PL188557B1 - Sposób wytwarzania swoiście wiążącego się czynnika, swoiście wiążący się czynnik, kwas nukleinowy ifag - Google Patents
Sposób wytwarzania swoiście wiążącego się czynnika, swoiście wiążący się czynnik, kwas nukleinowy ifagInfo
- Publication number
- PL188557B1 PL188557B1 PL97330075A PL33007597A PL188557B1 PL 188557 B1 PL188557 B1 PL 188557B1 PL 97330075 A PL97330075 A PL 97330075A PL 33007597 A PL33007597 A PL 33007597A PL 188557 B1 PL188557 B1 PL 188557B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- fibronectin
- antigen
- domain
- specific binding
- Prior art date
Links
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title claims abstract description 145
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title claims abstract description 145
- 238000010276 construction Methods 0.000 title 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 108
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 101
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 80
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 70
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 70
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 61
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N 0.000 claims description 3
- RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N Gly-Val-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- JWTKVPMQCCRPQY-SRVKXCTJSA-N His-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JWTKVPMQCCRPQY-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 3
- KKFVKBWCXXLKIK-AVGNSLFASA-N Lys-His-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KKFVKBWCXXLKIK-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 3
- JIWJRKNYLSHONY-KKUMJFAQSA-N Pro-Phe-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JIWJRKNYLSHONY-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 3
- ZYJMLBCDFPIGNL-JYJNAYRXSA-N Pro-Tyr-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O ZYJMLBCDFPIGNL-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims description 3
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 claims description 3
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 claims description 3
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 claims description 3
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims description 3
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 28
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 17
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 6
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 5
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 3
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 241001425027 Monomia Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- -1 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 101150008586 cgs2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 4-Chloro-ortho-toluidine Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1N CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001092081 Carpenteria Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101001027551 Gallus gallus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000049982 HMGA2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039143 HMGA2 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000662009 Homo sapiens UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 101001027130 Mus musculus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102100037921 UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108010018161 UlTma DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 101150070760 cgs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000289 malignant teratoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 108700041364 rat Eng Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 206010040400 serum sickness Diseases 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania swoiscie wiazacego sie czynnika, który jest przeciwcialem lub fragmentem przeciwciala zawierajacego domene przeciwciala wiazaca antygen, w którym domene przeciwciala wiazaca antygen, wyodrebnia sie ze zbioru syntetycznych, molekularnych receptorów i wiaze bezposrednio z ED-B nowotworowo-plodowa domena fibronektyny (FN), znamienny tym, ze (a) oddziela sie fragment przeciwciala z biblioteki ekspresyjnej frag- mentów przeciwcial ludzkich przy uzyciu rekombinowanej pochodnej antygenu z bialkiem fibronektyny, po czym (b) infekuje sie komórki bakteryjnego gospodarza pozy- tywnymi klonami, a nastepnie (c) podaje sie pozytywne klony fag procesowi dojrzewania powinowactwa, po czym (d) powtarza sie etap (a) w którym oddziela sie fragment prze- ciwciala z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwcial ludzkich przy uzyciu rekombi- nowanej pochodnej antygenu z bialkiem fibronektyny i etap (b) w którym infekuje sie komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami, celem oddzielenia pozytywnych klonów fag ze zwiekszonym powinowactwem do antygenu, a nastepnie (e) infekuje sie ko- mórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami i oczyszcza sie czasteczki przeciwciala od wspomnianych komórek gospodarza. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania swoiście wiążącego się czynnika, swoiście wiążący się czynnik, kwas nukleinowy i fag, stosowane w diagnostyce i leczeniu nowotworów. Swoiście wiążący się czynnik wiąże się z płodową izoformą fibronektyny, ED-B, która występuje również w rozwijających się naczyniach krwionośnych nowotworów, co udowodniono prowadząc badania immunocytochemiczne jak i bezpośrednio działając na nowotwory in vivo.
Podstawowym celem większości istniejących form terapii nowotworów jest zabicie jak największej liczby komórek nowotworowych. Ograniczony sukces, osiągany przy stosowaniu chemioterapii i radioterapii ma związek z względnym brakiem specyficzności leczenia w stosunku do nowotworów i występowaniem toksycznych, ubocznych efektów w tkankach zdrowych. Jednym ze sposobów mogących zwiększyć selektywność terapii nowotworów jest dostarczanie do nowotworu czynnika za pośrednictwem wiążącego się białka, które zazwyczaj zawiera domenę wiążącą przeciwciała, swoistą do znacznikowego antygenu występującego na powierzchni komórek nowotworowych a nieobecnego na komórkach zdrowych. Głównym przykładem takiej bezpośredniej terapii, potocznie określanej „magie bullets”, są przeciwciała monoklonalne (mAb) gryzoni, swoiste do tak zwanych: antygenów związanych z nowotworem obecnych na powierzchni komórek. Takie przeciwciała monoklonalne (mAb) mogą być chemicznie połączone z cząstką cytotoksyczną (na przykład z toksyną lub lekiem) lub mogą być otrzymywane w postaci zrekombinowanego białka, gdzie geny kodujące przeciwciało i toksynę są połączone i razem podlegają ekspresji.
Podejście „magie bullets” miało ograniczone, jakkolwiek istotne, zastosowanie w leczeniu ludzkiego raka, a szczególnie w ukierunkowanym działaniu na nowotwory pochodzenia limfatycznego, w których komórki nowotworowe są najbardziej dostępne dla terapeutycznej dawki leku, znajdującej się w krwiobiegu. Jednakże, leczenie guzów litych pozostaje poważnym problemem klinicznym, ponieważ tylko znikomy procent ich całkowitej masy komórkowej, przeważnie komórki znajdujące się najbardziej na zewnątrz guza, jest narażony na działanie terapeutycznych immunokonjugantów znajdujących się w krwiobiegu; te peryferyczne komórki tworzą tak zwaną: „barierę miejsca wiązania” („binding site barrier”) dla wnętrza guza (Juweid i inni, 1992, Cancer Res. 52 5144-5153). Wewnątrz guza architektura tkanki jest zazwyczaj zbyt zwarta z powodu zwłókniałego zrębu, a i komórki guza są ułożone zbyt ściśle
188 557 aby możliwa była penetracja do wnętrza cząsteczek wielkości przeciwciał. Ponadto, guzy znane są z tego, że posiadają podwyższone ciśnienie śródmiąższowe powodujące brak drenażu limfatycznego co także utrudnia dopływ egzogennych cząsteczek. Przegląd czynników wpływających na przenikanie środków terapeutycznych do wnętrza guzów przedstawił ostatnio Jain, R (1994), Sci. Am. 271 58-65.
Chociaż istnieją oczywiste ograniczenia leczenia guzów litych bezpośrednio działając na antygeny związane z nowotworami, nowotwory te mają wspólne właściwości, które dostarczają alternatywnego antygenu dla terapii przeciwciałami. Guzy, gdy osiągną pewną wielkość, są uzależnione od dopływu krwi z tlenem i substancjami odżywczymi, które są niezbędne do podtrzymywania ich wzrostu. Jeśli dopływ krwi zostanie zaburzony lub przerwany, jest potencjalnie możliwe zagłodzenie tysięcy komórek nowotworowych. W trakcie swojego rozwoju nowotwór ulega przełączeniu na fenotyp angiogeniczny, wytwarzający szeroką gamę czynników angiogenicznych, które mają wpływ na komórki śródbłonka sąsiednich naczyń włosowatych, indukując ich proliferację i migrację. Struktura tych nowopowstałych naczyń krwionośnych jest wysoce zdezorganizowana z powodu ślepych zakończeń i fenestracji prowadzących do zwiększonego wyciekania, w przeciwieństwie do uporządkowanej struktury naczyń włosowatych zdrowej tkanki. Indukcji angiogenezy towarzyszy wzrost ekspresji pewnych antygenów powierzchniowych komórek, z których wiele jest charakterystycznych dla naczyń zdrowych tkanek. Zidentyfikowanie antygenów, które są unikalne dla naczyń guzów było głównym czynnikiem ograniczającym rozwój leczenia ogólnego guzów litych, poprzez donaczyniowe podawanie leków. Antygen, który jest przedmiotem niniejszego wynalazku, odnosi się bezpośrednio do tego problemu.
W trakcie rozwoju nowotworu, zewnątrzkomórkowa macierz otaczających tkanek jest przebudowywana w dwóch podstawowych procesach: (1) proteolitycznej degradacji składników zewnątrzkomórkowej macierzy zdrowej tkanki i (2) syntezie de novo składników zewnątrzkomórkowej macierzy prowadzonej zarówno przez komórki nowotworowe jak i komórki zrębu aktywowane przez cytokiny indukowane nowotworem. Te dwa procesy, w stanie równowagi dynamicznej, wytwarzają „nowotworową zewnątrzkomórkową macierz”, która stwarza bardziej dogodne do rozwoju nowotworu środowisko i jest jakościowo i ilościowo różna od macierzy zdrowych tkanek. Do składników tej macierzy należą duże izoformy tenascyny i fibronektyny (FN); określanie tych białek używając terminu „izoformy”, podkreśla ich rozległą strukturalną heterogenność, która dokonuje się na poziomie transkiypcyjnym, posttranskrypcyjnym i posttranslacyjnym (patrz poniżej). Istotą niniejszego wynalazku jest jedna z izoform fibronektyny, nazywana izoformą B+ (B-FN).
Fibronektyny (FN) są wielofunkcyjnymi, wysokocząsteczkowymi glikoproteinami, które wchodzą w skład macierzy zewnątrzkomórkowej i płynów ustrojowych. Uczestniczą one w wielu różnorodnych procesach biologicznych jak ustalanie i utrzymywanie morfologii zdrowej komórki, migracja komórek, hemostaza i tromboza, gojenie ran i transformacja nowotworowa (Alitalo i inni, 1982; Yamada, 1983: Hynes, 1985; Ruoslahti i inni, 1988; Hynes, 1990; Owens i inni, 1986). Strukturalna różnorodność fibronektyn jest spowodowana alternatywnym składaniem (splicing) trzech regionów (ED-A, ED-B i IIICS) pierwotnego transkryptu fibronektyny (FN) (Hynes, 1985; Zardi i inni, 1987). Proces ten umożliwia powstawanie przynajmniej 20 różnych izoform fibronektyny, a ekspresja niektórych z nich jest różna w komórkach tkanek nowotworowych i zdrowych. Składanie pre-mRNA fibronektyny jest regulowane w tkankowo-specyficzny jak i rozwojowo-specyficzny sposób. Wiadome jest, że w komórkach transformowanych i komórkach o charakterze nowotworowym proces ten jest zaburzony (Castellani i inni, 1986; Borsi i inni, 1987; Vartio i inni, 1987; Zardi i inni, 1987; Barone i inni, 1989; Camemolla i inni 1989; Oyama i inni, 1989, 1990; Borsi i inni, 1992b). Izoformy fibronektyny zawierające sekwencje ED-A, ED-B i IIICS ulegają ekspresji w większym stopniu w komórkach transformowanych i złośliwych komórkach nowotworowych niż w komórkach zdrowych. Szczególnie, izoform fibronektyny, zawierającej sekwencję ED-B (izoformą B+), występuje więcej w tkankach płodowych i nowotworowych, podczas gojenia się ran, a jej ekspresja jest ograniczona w zdrowych tkankach dorosłych (Norton i inni, 1987; Schwarzbauer i inni, 1987; Gutman i Komblihtt, 1987; Camemolla i inni, 1989; Ffrench188 557
-Constant i inni, 1989; Ffrench-Constant i Hynes, 1989; Laitinen i inni, 1991). Cząsteczki B+ fibronektyny nie są wykrywane w dojrzałych naczyniach, ale ich poziom podnosi się podczas tworzenia się naczyń krwionośnych zdrowych (np. rozwój śluzówki macicy), patologicznych (np. w retiopatii cukrzycowej) i podczas rozwoju nowotworu (Castellani i inni, 1994).
Sekwencja ED-B zawiera powtarzającą się sekwencję homologiczną do sekwencji typu IH, jest kodowana przez pojedynczy exon i składa się z 91 reszt aminokwasowych. W przeciwieństwie do alternatywnie składanej izoformy IIICS, która zawiera miejsce typowo-specyficznego wiązania się do komórki, biologiczna funkcja izoform A+ i B+ jest ciągle przedmiotem spekulacji (Humphies i inni, 1986).
Obecność samej izoformy B+ stanowi zaindukowany nowotworem nowy antygen, a dodatkowo ekspresja ED-B ujawnia normalnie utajony antygen wewnątrz 7 powtarzającej się sekwencji typu III (poprzedzającej ED-B); ponieważ ten epitop nie ujawnia się w cząsteczkach fibronektyny, w których nie występuje ED-B, to wskazuje, że ekspresja ED-B indukuje bezpośrednio i pośrednio ekspresję nowych antygenów. To utajone miejsce antygenowe jest miejscem wiązania się przeciwciała monoklonalnego (mAb) nazwanego BC-1 (Camemolla i inni, 1992). Swoistość i biologiczne właściwości tego przeciwciała zostały opisane w EP 0 344 134 BI i można je otrzymać z hybrydoma zdeponowanej w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórek Zwierzęcych, Porton Down, Salisbury, UK pod numerem 88042101. Tego przeciwciała używano z powodzeniem do lokalizacji angiogenicznych naczyń krwionośnych nowotworów, nie wykazywały one krzyżowych reakcji z dojrzałymi naczyniami śródbłonka, co ilustruje potencjalną możliwość wykorzystania izoform fibronektyny w ukierunkowanym działaniu na naczynia przeciwciałami.
Jednakże, istnieją pewne sprzeczności dotyczące swoistości przeciwciał monoklonalnych BC-1. Fakt, że BC-1 nie rozpoznaje bezpośrednio izoformy B+ stawia pytanie, czy w niektórych tkankach, epitop rozpoznawany przez BC-1 mógłby być ujawniony pod nieobecność ED-B i pośrednio powodować niechciane reakcje krzyżowe przeciwciała BC-1. Ponadto, BC-1 jest całkowicie swoiste do ludzkiej izoformy B+, co oznacza, że badania prowadzone na zwierzętach, nad biodystrybucją i lokalizacją nowotworów przeciwciałami BC-1 nie są możliwe. Chociaż otrzymano przeciwciała poliklonalne przeciwko zrekombinowanym białkom fuzyjnym zawierającym izoformę B+ (Peters i inni, 1995), reagują one tylko z fibronektyną, traktowana uprzednio N-glikanazą, w celu ujawnienia epitopu.
Kolejnym ogólnym problemem związanym ze stosowaniem mysich przeciwciał monoklonalnych jest odpowiedź układu immunologicznego człowieka, który produkuje ludzkie przeciwciała przeciwko immunoglobulinom mysim (HAMA) (od ang. human-anti-mouse antibody) (Schroff i inni, 1985; Dejager i inni, 1988). Odpowiedzi te mają zasięg działania od neutralizacji podanego przeciwciała, prowadzącej do redukcji dawki terapeutycznej, aż do odpowiedzi alergicznych, choroby posurowiczej i upośledzenia nerek.
Chociaż otrzymano poliklonalne przeciwciała reagujące ze zrekombinowaną ED-B (patrz powyżej), to izolacja przeciwciał monoklonalnych o takiej samej swoistości jak swoistość BC-1, prowadząc immunizację myszy okazała się trudna ponieważ białka ED-B człowieka i myszy wykazują 100% homologię sekwencji. Dlatego ludzkie białko może być rozpoznawane przez mysz jako jej własny antygen, który nie wzbudza odpowiedzi immunologicznej. W rzeczywistości, przez ponad 10 lat intensywnych badań prowadzonych na tym polu, zidentyfikowano tylko jedno przeciwciało monoklonalne reagujące pośrednio z izoformą B+ fibronektyny (BC-1), a żadnego rozpoznającego bezpośrednio ED-B. Jest istotne, że swoistość BC-1 jest skierowana raczej w stosunku do utajonego epitopu ujawnianemu dzięki ED-B, niz w stosunku do części samej domeny ED-B, a epitop ten zazwyczaj nie występuje w mysiej fibronektynie i dlatego nie jest rozpoznawany jako własny przez układ immunologiczny myszy.
Niniejszy wynalazek zrealizowano dzięki zastosowaniu alternatywnej strategii, do tych wcześniej stosowanych, w której uprzednia immunizacja fibronektyną czy ED-B nie jest wymagana: przeciwciała swoiste do izoformy ED-B zostały otrzymane jako fragmenty pojedynczych łańcuchów Fvs (scFvs) z bibliotek różnych regionów ludzkiego przeciwciała prezentowanych na powierzchni bakteriofag. (Nissim i inni, 1994; patrz również W092/01047, W092/20791, W093/06213, W093/11236, W093/19172).
