PL199353B1 - Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało, koniugat zawierający przeciwciało i zastosowanie koniugatu - Google Patents
Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało, koniugat zawierający przeciwciało i zastosowanie koniugatuInfo
- Publication number
- PL199353B1 PL199353B1 PL345845A PL34584599A PL199353B1 PL 199353 B1 PL199353 B1 PL 199353B1 PL 345845 A PL345845 A PL 345845A PL 34584599 A PL34584599 A PL 34584599A PL 199353 B1 PL199353 B1 PL 199353B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- angiogenesis
- domain
- conjugate
- Prior art date
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 title description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical group Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 4
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 12
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 abstract description 5
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 58
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 41
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 37
- 102100021206 60S ribosomal protein L19 Human genes 0.000 description 34
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 12
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 10
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 10
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 6
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 229910021627 Tin(IV) chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 5
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- SYRHIZPPCHMRIT-UHFFFAOYSA-N tin(4+) Chemical compound [Sn+4] SYRHIZPPCHMRIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N acepromazine Chemical compound C1=C(C(C)=O)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005054 acepromazine Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 230000000916 dilatatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 2
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 2
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012483 real time interaction analysis Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 2
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b,9,9a-tetrahydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-1,1a,1b,4,4a,7a,7b,8,9,9a-decahydro-5H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-5-one Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(O)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZDHLPDYNVFANT-ZKWXMUAHSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-5,5-bis(sulfanylidene)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@H]2CS(=S)(=S)[C@@H](CCCCC(=O)O)[C@H]21 JZDHLPDYNVFANT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CHFFHQUVXHEGBY-GARJFASQSA-N Ala-Lys-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N CHFFHQUVXHEGBY-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- OTOXOKCIIQLMFH-KZVJFYERSA-N Arg-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OTOXOKCIIQLMFH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)CN=C(N)N PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N Arg-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- MRQQMVZUHXUPEV-IHRRRGAJSA-N Asp-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O MRQQMVZUHXUPEV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241001092081 Carpenteria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 1
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N Gln-Pro-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ININBLZFFVOQIO-JHEQGTHGSA-N Gln-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O ININBLZFFVOQIO-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- MIWJDJAMMKHUAR-ZVZYQTTQSA-N Glu-Trp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N MIWJDJAMMKHUAR-ZVZYQTTQSA-N 0.000 description 1
- YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N Gly-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- NXRNRBOKDBIVKQ-CXTHYWKRSA-N Ile-Tyr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N NXRNRBOKDBIVKQ-CXTHYWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N Iodine-123 Chemical compound [123I] ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KXUZHWXENMYOHC-QEJZJMRPSA-N Phe-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXUZHWXENMYOHC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- ODGNUUUDJONJSC-UFYCRDLUSA-N Phe-Pro-Tyr Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O ODGNUUUDJONJSC-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N Phe-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JDJMFMVVJHLWDP-UNQGMJICSA-N Pro-Thr-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JDJMFMVVJHLWDP-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N Thr-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IJVNLNRVDUTWDD-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N Thr-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N Trp-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PKZIWSHDJYIPRH-JBACZVJFSA-N 0.000 description 1
- MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N Tyr-Cys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 1
- IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N [3-[(2,4-dimethylphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1OP(O)(O)=O IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K amaranth Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C12=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C12 WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- 229960001736 buprenorphine Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical class BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004528 endothelial cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 1
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000001232 limbus corneae Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000000289 malignant teratoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002577 ophthalmoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N phorbol Natural products C[C@@H]1[C@@H](O)[C@]2(O)[C@H]([C@H]3C=C(CO)C[C@@]4(O)[C@H](C=C(C)C4=O)[C@@]13O)C2(C)C QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A sucralfate Chemical compound O[Al](O)OS(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H]1O[C@@]1(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)O1 MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A 0.000 description 1
- 229960004291 sucralfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011806 swiss nude mouse Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 tungsten halogen Chemical class 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
- A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy przeciwcia l o subnanomolarnym powinowactwie specyficznym dla charakte- rystycznego epitopu ED-B domeny fibronektyny, znacznika angiogenezy. Dotyczy on tak ze zastoso- wania znakowanych radioaktywnie przeciwcia l anty-ED-B o wysokim powinowactwie do wykrywania nowo tworz acych si e naczy n krwiono snych in vivo oraz zestawu diagnostycznego zawieraj acego wy- mienione przeciwcia lo. Wynalazek dotyczy tak ze koniugatów zawieraj acych takie przeciwcia la i odpo- wiednich fotoaktywnych cz asteczek (np. odpowiednio wybranego fotosensybilizatora) oraz ich zasto- sowania do wykrywania i/lub, koagulacji nowych naczy n krwiono snych. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy przeciwciał o subnanomolarnym (mniejszym niż 1 nM) specyficznym powinowactwie dla charakterystycznego epitopu Ekstra Domeny B (ED-B) fibronektyny (FN) będącego znacznikiem (markerem) angiogenezy. Ponadto, wynalazek dotyczy także zastosowania przeciwciał anty-ED-B o wysokim powinowactwie do wykrywania in vivo nowo tworzących się naczyń krwionośnych oraz zestawu diagnostycznego zawierającego wymienione przeciwciało. Wynalazek dotyczy również koniugatów zawierających wyżej wymienione przeciwciała z odpowiednią wzbudzaną światłem cząsteczką (np. fotouczulaczem) oraz ich zastosowania do wykrywania i/lub koagulacji nowopowstających naczyń krwionośnych.
Powszechnie wiadomo, że guzy nie mogą rosnąć powyżej pewnej masy bez wytworzenia nowych naczyń krwionośnych (angiogenezy), a korelację pomiędzy gęstością mikronaczyń a inwazyjnością guza obserwuje się dla wielu guzów (Folkman, Nature Med., (1995) 1, 27-31). Ponadto zaburzenia w angiogenezie leżą u podstaw większości zaburzeń w widzeniu, których konsekwencją może być utrata wzroku [Lee i inni, Surv. Ophthalmol. (1998), 43, 245-269; Friedlander. M. i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1996), 93, 9764-9769]. Cząsteczki zdolne do selektywnego rozpoznania znacznika angiogenezy mają potencjał, aby być wykorzystane w badaniach klinicznych, dając możliwości diagnozowania i terapii nowotworów oraz innych chorób charakteryzujących się proliferacją naczyniową, takich jak retinopatia cukrzycowa oraz związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Znaczniki angiogenezy są także eksprymowane w większości agresywnych guzów litych i powinny być łatwo dostępne dla wstrzykiwanych dożylnie specyficznych cząsteczek je wiążących (Pasaualini i inni, Nature Biotechnol., (1997), 15, 542-546; Neri i inni, Nature Biotechnol., (1997), 15 1271-1275). Ukierunkowane zamknięcie nowopowstających naczyń krwionośnych może spowodować niedokrwienie guza i w konsekwencji jego obumarcie (O'Reilly i inni,. Nature Med., (1996), 2, 689-692; Huang i inni,. Science, (1997), 275, 547-550).
Powstająca w wyniku alternatywnego składania transkryptu genu fibronektyny (ang. splicing czyli składanie mRNA) wysoce konserwowana sekwencja kodująca fragment o długości 91 aminokwasów (identyczny u myszy, szczurów i ludzi) tworzy tzw. domenę ED-B fibronektyny (ang. Extra Domain, dodatkowa domena FN). Fibronektyna z domeną ED-B specyficznie nagromadza się wokół struktur neounaczynienia (Castellani i inni, Int. J. Cancer, (1994), 59, 612-618), co może być wykorzystane do diagnostyki na poziomie molekularnym. W naszych pracach przy użyciu technik fluorescencyjnych wykazaliśmy, że jednołańcuchowe fragmenty przeciwciał Fv(scFv) przeciwko domenie ED-B fibronektyny (antygen ED-B) nagromadzają się specyficznie w naczyniach krwionośnych guza u myszy z różnymi nowotworami oraz że stopień powinowactwa tych przeciwciał do badanego antygenu wpływa na wydajność ich skierowanie do guza (Neri i inni, Nature Biotechnol., 15 1271-1275 (1997); międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/GB97/01412, oparte na GB96/10967.3). Poziom ilości skierowanych przeciwciał do guzów oceniano w 24 godziny po wstrzyknięciu lub w późniejszych punktach czasowych.
W dziedzinie wynalazku znane są róż ne podejścia do wytworzenia przeciwciał przeciwko domenie ED-B w celu zastosowania ich do specyficznego zlokalizowania guzów.
Peters i inni (Cell Adhesion and Communication 1995, 3: 67-89) opisali przeciwciała poliklonalne wytworzone przeciwko antygenom niezawierającym innej sekwencji FN niż nienaruszona domena ED-B i wykazali, że wiążą się one specyficznie i bezpośrednio z tą domeną. Jednak poliklonalne przeciwciała używane przez Petersa i współpracowników miały kilka wad. A mianowicie, surowica rozpoznawała ED-B(+)-FN, która wcześniej była deglikozylowana N-glikanazą. To czyni te odczynniki nieodpowiednimi do zastosowań in vivo w celu skierowania ich do guzów, obrazowania zmian i terapii. Ponadto, autorzy sami przyznają, że wyprodukowane przez nich przeciwciała nie rozpoznają pełnej długości ED-B(+)-FN wytwarzanej przez komórki ssacze oraz że nie udało im się wyprodukować przeciwciał monoklonalnych specyficznych przeciwko domenie ED-B fibronektyny, nawet gdy jednocześnie były wytwarzane przeciwciała przeciwko innym domenom fibronektyny (takim jak ED-A).
