mab 2, stellte sich als 87% homolog, mit Unterschieden bei 2 Aminosäuren heraus; Arginin bei Position 400 in humaner 21-Hydroxylase im Gegensatz zu Glutamin in boviner 21-Hydroxylase; und Tryptophan bei Position 405 in humaner 21-Hydroxylase im Gegensatz zu Arginin in boviner 21-Hydroxylase (3). ER2 (AA 406–411 erkannt durch Mab 3 und Mab 4, stellte sich als 100% homolog heraus. ER3 (AA 335–339, die von Mab 5 erkannt wird, stellte sich als 80% homolog heraus, mit nur einer unterschiedlichen Aminosäure zwischen humaner und boviner 21-Hydroxylase; Prolin bei Position 335 in humaner 21-Hydroxylase im Gegensatz zu Threonin in boviner 21-Hydroxylase (3).
Schlussfolgerungen
Es konnten mithin drei Abschnitte von 21-Hydroxylase-Aminosäuresequenzen identifiziert werden, die in dem C-Terminal-Abschnitt des Proteins angeordnet sind, welche wesentlich für die Anbindung von Mab 1 bis 5 sind. Da Fab oder F(ab')₂-Fragmente, die aus diesen monoklonalen Antikörpern präpariert wurden, bei 24 von 25 der getesteten Seren vollständig die Bindung von 21-Hydroxylase-Autoantikörpern hemmten, müssen dieselben Bereiche von Aminosäuren auch wesentlich für die Autoantikörper-Bindung sein. Autoantikörper-Bindung war im höchsten Maße gehemmt bei Mab 5 F(ab')₂, was nahe legt, dass ER3 (AA 335–339) das wichtigste autoantigene Epitop bei der Mehrzahl von Patientenseren ist. Studien mit Fab oder F(ab')₂-Präparaten aus Mab 1 und Mab 3 zeigten, dass ER1 (AA 391–405) weniger wichtig ist als ER3 (AA 335–339) und ER2 (AA 406–411).
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt beim Studium von 21-Hydroxylase-Ab von Patienten mit verschiedenen Formen autoimmuner Krankheiten. 21-Hydroxylase-Ab-Epitope, die von AA 335–339 (ER3) und AA 406–411 (ER2) abhängen, sind spezifisch für humane 21-Hydroxylase, und 21-Hydroxylase-Ab, die gegen diese Epitope gerichtet ist, reagiert bei Immunofluoreszenz-Tests nicht mit bovinem Nebennierengewebe. Analysen von Unterschieden in der Reaktivität von Mab mit humanem und bovinem Nebennierengewebe in Immunofluoreszenz-Studien und der Unterschiede in den Aminosäuren-Sequenzen humaner und boviner 21-Hydroxylase legen nahe, dass Prolin 335 wichtig bei der Ausbildung des (der) Haupt-21-Hydroxylase-Ab-Bindungsortes) ist.
Insgesamt zeigen diese Studien dass:

1. die Bindung von 21-Hydroxylase-Autoantikörpern abhängt von wenigstens drei verschiedenen Epitopen im C-Terminal-Teil von 21-Hydroxylase (AA 335–339, 391–405 und 406–411);
2. zwei dieser Epitope (eine abhängig von AA 335–339 und die andere abhängig von AA 406–411) sind spezifisch für humane 21-Hydroxylase und eine dritte (AA 391–405) ist vorhanden sowohl bei humaner als auch boviner 21-Hydroxylase.

Claims

Peptidsequenz, die die Konformation der Primärstruktur einer Epitop-Region von 21-OH repräsentiert, mit der Autoantikörper, die als Antwort auf 21-OH erzeugt werden, interagieren, wobei die Peptidsequenz aus einer der folgenden besteht: Aminosäuren Nr. 335 bis 339 von 21-OH; oder Aminosäuren Nr. 391 bis 405 von 21-OH; oder Aminosäuren Nr. 406 bis 411 von 21-OH.
Peptidsequenz, die die Konformation der Primärstruktur einer Epitop-Region von 21-OH repräsentiert, mit der Autoantikörper, die als Antwort auf 21-OH erzeugt werden, interagieren, wobei die Peptidsequenz aus Aminosäuren Nr. 335 bis 339 von 21-OH besteht.
Peptidsequenz, die die Konformation der Primärstruktur einer Epitop-Region von 21-OH repräsentiert, mit der Autoantikörper, die als Antwort auf 21-OH erzeugt werden, interagieren, wobei die Peptidsequenz aus Aminosäuren Nr. 391 bis 405 von 21-OH besteht.
Peptidsequenz, die die Konformation der Primärstruktur einer Epitop-Region von 21-OH repräsentiert, mit der Autoantikörper, die als Antwort auf 21-OH erzeugt werden, interagieren, wobei die Peptidsequenz aus Aminosäuren Nr. 406 bis 411 von 21-OH besteht.
Peptidsequenz nach Anspruch 1, bestehend aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen besteht: AHLDETVWERPHEFW AHLDETVWEQPHEFW PDRFLE PYKDR TYKDR.
Verfahren zur Diagnose von offener, subklinischer oder potentieller Autoimmun-Nebennierenkrankheit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Zurverfügungstellen einer Probe Körperflüssigkeit von einem Subjekt; (b) Zurverfügungstellen eines oder mehrerer monoklonaler, polyklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen 21-OH oder eines oder mehrerer Fragmente davon, der/die mit einer Epitop-Region von 21-OH interagiert/interagieren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert; (c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Peptidsequenz, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, und dem Antikörper, wie durch Schritt (b) zur Verfügung gestellt, so dass die Peptidsequenz mit entweder in der Probe enthaltenen Auto-Antikörpern gegen 21-OH oder dem durch Schritt (b) zur Verfügung gestellten Antikörper interagieren kann; und (d) Beobachten des Ausmaßes der Interaktion der Peptidsequenz mit den Auto-Antikörpern, um ein Anzeichen für die Anwesenheit solcher Auto-Antikörper in der Probe zu erhalten und damit eine Diagnose der offenen, subklinischen oder potentiellen Autoimmun-Nebennierenkrankheit zu stellen.
Verfahren zur Diagnose von offener, subklinischer oder potentieller Autoimmun-Nebennierenkrankheit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Zurverfügungstellen einer Probe Körperflüssigkeit von einem Subjekt; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer gekennzeichneten Peptidsequenz, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, so dass die Peptidsequenz mit in der Probe enthaltenen Auto-Antikörpern gegen 21-OH interagieren kann; und (c) Beobachten des Ausmaßes der Interaktion der Peptidsequenz mit den Auto-Antikörpern, um ein Anzeichen für die Anwesenheit solcher Auto-Antikörper in der Probe zu erhalten und damit eine Diagnose der offenen, subklinischen oder potentiellen Autoimmun-Nebennierenkrankheit zu stellen.
Verwendung einer Peptidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Nachweis von als Antwort auf 21-OH erzeugten Auto-Antikörpern in einer Probe Körperflüssigkeit von einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Nachweis von Auto-Antikörpern gegen 21-OH eine Diagnose der offenen, subklinischen oder potentiellen Autoimmun-Nebennierenkrankheit liefert.