188 557
Wykorzystując bibliotekę fagową przeciwciał, odkryliśmy, że swoiste fragmenty scFvs mogą być izolowane zarówno przez bezpośrednią selekcję z zastosowaniem zrekombinowanych fragmentów fibronektyny zawierających domenę ED-B jak i z zastosowaniem samej zrekombinowanej domeny ED-B, kiedy antygeny te były opłaszczane na stałej powierzchni („panning”). Te same źródła antygenu zastosowano z powodzeniem do otrzymywania „drugiego pokolenia” fragmentów scFvs, z udoskonalonymi właściwościami w stosunku do klonów rodzicielskich w procesie „dojrzewania powinowactwa”. Zauważyliśmy, że izolowane fragmenty scFvs reagują silnie i swoiście z izofonnąB+ ludzkiej fibronektyny bez uprzedniego traktowania jej N-glikanazą.
W zastosowaniach przeciwnowotworowych, domeny ludzkiego przeciwciała wiążące antygen dostarczone w niniejszym wynalazku, są korzystne ponieważ nie wywołują odpowiedzi HAMA. Ponadto, jak wykazano w tej pracy, mogą być stosowane w analizach immunohistochemicznych tkanki nowotworowej, zarówno in vitro jak in vivo. Te i inne zastosowania są omówione w dalszej części opisu i są oczywiste dla fachowca w tej dziedzinie.
TERMINOLOGIA
Swoiście wiążący się czynnik
Termin ten oznacza czynnik, jedną z pary cząsteczek, które swoiście wiążą się jedna do drugiej. Czynniki takiej swoiście wiążącej się pary mogą być naturalnymi pochodnymi lub mogą być całkowicie albo częściowo otrzymane syntetycznie. Jeden z czynników pary cząsteczek posiada na swojej powierzchni obszar, lub wgłębienie, które swoiście wiążą się i są komplementarne do określonej przestrzeni czy polarnej organizacji drugiego czynnika z pary cząsteczek. Dlatego czynniki jednej pary mają zdolność swoistego wiązania się ze sobą. Przykładami typów swoiście wiążących się par są: antygen-przeciwciało, biotyna-awidyna, hormon-receptor hormonu, receptor-ligand, enzym-substrat.
Przeciwciało
Ten termin oznacza immunoglobulinę naturalną lub częściowo albo całkowicie otrzymaną syntetycznie. Obejmuje również każdy polipeptyd lub białko posiadające domenę wiążącą, która jest domeną wiążącą przeciwciała lub jest do niej homologiczna. Mogą one pochodzić z naturalnych źródeł, lub mogą być częściowo lub całkowicie syntetyzowane. Przykładami przeciwciał są izotypy immunoglobulin i ich izotypowe podklasy; fragmenty, zawierające domenę wiążącą takie jak Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; i „diaciała” (diabody).
Możliwe jest wykorzystywanie przeciwciał monoklonalnych i innych przeciwciał, korzystając z technik rekombinacji DNA do produkcji innych przeciwciał lub cząsteczek chimerycznych, które zachowują swoistość oryginalnego przeciwciała. Do tych technik może należeć wprowadzanie DNA kodującego zmienny region immunoglobuliny, lub regiony determinujące komplementamość (CDR) przeciwciał do stałych regionów, lub stałych regionów z regionami strukturalnymi innych immunoglobulin. Patrz EP-A-184187, GB 2188638A lub EP-A-239400. Hybrydoma lub inna komórka wytwarzająca przeciwciała może być przedmiotem mutacji genetycznej lub innych zmian, które mogą ale nie muszą zmieniać swoistość wiązania produkowanych przeciwciał.
Ponieważ przeciwciała mogą być modyfikowane na wiele różnych sposobów, termin „przeciwciało” powinien być rozumiany jako obejmujący każdy swoiście wiążący się czynnik lub substancję posiadającą domenę wiążącą o wymaganej swoistości. Dlatego termin ten obejmuje fragmenty przeciwciał, pochodne, funkcjonalne ekwiwalenty i homologii przeciwciał, włączając każdy polipeptyd obejmujący domenę wiążącą immunoglobuliny, naturalny lub całkowicie albo częściowo syntetyczny. Chimeryczne cząsteczki zawierające domenę wiążącą immunoglobuliny, jej ekwiwalent połączony z innym peptydem są również w ten sposób nazywane. Klonowanie i uzyskiwanie ekspresji chimerycznych przeciwciał zostało opisane w EP-A-0120694 i EP-A-0125023.
Udowodniono, ze fragmenty całych przeciwciał mogą pełnić funkcję wiązania antygenów. Przykłady wiążących się fragmentów stanowią: (i) fragment Fab składający się z domen VL, VH, CL i CHI; (ii) fragment Fd składający się z domen VH i CHI; (iii) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego przeciwciała; (iv) fragment dAb (Ward i inni, 1989), który składa się z domeny VH; (v) pojedyncze regiony CDR; (vi) fragmenty F(ab')2, dwuwarto188 557 ściowy fragment obejmujący dwa połączone fragmenty Fab; (vii) cząsteczki pojedynczego łańcucha Fv (scFv), w których domena VH i domena VL są połączone peptydowym łącznikiem, który pozwala tym dwóm domenom na stworzenie miejsca wiązania antygenu (Bird i inni, 1988; Huston i inni, 1988); (viii) dwuwartościowe dimery pojedynczych łańcuchów Fv (PCT/US92/09965) i (ix) „diaciała”, wielowartościowe lub wieloswoiste fragmenty, otrzymane na drodze fuzji genów (W094/13804; Hollinger i inni, 1993).
„Diaciała” są multimerami polipeptydów, każdy polipeptyd zawiera pierwszą domenę zawierającą region wiązania łańcucha lekkiego immunoglobuliny i drugą domenę zawierającą region wiązania łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, te dwie domeny są połączone (np. peptydowym łącznikiem) ale nie mogą łącząc się ze sobą stworzyć miejsca wiążącego antygen: miejsca wiążące antygen są tworzone dzięki połączeniu się pierwszej domeny jednego polipeptydu multimeru z drugą domeną innego polipeptydu tego multimeru (W094/13804).
Stosując bispecyficzne przeciwciała można wykorzystywać konwencjonalne bispecyficzne przeciwciała, które można otrzymywać różnymi sposobami (Hollinger i Winter, 1993), np. otrzymywać chemicznie lub z hybrydowych hybrydoma, lub mogą to być jakiekolwiek bispecyficzne fragmenty przeciwciała wymienione powyżej. Czasami może być korzystniejsze zastosowanie dimerów scFv lub „diaciał” niż całych przeciwciał. „Diaciała” i dimery fragmentów scFv mogą być tak skonstruowane, że nie posiadają regionu Fc i zawierają tylko domeny zmienne, co potencjalnie redukuje skutki reakcji antyidiotypowej. Innymi formami przeciwciał bispecyficznych są pojedyncze łańcuchy „Janusins” opisane przez Traunekera i innych, (1991).
Bispecyficzne „diaciała”, w przeciwieństwie do bispecyficznych całych przeciwciał, mogą być szczególnie użyteczne ponieważ można je łatwo konstruować i otrzymywać w E.coli. „Diaciała” (i wiele innych polipeptydów takich jak fragmenty przeciwciał) o odpowiedniej swoistości mogą być łatwo selekcjonowane za pomocą bibliotek fagowych (W094/13804). Jeśli jedno ramię „diaciała” jest stałe na przykład o swoistości przeciwko antygenowi X, można zrobić bibliotekę, w której drugie ramię jest różnorodne i można z niej wybrać przeciwciało o odpowiedniej swoistości.
Domena wiążąca antygen
Termin ten określa część przeciwciała, która zawiera obszar swoiście się wiążący i komplementarny do części lub całego antygenu. Gdy antygen jest duzy, przeciwciało może wiązać się tylko z określoną częścią antygenu, określaną epitopem. Domena wiążąca antygen może być tworzona przez jedną lub więcej domen zmiennych przeciwciała. Korzystnie, domena wiążąca antygen zawiera zmienny region łańcucha lekkiego przeciwciała (VL) i zmienny region łańcucha ciężkiego przeciwciała (VH).
Swoistość
Ten termin odnosi się do sytuacji, w której jeden z czynników swoiście wiążącej się pary nie wykazuje znaczącego wiązania się do cząsteczek innych niż jego swoiście wiążący partner. To określenie jest również stosowane kiedy np. domena wiążąca antygen jest swoista do określonego epitopu, który posiada wiele antygenów, w takim przypadku swoiście wiążący się czynnik będzie mógł wiązać się z różnymi antygenami posiadającymi ten epitop.
Funkcjonalnie ekwiwalentny wariant
Określenie odnosi się do cząsteczki (wariantu), która chociaż różni się strukturalnie od innej cząsteczki (macierzystej) zachowuje znaczącą homologię a także przynajmniej niektóre z biologicznych funkcji cząsteczki macierzystej, np. zdolność wiązania się z określonym antygenem lub epitopem. Warianty mogą występować w formie fragmentów, pochodnych lub mutantów. Wariant pochodna lub mutant mogą być otrzymywane poprzez modyfikację cząsteczki macierzystej: addycję, delecję, substytucję lub insercję jednego lub większej liczby aminokwasów, lub przez sprzężenie z inną cząsteczką. Tych zmian można dokonywać na poziomie kwasu nukleinowego lub białka. Na przykład, kodowany polipeptyd może być fragmentem Fab, który jest sprzężony z fragmentem Fc pochodzącym z innego źródła. Alternatywnie może on być sprzężony z markerem np. enzymem, fluoresceiną, ect.
Sposób wytwarzania według wynalazku swoiście wiążącego się, izolowanego czynnika, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała zawierającego domenę przeciwciała
188 557 wiążącą antygen, w którym domenę przeciwciała wiążącą antygen, wyodrębnia się ze zbioru syntetycznych, molekularnych receptorów i wiąże bezpośrednio z ED-B nowotworowo-płodową domeną fibronektyny (FN), charakteryzuje się tym, że (a) oddziela się fragment przeciwciała z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwciał ludzkich przy użyciu rekombinowanej pochodnej antygenu z białkiem fibronektyny, po czym (b) infekuje się komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami, a następnie (c) podaje się pozytywne klony fag procesowi dojrzewania powinowactwa, po czym (d) powtarza się etap (a) w którym oddziela się fragment przeciwciała z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwciał ludzkich przy użyciu rekombinowanej pochodnej antygenu z białkiem fibroeżktyec i etap (b) w którym infekuje się komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami, celem oddzielenia pozytywnych klonów fag ze zwiększonym powinowactwem do antygenu, a następnie (e) infekuje się komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami i oczyszcza się cząsteczki przeciwciała od wspomnianych komórek gospodarza.
W etapie (a) korzystnie oddziela się fragment przeciwciała z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwciał ludzkich przy użyciu rżkombinowanżj pochodnej antygenu z białkiem fibronektyny przy użyciu zrekombinowanych antygenów 7B89 lub ED-B.
Stosuje się korzystnie dodatni klon kwasu nukleinowego podczas wyodrębniania z komórki gospodarza przeciwciała lub jego fragmentu kodowanego kwasem nukleinowym, przy czym przeciwciało lub jego fragment zawiera domenę przeciwciała wiążącego antygen, która jest swoista do i połączona bezpośrednio z ED-B nowotworowo-płodową domeną fibronektyny (FN).
Przeciwciało korzystnie otrzymuje się w postaci całkowitej, a fragment przeciwciała korzystnie otrzymuje się w postaci cząstki scFv.
Swoiście wiążący się, izolowany czynnik według wynalazku, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i zawiera domenę przeciwciała wiążącą antygen, charakteryzuje się tym, że domena przeciwciała wiążąca antygen jest izolowana z syntetycznych, molekularnych receptorów i jest swoista do i połączona bezpośrednio z nowotworowo-płodową domeną ED-B fibronektyny (FN).
Swoiście wiążący się czynnik korzystnie zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (VH) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DP47 (od kodonu 1 Glu do kodonu 98 Arg włącznie, przedstawioną na fig. 1) i sekwencję CDR3: Ser Leu Pro Lys; i/lub zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (VH) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DP47 (od kodonu 1 Glu do kodonu 98 Arg włącznie, przedstawioną na fig. 1) i sekwencję CDR3: Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu; i/lub zawiera sekwencję zmiżneżgo regionu łańcucha lekkiego (VL) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DPL16 (od kodonu 1 Ser do kodonu 90 Ser włącznie, przedstawioną na fig. 1) i resztę sekwencji CDR3 Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val; i/lub zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha lekkiego (VL) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DPL16 (od kodonu 1 Ser do kodonu 90 Ser włącznie, przedstawioną na fig. 1) i resztę sekwencji CDR3 Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val; i/lub zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (VH) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DP47 (od kodonu 1 Glu do kodonu 98 Arg włącznie, przedstawioną na fig. 1) i sekwencję CDR3.
Swoiście wiążący się czynnik według wynalazku w postaci oczyszczonego monomeru korzystnie ma stałą dysocjacji (Kj) 6 x KT M lub mniejszą dla domeny ED-B fibronektyny i korzystnie jest fragmentem przeciwciała, zawiera cząsteczkę scFv, a najkorzystniej zawiera dimeryczną cząsteczkę scFv i zawiera całkowite przeciwciała.
Kwas nukleinowy według wynalazku, charakteryzuje się tym, że koduje swoiście wiążący się izolowany czynnik, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i zawiera domenę przeciwciała wiążącą antygen, która jest izolowana z syntetycznych, molekularnych receptorów i jest swoista do i połączona bezpośrednio z nowotworowo-płodową domeną ED-B fibronektyny (FN).
Fag według wynalazku, charakteryzuje się tym, że zawiera kwas nukleinowy kodujący swoiście wiążący się izolowany czynnik, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i zawiera domenę przeciwciała wiążącą antygen, która jest izolowana z syntetycznych,
188 557 molekularnych receptorów i jest swoista do i połączona bezpośrednio z nowotworowo-płodową domeną eD-B fibronektyny (FN).
Komórka gospodarza według wynalazku, charakteryzuje się tym, że jest transformowana lub transfekowana kwasem nukleinowym kodującym swoiście wiążący się izolowany czynnik, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i zawiera domenę przeciwciała wiążącą antygen, która jest izolowana z syntetycznych, molekularnych receptorów i jest swoista do i połączona bezpośrednio z nowotworowo-płodową domeną ED-B fibronektyny (FN).
Swoiście wiążący się czynnik według wynalazku jest swoisty w stosunku do nowotworowo-płodowej domeny fibronektyny (FN). Swoiście wiążące się czynniki według wynalazku wiążą się bezpośrednio z domeną ED-B. W jednym z wykonań, swoiście wiążący się czynnik wiąże się z fibronektyną zawierającą ED-B, jakąkolwiek fibronektyną zawierającą ED-B lub ze wszystkimi fibronektynami zawierającymi ED-B, po uprzednim potraktowaniu fibronektyny termolizyną. W kolejnym wykonaniu, swoiście wiążący się czynnik wiąże się z fibronektyną zawierającą powtarzające się sekwencje homologii typu III, które obejmują domenę ED-B, jakąkolwiek fibronektyną zawierającą powtarzające się sekwencje homologii typu III, które obejmują domenę ED-B lub ze wszystkimi fibronektynami zawierającymi powtarzające się sekwencje homologii typu III, które obejmują domeną ED-B. Znane fibronektyny są opisane w dwóch artykułach Camemolla i innych, (1989; 1992). „Wszystkie fibronektyny zawierające ED-B” można traktować w odniesieniu do wszystkich fibronektyn określonych w tych artykułach jako zawierające ED-B.
Korzystnie, swoiście wiążący się czynnik wiąże ludzką ED-D, i korzystnie B+FN przynajmniej jeszcze jednego gatunku np. mysią, szczurzą i/lub kurzą. Korzystnie, swoiście wiążący się czynnik potrafi wiązać się z obiema ED-B fibronektyny: ludzką i innego pochodzenia np. mysią, co pozwala na prowadzenie testów i analizy swoiście wiążących się par czynników na modelu zwierzęcym.