Ogólnie wiadomo w dziedzinie wynalazku, że surowice poliklonalne są niedopuszczalne do powyżej wspomnianych zastosowań. Nawet po latach intensywnych badań nad tym zagadnieniem wiadomo, że przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają domenę ED-B fibronektyny bez uprzedniego jej traktowania N-glikanazą mogą być wytworzone tylko przy pomocy technik prezentacji fagowej, co zastosowano w niniejszym wynalazku.
PL 199 353 B1
Zang i inni (Matrix Biology 1994, 14: 623-633) ujawnili surowicę poliklonalną przeciw psiej domenie ED-B. Autorzy oczekując, że będzie ona wykazywała reaktywność krzyżową z ludzką ED-B(+)-FN nie zbadali tego. Jednakże autorzy przyznali, że mieli trudności z wyprodukowaniem monoklonalnych przeciwciał bezpośrednio rozpoznających domenę ED-B fibronektyny (strona 631). Używana przez nich w analizie Western blot surowica odpornościowa rozpoznawała ED-B(+)-FN dopiero po zadziałaniu na antygen N-glikanazą.
Tak jak wspomniano powyżej, działanie glikanazą czyni te przeciwciała nieodpowiednimi do zastosowań według autorów wynalazku. Natomiast rozpoznanie ED-B(+)-FN przez wyprodukowaną surowicę w teście ELISA zachodziło bez potrzeby wcześniejszej deglikozylacji antygenu, ale tylko na chrząstce wyekstrahowanej środkiem denaturującym (4M mocznik) i wiążącej się do żelatyny opłaszczającej płytki. Autorzy komentują, że „wiązanie cząsteczki fibronektyny (FN) do żelatyny związanej na powierzchni plastiku płytek ELISA może w jakiś sposób wyeksponować epitopy w sposób wystarczający do rozpoznania przez surowicę odpornościową”.
Ze względu na to, że FN nie może być zdenaturowana in vivo, wyżej wymieniona technika jej wykrywania nie może być używana na potrzeby tego wynalazku.
Z japoń skich patentów JP02076598 i JP04169195 dotyczą cych przeciwciał anty-ED-B nie wynika jasno czy opisane są w nich monoklonalne przeciwciała anty-ED-B, ponieważ nie wydaje się możliwe, aby pojedyncze przeciwciało (takie jak przeciwciało opisane w JP02076598) miało „determinantę antygenową” w sekwencji aminokwasowej o wzorze (1), (2) lub (3):
- (1) EGIPIFEDFVDSSVGY
- (2) YTYTGLEPGIDYDIS
- (3) NGGESAPTTLTQQT
Przypuszczenia te oparte są na podstawie następujących dowodów:
i) przeciwciało monoklonalne powinno rozpoznawać dobrze zdefiniowany epitop;
ii) trójwymiarową strukturę domeny ED-B fibronektyny wyznaczono przy pomocy spektroskopii
NMR, a segmenty (1), (2) i (3) leżą na przeciwległych powierzchniach struktury ED-B i nie mogą być jednocześnie wiązane przez przeciwciało monoklonalne.
Ponadto w celu zademonstrowania przydatności przeciwciał przeciwko ED-B(+)-FN do diagnostyki in vivo powinna być pokazana ich lokalizacja w guzach, a jako dowód ich wybarwienie w próbkach biologicznych bez działania odczynnikami zaburzającymi strukturę antygenu.
Przeciwciało BC1 opisane przez Carnemolla i innych, 1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692, rozpoznaje epitop na domenie 7 fibronektyny, ale nie na domenie ED-B. Domena 7 jest schowana w obecności domeny ED-B, co jest ściś le specyficzne dla ludzkiej fibronektyny. Ponadto przeciwciało BC1 oraz przeciwciała według wynalazku wykazują inną reaktywność. Przeciwciało BC1 rozpoznaje samą domenę 7 oraz domenę 7-8 fibronektyny przy braku domeny ED-B (Carnemolla i inni, 1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692). Takie epitopy mogą być wytwarzane in vivo tylko przez proteolityczną degradację cząsteczek FN.
O przydatności w badaniach in vivo przeciwciał przedstawianych przez autorów wynalazku świadczy fakt, że mogą one przyłączyć się do cząsteczek lub fragmentów FN zawierających domenę ED-B, bez konieczności wcześniejszej modyfikacji fibronektyny.
Jedną z technik wybieranych do diagnozy nowotworów, lub do obrazowania pierwotnych i wtórnych zmian nowotworowych, jest scyntygrafia. W tej metodzie pacjentów, którym podano zastrzyk ze związkiem znakowanym radioaktywnie (np. radioizotopu połączonego z odpowiednim podłożem) poddaje się obrazowaniu używając do tego odpowiedniego sprzętu (np. komory scyntylacyjnej zwanej również gammakamerą). W celu zminimalizowania ekspozycji pacjenta na promieniowanie jonizujące do zastosowań scyntygraficznych zazwyczaj stosuje się krótkotrwałe emitery promieniowania gamma, takie jak metastabilny technet-99m, jod-123 lub ind-111.
Najczęściej stosowanym radioizotopem w zakładach medycyny nuklearnej jest technet-99m (99mTc), emitujący promieniowanie gamma o krótkim okresie połowicznego rozpadu wynoszącym 6 godzin. Pacjentów, którym podano radiofarmaceutyki oparte na 99mTc moż na zazwyczaj obrazować w 12-24 godzin po podaniu, chociaż wymagane jest monitorowanie nagromadzania izotopu w badanej zmianie we wcze ś niejszych punktach czasowych.
W związku z powyższym zasadne wydaje się stwierdzenie, że gdyby przeciwciała zdolne do szybkiej i selektywnej lokalizacji nowotworzonych naczyń krwionośnych były dostępne dla badaczy i klinicystów, to fakt ten zachęciłby ich do dalszych poszukiwań w celach diagnostycznych i/lub terapeutycznych odpowiednich cząsteczek tworzących koniugaty z takimi przeciwciałami.
PL 199 353 B1
W związku z potrzebami istnieją cymi w medycynie nuklearnej znalezienie radiofarmaceutyków zdolnych do specyficznej lokalizacji w zmianach nowotworowych już w kilka godzin po ich podaniu, oraz biorąc pod uwagę fakt, że powinowactwo przeciwciał do antygenu wpływa na ich zdolność do ukierunkowanego łączenia się z nowopowstającymi naczyniami krwionośnymi, przedmiotem wynalazku jest wytworzenie przeciwciał specyficznych dla domeny ED-B fibronektyny o subnanomolarnej stałej dysocjacji (artykuł przeglądowy z definicjami i pomiarami powinowactwa przciwciało-antygen - Neri i inni, (1996), Trends in Biotechnol. 14, 465-470). Dalszym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie znakowanych radioaktywnie przeciwciał skierowanych bezpośrednio przeciwko domenie ED-B fibronektyny i wykrywających zmiany nowotworowe już w kilka godzin po podaniu.
Niniejszy wynalazek cele te pozwala osiągnąć poprzez przeciwciało o ulepszonym specyficznym powinowactwie do charakterystycznego epitopuria domenie ED-B fibronektyny.
Kolejnym aspektem wynalazku jest zastosowanie wyżej pisanego przeciwciała do szybkiej lokalizacji znacznika angiogenezy.
Inną przedstawioną w tym wynalazku nowością jest zestaw diagnostyczny zawierający wymienione przeciwciało oraz jeden lub więcej odczynników do wykrywania angiogenezy.
Kolejnym rozwiązaniem według wynalazku jest zastosowanie wymienionego przeciwciała do diagnozowania oraz terapii nowotworów i chorób charakteryzujących się proliferacją naczyniową.
Ostatecznym i ważnym rozwiązaniem według wynalazku są koniugaty zawierające wymienione przeciwciało oraz odpowiednie cząsteczki fotoaktywne (np. dobrze wybrany fotouczulacz) oraz ich zastosowanie do selektywnego, indukowanego światłem zamknięcia nowych naczyń krwionośnych.