Swoiście wiążące się czynniki według niniejszego wynalazku wiążą ED-B fibronektyny nie konkurując z ogólnie dostępnym, zdeponowanym przeciwciałem BC-1 omówionym w innym miejscu tego opisu. Przeciwciało BC-1 jest dokładnie swoiste do ludzkiej izoformy B+. Swoiście wiążące się czynniki według niniejszego wynalazku nie wiążą się do tego samego epitopu co przeciwciało BC-1.
Wiązanie się swoiście wiążącego się czynnika według niniejszego wynalazku z B+ fibronektyną może być hamowane przez domenę ED-B.
W innym aspekcie niniejszego wynalazku wiążąca się domena ma stałe dysocjacji (Kj) 6 x 10‘8 M lub mniej dla ED-B fibronektyny, do wyznaczenia tej stałej użyto oczyszczonego monomeru.
W jeszcze innym aspekcie niniejszego wynalazku domena wiążąca się wykazuje reaktywność tzn. jest zdolna związać się z ED-B fibronektyny bez wcześniejszego traktowania ED-B fibronektyny N-glikanazą.
Swoiście wiążące się czynniki według niniejszego wynalazku mogą być otrzymywane jako izolaty lub w oczyszczonej formie, co znaczy, że są wolne, oddzielone od innych swoiście wiążących się czynników, np. przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, lub wolnych innych swoiście wiążących się czynników posiadających zdolność wiązania ED-B fibronektyny. Korzystnie, swoiście wiążące się czynniki według niniejszego wynalazku są otrzymane w formie czystej substancji. Mogą być „monoklonalne” w tym sensie, ze pochodzą z pojedynczego klonu i nie są ograniczone do przeciwciał uzyskanych używając tradycyjnej technologii hybrydoma. Jak omówiono, swoiście wiążące się czynniki według wynalazku mogą być otrzymywane z wykorzystaniem bakteriofagowej technologii prezentacji i/lub ekspresji w zrekombinowanych np. bakteryjnych komórkach gospodarza. Nie istnieją wcześniejsze doniesienia dotyczące monoklonalnego swoiście wiążącego się czynnika, który wiąże się bezpośrednio z ED-B fibronektyny.
Korzystnie, swoiście wiążący się czynnik zawiera przeciwciało. Swoiście wiążący się czynnik może zawierać sekwencję polipeptydową w formie fragmentu przeciwciała takiego jak pojedynczy łańcuch Fv (scFv). Również mogą być wykorzystywane inne typy fragmentów przeciwciał takie jak: Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb lub „diaciało” (Winter i Milstein, 1991;
188 557
W094/13804). Swoiście wiążący się czynnik może być całym przeciwciałem. Całe przeciwciało może być jakąkolwiek z form izotypów przeciwciał np. IgG, IgA, IgD, IgE i IgM i jakąkolwiek z form podklas izotypowych np. IgGl lub IgG4.
Przeciwciało może być jakiegokolwiek pochodzenia, na przykład: ludzkie, mysie lub szczurze, owcze lub królicze. Fachowcom znane są również inne gatunki z których można otrzymywać przeciwciała. Korzystnie, przeciwciało jest ludzkiego pochodzenia. Przez „ludzkie” określa się przeciwciało, które częściowo lub wyłącznie pochodzi z biblioteki ludzkiego cDNA, biblioteki ludzkich białek lub peptydów. Termin ten określa również humanizowane peptydy i białka pochodzenia innego niż ludzkie, zmodyfikowane w sposób nadający cząsteczce przeciwciała cechy ludzkie, co pozwala jej obejść bariery układu immunologicznego człowieka.
Swoiście wiążący się czynnik może także być skonstruowanym przeciwciałem np. cząsteczką bispecyficzną przeciwciała (lub fragmentem takim jak F(ab')2), która posiada jedno ramię wiążące antygen (np. swoistą domenę) swoiste w stosunku do ED-B fibronektyny i drugie ramię o innej swoistości, lub dwuwartościową lub wielowartościową cząsteczką.
Oprócz sekwencji przeciwciała, swoiście wiążący się czynnik może zawierać inne reszty aminokwasowe np. tworzące peptyd lub polipeptyd, lub dodające cząsteczce inne funkcjonalne cechy będące dodatkiem do zdolności wiązania się z antygenem. Na przykład swoiście wiążący się czynnik może zawierać znacznik, enzym lub jego fragment itd.
Domena wiążąca może zawierać część lub całą domenę VH kodowaną przez segment linii zarodkowej lub przez segment genu powodującego rekombinacje. Domena wiążąca może zawierać część lub całość domeny VL kappa lub domeny VL lambda.
Domena wiążąca może zawierać sekwencję genu VH1, VH3 lub VH4 linii zarodkowej lub ich zrekombinowaną formę.
Swoiście wiążący się czynnik według niniejszego wynalazku może zawierać zmienny region łańcucha ciężkiego (domenę „VH”) pochodzący z ludzkiej linii zarodkowej DP47, którego sekwencję przedstawiono na fig. la, reszty aminokwasowe od 1 do 98. Oznaczenie „DP” jest wyjaśnione przez Tomlinson’a i innych, (1992). Sekwencja aminokwasowa CDR3 może być następująca: Ser Leu Pro Lys. Sekwencja aminokwasowa CDR3 może być także następująca: Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. Z tego powodu, domena wiążąca swoiście wiążącego się czynnika może zawierać domenę VH, która obejmuje sekwencje aminokwasowe CGSt i CGS2 pokazane na fig. 1(a).
Domena wiążąca może zawierać zmienny region łańcucha lekkiego (domenę „VL”) pochodzący z ludzkiej linii zarodkowej DPL16, którego sekwencję pokazano na fig. 1(b), kodony od 1 do 90.
Domena VL może zawierać następującą sekwencję CDR3;
Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val. Domena VL może zawierać następującą sekwencję CDR3: Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.
Swoiście wiążący się czynnik według wynalazku może zawierać funkcjonalnie ekwiwalentne warianty sekwencji przedstawionych na fig. 1 np. jeden lub więcej aminokwasów może być zmodyfikowanych poprzez insercję, delecję, substytucję lub addycję, pod warunkiem, że właściwość wykazana w tej pracy jest zachowana. Na przykład może być zmieniona sekwencja CDR3 lub jedna lub więcej zmian może być dokonanych w regionach strukturalnych, lub jeden region strukturalny może zostać zastąpiony innym lub zmodyfikowaną formą, pod warunkiem, ze swoiście wiążący się czynnik wiąże się z ED-B.
Jeden lub więcej regionów CDR z domen VL lub VH domeny wiążącej przeciwciała ujawnionych w tej pracy może być wykorzystanych do tak zwanego „przeszczepiania CDR” (CDR-grafting), gdzie jedna lub więcej sekwencji CDR jednego przeciwciała jest umieszczanych wewnątrz sekwencji nie tego przeciwciała np. innego przeciwciała, co zostało ujawnione w EP-B-0239400. Sekwencje CDR CGS1 i CGS2 przedstawiono na fig. 1(a) i 1(b).
Swoiście wiążący się czynnik według wynalazku może konkurować z przeciwciałem lub scFv opisanymi w tej pracy podczas wiązania się z ED-B fibronektyny. Konkurencja pomiędzy wiążącymi się czynnikami może być prosto oznaczona in vitro np. przez dołączenie specyficznej reporterowej cząsteczki do jednego z wiążących się czynników, który może zo188 557 stać wykryty w obecności innego niewyznakowanego wiążącego się czynnika(ów), umożliwiając identyfikację swoiście wiążących się czynników, które wiążą ten sam epitop lub epitop zachodzący.
Swoiście wiążący się czynnik według niniejszego wynalazku może być stosowany w sposobie obejmującym powodowanie wiązania się lub pozwalającym wiązać się swoiście wiążącemu się czynnikowi z jego epitopem. Wiązanie się może być następstwem podania swoiście wiążącego się czynnika ssakowi np. człowiekowi lub gryzoniowi np. myszy.
Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie swoiście wiążącego się czynnika jak wyżej do stosowania jako diagnostycznego dla nowotworów reagenta. Dowody uzyskane po przeprowadzeniu badań na modelu zwierzęcym opisane poniżej pokazują, że wiążące się czynniki według niniejszego wynalazku są użyteczne w lokalizacji nowotworu in vivo.
Swoiście wiążące się czynniki według niniejszego wynalazku obejmują te, które wiążą się z ludzkimi nowotworami np. w zamrożonym skrawku, które wykazują inwazyjny i angiogeniczny fenoptyp i te które wiążą się z tkankami embrionalnymi np. w zamrożonym skrawku. Wiązanie się może zostać zwizualizowane poprzez barwienie immunocytochemiczne.
W przedłożonym wykonaniu, swoiście wiążący się czynnik nie wiąże się lub nie wiąże się znacząco z tenascyną, białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej.
W innym przedłożonym wykonaniu, swoiście wiążący się czynnik nie wiąże się lub nie wiąże się znacząco ze zdrową ludzką skórą np. w zamrożonym skrawku i/lub co obrazuje zastosowanie barwienia immuncytochemicznego.
Kolejne wykonania swoiście wiążących się czynników według niniejszego wynalazku nie wiążą się lub nie wiążą się znacząco z jedną lub z większą ilością zdrowych tkanek (np. w zamrożonych skrawkach i/lub co obrazuje zastosowanie barwienia immuncytochemicznego) pobranych z wątroby, śledziony, nerek, żołądka, jelita cienkiego, jajnika, macicy, pęcherza, trzustki, nadnerczy, mięśnia szkieletowego, serca, płuc, tarczycy i mózgu.
Swoiście wiążący się czynnik dla ED-B może być wykorzystany jako czynnik ukierunkowujący działanie in vivo, który można wykorzystywać do specyficznego ujawniania obecności i lokalizacji nowotworów, w których ED-B ulega ekspresji lub nowotworów związanych ekspresją z ED-B fibronektyny. Może on być stosowany jako czynnik obrazujący. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określania obecności komórek lub nowotworu, w których ED-B ulega ekspresji lub związanych ekspresją z ED-B fibronektyny. Sposób obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórek ze swoiście wiążącym się czynnikiem i określanie wiązania się swoiście wiążącego się czynnika do komórek. Metoda może być stosowana in vivo lub in vitro lub w próbkach badanych komórek pochodzących z ciała.
Reagowanie przeciwciał z próbką komórek może być określane w jakikolwiek właściwy sposób. Jedną z możliwości jest sprzężanie z określonymi cząsteczkami reporterowymi. Cząsteczki reporterowe mogą bezpośrednio lub pośrednio generować wykrywalne, korzystnie mierzalne, sygnały. Połączenie reporterowych cząsteczek może być bezpośrednie lub pośrednie, kowalencyjne, np. przez wiązanie peptydowe lub niekowalencyjne. Połączenie wiązaniem peptydowym może powstać w rezultacie ekspresji fuzji genów kodujących przeciwciało i cząsteczkę reporterową.
Jednym z korzystnych sposobów jest kowalencyjne połączenie każdego przeciwciała z pojedynczym, określonym fluorochromem, fosforem lub barwnikiem wzbudzanym przez laser, które charakteryzują się określoną adsorpcją lub emisją widma. Do odpowiednich fluorochromów należą: fluoresceina, rodamina, fikoerytryna i Texas Red. Korzystne chromogenne znaczniki zawierają diaminobenzydynę.
Inne cząsteczki reporterowe obejmują wielkocząsteczkowe koloidalne cząstki lub materiały złożone z cząstek jak kulki lateksowe, które są barwne, magnetyczne lub paramagnetyczne, i biologicznie lub chemicznie aktywne czynniki, które mogą bezpośrednio lub pośrednio dawać wykrywalne sygnały wizualnie zauważane, wykrywane elektronicznie lub rejestrowane w jakikolwiek inny sposób. Te cząsteczki mogą być enzymami, które na przykład katalizują reakcje, zwiększające intensywność lub zmieniające barwy lub powodują zmiany właściwości elektrycznych. Mogą one być cząsteczkami ulegającymi wzbudzeniu, tak ze zmiany energii pomiędzy stanami można zaobserwować w charakterystycznych widmach adsorpcji
188 557 lub emisji. Te cząsteczki mogą obejmować jednostki chemiczne stosowane w sprzężeniu z biosensorami. Można zastosować systemy detekcji: biotyna/awidyna, biotyna/streptawidyna i alkaliczna fosfataza.
Sposób określania wiązania się nie jest przedmiotem mniejszego wynalazku, fachowcy są w stanie wybrać najbardziej korzystny sposób, zgodny z ich upodobaniami i wiedzą.
Sygnały generowane przez pojedyncze konjugaty przeciwciało-znacznik mogą być wykorzystywane do otrzymania warunkowo bezwzględnych lub względnych danych określających ilość związanego przeciwciała, wiążącego się do komórek próbek (zdrowego i badanego). Dodatkowo można zastosować barwienie jąder komórek np. jodkiem propidium, w celu policzenia całkowitej populacji komórek w próbce, co pozwala określić ilościowy stosunek pojedynczych populacji komórek do całkowitej liczby komórek w próbce. Kiedy przeciwciało jest połączone z promieniotwórczym nukleotydem takim jak 125I, inIn lub mTc, a przeciwciało to łączy się raczej z guzem niż ze zdrową tkanką, obecność promieniotwórczego znacznika w tkance nowotworowej może być wykryta i ilościowo oznaczona przy użyciu licznika gamma. Jakość otrzymanego obrazu nowotworu jest skorelowana bezpośrednio ze stosunkiem sygnał: tło.
Przeciwciała mogą być wykorzystywane jako czynniki diagnostyczne umożliwiające śledzenie nowounaczyniających się nowotworów, mogą także być stosowane np. w zmodyfikowanej formie do dostarczania czynników cytotoksycznych lub do wyzwalania koagulacji wewnątrz nowych naczyń krwionośnych, w ten sposób pozbawiając rozwijający się nowotwór tlenu i substancji odżywczych, co stanowi pośrednią formę terapii nowotworów.
Niniejszy wynalazek dostarcza także zastosowania swoiście wiążącego się czynnika jako terapeutycznego reagenta, np. gdy jest sprzężony, związany czy otrzymany jako białko fuzyjne, co nadaje mu funkcję efektora. Swoiście wiążący się czynnik według niniejszego wynalazku może być stosowany w celu bezpośredniego doprowadzenia toksyn, czynników promieniotwórczych, komórek T, komórek NK lub innych cząsteczek do nowotworu posiadającego lub związanego z antygenem, będącym przedmiotem zainteresowania.
Kolejne aspekty niniejszego wynalazku dostarczają sposobów leczenia obejmujących podawanie swoiście wiążącego się czynnika według wynalazku, kompozycje farmaceutyczne zawierające taki swoiście wiążący się czynnik, zastosowanie takiego wiążącego się czynnika do wytwarzania lekarstw, na przykład w sposobie przygotowywania lekarstwa lub kompozycji farmaceutycznej, swoiście wiążący się czynnik łączy się z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być podawane ludziom. Korzystne jest podawanie „terapeutycznie skutecznej ilości”, takiej, która daje pacjentowi korzyść. Tą korzyścią może być złagodzenie przynajmniej jednego z objawów choroby. Podawana ilość, i częstość i stosunek czas-przebieg podawania leku, będzie zależał od natury i przebiegu choroby. Sposób leczenia, np. zdecydowanie o dawce leku ect, jest pozostawione odpowiedzialności lekarzy. Odpowiednie dawki przeciwciał są dobrze znane ze stanu techniki; patrz Ledermann i inni, (1991); Bagshawe K.D. i inni, (1991).
Kompozycja może być podawana sama lub w połączeniu z innymi sposobami leczenia, zarówno jednocześnie jak i kolejno następując po sobie, zależnie od stanu pacjenta.
Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku, i do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą zawierać jako dodatek do aktywnego składnika, farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, bufor, stabilizator lub inne materiały dobrze znane specjalistom. Materiały te nie powinny być toksyczne i nie powinny wpływać na skuteczność działania aktywnego składnika. Dokładne określenie natury nośnika lub innego materiału będzie zalezeć od drogi podawania, która może być doustna, lub poprzez iniekcję, np. dożylną.
Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego mogą mieć postać tabletki, kapsułki, proszku lub płynu. Tabletka może zawierać stały nośnik taki jak żelatyna lub adjuwant. Płynne farmaceutyczne kompozycje zawierają płynny nośnik taki jak woda, olej skalny, oleje zwierzęce lub roślinne, olej mineralny lub olej syntetyczny. Mogą zawierać także roztwór soli fizjologicznej, roztwór dekstrozy lub innego sacharydu lub glikole takie jak glikol etylenowy, glikol propylenowy lub glikol polietylenowy.
188 557
Do iniekcji dożylnych, iniekcji i iniekcji w chore miejsce, składnik aktywny może być w formie wodnego roztworu, a do podania pozajelitowego, który jest apyrogenny, ma on odpowiednie pH, izotoniczność i stabilność. Specjaliści są w stanie przygotować odpowiednie roztwory używając na przykład izotonicznej zarobki takiej jak chlorek sodu do iniekcji, płyn Ringera do iniekcji, płyn Ringera z laktozą do iniekcji. Środki ochronne, stabilizatory·', bufory, przeciwutleniacze i/lub inne dodatki mogą w razie potrzeby zostać dodane.
Swoiście wiążący się czynnik według niniejszego wynalazku może być wytworzony, poddając ekspresji kodujący go kwas nukleinowy. Kwas nukleinowy kodujący jakikolwiek swoiście wiążący się czynnik jest kolejnym rozwiązaniem według niniejszego wynalazku, tak jak sposób otrzymywania swoiście wiążącego się czynnika, który to sposób obejmuje ekspresję tego kodującego kwasu nukleinowego. Ekspresja może być prowadzona konwencjonalnie, poprzez hodowanie w odpowiednich warunkach zrekombinowanych komórek gospodarza zawierających ten kwas nukleinowy.
Kwas nukleinowy może kodować jakiekolwiek sekwencje aminokwasowe domen przeciwciała wiążących antygen opisane w tej pracy lub jakąkolwiek formę funkcjonalnie ekwiwalentną. Zmiany mogą być dokonywane na poziomie nukleotydu poprzez addycję, substytucję, delecję lub insercję jednego lub większej liczby nukleotydów, które to zmiany mogą ale nie muszą spowodować zmiany na poziomie sekwencji aminokwasowej, co zależy od degeneracji kodu genetycznego.
Dobrze znane są systemy klonowania i ekspresji polipeptydu w szeregu różnych komórkach jako komórki gospodarza. Korzystnie komórki gospodarza obejmują bakterie, komórki ssaków, drozdzowe i bakulowirusowe systemy. Linie komórkowe ssaków dostępne ze stanu techniki do ekspresji heterologicznych polipeptydów obejmują komórki jajnika chomika chińskiego, komórki HeLa, komórki nerki chomika i wiele innych. Powszechnie stosowanym bakteryjnym gospodarzem jest E.coli.
Ekspresja przeciwciał i fragmentów przeciwciał w komórkach prokariotycznych takich jak E.coli jest dobrze znana ze stanu techniki, patrz na przykład Pliickthun, (1991). Ekspresja w kulturach komórek eukariotycznych jest również znana fachowcom jako jeden ze sposobów służący produkcji swoiście wiążącego się czynnika, patrz na przykład Ref, (1993); Trill i inni, (1995).
Korzystne wektory można wybrać lub skonstruować tak aby zawierały odpowiednie sekwencje regulatorowe, włączając sekwencje promotorowe, sekwencje terminatorowe, sekwencje poliadenylacji, sekwencje wzmacniające, geny markerowe i inne korzystne sekwencje. Wektory mogą być plazmidami lub wektorami wirusowymi np. fag lub fagemid. Więcej szczegółów można znaleźć na przykład w Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2-gie wydanie, Sambrook i inni, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Wiele znanych technik i sposobów postępowania dotyczących manipulacji genetycznych na przykład przygotowywania konstruktów kwasu nukleinowego, mutagenezy, sekwencj onowania, wprowadzania DNA do komórek i ekspresji genów, i analizy białek jest szczegółowo opisane w Short Protocols in Molecular Biology, drugie wydanie, Ausubel i inni, wydawcy John Wiley & Sons, 1992. Do publikacji Sambrook'a i innych i Ausubefa i innych odniesiono się w tej pracy, w wykazie literatury.
Dlatego, kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest komórka gospodarza zawierająca kwas nukleinowy według wynalazku. Do wprowadzania kwasu nukleinowego do komórki gospodarza może być zastosowana jakakolwiek dostępna technika. Dla komórek eukariotycznych korzystne techniki mogą obejmować transfekcję z zastosowaniem fosforanu wapnia, DEAE-Dextranu, elektroporację, transfekcję za pośrednictwem liposomów i transdukcję z zastosowaniem retrowirusów lub innych wirusów, np. wirusa krowianki lub dla komórek owadzich, bakulowirusa. Dla komórek bakteryjnych odpowiednie techniki mogą obejmować transformację z chlorkiem wapnia, elektroporację i transfekcję z zastosowaniem bakteriofag.
Po wprowadzeniu może następować powodowanie lub pozwalanie na ekspresję kwasu nukleinowego, np. przez hodowanie komórek gospodarza w warunkach, w których może następować ekspresja genu.
188 557
W jednym z wykonań wynalazku, kwas nukleinowy jest integrowany do genomu (np. chromosomu) komórki gospodarza. Integracja może być wzmagana poprzez włączenie sekwencji, które wzmagają rekombinację z genomem, za pomocą standardowych technik.
Wytwarzanie swoiście wiążącego się czynnika może być wykonane na przykład w jakikolwiek sposób ujawniony w tej pracy, taki jak przygotowywanie farmaceutycznych lub diagnostycznych produktów takich jak zestaw, zawierający jako dodatek do swoiście wiążącego się czynnika jeden lub więcej reagentów do określania wiązania się czynnika do komórek, jak to zostało opisane.
Dalsze aspekty wynalazku i jego wykonania będą oczywiste dla fachowców w tej dziedzinie. Aby uczynić niniejszy wynalazek w pełni zrozumiałym, został on zilustrowany przykładami, które nie ograniczają jego zakresu.
Wynalazek został pokazany na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej VH i Vl fragmentu scFv cGS-1 i CGS-2; fig. la przedstawia sekwencję VH; fig. Ib przedstawia sekwencję VL. Sekwencje CDR (1, 2 i 3) są zaznaczone. Najbardziej homologicznym VH ludzkiej linii zarodkowej do obu fragmentów scFv jest segment DP47 rodziny VH3; segmentem VL obu klonów jest DPL16, którego łańcuch lekki zastosowano do stworzenia oryginalnej biblioteki fragmentów scFv (Nissim i inni, 1994). Reszty aminokwasowe, którymi różnią się oba klony podkreślono.
Figura 2A przedstawia model budowy domeny podjednostki ludzkiej fibronektyny. Regiony zmienności IIICS, ED-A i ED-B, powodujące alternatywne składanie pre-mRNA fibronektyny, są zaznaczone. Przedstawiono także wewnętrzne homologie i główne produkty powstające po trawieniu termolizyną zawierające ED-B (Zardi i inni, 1987). Fig. 2B przedstawia rozdział elektroforetyczny w 4-18% żelu poliakryloamidowym z SDS fibronektyny osocza i fibronektyny WI38VA i ich trawień termolizyną, barwiony Coomasie Blue, następnie przenoszony na błonę i traktowany znakowanymi (immunobloting) BC-1, IST-6, CGS-1 i CGS-2. Nietrawiona (linia 1) i trawiona fibronektyna osocza termolizyną w stężeniu 1 ng/mg fibronektyny (linia 3) i 10 pg/mg fibronektyny (linia 4). Nietrawiona (linia 2) i trawiona fibronektyna WI38VA termolizyną w stężeniu 1 pjgmg (linia 5), 5 pg/mg (linia 6) i 10 pg/mg (linia 7) fibronektyny. Numery po prawej stronie wskazują główne produkty powstające po trawieniu termolizyną pokazane na fig. 2A. Po lewej stronie zaznaczone są wartości standardów molekularnej wagi w kiloDaltonach.
Figura 3A przedstawia sekwencje powtarzające się typu III fibronektyny zawarte w białkach fuzyjnych i zrekombinowanych, poddanych ekspresji w E.coli i reakcyjność tych białek z CGS-1 i CGS-2 i z przeciwciałami monoklonalnymi BC-1 i IST-6. Fig. 3B przedstawia żel wybarwiony Coomassie Blue, a obok wynik reakcji próbek ze znakowanymi CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6. Numery linii odpowiadają numerom konstruktów białkowych na fig. 3A. Po lewej stronie zaznaczone są wartości standardów molekularnej wagi w kiloDaltonach.
Pokazany na fig. 4 Infared Mouse Imager; detektor podczerwieni stosowany do eksperymentów, w których bezpośrednio działano na guzy myszy składa się z czarnego, niefluoryzującego pudełka wyposażonego w wolframową lampę halogenową, filtr wzbudzający i filtr emisyjny zaprojektowane dla światła podczerwonego CY7 fluoroforu i połączonej z komputerem kamery (8-bitowa monochromatyczna CCD-camera).
Na fig. 5 pokazano bezpośrednie działanie fluorescencyjnie wyznakowanych fragmentów przeciwciał na mysiego potwomiaka złośliwego F9, z zastosowaniem monomerycznych fragmentów scFv (CGS-1) i dimerycznych fragmentów scFv(CGS-l)2 skierowanych przeciwko fibronektynie B (B-FN). Dimeryczne fragmenty scFv(D1.3)2 swoiście wiążące lizozym zostały użyte jako kontrola negatywna.
Na fig. 6 pokazano bezpośrednie działanie fluorescencyjnie wyznakowanych fragmentów przeciwciał na mysiego potwomiaka złośliwego F9, z zastosowaniem fragmentów o dojrzałym powinowactwie scFv(GCS-2) i fragmentów o mniejszym powinowactwie scFv(28SI) skierowanych przeciwko fibronektynie B (B-FN). Działanie zostało zaobserwowane zarówno w przypadku dużych nowotworów (guzów) (około 0,6 gramów) pokrytych po 48 godzinach czarnym strupem, który częściowo zaciemnił obraz, jak i nowotworów (guzów) małych (około 0,2 gramów).
188 557
Wszystkie publikacje przytaczane w tej pracy są włączone do wykazu literatury·'.
Przykład 1- Izolacja ludzkich fragmentów scFv swoistych w stosunku do domeny ED-B ludzkiej fibronektyny.
Przykład 2 - Dojrzewanie powinowactwa ludzkich fragmentów scFv swoistych w stosunku do domeny ED-B ludzkiej fibronektyny.
Przykład 3 - Swoistość fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie w stosunku do fibronektyn zawierających ED-B.
Przykład 4 - Zastosowanie fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie anty ED-B w immunocytochemicznym barwieniu ludzkich i mysich skrawków nowotworów.
Przykład 5 - Zastosowanie fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie anty ED-B w bezpośrednim działaniu na ludzkie nowotwory in vivo.
Przykład 6 - Bezpośrednie działanie na mysi potworniak złośliwy przeszczepiony myszy szczepu nagiego z innego gatunku.
Przykład 1- Izolacja ludzkich fragmentów scFv swoistych w stosunku do domeny ED-B ludzkiej fibronektyny
Do wyselekcjonowania zrekombinowanych przeciwciał wykorzystano bibliotekę fagową ludzkich fragmentów scFv (Nissim i inni, 1994). Użyto dwóch różnych form izoformy ED-B fibronektyny jako źródła antygenu do selekcji, i w obu przypadkach izoformy były zrekombinowanym ludzkim białkiem.
Uzyskano ekspresję w E.coli zrekombinowanych peptydów fibronektyny, zawierających powtarzające się sekwencje typu III, 2-11 (B-) i 2-11(B+).
Konstrukt otrzymano wykorzystując cDNA fibronektyny pochodzący z klonów pFH154 (Komblihtt i inni, 1985), eF10 i eF2 (Camemolla i inni, 1989). Konstrukty cDNA, obejmujące zasady od 2229 do 4787 (Komblihtt i inni, 1985) zostały wstawione do wektora ekspresyjnego pQE-3/5 przy użyciu zestawu QIAexpress firmy Qiagen (Chatsworth, CA). Rekombinanty fibronektyny typu III 2-11(B-) i (B+) zostały oczyszczane wykorzystując chromatografię immunopowinowactwa, stosując przeciwciała monoklonalne (mAb) 3E3 (Pierschbacher i inni, 1981) połączone z Sepharose 4B (Pharmacia). Fragmenty DNA do produkcji zrekombinowanych fragmentów fibronektyny, zawierającej powtarzające się sekwencje homologii typu III, 7B89, 789, ED-B i fibronektyny 6 otrzymano w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) używając UltMa DNA polimerazy (Perkin Elmer), wykorzystując DNA klonów FN 2-11 (B+) i FN 2-11 (B-) jako matryce. Startery reakcji zostały tak zaprojektowane aby możliwe było klonowanie produktów reakcji PCR do wektora pQE-12, używając zestawu QIAexpress (Qiagen). Otrzymanymi kostruktami transformowano komórki E.coli, w których zachodziła ich ekspresja. Wszystkie klony cDNA zostały zsekwencjonowane przy użyciu zestawu do sekwencjonowania Sequenase 2.0 DNA (USB).
Zrekombinowane białka były czyszczone za pomocą chromatografii Ni-NTA (IMAC), zgodnie z załączonymi instrukcjami (Qiagen), wykorzystując sześciohistydynowy ogon na karboksylowym końcu fibronektynowych fragmentów. Białko fuzyjne ED-B-pGal otrzymano przez klonowanie cDNA ED-B do wektora bakteriofagowego gt11, co dało klon eED-B. Klon echFN60 (zawierający część sekwencji ED-B) został otrzymany jako białko fuzyjne ze sklonowanej kurzej FN pchFN60 (Norton i inni, 1987).
W celu selekcji biblioteki fagowej ludzkich fragmentów scFv, przeprowadzono 3 etapy selekcji fag z zastosowaniem swoistego antygenu (panning), dla każdego z dwóch różnie zrekombinowanych antygenów (7B89 i ED-B). Antygenami w stężeniu 50 pg/ml w PBS (20 mM bufor fosforanowy, 0,15 M NaCl, pH 7,2) pokrywano probówki immunologiczne (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Denmark) przez noc. Pierwszy antygen był zrekombinowanym fibronektynowym fragmentem 7B89, w którym domena ED-B jest otoczona przez powtarzające się sekwencje homologii typu III fibronektyny; opłaszczanie tym antygenem prowadzono w 4°C przez noc. Drugi użyty antygen był zrekombinowaną domeną ED-B (Zardi i inni, 1987), posiadającym na karboksylowym końcu ogon sześciohistydynowy, ponieważ białko to nie zawiera reszt lizyny, końcowa grupa aminowa pierwszego aminokwasu umożliwia miejsowo-specyficzną kowalencyjną immobilizację ED-B do płytek Elisa (Nunc; Covalink). Opłaszczanie było prowadzone przez noc w pokojowej temperaturze.
188 557
Po trzech etapach wyłapywania fag za pomocą swoistego antygenu, wyeluowanymi fagami infekowano komórki HB2151 E.coli i wysiewano je na płytki (Nissim i inni, 1994). Po każdym etapie selekcji badano 95 opornych na ampicylinę, pojedynczych kolonii, oznaczając testem ELISA swoistość w stosunku do antygenu fragmentów scFv. Klony, które dawały największe sygnały w teście ELISA z antygenem użytym do selekcji, zostały wybrane do kolejnych analiz i procesu dojrzewania powinowactwa. Klony te także wykazywały podczas barwienia immunocytochemicznego, swoiste wiązanie się do skrawków glejaka wielopostaciowego i nowotworów piersi, co dokładniej opisano w przykładzie 4.
Przykład 2 - Dojrzewanie powinowactwa ludzkich fragmentów scFv swoistych w stosunku do domeny ED-B ludzkiej fibronektyny
Klony 35GE (z selekcji z 7B89) i 28SI (z selekcji z samą domeną ED-B) wytypowano jako przeciwciała, które zostaną poddane procesowi dojrzewania powinowactwa. W celu zróżnicowania lekkich łańcuchów, jako sposobu zwiększania powinowactwa, zastosowano prostą strategię prowadzącą do dojrzewania powinowactwa, opartą na losowym podstawieniu sześciu centralnych reszt aminokwasowych (DSSGNH) regionu CDR3 łańcucha lekkiego, używając zdegenerowanych oligonukleotydów i PCR (fig. 1), dostarczającym potencjalnie 20'’ = 6,4 x 10 różnych sekwencji. Ten region (razem z regionem CDR3 łańcucha ciężkiego) jest umiejscowiony w centrum miejsca wiążącego antygen (Padlan, 1994). Również przeprowadziliśmy mutację reszty argininy bezpośrednio poprzedzającej sekwencję sześcioaminokwasową na serynę, w celu uniknięcia możliwości dominacji podczas selekcji efektów elektrostatycznych.