W zgłoszeniu zastosowano kilka wyrażeń technicznych, do których stosują się następujące definicje:
- przeciwciało
Opisuje on immunoglobulinę, czyli cząstkę zdolną do swoistego łączenia się z antygenem. Termin ten odnosi się także do innych polipeptydów lub białek posiadających domenę wiążącą, która nie musi, ale może być homologiczna do domeny wiążącej występującej w immunoglobulinie. Zarówno immunoglobuliny, białka i peptydy mogą pochodzić ze źródeł naturalnych lub być wytwarzane częściowo lub całkowicie syntetycznie. Przykładami przeciwciał są izotopy immunoglobulinowe oraz ich podklasy izotypowe; fragmenty zawierające domenę wiążącą antygen, takie jak Fab, scFv, Fv, dAb, Fd a także nieposiadające jeszcze polskiego nazewnictwa „diabodies”, które są dwuczłonowymi małymi fragmentami specyficznych przeciwciał. Możliwe jest przetworzenie przeciwciał monoklonalnych i innych przy pomocy technik rekombinacji DNA w celu wytworzenia nowych przeciwciał lub chimerycznych cząsteczek, które zachowają specyficzność oryginalnych przeciwciał. Takie techniki mogą obejmować wprowadzenie DNA kodującego zmienny (V) region immunoglobuliny lub regiony determinujące dopasowanie (CDR) przeciwciała do stałych regionów lub stałych regionów połączonych z regionami zrę bowymi innej immunoglobuliny (patrz, np. EP-A-184187, GB 2188638A lub EP-A-239400). Hybrydoma lub inna komórka wytwarzająca przeciwciało może ulegać mutacjom genetycznym lub innym zmianom, które mogą wpływać lub nie na specyficzność wiązania przeciwciałoantygen. Ze względu na to, że przeciwciała można modyfikować na wiele różnych sposobów, termin „przeciwciało” powinien obejmować również inne białka uczestniczące w wiązaniu lub cząstkę posiadające domenę wiążącą o wymaganej specyficzności. Zatem termin obejmuje również fragmenty przeciwciał, pochodne, ekwiwalenty funkcjonalne oraz homologi przeciwciał, włącznie z jakimkolwiek polipeptydem zawierającym domenę wiążącą immunoglobuliny, naturalną bądź całkowicie lub częściowo syntetyczną. Terminem „przeciwciało” objęte są też cząsteczki chimeryczne zawierające domenę wiążącą immunoglobuliny, lub jej ekwiwalent zfuzjowany z fragmentem immunoglobuliny pochodzącej z innego organizmu. Klonowanie i nadprodukcję przeciwciał chimerycznych opisano w patentach EP-A-0120694 i EP-A-0125023, w których wykazano, ż e fragmenty cał ego przeciwciał a mogą wykazywać właściwości wiązania antygenu. Takimi przykładami są: (i) fragment Fab składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iii) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczych przeciwciał; (iv) fragment dAb (Ward i inni, (1989) Naturę. 9, 341, 544-546) zawierający domenę VH; (v) wyizolowane regiony CDR; (vi) fragmenty F(ab')2, dwuskładnikowy fragment zawierający dwa połączone fragmenty Fab; (vii) pojedynczy łańcuch cząsteczek Fv (scFv), gdzie domena VH i domena VL są połączone przez polipeptyd łącznikowy, który umożliwia łączenie się dwóch domen i tworzenie miejsca wiążącego antygen (Bird i inni, (1988) Science, 242, 423-426.; Hustonet i inni, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85. 5879-83); (viii) dimery pojedynczego łańcucha FV o podwójnej specyficzności (PCT/US92/09965) oraz (ix) „diabodies”, czyli dwuskładnikowe i dwuspecyficzne fragmenty powstałe w wyniku fuzji genów (W094/13804; Holliger
PL 199 353 B1 i inni, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6444-6448). „Diabodies” są dimerami polipeptydów zbudowanych jeden z regionu wiążącego łańcucha lekkiego (VL) immunoglobuliny, a drugi z regionu łańcucha ciężkiego (VH). Domeny te są połączone ze sobą przez krótki łącznik peptydowy, który uniemożliwia parowanie łańcuchów tej samej cząsteczki, ale promuje tworzenie wiązania z komplementarnym łańcuchem innej cząsteczki tworząc w ten sposób dimer o dwóch funkcjonalnych miejscach łączących ten sam lub różne antygeny (W094/13804). Dwuspecyficzne (dispecyficzne) przeciwciała można wytwarzać na wiele różnych sposobów, np. chemicznie z hybryd hybrydomowych lub z każdym z wyżej wymienionych fragmentów przeciwciała (Holliger i Winter (1993), Curr. Opin. Biotech., 4, 446-449). Wydaje się, że stosowanie dimerów scFv lub „diabodies” jest bardziej korzystne z punktu widzenia ich dalszego wykorzystania.
„Diabodies” i scFv można skonstruować bez regionu Fc, stosując tylko domeny zmienne, co potencjalnie zmniejsza działanie reakcji anty-idiotypowej. Inne formy przeciwciał bispecyficznych obejmują jedno-łańcuchowe CRAb opisane w Neri i inni, ((1995) J. Mol. Biol.. 246, 367-373).
- regiony determinują ce dopasowanie
Regiony determinujące dopasowanie (CDR) domen zmiennych przeciwciał zidentyfikowano jako kiper zmienne sekwencje przeciwciał zawierające podstawniki odgrywające zasadnicza rolę w specyficznym rozpoznawaniu antygenu. W tym dokumencie odniesiono się do definicji CDR i numeracji według Chothia i Lesk (1987), J. Mol. Biol., 196. 901-917.
- funkcjonalnie równoważ ne formy odmian
Odnosi się to do cząsteczki (odmiany), która pomimo posiadania różnic strukturalnych względem cząsteczki rodzicielskiej zachowuje pewną znaczącą homologię, a także przynajmniej część funkcji biologicznych cząsteczki rodzicielskiej, np. zdolność do wiązania konkretnego antygenu lub epitopu. Odmiany mogą być w formie fragmentów, pochodnych lub mutantów, które można wytworzyć na drodze modyfikacji cząsteczki rodzicielskiej przez wstawienie, wydeletowanie (odjęcie) lub zamianę jednego lub więcej aminokwasów, a także przez połączenie z inną cząsteczką. Zmiany te można wykonywać na poziomie DNA lub białka. W związku z takimi modyfikacjami kodowany polipeptyd może być fragmentem Fab, który może łączyć się z ogonem Fc z innego źródła i dodatkowo może posiadać dołączony znacznik (enzym, fluoresceina, itd.). Funkcjonalne równoważna odmiana formy przeciwciała „A” przeciwko charakterystycznemu epitopowi domeny ED-B fibronektyny może być przeciwciałem „B” o innej sekwencji regionów determinujących dopasowanie, ale rozpoznające ten sam epitop co przeciwciało „A”.
Autorzy wynalazku wyizolowali rekombinowane przeciwciała w formie odmiany scFv z fagowej biblioteki prezentującej przeciwciała specyficzne dla domeny ED-B fibronektyny i rozpoznające ED-B(+)-fibronektynę w skrawkach tkanek. Jedno z tych przeciwciał E1 udoskonalano zwiększając jego powinowactwo do antygenu. W ten sposób wytworzono kolejne odmiany przeciwciał - H10 i L19, specyficznych do domeny ED-B fibronektyny o zwiększonym do niej powinowactwie niż przeciwciało rodzicielskie. Przeciwciało L19 ma stałą dysocjacji dla domeny ED-B fibronektyny w zakresie stężeń subnanomolarnych.
Przeciwciała o wysokim powinowactwie L19 (do badanego antygenu) i D1.3 (przeciwciało specyficzne dla lizozymu z jaja kurzego będącego kontrolą negatywną) znakowano radioaktywnie i wstrzyknię to myszom z rozwinię tymi nowotworami. Lokalizację (biodystrybucję) w guzie, krwi i organach oznaczano w różnych punktach czasowych i wyrażano jak procent podanej dawki na gram tkanki (%ID/g). Już po 3 godzinach po podaniu %ID/g (w guzie) był wyższy niż %ID/g (we krwi) dla L19, ale nie dla negatywnej kontroli D1. 3. Stosunek guz: krew wzrastał w kolejnych punktach czasowych. Sugeruje to, że wysokie powinowactwo przeciwciał L19 do domeny ED-B fibronektyny może znaleźć zastosowanie w immunoscyntygraficznego wykrywania angiogenezy.
- fotouczulacz
Fotouczulacz można zdefiniować jako cząsteczkę, która po naświetleniu w obecności wody i/lub tlenu tworzy toksyczne cząsteczki (np. tlen singletowy) zdolne do reagowania z biocząsteczkami, wywołując przez to potencjalne uszkodzenia w komórkach, tkankach i płynach ustrojowych. Fotouczulacze są szczególnie użyteczne, gdy absorbują przy długościach fali powyżej 600 nm, ponieważ przenikanie światła do tkanek i płynów ustrojowych jest maksymalne w zakresie 600-900 nm [Wan i inni, (1981) Photochem. Photobiol. 34, 679-681). Ukierunkowane dostarczanie fotouczulaczy do zmienionych chorobowo tkanek, a następnie naświetlanie w celu wywołania specyficznego uszkodzenia tkanki może być atrakcyjnym rozwiązaniem w terapii chorób związanych z angiogenezą w szczególności do usunięcia neounaczynienia gałki ocznej [Yarmush, M.L. i inni, Antibody targeted photolysis. Crit.
PL 199 353 B1
Rev. Therap. Drug Carrier Systems 10, 197-252 (1993); Rowe, P.M. Lancet 351, 1496 (1998); Levy, J. Trends Biotechnol. 13. 14-18 (1995)). Dostępne metody terapeutyczne, takie jak bezpośrednia lub po podaniu środków fotouczulających laserowa fotokoagulacja są ograniczone przez brak selektywności i zazwyczaj powodują uszkodzenie zdrowych tkanek i naczyń [Macular Photocoagulation Study Group, Arch. Ophtalm. 112, 480-488 (1994); Haimovici, R. i inni, Curr. Eye Res. 16, 83-90 (1997); Schmidt-Erfurth. U. i inni, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 236, 365-374 (1998)].
Na podstawie podanych wyżej argumentów można stwierdzić, że niezwykle ważne jest odkrycie metod ulepszających selektywność i specyficzność fotouczulaczy. Można tego dokonać łącząc je z odpowiednią cząsteczką nośnikową. Również moż liwe jest, że opracowanie cząsteczek noś nikowych dobrej jakości nie będzie łatwym zadaniem i, że nie wszystkie fotouczulacze będą mogły być przenoszone przez te cząstki do konkretnego miejsca w warunkach in vivo. Czynniki fizyczne takie jak struktura chemiczna, rozpuszczalność, lipofilność, lepkość oraz siła fotouczulacza mogą znacząco wpływać na docieranie do celu i skuteczność koniugatów zawierających fotouczulacz.
W wynalazku wykazano, że po podaniu ogólnoustrojowym specyficzne przeciwciało L19 o dużym powinowactwie do domeny ED-B fibronektyny selektywnie lokalizuje się w nowotworzonych naczyniach krwionośnych w króliczym modelu angiogenezy ocznej (badania in vivo). Przeciwciało L19 chemicznie sprzężone ze środkiem fotouczulającym chlorkiem cyny (IV) eg i naświetlane czerwonym światłem pośredniczy w selektywnym zamknięciu neounaczynienia ocznego i wywołuje apoptozę odpowiednich komórek śródbłonka. Wyniki te pokazują, że nowe naczynia krwionośne w oku mogą być in vivo immunochemicznie odróżnione od wcześniej istniejących i wyraźnie sugerują, że ukierunkowane dostarczanie fotouczulacza, a następnie naświetlanie może być skuteczne w leczeniu postępującej ślepoty oraz prawdopodobnie innych patologii związanych z angiogenezą.
Istotą wynalazku jest wyizolowane przeciwciało o specyficznym powinowactwie do charakterystycznego epitopu Ekstra Domeny B fibronektyny, gdzie wspomniane przeciwciało ma subnanomolarne powinowactwo do wymienionego epitopu Ekstra Domeny B i rozpoznaje Ekstra Domenę B (+) fibronektyny.
Korzystnie przeciwciało wiąże domenę ED-B fibronektyny ze stałą dysocjacji Kd = 5,4 pM.
Korzystnie przeciwciało posiada ciężki łańcuch zmiennej domeny VH o sekwencji opisanej w SEQ ID NO. 19.
Korzystnie przeciwciało posiada następującą sekwencję aminokwasową:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
ISGSSGTTYY ADSYKGRFTI SRDNSKNTLY LQJNSLRAED TAVYYCAKPF
PYFDYWGQGT LVTVSS GDGSSGGSGGAS EIVLTQSPGT LSLSPGERAT
LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGT
DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK
Korzystnie przeciwciało jest funkcjonalną odmianą L19 z sekwencją opisaną w SEQ ID NO. 19, 20, 21.
Korzystnie przeciwciało jest jednołańcuchową formą przeciwciała złożoną ze zmiennych części (scFv).
Korzystnie przeciwciało jest jedną cząsteczką, która cała jest przeciwciałem.
Korzystnie przeciwciało jest radioaktywnie wyznakowane.
Korzystnie przeciwciało jest wyznakowane radioaktywnym jodem.
Przeciwciało według wynalazku jest przeznaczone do zastosowania do szybkiej lokalizacji znacznika angiogenezy.
Korzystne przeciwciało stosuje się do immunoscyntygraficznego wykrywania angiogenezy.
Korzystnie przeciwciało stosuje się do detekcji chorób charakteryzujących się proliferacją naczyń krwionośnych, w chorobach takich jak retinopatia cukrzycowa, związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej lub nowotwory.
Istotą wynalazku jest także zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało według wynalazku oraz jeden lub więcej odczynników niezbędnych do wykrywania angiogenezy.
Istotą wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania środka do diagnostyki nowotworów i chorób związanych z proliferacją naczyń krwionośnych oraz do terapii chorób nowotworowych i chorób związanych z proliferacją naczyń krwionośnych.
Kolejnym rozwiązaniem według wynalazku są koniugaty zawierające przeciwciało według wynalazku oraz cząsteczkę zdolną do wywoływania koagulacji krwi i zamknięcia naczynia krwionośnego.
Korzystnie cząsteczka zdolna do wywołania koagulacji krwi i zamknięcia naczynia krwionośnego jest cząsteczką fotoaktywną, najkorzystniej jest fotouczulaczem.
PL 199 353 B1
Korzystnie cząsteczka fotoaktywną jest fotouczulaczem absorbującym przy długości fali ponad 600 nm.
Najkorzystniej fotouczulacz jest pochodną chlorku cyny (IV) e6.
Wynalazek obejmuje również zastosowanie koniugatu w leczeniu ludzkich i zwierzęcych nowotworów i chorób związanych z proliferacją naczyń krwionośnych.
Korzystnie koniugat stosuje się, jako składnik do iniekcji w leczeniu patologii związanych z angiogenezą.
Korzystnie koniugat stosuje się do leczenia patologii związanych z proliferacją naczyń krwionośnych wywołanych lub towarzyszących angiogenezie ocznej.
Rozwiązanie według wynalazku zilustrowano na rysunku, na którym:
figura 1 przedstawia sposób projektowania fagowej biblioteki przeciwciał;
figura 2 przedstawia elektroforezę dwukierunkową (2D) białek lizatu ludzkich komórek czerniaka
COLO-38 i analizę rozwiniętego żelu metodą Western błot; figura 3A, 3B, 3C przedstawiają analizę immunohistochemiczną glejaka wielopostaciowego; figura 4 przedstawia analizę stabilności kompleksów przeciwciało-(ED-B) figura 5 przedstawia rozmieszczenie znakowanych radioaktywnie fragmentów przeciwciał w guzie i we krwi u myszy z rozwiniętymi nowotworami;
figura 6 przedstawia sekwencję aminokwasową L19;
figura 7A i 7B przedstawiają oczy królika z wszczepionymi tabletkami;
figura 8 przedstawia analizę immunohistochemiczną skrawków króliczej rogówki;
figura 9 przedstawia analizę immunohistochemiczną skrawków struktur oka królików (rogówki, tęczówki i spojówki) przy pomocy czerwonego substratu fosfatazy alkalicznej i hematoksyliny. figura 10 przedstawia umiejscowienie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał w neounaczynieniu gałki ocznej.
figura 11 przedstawia makroskopowy wygląd oczu królików, przed i po naświetlaniu, którym wcześniej podano białka sprzężone z fotouczulaczem.
figura 12 przedstawia analizę mikroskopową skrawków struktur ocznych królików, którym podano białka sprzężone z fotouczulaczem i naświetlano światłem czerwonym.
Zaprojektowanie fagowej biblioteki przeciwciał zgodnie z fig. 1.
(A) Fragmenty przeciwciał są prezentowane na fagu jako fuzja pIII, co przedstawiono schematycznie. W miejscu wiązania przeciwciała (z punktu widzenia antygenu), szkielet Vk CDR jest przedstawiony na żółto, szkielet VH CDR jest przedstawiony na niebiesko. Podstawniki poddane losowym mutacjom są w Vk CDR3 w pozycjach 91, 93, 94 i 96 (żółte), i w VH CDR3 w pozycjach 95, 96, 97, i 98 (niebieskie). Atomy Cb tych łańcuchów bocznych przedstawiono w ciemniejszych kolorach. Przedstawiono także (szary) podstawniki w CDR1 i CDR2, które mogą być zmutowane w celu polepszenia powinowactwa przeciwciał.
Strukturę scFv wymodelowano z pliku pdb ligm (Brookhaven Protein Data Bank; http://www2.ebi.ac.uk/pcserv/pdbdb.htm) przy pomocy programu RasMol (http://www.chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html).
(B) Namnożenie DNA metodą PGR i strategia klonowania do biblioteki. Matryce DP47 i DPK22 z linii rozrodczej zmodyfikowano (patrz tekst) w celu wytworzenia mutacji w regionach CDR3. Geny oznaczono w postaci prostokątów, a CDR tak jak ponumerowane kratki w prostokątach. Następnie segmenty VH i VL złożono i wklonowano do wektora fagemidowego pDN332. Startery (od SEQ. ID. NO. 11 do SEQ. ID. NO. 18) zastosowane do amplifikacji i złożenia produktów PGR wymieniono poniżej.
figura 2 przedstawia:
Żel 2D i analizę Western blot.
(A) Barwienie srebrem rozdzielonych metodą 2D-PAGE białek z lizatu ludzkich komórek czerniaka COLO-38, do których dodano rekombinowane białko 7B89 zawierające domenę ED-B. Dwie plamki 7B89 (zakreślone) są wynikiem częściowej proteolizy znacznika His (His-tag) zastosowanego do oczyszczania białka.
(B) Analiza immunologiczna żelu (Western błot) identycznego jak przedstawiony na fig. 2A z uż yciem przeciwciał El anty-ED-B (tabela 1) i M2 anty-FLAG. Tylko plamki 7B89 s ą wykrywane, co potwierdza specyficzność zrekombinowanego przeciwciała.
figura 3A-3C przedstawiają:
Immunohistochemiczną analizę w kolejnych skrawkach glejaka wielopostaciowego wykazującego typowe kłębkowo-podobne struktury wybarwione przy pomocy scFvs El (A), A2 (B) i G4
PL 199 353 B1 (C) Słupki skali: 20 μηι.
figura 4 przedstawia:
Analizę stabilności wiązania -scFvs El, H10 i L19 z domeną ED-B fibroriektyny.
(A) Sensogramy BIAcore przedstawiające ulepszone profile dysocjacji uzyskane po dojrzewaniu powinowactwa przeciwciał do antygenu.
(B) Elektroforetyczna analiza kompleksów scFv-(ED-B) w natywnym żelu. Tylko przeciwciało L19 o wysokim powinowactwie może utworzyć stabilny kompleks ze znakowanym fluorescencyjnie antygenem. Detekcję fluorescencji wykonano w opisany wcześniej sposób (Neri i inni, (1996) BioTechnigues. 20,708-712).