Plazmid z pojedynczej bakteryjnej kolonii, produkującej wyjściowy fragment scFv został powielony techniką PCR przy użyciu starterów LMB3 (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') i CDR3-6-VL-FOR (5' CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNNMNN AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC 3') (94°C [1'] - 55°C [1'] - 72°C [1'30], 25 cykli; patrz Marks i inni, 1991 odnośnie buforów i warunków). Otrzymany produkt oczyszczono w żelu (w celu usunięcia pozostałych śladów plazmidu zawierającego wyjściowy gen scFv) i został on użyty jako matryca do kolejnego powielania ze starterami LMB3 i J1Not-FOR (5' ATT GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3') (94°C [1'] - 55°C [1'] - 72°C [1'30], 25 cykli). „Surowy” produkt PCR, który wędrował jak pojedynczy prążek na wysokości właściwej masy cząsteczkowej w żelu agarozowym, został odczyszczony od mieszaniny PCR za pomocą Spin-Bind (FMC, Rocland, ME, USA), cięty dwoma enzymami Ncol/Notl i ligowany z oczyszczonym w żelu fagemidem pHEN1 (Hoogenboom i inni, 1991) przeciętym Ncol/Notl, zawierającym sztuczną Ncol/Notl wstawkę, ułatwiającą oddzielanie wektora strawionego w obu miejscach od strawionego w jednym miejscu. Wektor był przygotowany przy pomocy zestawu do czyszczenia plazmidu firmy Qiagen (Chatsworth, CA, U.S.A.). Około 5 pg strawionego plazmidu i tyle samo wstawki użyto do ligacji, którą oczyszczano prowadząc ekstrakcje: jeden raz fenolem, raz mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:25; 1), a następnie strącano etanolem stosując dodatek glikogenu (Boehringer, Mannheim, Germany), po czym suszono w próżni. Osad rozpuszczono w 20 pl wody i otrzymany plazmid wprowadzano za pomocą elektroporacji do elektrokompetentnych komórek E. coli TG1 (Gibson, 1984). Zazwyczaj stosowaliśmy komórki elektrokompetentne o wydajności transformacji rzędu 109 transformantów/pg gdy używaliśmy stock'ów z glicerolem lub 1010 transformantów/pg ze świeżo przygotowanych komórek. Zastosowanie tej procedury dawało zazwyczaj >107 klonów.
Powstała biblioteka została poddana takiej samej procedurze jak biblioteka Nissima (Nissim i inni, 1994) w celu uzyskania cząstek fag, które zostały wykorzystane w etapie selekcji w probówkach immunologicznych z antygenem 7B89 (10 pg/ml), poprzedzonym etapem selekcji kinetycznej (Hawkins i inni, 1992). Ten etap wykonano inkubując 5 minut biotynylowany 7B89 (10 nM) z zawiesiną fag (około 10012 t.u.) w 2% buforze PBS z mlekiem (2% MPBS) z pierwszego etapu selekcji, a następnie dodawano nie-biotynylowany 7B89 (1 pM) i inkubowano przez 30 minut, pozwalając cząsteczkom współzawodniczyć. Potem 100 pl kulek pokrytych streptawidyną (Dynal:M480) blokowano 2% MPBS i dodano do mieszaniny reakcyjnej, mieszano 2 minuty, i wyłapywano przy pomocy magnesu, przemywano 10 razy kolej188 557 no buforami (PBS + 0,1% Tween-20) i PBS. Fag eluowano z kulek stosując 0,5 ml 100 mM trietyloaminę. Roztwór ten neutralizowano 0,25 ml 1M Trisu, pH 7,4, i stosowano do infekowania komórek HB2151, w logarytmicznej fazie wzrostu (Nissim i inni, 1994). Do otrzymania supżrnataetów zawierających fragmenty scFv wybrano 95 opornych na ampicylinę pojedynczych koloni (Nissim i inni, 1994), które przebadano testem ELISA, immunohistochżmicznie i techniką BIAcore w celu wybrania tych klonów, które najlepiej wiążą się z antygenem. Następnie były one subklonowane pomiędzy miejsca Sfil/Notl wektora ekspresyjnego pDN268 (Neri i inni, 1996), dołączający fragment, który może być fosforylowany, epitop FLAG i fragment sześciohistydceowy przy C końcu fragmentu scFv.
Pojedyncze kolonie, produkujące wybrane przeciwciała subklonowane w wektor pDN268 rosły w 37°C na podłożu 2xTY, zawierającym 100 mg/l ampicyliny i 0,1% glukozę. Kiedy OD600 hodowli osiągnęło 0,8, dodano 1PTG do końcowego stężenia 1 mM i kontynuowano hodowlę przez 16 do 20 godzin w 30°C. Po żwirowaniu (GS-3 Sorvall rotor, 7000 rmp, 30 minut), supernatant filtrowano, zagęszczano i dodawano buforu do nanoszenia (loading buffer) (50 mM fosforan, pH 7,4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) stosując aparat Minisette (Filtron). Otrzymany roztwór nanoszono na kolumnę zawierająca 1 ml żywicy Ni-NTA (Qiagen), przemywano 50 ml buforu do nanoszenia i eluowano buforem do elucji (50 mM fosforan, pH 7,7, 500 mM NaCl, 100 mM imidazol). Oczyszczone przeciwciała analizowano techniką SDS-PAGE (Laemmli, 1970) i dializowano wobec buforu PBS w temperaturze 4°C. Tak oczyszczone fragmenty scFv, były następnie filtrowane przez żel w aparacie FPLC wyposażonym w kolumnę S-75 (Pharmacia), ponieważ wiadomo, że wielowartościowe fragmenty scFv mogą wykazywać eiżspecyficznż, silne wiązanie do BIAcore (Jonsson i inni, 1991), spowodowane przez efekt tzw. zachłanności (Nissim i inni, 1994; Crothers i Metzger, 1972). Stężenie przeciwciał w oczyszczonych na FPLC monomerycznych frakcjach określano spektrofotometrcczeie przyjmując absorbancję przy 280 nm 1,4 jednostki za roztwór o stężeniu 1 mg/ml fragmentów scFv.
Wiązanie się jednowartościowych fragmentów scFv w różnych stężeniach od 0,1 do 1 pM w PBS było oznaczane w aparacie BIAcore (Pharmacia Biosensor), przy użyciu następujących antygenów: (i) 1000 jednostek rezonansowych (RU) biotynclowaeżgo zrekombinowanego fibronektynowego fragmentu 7B89 immobilizowanych na pokrytej sptrżptawidyną płytce, który był wiązany swoiście przez 250 RU fragmentu scFv; (ii) 200 RU zrekombinowanej ED-B, chemicznie immobilizowanej za pomocą N końcowej grupy aminowej, która była wiązana swoiście przez 600 RU fragmentu scFv; (iii) 3500 RU fibronektyny WI38VA bogatej w ED-B (patrz przykład 3), która była wiązana swoiście przez 150 RU fragmentu scFv. Analizy kinetyki dokonano zgodnie z załączonymi do aparatu instrukcjami. Na podstawie ilościowych analiz przy użyciu aparatu BIAcore supernatantów zawierających przeciwciała, wybrano po jednym klonie fragmentów scFv o zwiększonym powinowactwie: klon CGS-1 z selekcji fragmentem 7B89 i CGS-2 z selekcji fragmentem ED-B zrekombinowanej fibronektyny. Stałe szybkości asocjacji (Kon i dysocjacji (Koff) są przedstawione w tabeli 1, razem z wyliczonymi stałymi dysocjacji (Kd) obu fragmentów scFv i wyjściowego klonu 28SI. Chociaż oba klony CGS-1 i CGS-2 mają stałe dysocjacji w skali nanomolarnej, klon CGS-2 wykazuje najlepszą poprawę właściwości w stosunku do swojego wyjściowego klonu, mając Kd 1 nM (uzyskaną z 110 nM) w odniesieniu do wszystkich trzech białek badanych tą metodą (tabela 1). Ta poprawa była spowodowana wolniejszą kinetyką dysocjacji (~10'4s‘1), co oznaczono na preparatach monomerycznych przeciwciał (dane nieprzedstawione).
188 557
Tabela 1
Stałe kinetyczne i dysocjacji monomerycznych fragmentów scFv CGS-1 i CGS-2 w stosunku do białek zawierających domenę ED-B
| Antygen | ED-B | 7B89 | FN WI38VA | ||||||
| ScFv | CGS-1 | SI28 | CGS-2 | CGS-1 | SI28 | CGS-2 | CGS-1 | SI28 | CGS-2 |
| KoBfs-')* | 7,0x10'3 | 2,7x10-2 | 1,5x10·4 | 3,9x10-3 | 3,0x10-2 | 2,3x10-4 | 5,0x10 3 | 7,1x10-2 | 6,5x10-4 |
| Ko„(M-'s') | 1,3x10s | 2,5x105 | 1,3x10s | 1,1x105 | 2,9x105 | 1,1x105 | 4,1x105 | 1,2x106 | 2,9x105 |
| Kd(M)* | 5,4x10’8 | 1,1x10-7 | 1,1x10-’ | 3,5x10-8 | 1,0x10-7 | 2,1x10-9 | 1,2x10-8 | 5,9x10-8 | 2,4x10-9 |
Doświadczenia były prowadzone w sposób opisany w rozdziale Materiały i Metody.
*Wartości KolT i KOf są podane z dokładnością do +/-30%, z powodu dokładności oznaczeń stężenia i w związku z niewielką rozbieżnością wyników otrzymanych z różnych regionów sensogramów wykorzystywanych w procesie dopasowywania. Kd = Koff/Kon.
Strategia dojrzewania wydaje się być ogólna i doprowadziła do zwiększenia powinowactwa przeciwciał przeciwko białku wiążącemu maltozę, cytochromowi C, zewnątrzkomórkowej domenie mysiej lub szczurzej endogliny (D.N., L. Wyder, R. Klemenz), cytomegalowirusowi (A.R, G. Neri, R. Botti, RN.), białku HMGI-C, które jest jądrowym markerem nowotworowym ( A.R, R Soldani), V. Giancotti, RN.) i jajnikowemu nowotworowemu markerowi-łożyskowej alkalicznej fosfatazie (M. Deonarain i A.A. Epenetos). Dlatego też, zastosowana strategia wydaje się być przynajmniej tak samo dobra jak inne strategie dojrzewania powinowactwa (Marks i inni, 1992; Low i inni, 1996), i prowadzi do otrzymania przeciwciał o podobnym powinowactwie do tych pochodzących z bardzo dużych fagowych bibliotek przeciwciał (Griffiths i inni, 1994; Vaughan i inni, 1996).
Klony CGS-1 i CGS-2, o dojrzałym powinowactwie zostały zsekwencjonowane i porównane z bazą danych zawierającą geny V przeciwciała ludzkiej linii zarodkowej (V-BASE), a następnie przeprowadzono translację stosując program MacVector. Gen VH obu klonów był najbardziej homologiczny do ludzkiej linii zarodkowej DP47 (VH3), i dodatkowo każdy klon miał inną sekwencję regionu CDR3 Vh (fig. 1). Gen VL obu klonów pochodził z linii zarodkowej DPL16, użytej do konstrukcji zestawu ludzkich syntetycznych fragmentów scFv opisanego przez Nissima i innych, 1994. Sekwencje regionu CDR3 różniły się od siebie czterema, pięcioma lub sześcioma losowo podstawionymi resztami aminokwasowymi (fig. 1b).
Przykład 3 - Swoistość fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie w stosunku do fibronektyn zawierających ED-B
Oszacowano immunoreaktywność dwóch fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie, CGS-1 i CGS-2, początkowo testem ELISA i otrzymane wyniki porównano bezpośrednio z danymi otrzymanymi dla przeciwciał monoklonalnych BC-1 (które rozpoznają izoformę FN-B) i przeciwciałami monoklonalnymi IST-6, które rozpoznają tylko izoformy niezawierające ED-B (Carnemolla i inni, 1989; 1992). Później wykonano subtelniejsze analizy swoistości stosując rozległy zestaw fragmentów fibronektyny, powstałych po trawieniu termolizyną i zrekombinowane białka fuzyjne.
Antygeny stosowane w teście ELISA i immunoblotingu były przygotowywane w następujący sposób: fibronektynę otrzymywano z ludzkiego osocza i z pożywki hodowlanej komórek linii WI38VA13, w sposób wcześniej opisany (Zardi i inni, 1987); oczyszczone fibronektyny były trawione termolizyną (proteaza typu X; Sigma Chemical Co.) według Carnemolla i innych (1989); natywne fragmenty fibronektyny (B-) 110 kD i natywne fragmenty fibronektyny (B+) 120 kD (patrz fig. 2) odczyszczono od strawionej fibronektyny znanym sposobem (Borsi i inni, 1991); dużą formę tenascyny-C oczyszczono według Saginati i innych (1992), zrekombinowane białka otrzymywano i oczyszczano sposobem opisanym w Przykładzie 1. Rozdziały SDS-PAGE i Western blotting prowadzono według procedury Carnemolla i innych (1989).
Wszystkie antygeny zastosowane w teście ELISA rozpuszczano w buforze PBS do stężenia pomiędzy 50-100 pg/ml i opłaszczano nimi studzienki płytek immunologicznych (Nunc, Roskilde, Denmark) przez noc w 4°C. Niezwiązany antygen usuwano razem z bufo188 557 rem PBS i blokowano płytki buforem PBS zawierającym 3% (w/v) albuminę surowicy wołowej (BSA) przez 2 godziny w 37°C. Następnie płytki przemywano cztery razy buforem PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST). Wtedy dodawano przeciwciał i inkubowano w 37°C przez 1,5 godziny; fragmenty scFv były wcześniej inkubowane z surowicą odpornościową przeciwko sekwencji markerowej: mAb M2 (Kodak, new Haven CT) dla regionu FLAG lub 9E10 (ATCC, Rockville, MD) dla regionu myc. Kontrolę przeciwciał stanowiły przeciwciała monoklonalne BC-1 i IST-6. Po czterech płukaniach PBST, płytki inkubowano przez 1 godzinę w 37°C z rozcieńczonymi 1:2000 (w PBST+ 3% BSA) biotynylowanymi kozimi IgG przeciwko immunoglobulinom mysim (Bio-SPA Division, Milan, Italy). Powtórzono płukania dodano kompleks streptawidyna - biotynylowana alkaliczna fosfataza (Bio-SPA Division, Milan, Italy) (w rozcieńczeniu 1:800 w PBST zawierającym 2 mM MgCh), inkubowano godziny w 37°C. Reakcje wywoływano stosując tabletki substratu dla fosfatazy (Sigma) rozpuszczone w 10% dietanoloaminie, pH 9,8, a gęstość optyczną odczytywano przy 405 nm. Wyniki są przedstawione poniżej w tabeli 2.
Tabela 2
| CGS-1 | CGS-2 | BC-1 | IST-6 | |
| FN osocza | 0,07 | 0,04 | 0,09 | 1,73 |
| FN W138VA | 1,16 | 0,72 | 1,20 | 1,12 |
| nllOkD (B-) | 0,03 | 0,01 | 0,05 | 1,20 |
| nl20 kD (B+) | 0,82 | 0,81 | 1,20 | 0,02 |
| rec FN 7B89 | 1,11 | 1,02 | 1,02 | 0,01 |
| rec FN 789 | 0,01 | 0,01 | 0,05 | 1,25 |
| rec ED-B | 1,21 | 1,32 | 0,15 | 0,04 |
| rec FN-6 | 0,01 | 0,01 | 0,08 | 0,03 |
| Tenascyna | 0,01 | 0,02 | 0,06 | 0,02 |
Immunoreaktywność fragmentów scFv i przeciwciał monoklonalnych z antygenami, które były pochodnymi fibronektyny mierzono testem ELISA. Wartości odpowiadają OD mierzonej przy 405 nm po odliczeniu sygnału tła. Dane zostały uśrednione z czterech doświadczeń i wykazują maksymalnie 10% odchylenie standardowe.
Oznaczenia różnych form fibronektyny wykorzystywanych w doświadczeniu są następujące: FN osocza = fibronektyna ludzkiego osocza; fN WI38-VA = fibronektyna z supernatantów fibroblastów transformowanych SV40 (Zardi i inni, 1987); nllO kD - domena 4 fibronektyny traktowana termolizyną, bez ED-B; nl20 kD = domena 4 fibronektyny traktowana termolizyną, zawierająca ED-B; rec FN 7B89 = domena ED-B otoczona powtarzającymi się sekwencjami homologii typu III fibronektyny; rec FN 789 = powtarzające się sekwencje homologii typu III fibronektyny z domeną ED-B; rec ED-B = sama zrekombinowana ED-B; rec FN6 = zrekombinowana domena 6 fibronektyny.