(C) Kompetycja kompleksu scFv-(ED-B-biotyna) ze 100-molarnym nadmiarem niebiotynylowanej ED-B monitorowana przy pomocy eletrochemiluminescencji przy pomocy aparatu Origen. Można zaobserwować długi okres półrozpadu kompleksu L19-(ED-B). Czarne kwadraty: Li9; białe trójkąty: H10.
figura 5 przedstawia:
Rozmieszczenie znakowanych radioaktywnie przeciwciał w ciele myszy z rozwiniętymi nowotworami. Biodystrybucję w guzie i we krwi wyrażoną w procentach podanej dawki na gram wykreślono względem czasu. Przedstawiono także biodystrybucję w odpowiednich organach.
figura 6 przedstawia:
Sekwencję aminokwasową przeciwciała L19 zawierającego łańcuch ciężki (VH), łącznik oraz łańcuch lekki (VL).
figura 7A i 7B przedstawiają:
Oczy królików z wszczepionymi polimerowymi tabletkami nasączonymi substancjami angiogennymi. figura 8 przedstawia:
Analizę immunohistochemiczną skrawków króliczej rogówki z nowopowstającymi naczyniami krwionośnymi, wybarwione przeciwciałem L19.
figura 9 przedstawia:
Badania immunohistochemiczne skrawków struktur ocznych przy pomocy przeciwciała L19. Specyficzne barwienie na czerwono obserwowano wokół struktur neounaczynienia w rogówce (a), ale nie wokół naczyń tęczówki (b) i nie w spojówce (c). Małe strzałki: nabłonek rogówki. Odpowiednie naczynia krwionośne wskazano przy pomocy dużych strzałek. Słupki skali: 50 μm. figura 10 przedstawia:
Immunofotodetekcję znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał skierowanych przeciwko angiogenezie zachodzącej w gałce ocznej. Silnie fluorescencyjne neounaczynienie rogówki (wskazane przez strzałkę) obserwowano u królików, którym podano koniugat L L19-Cy5 specyficzny dla domeny ED-B fibronektyny (a), ale nie po podaniu przeciwciała HyHEL-10-Cy5 (b). Mikroskopia immunofluorescencyjna skrawków rogówki potwierdziła, że L19-Cy5 (c), ale nie HyHEL-10-Cy5 (d), umieszcza się wokół struktur neounaczynienia w rogówce. Obrazy (a, b) wykonano w 8 godzin po podaniu przeciwciała; (c, d) wykonano ze skrawków rogówki wyizolowanych z królików w 24 godziny po podaniu przeciwciała. P, tabletka.
figura 11 przedstawia:
Obraz makroskopowy oczu królików poddanych działaniu koniugatów z fotouczulaczem. Oko królika, któremu podano L19-PS przed (a) i po 16 godzinach od naświetlania czerwonym światłem (b). Strzałka wskazuje skoagulowane neounaczynienie, co potwierdzono przez hipofluorescencyjny region w Cy5 fluoroangiogramie 16 godzin po naświetlaniu (c). Należy zauważyć, że nie obserwowano żadnej koagulacji w strukturach naczyń, np. w rozszerzających się naczyniach spojówki. Dla porównania przedstawiono Cy5 fluoroangiogram z hiperfluorescencją przeciekających naczyń (d) oraz odpowiednio kolorowe zdjęcie nietraktowanego żadnym czynnikiem oka królika (h). Ryciny (e, g, f) są analogiczne do (a, b, c) i przedstawiają oczy królika, któremu podano albuminę jaja kurzego-PS i naświetlano czerwonym światłem. Nie zaobserwowano koagulacji i angiogram pokazuje hiperfluorescencję przeciekających naczyń. Oczy królików, którym podano L19-PS we wczesnej fazie angiogenezy przedstawiono w (i-l). Obrazy przed (i) i po 16 godzinach od naświetlania czerwonym światłem (j) wykazały rozległą i selektywną koagulację wywołaną światłem (strzałka). Zamknięcie naczyń (strzałka) następuje w naświetlonym oku królika zaraz po anestezjologicznym uśpieniu (1), ale nie może być wykryte w oku tego samego królika, które nie było naświetlane (k). P, tabletka. Groty strzałek wskazują połączenie rogówkowo-twardówkowe (obwódka). Na wszystkich rycinach istniejące wcześniej rozszerzające się naczynia spojówkowe są widoczne powyżej obwódki, podczas gdy wzrost neounaczynienia rogówki można obserwować od obwódki w kierunku tabletki (P).
PL 199 353 B1 figura 12 przedstawia:
Analizę mikroskopową selektywnego zamknięcia naczyń krwionośnych. Skrawki H/E rogówki (a, e, b, f: nieutrwalone; i, j: utrwalone paraformaldehydem) królików, którym podawano albuminę jaja kurzego-PS (a, e, i) lub L19-PS (b, f, j) a następnie naświetlano. Duże strzałki wskazują reprezentatywne nieuszkodzone (e, i) lub całkowicie zamknięte (f, j) naczynia krwionośne. W odróżnieniu od selektywnie zamykanego neounaczynienia rogówki i ograniczonego uszkodzenia okołounaczynienia (eozynofilia) wywołanych przez L19-PS po naświetlaniu (b, f, j), naczynia w spojówce (k) i tęczówce (1) nie wykazywały znaków uszkodzenia u tego samego królika. Fluorescencyjny test TUNEL wykazał różną liczbę komórek apoptotycznych w skrawkach gałek ocznych naświetlanych królików, którym podano L19-PS (c, g) lub albuminę jaja kurzego-PS (d, h).
Duże strzałki wskazują kilka odpowiednich struktur naczyniowych. Małe strzałki wskazują nabłonek rogówki. Słupki skali 100 μm (a-d) i 25 μm (e-1).
Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładach.
P r z y k ł a d 1
Izolacja fragmentów scFv ludzkich przeciwciał specyficznych dla domeny ED-B fibronektyny z biblioteki fagowej prezentującej przeciwciała.
Ludzka biblioteka przeciwciał została sklonowana przy z genów: VH (DP47; Tomlinson i inni, (1992) J. Mol. Biol, 227, 776-798.) i VL (DPK22; Cox i inni, (1994). Eur. J. Immunol. 24, 827-836) linii zarodkowych (strategia klonowania i amplifikacji patrz fig. 1). Komponent VH biblioteki stworzono stosując częściowo zdegenerowane startery (fig. 1) (od SEQ. ID. NO. 11 do SEQ. ID. NO. 18) w metodzie opartej na PGR w celu wprowadzenia losowych mutacji w pozycjach 95-98 CDR3. Komponent VL biblioteki stworzono w ten sam sposób, wprowadzając losowe mutacje w pozycjach 91, 93, 94 i 96 CDR3. Reakcje PCR prowadzono w sposób wcześniej opisany (Marks i inni, (1991). J. Mol. Biol, 222, 581-597).
Fragmenty VH-VL scFv skonstruowano składając przy pomocy metody PCR (fig. 1; Clackson i inni, (1991), Nature, 352, 624-628), z oczyszczonych w żelu fragmentów DNA dla segmentów VH i VL. 30 μg oczyszczonych fragmentów DNA dla VH-VL scFv podwójnie strawiono przy pomocy 300 jednostek każdego z enzymów restrykcyjnych: Ncol i Notl, a następnie zligowano z 15 μg trawionego Notl/NcoI wektora fagemidowego pDN332. pDN332 jest pochodną fagemidu pHENl (Hoogenboom i inni, (1991), Nucl. Acids Res., 19, 4133-4137), w którym sekwencję pomiędzy miejscem Notl a kodonem amber poprzedzającym sekwencję dla rejonu III fibronektyny zastąpiono następującą sekwencją kodującą znacznik D3SD3-FLAG-His6 (Neri i inni, (1996), Nature Biotechnology, 14, 385-390):
| Notl | D | D | D S | D | D | D | |||
| -5' | GCG | GCC | GCA | GAT | GAC | GAT TCC | GAC | GAT | GAC |
| Y | K | D | D | D | D | K H H | H | H | H |
| TAC | AAG | GAĆ | GAĆ | GAĆ | GAĆ | AAG CAC CAT | CAC | CAT | CAC |
| H | amber | ||||||||
| CAT | TAG | -3' |
Transformację wektora ze wstawką do szczepu TG1 Escherichia coli wykonano według Marks i inni, (1991, J. Mol. Biol., 222, 581-597), a fagi przygotowano według standardowych protokołów (Nissim i inni, (1991), J. Mol. Biol., 222, 581-597). Pięć losowo wybranych klonów zsekwencjonowano w celu sprawdzenia powodzenia transformacji. Wynik był za każdym razem pozytywny, a klony zawierały pożądany wektor ze wstawką.
Natomiast zrekombinowane białka fibronektny zawierające fragmenty ED-B i 7B89 oraz odpowiednio jedno i cztery homologiczne powtórzenia regionu III fibronektyny nadprodukowano z wektorów ekspresyjnych opartych na pQE12 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) w sposób wcześniej opisany (Carnemolla i inni, (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405).
Selekcję przeciwciał przeciwko zrekombinowanej domenie ED-B fibronektyny (Carnemolla i inni, (1996), Int. J. Cancer, 68. 397-405, Zardi i inni, (1987), EMBO J., 6, 2337-2342) przeprowadzono na dwukierunkowym żelu (2D) z użyciem 10 nM stężenia antygenów biotynylowanych estrem N-hydroksysukcynymidowym disiarczku biotyny (odczynnik B-4531; Sigma, Buchs, Szwajcaria; 10). Kompleksy takie wymywano z żelu 2D i wychwytywano na złożu Dynabeads powlekanych streptawidyną (Dynal, Oslo, Norwegia). Do każdej rundy selekcji (panningu) stosowano 1013 fagów w 1 ml reakcji. Fagi inkubowano z antygenem w 2% roztworze odtłuszczonego mleka/PBS (MPBS) przez 10 minut. Do tego roztworu dodano 100 μl złoża Dynabeads (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Norwegia) blokowanego wcześniej w MPBS. Po 5 minutach mieszania kulki złoża oddzielono magnetycznie od roztworu i przemyto siedem razy roztworem PBS-01% Tween-20 (PBST) i trzy razy PBS.