Oba fragmenty CGS-1 i CGS-2 rozpoznają rekombinowany peptyd ED-B, jak również natywne i zrekombinowane fragmenty FN zawierające sekwencję ED-B, ale nie wiążą się z fragmentami FN nie posiadającymi ED-B. Ponadto fragmenty CGS-1 i CGS-2 nie reagują z tenascyną (która zawiera piętnaście powtarzających się sekwencji homologii typu III: Sari i inni, 1991) i FN osocza, która nie zawiera wykrywalnego poziomu sekwencji ED-B w produktach powstałych po trawieniu termolizyną (Zardi i inni, 1987). Natomiast z FN wyizolowaną z linii komórkowej WI38VA transformowanej wirusem SV40 fragmenty CGS-1 i CGS-2 reagują silnie. Około 70-90% cząsteczek FN z tej linii komórkowej zawiera ED-B, co wykazano trawiąc termolizyną oczyszczoną FN oraz trawiąc nukleazą S1 całkowity RNA uzyskany z komórek linii (Zardi i inni, 1992). Swoistość fragmentów scFv w stosunku do domeny ED-B fibronektyny wykazano później używając rozpuszczalnych zrekombinowanych
188 557
ED-B do hamowania wiązania CGS-1 i/lub CGS-2 z FN na powierzchni komórek W138VA (wyniki nieprzedstawione).
Dane te potwierdzają, że fragmenty CGS-1 i CGS-2 swoiście rozpoznają tylko te pochodne FN, które posiadają domenę ED-B. Oba te fragmenty wykazują taką samą reaktywność jak mAb BC-1, z wyjątkiem zrekombinowanej domeny ED-B, która nie jest rozpoznawana przez przeciwciała BC-1. Intensywność sygnału w teście ELISA w stosunku do monoklonalnych przeciwciał kontrolnych odzwierciedla wysoką swoistość obu fragmentów scFv w rozpoznawaniu antygenów zawierających ED-B.
Swoistość fragmentów CGS-1 i CGS-2 była następnie badana metodą immunoblot, gdzie stosowano FN izolowaną z osocza i z komórek W138VA i ich fragmenty powstałe po trawieniu termolizyną. Po trawieniu termolizyną FN z komórek W138VA (której większość zawiera domenę ED-B) uzyskuje się fragment 120 kD (zawierający ED-B) i mniejszy fragment 110 kD, który nie posiada ED-B (fig. 2A); Zardi i inni, 1987). Kolejne trawienie domeny 120 kD daje dwa fragmenty: pierwszy o masie 85 kD zawierający prawie całą wyjściową sekwencję ED-B w rejonie C-końcowym i drugi o masie 35 kD (fig. 2A); Zardi i inni, 1987).
Po lewej stronie fig. 2B przedstawiony jest wybarwiony za pomocą Coomassie żel zawierający frakcje białkowe badane metodą immunoblot. Fibronektyna osocza (linia 1) i produkty jej trawienia termolizyną (linia 3-zawierająca białko o m.cz. 110 kD i linia 4-zawierająca trawione białko 110 kD) nie były rozpoznawane przez fragmenty CGS-1 i CGS-2. Natomiast FN z komórek W138VA posiadająca dużo domen ED-B była rozpoznawana przez oba fragmenty scFv, zarówno jako całe białko (linia 2) jak i po trawieniu termolizyną (linie 5, 6 i 7). Najmniejszy fragment fibronektyny, który był swoiście rozpoznany przez fragment CGS-1, był białkiem o m.cz. 120 kD (obejmującym powtarzające się sekwencje typu III od 2 do 11), natomiast fragment CGS-2 był zdolny rozpoznawać fragment o m.cz. 85 kD zawierający powtarzające się sekwencje od 2 do 7 zlokalizowane w części N-końcowej ED-B (fig. 2B); Zardi i inni 1987). Wyniki te świadczą o reaktywności obu scFv z różnymi epitopami wewnątrz sekwencji ED-B. Wiązanie się fragmentu CGS-2 z domeną 85 kD świadczy 0 tym, że epitop dla tego klonu znajduje się w części aminowej ED-B. Natomiast fragment CGS-1 nie wiąże się z fragmentem 85 kD otrzymanym w wyniku trawienia białka 120 kD, co dowodzi, że rozpoznaje on epitop zlokalizowany bliżej końca karboksylowego cząsteczki ED-B.
Precyzyjniej swoistość fragmentów CGS-1 i CGS-2 była określana metodą immunoblot z wykorzystaniem zrekombinowanych fragmentów FN oraz białek fuzyjnych, które posiadały sekwencję ED-B lub były jej pozbawione. Białka fuzyjne zostały przygotowane według Carnemolla i innych (1989). Wyniki tych eksperymentów przedstawiono na fig. 3; aby przyporządkować schematyczny diagram strukturze domen ludzkiej FN patrz Camemolla i inni, 1992. Otrzymane tą metodą profile wiązania zasadniczo potwierdzają wyniki uzyskane wcześniej metodą ELISA i immunoblot dla oczyszczonej FN i produktów jej proteolizy: fragmenty CGS-1 i CGS-2 były wysoce reaktywne wobec fragmentów fibronektyny zawierającej ED-B (linie 2 i 4) ale nie rozpoznawały sekwencji bez domeny ED-B (linie 1 i 3). Fragment CGS-1 nie reagował z ludzkim (linia 5) jak również z kurzym (linia 6) białkiem fuzyjnym ED-B, natomiast CGS-2 silnie reagował z oboma tymi białkami (fig. 3). Wyniki te mogą odzwierciedlać pewne przestrzenne ograniczenia epitopu w fibronektynie zawierającej domenę ED-B, który jest rozpoznawany przez fragment CGS-1; możliwe jest na przykład, że epitop ten jest wrażliwy na denaturację lub nie jest prawidłowo prezentowany (pokazywany na tle białka) po rozdziale w żelu SDS-PAGE i przeniesieniu na nośnik stały jakim jest nitroceluloza.
Podsumowując, wyniki te wskazują, że fragmenty CGS-1 i CGS-2 wiążą się silnie i swoiście z fibronektynami posiadającymi domeną ED-B. Rozpoznawane przez nie regiony ED-B różnią się między sobą, jak również są inne niż region rozpoznawany przez mAb BC-1.
Przykład 4 - Zastosowanie fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie anty ED-B w immunocytochemicznym barwieniu ludzkich i mysich skrawków nowotworów
Fragmenty CGS-1 i CGS-2 zostały użyte do lokalizacji cząsteczek fibronektyny zawierającej domenę ED-B w różnych tkankach zdrowych i nowotworowych człowieka. Z tkanek zdrowych wybrano skórę, gdyż wiadomo, że izoformy B-FN są obecne w makrofagu i fibroblastach podczas gojenia ran (Camemolla i inni, 1989; Brown i inni, 1993). Dwa wybrane
188 557 nowotwory ludzkie wcześniej badano pod kątem swoistości barwienia przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko fibronektynie; glejak wielopostaciowy był szczegółowo badany ponieważ komórki w naczyniach tego guza silnie proliferują i nasilają procesy angiogenezy, w tym ekspresję izoform B-FN (Castellani i inni, 1994). Ponadto, badania prowadzone na normalnej, rozrostowej i nowotworowej ludzkiej tkance piersi dostarczyły danych o zależności pomiędzy angiogeneząi ekspresją B-FN (Kaczmarek i inni, 1994).
W opisanych w tej pracy doświadczeniach barwienie immunohistochemiczne za pomocą fragmentów CGS-1 i CGS-2 było porównane z wynikami barwienia przeciwciałem BC-1 (które rozpoznaje izoformy B-FN) i innymi przeciwciałami monoklonalnymi, które reagują z wszystkimi znanymi wariantami izoform fibronektyny (IST-4) lub tylko z izoformami fibronektyny pozbawionymi domeny ED-B (IST-6). Właściwości wszystkich tych przeciwciał kontrolnych zostały wcześniej opisane (Camemolla i inni, 1992).
Zdrowe i nowotworowe tkanki otrzymano z materiału pobranego podczas operacji. Wcześniej wykazano, że pobranie i utrwalenie tkanki jest kluczowe dla dokładności i czułości detekcji cząsteczek zawierających fibronektynę (Castellani i inni, 1994). Do oznaczeń immunohistochemicznych brano zamrożone skrawki o grubości 5 pm suszone powietrzem i utrwalane zimnym acetonem przez 10 minut. Reakcję barwną wywoływano przy użyciu zestawu streptavidin-biotin alkaline phosphatase complex (Bio-SPA Division, Milan, Italy) i napholAS-MX-phosphate i Fast Red TR (Sigma). Hematoksylina GilFa została zastosowana w barwieniu kontrastowym, po zatopieniu w „glycergel” (Dako, Carpenteria, CA) jak opisał Castellani i inni, 1994. Te skrawki, które zostały wybarwione, analizowano pod względem swoistości w kolejnych doświadczeniach, swoistość w stosunku do ED-B wykazywano, przez wcześniejszą inkubację przeciwciał ze zrekombinowaną domeną ED-B, poprzedzającą detekcję opisaną wcześniej.
Wyniki wszystkich tych eksperymentów dowodzą, ze CGS-1 i CGS-2 reagują z tą samą strukturą tkankową co mAb BC-1. Obraz barwienia skóry za pomocą CGS-1, CGS-2 i BC-1 świadczy o braku domen ED-B w FN obecnej w tej tkance. Barwienie skrawków inwazyjnego raka przewodowego przy użyciu CGS-1 CGS-2 i BC-1 wykazało ograniczone rozmieszczenie barwnika, który był obecny na granicy pomiędzy komórkami nowotworowymi i zrębu. Jest to zgodne z obserwacją, że jakkolwiek całkowita FN jest równomiernie rozmieszczona w zrębie guza to ekspresja B-FN jest ograniczona do pewnych obszarów i są to te same obszary (w 95% przypadków), które wcześniej zlokalizowano za pomocą mAb BC-1 w inwazyjnym raku przewodowym (Kaczmarek i inni, 1994).
Potwierdzono wcześniejsze doniesienia na temat barwienia glejaka wielopostaciowego za pomocą BC-1. Castellani i inni (1994) obserwował charakterystyczny wzór barwienia struktur naczyniowych przypominających kłębuszkowe (glomerular-like); w naszych doświadczeniach CGS-1 i CGS-2 dały jakościowo identyczne wyniki.
Jednakże jest istotna różnica pomiędzy CGS-1 i CGS-2, a mAb BC-1: wykazano, że te dwa ludzie fragmenty scFv wiążą się z kurzą i mysią B-FN, podczas gdy BC-1 jest swoista tylko dla ludzkiej B-FN. Fragment CGS-2 reaguje z embrionami kury (wyniki nie przedstawione), a oba CGS-1 i CGS-2 reagują z nowotworami myszy.
Fragment CGS-1 barwił również struktury naczyniowe w wycinkach F9 potwomiaka. Nie następują natomiast reakcje barwne CGS-1 i CGS-2 z badanymi tkankami myszy zdrowych (wątroba, śledziona, nerki, żołądek, jelito cienkie, jelito grube jajniki, macica, pęcherz moczowy, trzustka, nadnercza, mięśnie szkieletowe, serce, płuca, tarczyca i mózg) (wyniki nie przedstawione). W skrawkach F9 potwomiaka wybarwione zostały struktury o swoistości ED-B, dzięki zastosowaniu zrekombinowanej domeny ED-B do całkowitego blokowania tej reakcji (wyniki niepokazane).
Przykład 5 - Zastosowanie fragmentów scFv o dojrzałym powinowactwie anty ED-B w bezpośrednim działaniu na ludzkie nowotwory in vivo
Linię komórek ludzkiego czerniaka SKMEL-28 wykorzystano do hodowli ksenograficznych (przeszczepionych z innego gatunku) nowotworów w 6 - 8 tygodniowych myszach szczepów nagich (Balb-c lub MF-1; Harlan UK), którym wstrzykiwano podskórnie lxl07
188 557 komórek/ mysz w jeden bok ciała. Gdy guz osiągnął średnicę około 1 cm, myszom wstrzykiwano do żyły ogonowej 100 p1 roztworu scFvi - CY71 o stężeniu 1 mg/ml w PBS.
Wyznakowanie zrekombinowanych przeciwciał za pomocą CY7 uzyskiwano przez dodanie 100 }l IM buforu węglowego, pH 9,3 i 200 fil CY7-bis-Osu (Amersham; Cat. Nr. PA17000; 2 mg/ml w DMSO) do 1 ml roztworu przeciwciała w PBS (1 mg/ml). Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do mieszaniny dodawano 100 μ1 IM buforu Tri, pH 7,4 i oddzielano wyznakowane przeciwciało od nadmiaru barwnika na kolumnach PD-10 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) zrównoważonej uprzednio roztworem PBS. Eluowane frakcje zawierające zabarwione na zielono przeciwciało były zatężone do stężenia około 1 mg/ml w probówkach Centricon-10 (Amicon, Bevery, MA, USA). Ilościowy stosunek cząsteczek znacznika CY7 do cząsteczek przeciwciała w przybliżeniu wynosił 1:1. Oceniono to spekrofotometrycznie, przyjmując, że absorpcja roztworu przeciwciał o stężeniu 1 mg/ml w 1 cm wynosi 1,4 jednostki przy długości fali 280 nm, molowy współczynnik absorpcji CY7 przy 748 nm jest równy 200000 (M^cm'1), pomijając absorpcję CY7 przy 280 nm.
Immunoreaktywność próbek przeciwciał po znakowaniu potwierdzono badając ruchliwość elektroforetyczną w żelu (Neri i inni, 1996b), wiązanie z antygenem stosując chromatografię powinowactwa jak również prowadząc analizę za pomocą aparatu BIAcore. Myszy były obserwowane za pomocą urządzenia własnej konstrukcji, w równych odstępach czasu, i znieczulane wziewnie mieszaniną tlenu i fluorotanu. Badano od 2 do 8 myszy w każdej próbie, w zależności od powtarzalności uzyskiwanych wyników. Doświadczenie przeprowadzono zgodnie z licencją UK Project Licence „Tumor Targeting” wydaną D. Neri (UK PPL 80/1056).
Detektor podczerwieni zbudowano jako modyfikację układu do fotodetekcji skonstruowanego przez Folii i innych (1994), który pozwala mierzyć światło podczerwone fluroforu CY7. Światło podczerwone zostało wybrane aby uzyskać lepsze przenikanie przez tkankę. Fluorescencja CY7 (>760 nm) jest niewidoczna dla człowieka i wymaga użycia komputerowo sterowanej kamery CCD. Detektor podczerwieni składa się z czarnego, nieprzepuszczającego światła pudełka wyposażonego w wolframową lampę halogenową o mocy 100 W, posiadającą filtr wzbudzający o średnicy 50 mm zaprojektowany dla CY7 (Chroma Corporation, Brattleboro, VT, USA; 673-748 nm). Powstająca wiązka światła jest prawie jednorodna na przestrzeni 5x10 cm, na której była umieszczona mysz w celu obrazowania. Fluorescencję mierzono 8 bitową monochromatyczną kamerą Pulnix CCD, wyposażoną w C-mount obiektyw i filtr emisji o średnicy 50 mm (Chroma Corporation, Brattleboro, VT, USA; 765-855 nm) i połączoną z systemem ImageDOK (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). System ten składa się z komputera wyposażonego w urządzenie do „przechwytywania” zdjęć i oprogramowania do wyłapywania i scalania następujących po sobie obrazów. Trzy sekwencyjne obrazy po 50 ms każdy, były zazwyczaj wykorzystywane w tym procesie; ta liczba była utrzymana jako stała dla serii zdjęć jednego zwierzęcia, by umożliwić dokładne porównanie oddziaływania z nowotworem w różnym czasie. Zdjęcia w formacie TIFF były potem przetwarzane na pliki PICT za pomocą programu graficznego Graphics Converter przy użyciu komputera Power Macintosh 7100/66 i programu MacDraw Pro.
Schematyczny szkic projektu tej aparatury zamieszczono na fig. 4.
Doświadczenie te wykazały, że oba fragmenty scFv umiejscawiają się w guzie, co widoczne jest na poziomie makroskopowym.