PL 199 353 B1
Wymywanie przeprowadzano inkubując przez 2 minuty z 500 μΐ 50 mM ditiotreitolu (DTT) w celu zredukowania mostków dwusiarczkowych pomiędzy antygenem i biotyną. Kulki ponownie wychwytywano a powstały roztwór stosowano do zakażenia wykładniczo rosnących E. coli TG1. Po trzech rundach selekcji (panningu) wymytego faga zastosowano do zakażenia wykładniczo rosnących komórek E. coli HB21511 wysiano na płytki selekcyjne (2xTY + 1% glukoza + 100 μg/ml ampicyliny, 1,5% agar). Z wyrosłych w tych warunkach kolonii (bakteria zakażona fagiem z odpowiednią wstawką) pobierano materiał i zaszczepiano pojedynczą kolonią płynne podłoże 2xTY + 0,1% glukoza +100 μg/ml ampicyliny. Bakterie hodowano, a ekspresję (produkcję) białka (w tym przypadku przeciwciała) indukowano 1 mM IPTG przez noc w 30°C. Po nocy bakterie odwirowano, a powstałe supernatanty przebadano przy pomocy testu ELISA stosując powlekane streptawidyną płytki do mikromianowania, na które dodano 10 nM biotynylowanej-ED-B (antygen) i jako odczynnika wykrywającego przeciwciało I-rzędowe związane z biotynylowanym antygenem - przeciwciało II-rzędowe anty-FLAG M2 (IBI Kodak, New Haven, CT). 32% przebadanych klonów było dodatnie, a trzy z nich, które dały najsilniejszy sygnał ELISA (E1, A2 i G4) zsekwencjonowano i dalej scharakteryzowano.
Testy ELISA przeprowadzano z użyciem: (i) biotynylowanej ED-B odzyskanej z plamki w żelu, (ii) domeny ED-B, która nie była zdenaturowana, (iii) domeny ED-B połączonej z przyległymi domenami fibronektyny (zrekombinowane białko zawierające domeny 7B89), oraz (iv) wielu niespecyficznych antygenów. Przeciwciała E1, A2 i 64 reagowały silnie i specyficznie ze wszystkimi trzema białkami zawierającymi ED-B, co sugeruje to, że trzy rekombinowane przeciwciała oczyszczone z supernatantów bakteryjnych przy pomocy kolumny powinowactwa do ED-B, rozpoznają także epitop obecny w natywnej konformacji domeny ED-B fibronektyny. Nie wykryto żadnej reakcji z fragmentami fibronektyny, które nie zawierały domeny ED-B (dane nieprezentowane).
W celu stwierdzenia, czy przeciwciała wyizolowane przeciwko plamce z żelu (patrz wyżej) miały dobre powinowactwo względem natywnego antygenu, przeprowadzono analizę oddziaływań w czasie rzeczywistym używając techniki plazmonowego rezonansu powierzchniowego na sprzęcie BIAcore, co opisano w (Neri i inni, (1997) Nature Biotechnol., 15, 1271-1275). Monomeryczne frakcje fragmentów scFv El, A2 i G4 wiązały domenę ED-B fibronektyny z powinowactwem w zakresie 107-108 M-1 (tabela 1).
Aby dalej zbadać specyficzność i użyteczność przeciwciał wykonano immunoblot z żelu 2D-PAGE, na który elektroforezie poddano lizat ludzkiej linii komórek czerniaka COLO-38, do której dodano niewielkie ilości domeny ED-B zawierającej zrekombinowane białko 7B89 (fig. 2). Przeciwciało ScFv (E1) wybarwiło silnie i specyficznie tylko plamkę 7B89.
Przeciwciała E1, A2 i G4 zastosowano do immunozlokalizowania fibronektyny zawierającej ED-B (ED-B(+)-FN) w skrawkach kriostatowych glejaka wielopostaciowego, agresywnego nowotworu mózgu człowieka z widocznymi procesami angiogenezy. Fig. 3 przedstawia serię skrawków glejaka wielopostaciowego, z typowymi kłębkowowo-podobnymi strukturami naczyniowymi wybarwionymi na czerwono przez trzy przeciwciała. Immunowybarwianie skrawków próbek glejaka wielopostaciowego zamrożonych w ciekłym azocie bezpośrednio po usunięciu w wyniku procedur chirurgicznych przeprowadzono w opisany wcześniej sposób (Camemolla i inni, (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405; Castellani i inni, (1994), Int. J. Cancer. 59. 612-618). W skrócie, immunowybarwianie wykonano przy pomocy przeciwciała M2-anty- FLAG (IBI Kodak), biotynylowanych anty-mysich przeciwciał poliklonalnych (Sigma), zestawu wybarwiającego kompleks streptawidyna-biotyna fosfataza alkaliczna (BioSpa, Milan, Włochy) oraz naftol-AS-MX-fosforanu i fast-red TR (Sigma). W dalszej kolejności do barwienia kontrastowego zastosowano hematoksylinę Gilla (Dako, Carpenteria, CA) jak wcześniej opisano (Castellani i inni, (1994;, Int. J. Cancer, 59, 612-6-18).
Przy pomocy podobnych technik oraz przeciwciała L19 (patrz następny przykład) można także specyficznie wybarwić nowo powstające naczynia krwionośne wywołane wszczepieniem do króliczej rogówki polimerowych tabletek nasączonych substancjami angiogennymi, takimi jak czynnik wzrostowy komórek śródbłonka naczyń lub estry forbolu.
P r z y k ł a d 2
Izolacja fragmentu ludzkiego przeciwciała wiążącego ED-B z subnanomolarnym powinowactwem.
Przeciwciało ScFv(E1) zostało wybrane jako najlepsze i dalej pracowano nad zwiększeniem jego powinowactwa do antygenu ED-B z jednoczesną kontrolą ilości mutacji w CDR (region determinujący dopasowanie) zlokalizowanym w peryferyjnej części miejsca wiążącego antygen (fig. 1A).
Na podstawie znanych strukturach 3D kompleksów antygen-przeciwciało zmutowano nukleotydy kodujące podstawniki 31-33, 50, 52 i 54 w łańcuchu VH przeciwciała i wytworzono kolejną populację
PL 199 353 B1 przeciwciał prezentowanych w bibliotece fagowej. 4 x 108 powstałych klonów wybrano do wiązania domeny ED-B fibronektyny. Po dwóch rundach selekcji (panningu) i przeszukaniu 96 pojedynczych klonów wyizolowano przeciwciało o 27-krotnie zwiększonym powinowactwie (H10; tabele 1 i 2).
Podobnie do tego, co inni badacze obserwowali podczas dojrzewania powinowactwa przeciwciał, podwyższone powinowactwo wynikało raczej z wolniejszej dysocjacji od antygenu, niż z ulepszonych wartości kon (Schier i inni, (1996), Gene, 169; 147-155; Ito (1995), J. Mol. Biol., 248. 729-732). Często uważa się, że lekki łańcuch przeciwciała mniej wpływa na powinowactwo wiązania antygenu, co potwierdza fakt, że zarówno naturalne jak i syntetyczne przeciwciała pozbawione łańcucha lekkiego nadal mogą wiązać antygen (Ward i inni, (1989), Nature, 341, 544-546; Hamers-Casterman i inni, (1993), Nature, 363, 4.46-448). Z tego względu wybrano do losowej mutacji tylko dwa podstawniki domeny VL (32 i 50), które są zlokalizowane centralnie w miejscu wiążącym antygen (fig. 1A), ponieważ często stwierdza się, że stykają się one z antygenem w strukturach 3D. Powstałą bibliotekę zawierającą 400 klonów wyrażono w fagach i poddano selekcji pod względem wiązania antygenu. Z badań profili dysocjacji przy pomocy analizy interakcji w czasie rzeczywistym przy zastosowaniu instrumentu BIAcore (Jonsson i inni, (1991), BioTechnigues, 11, 620-627) i pomiarów koff przez doświadczenia kompetycyjne z wykorzystaniem detekcji elektrochemiluminescencyjnej zidentyfikowano klon (L19) (fig. 6) wiążący domenę ED-B fibronektyny z Kd = 54 pM (tabele 1 i 2).
Doświadczenia z dojrzewaniem powinowactwa przeprowadzono w następujący sposób: (i) Aby wprowadzić losowe mutacje w pozycjach 31-33 w regionie CDR1 łańcucha VH gen scFv (E1) powielono metodą PCR ze starterami LMB1bis (5'-GCG GCC GAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEQ. ID. NO. 1) i DP47CDR1for (5'-GA GCC TGG CGG ACC GAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (SEQ. ID. NO. 2). (ii) Aby uzyskać losowe mutacje w pozycjach 50, 52, 54 w regionie CDR2 łańcucha VH gen scFv (E1) powielono metodą PGR ze starterami DP47CDRlback (5'-ATG AGC TGG GTC CGC GAG GCT CC-3') (SEQ. ID. NO. 3) i DP47CDR2for (5'GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC GAG CCC CTT-3') (SEQ. ID. NO. 4). (iii) Pozostały fragment genu scFv, pokrywający część 3' genu VH, łącznik peptydowy i gen VL, zamplifikowano przy pomocy starterów DP47CDR2back (5'-ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEQ. ID. NO. 5) i JforNot (5'-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3') (SEQ. ID. NO. 6) (94°C 1 minuta, 60°C 1 minuta, 72°C 1 minuta). Trzy powstałe produkty PCR oczyszczono w żelu i złożono używając metody PCR (21) ze starterami LMB1bis i JforNot (94°C 1 minuta, 60°C 1 minuta, 72°C 1 minuta). Powstały pojedynczy produkt PCR oczyszczono z mieszaniny po reakcji PCR podwójnie strawiono używając enzymów restrykcyjnych Afotl i Ncol. Następnie wytrawiony produkt zligowano ze strawionym Notl/NcoI wektorem pDN332.