Mikroskopowo stwierdzono, ze oba fragmenty scFv przeciwko ED-B rozpoznają nowopowstałe naczynia krwionośne rozwijającego się guza.
Myszom szczepu nagiego i/lub SCID z nowotworem ksenograficznym ludzkiego czerniaka SKMEL-28, jak również mysiego potwomiaka F9 po jednej stronie grzbietu wstrzykiwano nieznakowane fragmenty scFv z dołączoną sekwencją FLAG oraz biotynylowane fragmenty scFv.
Myszy zabijano w różnym czasie po injekcji, izolowano skrawki guza i innych tkanek, które były następnie barwione zgodnie z przepisem tradycyjnej metody immunohistochemicznej wykorzystując przeciwciała M2 przeciwko FLAG (Kodak, 181) lub zestaw odczynników do detekcji opartej na własnościach streptawidyny. Optymalne rozpoznawanie (wnikanie do guza) obserwowano po 12 godzinach po injekcji. Zarówno CGS-1 jak i CGS-2 wiązały się
188 557 z naczyniami krwionośnymi obu guzów: kserograficznego przeszczepu ludzkiego nowotworu i mysiego potwomiaka.
Przykład 6 - Bezpośrednie działanie na mysi potwomiak złośliwy przeszczepiony myszy szczepu nagiego z innego gatunku
Prowadzono hodowlę guzów litych na boku myszy szczepu nagiego poprzez podskórne wstrzyknięcie 4x106 komórek mysiego potwomiaka F9. Nowotwór ten rośnie bardzo szybko u myszy, osiągając średnicę 1 cm około tygodnia po infekcji i jest silnie unaczyeioec. W celu obrazowania swoistego rozpoznawania tego guza przez przeciwciała, użyliśmy zmodyfikowanej metody fotodżtżkcji autorstwa Folii i innych (1994), która pozwala na kinetyczną ocenę wnikania przeciwciał do guza oraz usuwania ich z organizmu u tego samego zwierzęcia, w różnych odstępach czasu jak szczegółowo opisano powyżej (fig. 4).
W celu swoistego działania na nowotwór i dla ułatwienia detekcji przeciwciał, scFv(CGS-l), scFv(CGS-2) i scFv(D1.3) przeciwko lizozymowi (McCafferty i inni, 1990) były połączone ze znacznikiem i poddane dimeryzacji poprzez klonowanie tych przeciwciał w miejscach Sfil/Notl do wektora ekspresyjnego pGINŚO. Ten wektor jest pochodną wektora pDN268 (Neri i inni, 1996b), w którym sekwencja sześciu histydyn zastąpiona jest przez sekwencje: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT ELA HLL KEK EKL EFI LAA H, która zawiera resztę cysteiny i amfipatyczną helisę białka Fos umożliwiające kowalencyjne tworzenie homodimerów fragmentów przeciwciał (Abate i inni, 1990). Nie uzyskano całkowitej dimeryzacji: w przybliżeniu 30-50% fragmentów przeciwciał występowało w postaci kowalencyjeiż połączonych dimerów.
Fragmenty przeciwciała oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa na kolumnach otrzymanych przez związanie lizozymu jaja kurzego (01.3) lub 7B89 (przeciwciała przeciwko ED-B; Camemolla i inni, 1996) z aktywowaną cjanobromem sefarozą (Sepharose) (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Supematanty nanoszono na złoże, które było następnie przemywane roztworem PBS; PBS z 0,5 M NaCl i eluowane 100 mM roztworem Et3N. Następnie przeciwciała dializowano wobec buforu PBS.
Przeciwciała wyznakowane wcześniej opisaną metodą były wstrzykiwane do żyły ogonowej myszy chorych, gdy guz osiągnął średnicę około 1 cm. Podawano 100 pl roztworu scFv-CY7 o stężeniu 1 mg/ml w PBS.
Jak przedstawiono na Rysunku 5 (fig. 5) scFv (CGS-1) obecne były w guzach do trzech dni mimo, że w tym czasie obserwowano szybkie usuwanie CGS-1 z guza. Jednak występowało również pewne barwienie kości udowej. Ukierunkowane wiązanie się CGS-1 z guzem znacząco wyrosło po wprowadzeniu amfipatycznej helisy zawierającej resztę cysteiny na C-końcu, umożliwiającej dimeryzację przeciwciała (Pack i inni, 1993). W rzeczywistości umiejscawianie się dimerów scFv (CGS-2)2 nie zmniejszyło się znacząco z 24 do 72 godzin. Negatywna kontrola natomiast (dimeryczne przeciwciało scFv(D1.3)2, przeciwciało przeciwko lizozymowi), wykazała szybkie usuwanie i eiżmoZliwż było ich zlokalizowanie w nowotworze lub w kości udowej.
Przeciwciało scFy^SI) wykazywało słabe docelowe wiązanie się z nowotworem po 6 godzinach (dane niepokazane) i nie było wykrywalne po 24 godzinach i później (fig. 6). Prowadzenie procesu dojrzewania powinowactwa doprowadziło do większego wzrostu swoistości bezpośredniego oddziaływania, ponieważ scFv(GCS-2) działał na małe i duże nowotwory F9, jako monomer (fig. 6) lub dimer (dane niepokazanż). Po dwóch dniach, procent wstrzykiętej dawki przeciwciała na gram nowotworu wynosił około 2 dla monomerów scFy^GS^) i 3-4 dla dimerów scFv(CGS-2). Dawka, która dotarła do nowotworu dzięki scFv (CGS-2) była wyższa od tej z scFv(CGS-l) (fig. 5, 6), i skorelowana odpowiednio z ich powinowactwem (Tabela 1). Jednakże oba scFv(28SI) i scFv(CGS-2) wydaje się, że ulegają protżoliziż i w dużym stopniu są wychwytywane przez wątrobę (fig. 6), podczas gdy przeciwciała scFv(CGS-l) były bardziej stabilne i w mniejszym stopniu wychwytywane przez wątrobę (fig. 5).
188 557
LITERATURA:
Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992; Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition.
Alitalo et al.Adv. Cancer Res. 37, 111-158 (1982).
Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates end Radiopharmaceuticals 4: 915-922.
Barone et al. EMBO J. 8, 1079-1085 (1989).
Bird et al. Science, 242, 423-426, (1988).
Borsi et al. J. Cell. Biol. 104, 595-600 (1987).
Borsi et al. Anal. Biochem. 192, 372-379 (1991).
Borsi et al. Int. J. Cancer 52, 688-692 (1992a).
Borsi et al. Exp. Cell Res. 199, 98-105 (1992b).
Brown et al. Amer. J. Pathol. 142, 793-801 (1993).
Camemolla etal. J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989).
Camemolla et al. J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992).
Castellani et al. J. Cell Biol. 103, 1671-1677 (1986).
Castellani et al. Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994).
Crothers et al. Immunochemistry 9, 341-357 (1972).
DeJager et al. (1988), Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 29:377.
Folli et al. (1994), Cancer Res., 54, 2643-2649.
Ffrench-Constant et al. J. Cell Biol. 109, 903-914 (1989).
Ffrench-Constant et al. Development 106, 375-388 (1989).
Gibson T. J. (1984), PhD tesis. (University of Cambridge, Cambridge, UK).
Griffiths et al. (1994), EMBO J. 13, 3245-3260.
Gutman and Komblihtt. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 7179-7182 (1987).
Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992).
Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 6444-6448 (1993).
Holliger P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993).
Hoogenboom et al. Nucl. Acids Res. 19,4133-4137 (1991).
Humphries et al. J. Cell Biol. 103, 2637-2647 (1986).
Huston et al. PNAS USA, 85, 5879-5883 (1988).
Hynes Ann. Rev. Cell Biol. 1, 67-90 (1985).
JainR.K. Sci. Am. 271, 58-65 (1994).
Jonsson et al. Bio Techniques 11, 620-627 (1991).
Juweid et al. Cancer Res. 52, 5144-5153 (1992).
Kaczmarek et al. Int. J. Cancer 58, 11-16 (1994).
Komblihtt et al. EMBO J. 4, 1755 (1985).
Laitinen et al. Lab. Invest. 64, 375-388 (1991).
Ledermann J.A. et al. Int. J. Cancer 47, 659-664 (1991).
Low et al. J. Mol. Biol. 260, 359-368 (1996).
Marks et al. J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991).
Marks et al. Bio/Technology 10, 779-783 (1992).
McCafferty J., Griffiths A. D., Winter G, Chiswell D.J. (1990) Phage andbodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature (London) 348,552-554.
Neri et al. Bio/Techniques 20, 708-713 (1996a).
Neri et al. Nature Biotechnology 14, 385-390 (1996b).
Nissim et al. EMBO J. 13, 692-698 (1994).
Norton and Hynes. Mol. Cell. Biol. 7, 4297-4307 (1987).
Owens et al. Oxf. Surv. Eucaryot. Genes 3, 141-160 (1986).
Oyama et al. J. Biol. Chem. 10331-10334 (1989).
Oyamaet al. Cancer Res. 50, 1075-1078(1990).
Pack et al. Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993).
Peters et al. Cell Adhes. Commun. 3, 67-89 (1995).
Pierschbacher et al. Cell 26, 259-267 (1981).
188 557
Pluckthun A. Bio/Technology 9, 545-551 (1991).
Reff M.E. Curr. Opinion Biotech. 4, 573-576 (1993).
Ruoslahti. Ann. Rev. Biochem. 57, 375-413 (1988).
Saginati et al. Eur. J. Biochem. 205, 545-549 (1992). Schwarzbauer et al. EMBO J. 6, 2573-2580 (1987).
Schroff et al. Cancer Res. 45, 879-885 (1985).
Siri et al. Nucl. Acids Res. 19, 525-531 (1991).
Tomlinson I.M. et al. J. Mol. Biol. 227, 776-798 (1992). Traunecker et al. EMBO J. 10, 3655-3659 (1991).
Trill J. J. et al. Curr·. Opinion Biotech. 6, 553-560 (1995).
Vartio et al. J. Cell Science 88, 419-430 (1987).
Vaughan et al. Nature Biotechnol. 14, 309-314 (1996).
Ward E.S. et al. Nature 341, 544-546 (1989).
Winter G. And C. Milstein. Nature 349, 293-299 (1991). WO94/13804 Yamada. Ann. Rev. Biochem. 52, 761-799 (1983). Zardi et al. EMBO J. 6, 2337-2342 (1987).
188 557
| rH | 03 | T-l | Ol |
| co | W | cn | w |
| U | p | p | O |
| U | O | O | O |
188 557
188 557
188 557 rΌ un
-4· m
Cm r*
Ό un
CM fcrt u
U
I
ΙΛ
U co o
| C* | I 1 | <£ 1 |
| md | ii | |
| LH | li | CZ5 |
| <r | BB | |
| m | IBT | |
| cm | El |
Q0 s
CM Q3
Ί i (8» r* o
Ln *4m
Cm
O tn
-ί rn
Cq *
CO O
CM co
Ύ<
, l<ig j «4'tri9 i '14 M#*| «sęrjj tt $3 u
□
B
OJ
V)
VI ra
E o
a u
O
Cm
I I *~o\ O *4·
TT ~i—r~r
O O -J m cm ·<30
188 557
188 557
188 557
188 557
FIG. 5
188 557
24τι 48 h scFy(28SI)
(duży martwiczy guz) scFv(CGS-2) ; scFv(CGS-2) HBgggj iODepartament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania swoiście wiążącego się czynnika, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała zawierającego domenę przeciwciała wiążącą antygen, w którym domenę przeciwciała wiążącą antygen, wyodrębnia się ze zbioru syntetycznych, molekularnych receptorów i wiąże bezpośrednio z ED-B nowotworowo-płodową domeną fibronektyny (FN), znamienny tym, że (a) oddziela się fragment przeciwciała z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwciał ludzkich przy użyciu rekombinowanej pochodnej antygenu z białkiem fibronektyny, po czym (b) infekuje się komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami, a następnie (c) podaje się pozytywne klony fag procesowi dojrzewania powinowactwa, po czym (d) powtarza się etap (a) w którym oddziela się fragment przeciwciała z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwciał ludzkich przy użyciu rekombinowanej pochodnej antygenu z białkiem fibronektyny i etap (b) w którym infekuje się komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami, celem oddzielenia pozytywnych klonów fag ze zwiększonym powinowactwem do antygenu, a następnie (e) infekuje się komórki bakteryjnego gospodarza pozytywnymi klonami i oczyszcza się cząsteczki przeciwciała od wspomnianych komórek gospodarza.
- 2. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że (a) oddziela się fragment przeciwciała z biblioteki ekspresyjnej fragmentów przeciwciał ludzkich przy użyciu rekombinowanej pochodnej antygenu z białkiem fibronektyny przy użyciu zrekombinowanych antygenów 7B89 lub ED-B.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się dodatni klon kwasu nukleinowego podczas wyodrębniania z komórki gospodarza przeciwciała lub jego fragmentu kodowanego kwasem nukleinowym, przy czym przeciwciało lub jego fragment zawiera domenę przeciwciała wiążącego antygen, która jest swoista do i połączona bezpośrednio z ED-B nowotworowo-płodową domeną fibronektyny (FN).
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że przeciwciało otrzymuje się w postaci całkowitej.
- 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że fragment przeciwciała otrzymuje się w postaci cząstki scFv.
- 6. Swoiście wiążący się, izolowany czynnik, który jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i zawiera domenę przeciwciała wiążącą antygen, znamienny tym, że domena przeciwciała wiąząca antygen jest izolowana z syntetycznych, molekularnych receptorów i jest swoista do i połączona bezpośrednio z nowotworowo-płodową domeną ED-B fibronektyny (FN).
- 7. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (VH) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DP47 (od kodonu 1 Glu do kodonu 98 Arg włącznie, przedstawioną na fig. 1) i sekwencję CDR3: Ser Leu Pro Lys.
- 8. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (VH) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DP47 (od kodonu 1 Glu do kodonu 98 Arg włącznie, przedstawioną na fig. 1) i sekwencję CDR3: Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu.
- 9. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, ze zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha lekkiego (VL) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DPL16 (od kodonu 1 Ser do kodonu 90 Ser włącznie, przedstawioną na fig. 1) i resztę sekwencji CDR3 Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val.
- 10. Swoiście wiążący się c zynnik wedlugzastrz.6, znamienny tym, żezawierasekwencję zmiennego regionu łańcucha lekkiego (VL) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DPL16 (od kodonu 1 Ser do kodonu 90 Ser włącznie, przedstawioną na fig. 1) i resztę sekwencji CDR3 Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.188 557
- 11. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego (VH) pochodzącą z ludzkiej linii zarodkowej DP47 (od kodonu 1 Glu do kodonu 98 Arg włącznie, przedstawioną na fig. 1) i sekwencję CDR3.
- 12. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że w postaci oczyszczonego monomeru ma stałą dysocjacji (Kj 6 x 10'8M lub mniejszą dla domeny ED-B fibronektyny FN.
- 13. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że wiążący czynnik jest fragmentem przeciwciała.
- 14. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że wspomniany wiążący się czynnik zawiera cząsteczkę scFv.
- 15. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że wspomniany wiążący się czynnik zawiera dimeryczną cząsteczkę scFv.
- 16. Swoiście wiążący się czynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera całkowite przeciwciało.
- 17. Kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje swoiście wiążący się czynnik jak określono w zastrz. 6.
- 18. Fag, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 17, który koduje swoiście wiążący się czynnik jak określono w zastrz. 6.
- 19. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana lub transfekowana kwasem nukleinowym jak określono w zastrz. 17.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9610967A GB9610967D0 (en) | 1996-05-24 | 1996-05-24 | Specific binding members,materials and methods |
| PCT/GB1997/001412 WO1997045544A1 (en) | 1996-05-24 | 1997-05-23 | Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, their construction and uses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL330075A1 PL330075A1 (en) | 1999-04-26 |
| PL188557B1 true PL188557B1 (pl) | 2005-02-28 |
Family
ID=10794298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97330075A PL188557B1 (pl) | 1996-05-24 | 1997-05-23 | Sposób wytwarzania swoiście wiążącego się czynnika, swoiście wiążący się czynnik, kwas nukleinowy ifag |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7273924B1 (pl) |
| EP (1) | EP0906426B1 (pl) |
| JP (2) | JP4750912B2 (pl) |
| KR (2) | KR100741452B1 (pl) |
| CN (1) | CN100447159C (pl) |
| AT (1) | ATE361364T1 (pl) |
| AU (1) | AU729081B2 (pl) |
| BG (1) | BG65138B1 (pl) |
| BR (1) | BR9709350B1 (pl) |
| CA (1) | CA2256308C (pl) |
| CZ (1) | CZ295531B6 (pl) |
| DE (1) | DE69737683T2 (pl) |
| DK (1) | DK0906426T3 (pl) |
| EA (1) | EA004329B1 (pl) |
| ES (1) | ES2286831T3 (pl) |
| GB (1) | GB9610967D0 (pl) |
| HK (1) | HK1020990A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0200546A2 (pl) |
| IL (2) | IL127216A0 (pl) |
| IS (1) | IS2508B (pl) |
| NO (1) | NO324904B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ333083A (pl) |
| PL (1) | PL188557B1 (pl) |
| PT (1) | PT906426E (pl) |
| SI (1) | SI0906426T1 (pl) |
| SK (1) | SK285916B6 (pl) |
| TR (1) | TR199802416T2 (pl) |
| UA (1) | UA74129C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997045544A1 (pl) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965132A (en) | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
| US6749853B1 (en) | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
| GB9610967D0 (en) | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
| US6685943B1 (en) | 1997-01-21 | 2004-02-03 | The Texas A&M University System | Fibronectin binding protein compositions and methods of use |
| US7244826B1 (en) | 1998-04-24 | 2007-07-17 | The Regents Of The University Of California | Internalizing ERB2 antibodies |
| US20030176663A1 (en) * | 1998-05-11 | 2003-09-18 | Eidgenossische Technische Hochscule | Specific binding molecules for scintigraphy |
| TWI259837B (en) * | 1998-05-11 | 2006-08-11 | Eidgenossische Tech Hochscule | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
| US20030045681A1 (en) * | 1998-05-11 | 2003-03-06 | Anthony J. Zelano | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
| DE19932688B4 (de) | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
| CA2400622A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis |
| PT1719528E (pt) * | 2000-02-24 | 2012-01-06 | Philogen Spa | Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas |
| CA2411244A1 (en) | 2000-05-09 | 2001-11-15 | Greenville Hospital System | Therapeutic pore-forming peptides |
| AU2001281824A1 (en) * | 2000-06-15 | 2001-12-24 | Patrizia Castellani | Methods for quantitative determination of b-fibronectin in biological fluids and tissues |
| EP1381629B1 (de) * | 2000-09-07 | 2008-09-10 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | REZEPTOR DER EDb-FIBRONEKTIN-DOMÄNE (II) |
| IT1317108B1 (it) * | 2000-12-06 | 2003-05-26 | Philogen Srl | Processo per la selezione di frammenti anticorporali anti-angiogenesi,frammenti anticorpali anti-angiogenesi cosi' ottenuti e loro uso. |
| US7456146B2 (en) * | 2001-05-09 | 2008-11-25 | Ghc Research Development Corporation | Lytic peptide prodrugs |
| EP2239274A1 (en) | 2002-01-03 | 2010-10-13 | Bayer Schering Pharma AG | New methods for diagnosis and treatment of tumours |
| US8491906B2 (en) * | 2002-03-11 | 2013-07-23 | Philogen S.P.A. | Selective targeting of tumor vasculature using antibody molecules |
| DK1537146T3 (da) | 2002-07-15 | 2011-04-04 | Univ Texas | Antistoffer, der binder til anioniske phospholipider og aminophospholipider, og deres anvendelse til behandling af virusinfektioner |
| RU2005131852A (ru) | 2003-03-14 | 2006-04-20 | Уайт (Us) | Антитела против человеческого рецептора il-21 и их применение |
| DE10324447A1 (de) | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
| EA011859B9 (ru) | 2004-01-05 | 2013-07-30 | Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. | Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени |
| EP1778874B1 (en) | 2004-07-30 | 2011-11-23 | Adeza Biomedical Corporation | Oncofetal fibronectin as a marker for cervical cancer |
| US7785591B2 (en) * | 2004-10-14 | 2010-08-31 | Morphosys Ag | Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies |
| EP1803814A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-07-04 | SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. | Method of improving the antibody selection capacity in phage-display library |
| EP1925664A1 (en) | 2006-11-15 | 2008-05-28 | Scil proteins GmbH | Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin |
| US8253725B2 (en) * | 2007-12-28 | 2012-08-28 | St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. | Method and system for generating surface models of geometric structures |
| ATE548052T1 (de) | 2008-01-17 | 2012-03-15 | Philogen Spa | Kombination aus einem anti-edb-fibronectin- antikörper-il-2-fusionsprotein und einem b-zellen bindenden molekül, b-zellen-vorläufern und/oder deren krebserregendem gegenspieler |
| EP2100621A1 (en) | 2008-03-10 | 2009-09-16 | mivenion GmbH | Polyether polyol dendron conjugates with effector molecules for biological targeting |
| EP2116555A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma |
| IT1392027B1 (it) * | 2008-12-12 | 2012-02-09 | Castellani | Anticorpo monoclonale e suo uso per la identificazione della isoforma oncofetale della fibronettina (b-fn) a scopo diagnostico o terapeutico. |
| JP5749733B2 (ja) | 2009-12-14 | 2015-07-15 | シル プロテインズ ゲーエムベーハーＳｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ | フィブロネクチンのエキストラドメインｂに対する特異的結合活性を有する修飾ユビキチンタンパク質 |
| WO2011110490A1 (en) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Process for the production of radioactively labelled scfv antibody fragments, kits and compositions |
| WO2012171541A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins |
| AU2012268970B2 (en) | 2011-06-15 | 2016-01-28 | Navigo Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
| EP2861616A1 (en) | 2012-06-13 | 2015-04-22 | Scil Proteins GmbH | Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains |
| WO2014094799A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Scil-Proteins-Gmbh | Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life |
| US10611830B2 (en) * | 2013-06-06 | 2020-04-07 | Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. | Human antibody against ED-B domain of fibronectin and uses thereof |
| CA2975362A1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | Navigo Proteins Gmbh | Egfr binding proteins comprising ubiquitin muteins |
| CN107922483B (zh) | 2015-07-16 | 2021-07-30 | 纳维格蛋白质有限公司 | 新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途 |
| JP2018520675A (ja) | 2015-07-20 | 2018-08-02 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ | ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法 |
| EP3378947B1 (en) * | 2015-11-16 | 2024-01-24 | Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. | Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia |
| CN109310780A (zh) | 2016-05-04 | 2019-02-05 | 纳维格蛋白质有限公司 | 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物 |
| EP3497118B1 (en) | 2016-08-11 | 2022-09-14 | Repligen Corporation | Alkaline stable fc binding proteins for affinity chromatography |
| IL266112B2 (en) | 2016-10-17 | 2024-07-01 | Pfizer | Antibodies against EDB and antibody-drug conjugates |
| EP3634999A1 (en) | 2017-06-07 | 2020-04-15 | Philogen S.p.A. | Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins |
| WO2019062877A1 (zh) * | 2017-09-30 | 2019-04-04 | 合肥立方制药股份有限公司 | 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白 |
| EP3706804B1 (en) | 2017-11-07 | 2022-02-23 | Navigo Proteins GmbH | Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
| EP3660039A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-03 | Philogen S.p.A. | Il2 immunoconjugates |
| WO2020070150A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Philogen S.P.A | Il2 immunoconjugates |
| AU2020328049A1 (en) | 2019-08-15 | 2022-02-17 | Janssen Biotech, Inc. | Materials and methods for improved single chain variable fragments |
| CA3164226A1 (en) | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Cilag Gmbh International | Multispecific binding molecules comprising ltbr and edb binding domains and uses thereof |
| CN111234016B (zh) * | 2020-02-23 | 2021-09-07 | 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 | 一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用 |
| CN111171149B (zh) * | 2020-02-23 | 2021-09-07 | 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 | 一种抗补体c5分子的人源化单链抗体及其应用 |
| KR102614063B1 (ko) | 2020-12-24 | 2023-12-19 | 대화제약 주식회사 | 엑스트라도메인 b 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 |
| AU2023206004A1 (en) | 2022-01-04 | 2024-08-22 | Philogen S.P.A. | Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor |
| WO2024028258A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Philochem Ag | Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents |
| WO2024052333A1 (en) | 2022-09-06 | 2024-03-14 | Philochem Ag | Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications |
Family Cites Families (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
| DE3650625T2 (de) | 1985-01-28 | 1997-10-02 | Xoma Corp | AraB-Promoter und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden einschliesslich Cecropinen mittels mikrobiologischer Verfahren |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US5243029A (en) * | 1986-04-09 | 1993-09-07 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Oncofetal structure of fibronectin |
| US4894326A (en) | 1986-04-09 | 1990-01-16 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Monoclonal antibody defining oncofetal structure of fibronectin |
| CA1341235C (en) | 1987-07-24 | 2001-05-22 | Randy R. Robinson | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| EP0311434A3 (en) * | 1987-10-09 | 1990-05-09 | The De La Rue Company Plc | Integrated circuit card |
| JP2980626B2 (ja) | 1988-01-11 | 1999-11-22 | ゾーマ・コーポレーション | ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター |
| IT1217724B (it) * | 1988-05-26 | 1990-03-30 | Ist Naz Ric Sul Cancro | Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori |
| US5177015A (en) | 1988-08-12 | 1993-01-05 | Fred Hutchinson Cancer Research Centre | Onco-developmentally regulated α-N-acetylgalactosaminyltransferase |
| US5843156A (en) | 1988-08-24 | 1998-12-01 | Endoluminal Therapeutics, Inc. | Local polymeric gel cellular therapy |
| JPH0276598A (ja) * | 1988-09-14 | 1990-03-15 | Fujita Gakuen | 抗ｅｄ−ｂ抗体 |
| JPH04169195A (ja) * | 1990-10-31 | 1992-06-17 | Fujita Gakuen | 抗ｅｄ―ｂモノクローナル抗体 |
| EP1136556B1 (en) | 1991-11-25 | 2005-06-08 | Enzon, Inc. | Method of producing multivalent antigen-binding proteins |
| US5629291A (en) | 1992-01-31 | 1997-05-13 | La Jolla Cancer Research Foundation | Methods of modulating fibronectin extracellular matrix assembly |
| US5877289A (en) | 1992-03-05 | 1999-03-02 | The Scripps Research Institute | Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature |
| US6036955A (en) | 1992-03-05 | 2000-03-14 | The Scripps Research Institute | Kits and methods for the specific coagulation of vasculature |
| US5965132A (en) | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
| US6749853B1 (en) | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
| US6004555A (en) | 1992-03-05 | 1999-12-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for the specific coagulation of vasculature |
| US6093399A (en) | 1992-03-05 | 2000-07-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature |
| US5976535A (en) | 1992-06-09 | 1999-11-02 | Neorx Corporation | Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore |
| EP0614696A4 (en) | 1992-09-25 | 1995-04-26 | Otsuka Pharma Co Ltd | ADSORBENT FOR CELLULAR FIBRONECTIN, SEPARATION AND PURIFICATION OF FIBRONECTIN, AND PURIFICATION OF BLOOD. |
| US5491130A (en) | 1992-11-10 | 1996-02-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Peptide inhibitors of fibronectin and related collagen-binding proteins |
| ATE199392T1 (de) | 1992-12-04 | 2001-03-15 | Medical Res Council | Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung |
| US6015897A (en) | 1993-12-07 | 2000-01-18 | Neorx Corporation | Biotinamido-n-methylglycyl-seryl-o-succinamido-benzyl dota |
| US5523229A (en) | 1994-03-22 | 1996-06-04 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antibodies specific for oncofetal fibronectin |
| DE4417865A1 (de) | 1994-05-20 | 1995-11-23 | Behringwerke Ag | Kombination von Tumornekrose-induzierenden Substanzen mit Substanzen, die durch Nekrosen aktiviert werden, zur selektiven Tumortherapie |
| ITFI940095A1 (it) | 1994-05-23 | 1995-11-23 | Molteni & C | Coniugati fotodinamici aventi proprieta' biocide |
| US5648485A (en) | 1994-10-26 | 1997-07-15 | University Of British Columbia | β, β-dihydroxy meso-substituted chlorins, isobacteriochlorins, and bacteriochlorins |
| WO1996023816A1 (en) | 1995-02-01 | 1996-08-08 | British Technology Group Limited | Radiolabelled proteins |
| WO1997002479A2 (en) | 1995-06-30 | 1997-01-23 | Yale University | Human monoclonal anti-tumor antibodies |
| US5808146A (en) | 1995-11-09 | 1998-09-15 | Emory University | Amino acid analogs for tumor imaging |
| GB9610967D0 (en) | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
| US5913884A (en) | 1996-09-19 | 1999-06-22 | The General Hospital Corporation | Inhibition of fibrosis by photodynamic therapy |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| US6394952B1 (en) | 1998-02-03 | 2002-05-28 | Adeza Biomedical Corporation | Point of care diagnostic systems |
| US6267722B1 (en) | 1998-02-03 | 2001-07-31 | Adeza Biomedical Corporation | Point of care diagnostic systems |
| TWI259837B (en) | 1998-05-11 | 2006-08-11 | Eidgenossische Tech Hochscule | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
| CA2400622A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis |
| PT1719528E (pt) | 2000-02-24 | 2012-01-06 | Philogen Spa | Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas |
| EP2239274A1 (en) | 2002-01-03 | 2010-10-13 | Bayer Schering Pharma AG | New methods for diagnosis and treatment of tumours |
| JP4169195B2 (ja) * | 2003-06-24 | 2008-10-22 | 株式会社河合楽器製作所 | 電子楽音発生装置の記録制御装置 |
-
1996
- 1996-05-24 GB GB9610967A patent/GB9610967D0/en active Pending
-
1997
- 1997-05-23 DE DE1997637683 patent/DE69737683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-23 SI SI9730765T patent/SI0906426T1/sl unknown
- 1997-05-23 TR TR1998/02416T patent/TR199802416T2/xx unknown
- 1997-05-23 CZ CZ19983815A patent/CZ295531B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 PT PT97923243T patent/PT906426E/pt unknown
- 1997-05-23 AU AU29101/97A patent/AU729081B2/en not_active Expired
- 1997-05-23 KR KR1020067006008A patent/KR100741452B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 EA EA199801043A patent/EA004329B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 NZ NZ33308397A patent/NZ333083A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 US US09/194,356 patent/US7273924B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-23 CN CNB971949026A patent/CN100447159C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-23 SK SK1612-98A patent/SK285916B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 EP EP19970923243 patent/EP0906426B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-23 HU HU0200546A patent/HUP0200546A2/hu unknown
- 1997-05-23 WO PCT/GB1997/001412 patent/WO1997045544A1/en active IP Right Grant
- 1997-05-23 JP JP54182897A patent/JP4750912B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-23 IL IL12721697A patent/IL127216A0/xx active IP Right Grant
- 1997-05-23 BR BRPI9709350-5A patent/BR9709350B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 KR KR10-2005-7000518A patent/KR20050010081A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-05-23 ES ES97923243T patent/ES2286831T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-23 PL PL97330075A patent/PL188557B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-05-23 AT AT97923243T patent/ATE361364T1/de active
- 1997-05-23 DK DK97923243T patent/DK0906426T3/da active
- 1997-05-23 CA CA 2256308 patent/CA2256308C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-23 UA UA98126836A patent/UA74129C2/uk unknown
-
1998
- 1998-10-29 IS IS4883A patent/IS2508B/is unknown
- 1998-11-23 NO NO19985459A patent/NO324904B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-11-23 IL IL127216A patent/IL127216A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-11-24 BG BG102950A patent/BG65138B1/bg unknown
-
1999
- 1999-12-14 HK HK99105868A patent/HK1020990A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-08-21 US US11/842,774 patent/US8703143B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-07 JP JP2008204682A patent/JP2009050261A/ja active Pending
-
2013
- 2013-10-04 US US14/046,224 patent/US9096670B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9096670B2 (en) | Antibodies of the ED-B domain of fibronectin, their construction and uses | |
| JP4773540B2 (ja) | ヒト癌胎児性抗原に対する特異的結合メンバー；材料および方法 | |
| PL199353B1 (pl) | Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało, koniugat zawierający przeciwciało i zastosowanie koniugatu | |
| US7060275B2 (en) | Use of protein biomolecular targets in the treatment and visualization of brain tumors | |
| Borsi et al. | Preparation of phage antibodies to the ED-A domain of human fibronectin | |
| KR100494530B1 (ko) | 피브로넥틴ed-b도메인에대한항체,그제조방법및용도 | |
| MXPA98009732A (en) | Antibodies for the fibronectin ed-b domain, its construction and u |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120523 |