Do mieszaniny ligacyjnej użyto około 9 μg wektora i 3 μg wstawki. Po reakcji wektor ze wstawką oczyszczono od białek przez fenolizację (roztwór fenol/chloroform) a następnie DNA wytrącono etanolem i zawieszono w 50 μΐ jałowej wody. Używając techniki elektroporacji tak przygotowanym wektorem transformowano elektrokompetentne komórek E. coli TG1. Powstała po dojrzewaniu powinowactwa biblioteka zawierała 4 x 108 klonów. Cząstki przeciwciało-fag, wytworzone jak opisywano (Nissim i inni, (1994), EMBO J., 13, 692-698) zastosowano do pierwszej rundy selekcji na opłaszczonych 7B89 immunoprobówkach (Carnemolla i inni, (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405). Wybrane fagi zastosowano do drugiej rundy selekcji (panningu) przeprowadzanej na biotynylowanych ED-B, a następnie wychwytywano na powlekanych streptawidyną magnetycznych kulkach (Dynal, Oslo, Norwegia; patrz poprzedni paragraf). Po selekcji około 25% klonów było dodatnich w badaniach testem ELISA (protokół doświadczalny w poprzednim rozdziale). Z dodatnich prób dalej identyfikowano klon (H10; tabela 1) o najniższej koff przy pomocy analizy BIAcore (Jonsson i inni, (1991), BioTechnigues, 11, 620-627).
W celu wprowadzenia losowych mutacji w pozycji 32 regionu CDR1 łańcucha VL gen scFv(H10) powielono metodą PCR ze starterami LMB1bis i DPKCDRlfor (5'-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G-3') (SEQ. ID. NO. 7) (numeracja: Chothia i Lesk, (1987), J. Mol. Biol., 196, 901-917). Natomiast, aby wprowadzić losowe mutacje w pozycji 50 regionu CDR2 łańcucha VL gen scFv (H10) powielono ze starterami DPKCDR1back (5'-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-3') (SEQ. ID. NO. 8) i DPKCDR2for (5'-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (SEQ. ID. NO. 9). Pozostałą część genu scFv zamplifikowano przy pomocy oligonukleotydów DPKCDR2back (5'-GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC3') (SEQ. ID. NO. 10) i JforNot (94°C 1 minuta, 60°C 1 minuta, 72°C 1 minuta). Trzy powstałe produkty
PL 199 353 B1 złożono, strawiono i wklonowano do pDN332 w sposób opisany powyżej dla mutagenezy łańcucha ciężkiego. Powstałą bibliotekę inkubowano z biotynylowaną domeną ED-B fibronektyny w 3% BSA przez 30 minut, następnie przez 10 minut wychwytywano na płytkach do mikromianowania powlekanych streptawidyną (Boehringer Mannheim GmbH, Niemcy). Fagi wymyto przy pomocy 20 mM roztworu DTT (1,4-ditio-DL-treitol, Fluka) i użyto do zainfekowania komórek E. coli TG1 w wykładniczej fazie wzrostu. Analiza wiązania ED-B przez supernatanty z 96 kolonii przy pomocy ELISA i BIAcore pozwoliła zidentyfikować klon L19 (fig. 6). Fragmenty scFv przeciwciał anty-ED-B: El, G4, A2, H10 i L19 selektywnie wybarwiały nowo powstające naczynia krwionośne w skrawkach agresywnie rozrastających się nowotworów (fig. 3).
Produkcję wspomnianych powyżej fragmentów przeciwciał anty-ED-B prowadzono zaszczepiając pojedynczą świeżą kolonią bakteryjną 1 litr płynnej pożywki 2xTY jak wcześniej opisywano w Pint i inni, ((1997), J. Immunol. Meth., 206, 171-182). Tak nadprodukowane przeciwciała oczyszczono na kolumnie powinowactwa CNBr aktywowanej sefarozą (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) i sprzężonej z 10 mg zrekombinowanych białek 7B89 zawierających domenę ED-B (Camemolla i inni, (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405) i przepłukanej 50 ml buforu równoważącego (PBS, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl). Następnie fragmenty przeciwciał wymyto 100 mM trietyloaminą, natychmiast zneutralizowano przy pomocy 1M Hepes, pH 7 i dializowano względem PBS. Pomiary powinowactwa przy pomocy BIAcore wykonano z oczyszczonymi przeciwciałami w sposób wcześniej opisany (Neri i inni, (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1275) (fig. 4). Analizę przesunięcia prążków świadczącą o łączeniu się badanych białek wykonano w sposób wcześniej opisany (Neri i inni, (1996), Nature Biotechnology, 14, 385390). Użyto oczyszczonych przeciwciał i zrekombinowanej domeny ED-B znakowanej fluorescencyjnie fluorochromem podczerwieni Cy5 (Amersham) na N-końcowym odcinku białka (Camemolla i inni, (1996), Int. J. Cancer. 68, 397-405, Neri i inni, (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1275) (fig. 4). Analiza BIAcore nie zawsze pozwala dokładnie wyznaczyć parametry kinetyczne powolnych reakcji dysocjacji ze względu na możliwość efektów ponownego wiązania, niestabilność linii podstawowej i długie czasy pomiarów potrzebne do stwierdzenia, że faza dysocjacji przebiega według pojedynczego wykładniczego profilu. Zatem pomiary kinetycznej stałej dysocjacji koff wykonano przy pomocy doświadczeń kompetycyjnych (Neri i inni, (1996), Trends in Biotechnol., 14, 465-470) (fig. 4), która w skrócie polegała na tym, że przeciwciała anty-ED-B (30 nM) inkubowano z biotynylowaną domeną ED-B (10 nM) przez 10 minut w obecności przeciwciała M2 anty-FLAG (0,5 μg/ml) i poliklonalnych przeciwciał anty-mysim IgG (Sigma) wcześniej znakowanych kompleksem rutenu w sposób wcześniej opisany (Deaver, D. R. (1995), Naturę, 377, 758-760). W równoległych reakcjach i w różnych czasach do tego roztworu dodano niebiotynylowaną domenę ED-B (1 μΜ). Następnie dodano powlekanego streptawidyną złoża Dynabeads (20 pl, 1 mg/ml) rozcieńczonego w buforze do testów Origen (Deaver, D.R. (1995), Nature, 377, 758-760), a powstałe mieszaniny analizowano w aparacie ORIGEN Analyzer (IGEN Inc. Gaithersburg, MD USA). Pomiar ten pozwala wykryć sygnał elektrochemiluminescencyjny (ECL) korelujący z ilością fragmentu scFv nadal związanego z biotynylowaną ED-B pod koniec reakcji kompetycji. Wykreślenie sygnału ECL względem czasu kompetycji pozwala uzyskać profil, który można dopasować do pojedynczego wykładniczego profilu z charakterystyczną stałą kott (fig. 4; tabela 2).
P r z y k ł a d 3
Ukierunkowane gromadzenie się w nowotworach znakowanych radioaktywnie specyficznych przeciwciał scFv o dużym powinowactwie do domeny ED-B fibronektyny.
Znakowane radioaktywnym jodem przeciwciała: scFv(L19) (będące przedmiotem wynalazku) lub scFv(D1.3) (specyficzne dla lizozymu z jaja kurzego) wstrzyknięto dożylnie myszom z podskórnie wszczepionym mysim potworniakiem złośliwym F9, który jest szybko rosnącym agresywnym nowotworem.
Rozmieszczenie (biodystrybucję) przeciwciał badano w różnych punktach czasowych (fig. 5). ScFv(L19) i scFv(D1.3) oczyszczono na kolumnach powinowactwa z odpowiednim antygenem (Neri i inni, (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1273) i znakowano radioaktywnie jodem-125 używając metody lodogen (Pierce, Rockford, IL, USA). Znakowane radioaktywnie fragmenty zachowały ponad 80% immunoreaktywności, co oznaczono przez nałożenie na kolumnę z antygenami znakowanych radioaktywnie przeciwciał i pomiar radioaktywności we frakcjach cieczy przepływającej oraz z eluatu. Myszom Nude (12-tygodniowe myszy Swiss nude, samce) z podskórnie wszczepionym mysim potworniakiem złośliwym F9 (Neri i inni, (1997), Nature Biotechnol., 15, 1271-1273) wstrzyknięto 3 pg (3-4 pCi) scFv w 100 pl roztworu soli. Masa nowotworu była w przedziale 50-250 mg, ponieważ większe nowotwory mogą mieć centrum nekrotyczne, ale doświadczenia skierowania przeciwciał scFv do większych nowotworów
PL 199 353 B1 (300-600 mg) dawały zasadniczo te same wyniki. Dla każdego punktu czasowego poświęcono trzy zwierzęta. Myszy uśmiercono w humanitarny sposób, a następnie ważono ich organy i zliczano w nich radioaktywność. Wyniki skierowania przeciwciał do odpowiednich organów wyrażono jako procent wstrzykniętej dawki przeciwciała na gram tkanki (%ID/g). ScFv(L19) był szybko eliminowany z krwi przez nerki, inaczej niż normalne przeciwciała, oraz nie gromadził się w wątrobie lub innych organach. 8% wstrzykniętej dawki na gram tkanki lokalizowano w guzie już w trzy godziny po wstrzyknięciu. Dalsze obniżenie tej wartości wynikało jednak z faktu, że guz podwoił swój rozmiar w ciągu 24-48 godzin. Stosunek przeciwciał w guzie i we krwi w 3, 5 i 24 godziny po wstrzyknięciu wynosił odpowiednio 1,9, 3,9 i 11,8 dla L19, ale zawsze poniżej 1,0 dla przeciwciała będącego kontrolą negatywną.
Znakowane radioaktywnie przeciwciała scFv(L19) najczęściej umieszczają się w guzach już w kilka godzin po podaniu, co sugeruje uż yteczność do immunoscyntygraficznej detekcji angiogenezy u pacjentów.
P r z y k ł a d 4
Selektywne wybarwienie nowopowstających naczyń krwionośnych w gałce ocznej przez przeciwciała anty-ED-B.
Angiogeneza, czyli powstawanie nowych naczyń krwionośnych z istniejących wcześniej jest charakterystycznym procesem będącym podłożem wielu chorób, włącznie z rakiem i większością zaburzeń w gałce ocznej, które mogą powodować utratę wzroku. Możliwość selektywnego skierowania i zamknięcia neounaczynienia przez przeciwciała i ich koniugaty otwiera możliwości ich diagnostycznego i terapeutycznego zastosowania.
Zbadano, czy antygen B-FN jest specyficznym znacznikiem angiogenezy w gałce ocznej oraz, czy przeciwciała rozpoznające B-FN mogą selektywnie dotrzeć in vivo do struktur neounaczynienia ocznego po podaniu ogólnoustrojowym. W tym celu stymulowano angiogenezę w rogówce królika, co pozwoliło bezpośrednio obserwować nowe naczynia krwionośne, przez chirurgiczne wszczepienie tabletek zawierających czynnik wzrostowy komórek śródbłonka naczyń lub estry forbolu (fig. 7). Tabletki sukralfat (dar Merck, Darmstadt, Niemcy)/hydron zawierające 800 ng czynnika wzrostu komórek śródbłonka naczyń (Sigma) lub 400 ng 12-myristynianu-13-octanu forbolu („PMA”; Sigma) wszczepiono samicom królików New Zealand White w sposób opisany wcześniej [D'Amato, R.J., i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4082-4085, (1994)]. Angiogenezę wywołały oba czynniki. Króliki monitorowano codziennie. Silnie kumulację antygenu ED-B po działaniu obu czynników indukujących powstawanie nowych naczyń krwionośnych potwierdzono analizą immunohistochemiczną. We wszystkich następnych doświadczeniach zastosowano tabletki PMA.
Badania immunohistochemiczne wykazały, że L19 silnie wybarwia neounaczynienie wywołane w rogówce królika (fig. 8; 9a), ale nie już istniejące wcześniej naczynia krwionośne w oku królika (fig. 9b, c) lub innych tkankach (dane nieprezentowane). Badania immunohistochemiczne wykonano w sposób opisany przez [Camemolla, B. i inni, Int. J. Cancer 68, 397-405, (1996)].
P r z y k ł a d 5
Skierowanie fragmentu L19 ludzkiego przeciwciała posiadającego subnanomolarne powinowactwo do domeny ED-B będącej in vivo znacznikiem angiogenezy ocznej.
Używając króliczego modelu angiogenezy ocznej opisanego w poprzednim przykładzie oraz metod immunofotodetekcji [Neri, D. i inni, Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997)], pokazaliśmy, że przeciwciało L19 chemicznie sprzężone z czerwonym fluoroforem Cy5 selektywnie dociera do angiogenezy ocznej po podaniu dożylnym (fig. 10a). Takich właściwości nie wykazuje fragment przeciwciała (HyHEL-10)-Cy5 skierowany przeciwko innemu antygenowi (fig. 10b). Wybarwienie fluorescencyjnym barwnikiem rosnących naczyń ocznych było wyraźnie wykrywalne przez przeciwciało L19 krótko po podaniu i utrzymywało się przez co najmniej dwa dni analogicznie do wcześniejszych obserwacji angiogenezy nowotworowej. Wykonana później ex vivo mikroskopowa analiza immunofluorescencyjna na skrawkach rogówki potwierdziła umiejscowienie L19 (fig. 10c), ale nie HyHEL-10 (fig. 10d), wokół struktur naczyniowych.
Wykazanie selektywnego skierowania przeciwciał do nowotworzonych naczyń krwionośnych w oku gwarantuje powodzenie dalszych badań kliniczne. Natomiast obrazowanie immunofluorescencyjne może znaleźć zastosowanie we wczesnym wykrywaniu angiogenezy ocznej u pacjentów z grupy ryzyka zanim uszkodzenia te staną się widoczne we fluoroangiografii.
PL 199 353 B1
Kilka szczegółów metodologicznych:
Do badań immunofluorescencji ex vivo i niektórych barwień H/E rogówki utrwalono w 4% paraformaldehydzie w PBS przed dalszą obróbką mikroskopową. Doświadczenia z fotodetekcją fluorescencji wykonano na królikach uspokojonych 5 mg/kg Acepromaziny. Do doświadczeń pokazujących ukierunkowaną lokalizację przeciwciał w oku, każdemu królikowi wstrzyknięto dożylnie 3,5 mg scFv(L19)1-Cy50,66 i 2,8 mg scFv (HyHEL-10)1-Cy50,83 (czas wstrzykiwania = 15 minut). Silną fluorescencję w neounaczynieniu rogówki obserwowano po podaniu L19, która utrzymywała się przez kilka godzin. Nie obserwowano fluorescencji w oku po podaniu HyHEL-10, będącego negatywną kontrolą fluorescencji. Jako dodatkowy test specyficzności królikom, którym podano poprzedniego dnia scFv(HyHEL-10)-Cy5, następnego dnia podano scFv (L19)-Cy5 i wykazały one silne wybarwienie fluorescencyjne angiogenezy rogówkowej.
Do detekcji fluorescencji oko królika naświetlano halogenową lampą wolframową (model Schott KL1500; Zeiss, Jena, Niemcy) wyposażoną w filtr wzbudzenia Cy5 (Chroma, Brattleboro, VT, U.S.A.) i dwa światłowody, które gasną, gdy są umieszczone w odległości około 2 cm od oka. Fluorescencję wykrywano umieszczoną w odległości 3-4 cm od naświetlanego oka ochłodzoną C-5985 monochromatyczną kamerą CCD (Harnamatsu, Hamamatsu-City, Japonia), wyposażoną w C-osadzone soczewki powiększające Canon (V6 x 16; 16 - 100 mm; 1: 1,9) i filtr emisjii Cy5 o średnicy 50 mm (Chroma). Zbieranie danych trwało 0,4 sekundy.
Doświadczenia z fluoroangiografią Cy5 przeprowadzano przy pomocy tego samego zestawu doświadczalnego, ale podając dożylnie 0,25 mg Cy5-Tris (produkt reakcji pomiędzy Cy5-NHS i tris[hydroksylmetylo]aminometanem). Czas wstrzykiwania wynosił 5 sekund, a czas zbierania danych - 0,2 sekundy.
Fragmenty przeciwciał były w formie scFv (jednołańcuchowych białek wiążących fragmenty antygenu). Oczyszczanie scFv(L19) i scFv(HyHEL-10) oraz ich znakowanie estrami N-hydroksysukcynimidowe (NHS) barwników indocjanidowych wcześniej opisywano [Neri, D. i inni, Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997); Fattorusso, R., i inni, (1999) Structure, 1, 381-390]. Stosunek przeciwciało:Cy5 przy znakowaniu dla obu przeciwciał wynosił odpowiednio 1,5:1 i 1,2:1. Cy5-NHS zakupiono z Amersham Pharmacia Biotech (Zurich, Szwajcaria), albuminę jaja kurzego z Sigma (Buchs, Szwajcaria).
Po reakcji znakowania koniugaty przeciwciał oddzielono od niewłączonego fluoroforu lub fotouczulacza używając kolumn PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) równoważonych 50 mM fosforanem, pH 7,4, 100 mM NaCl (PBS). Immunoreaktywność koniugatów przeciwciał zmierzono przy pomocy chromatografii powinowactwa na kolumnach z antygenem [Neri, D. i inni, Nature Biotechnol. 15, 1271-1275 (1997)]. Wynosiła ona we wszystkich przypadkach ponad 78%. Koniugaty analizowano w żelu poliakrylamidowym zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDS-PAGE). Migrowały one w postaci prążka o MW = 30000 Daltonów (czystość preparatu wynosiła ok. 90%).
P r z y k ł a d 6
Fragment L19 ludzkiego przeciwciała chemiczne sprzężony z fotouczulaczem, selektywność jego docierania do angiogenezy ocznej i pośredniczenie w jej zahamowaniu pod wpływem naświetlania czerwonym światłem.
Aby zbadać, czy selektywność usuwania naczyń można osiągnąć przy pomocy skierowania koniugatów przeciwciał do naczyń w gałce ocznej, wstrzyknięto królikom fragment L19 lub niespecyficzne białko (albuminę jaja kurzego), które nie umieszcza się w nowo tworzonych naczyniach krwionośnych. Oba białka były sprzężone z fotouczulaczem - chlorkiem cyny (IV) e6 (nazywanym tutaj poniżej „PS”). Oczy zwierząt, którym podano wyżej wymienione przeciwciała naświetlano czerwonym światłem (dawka światła = 78 J/cm2) (fig. 11). Dużą makroskopową różnicę obserwowano po 16 godzinach od naświetlania u królików, którym podano L19-PS (fig. 11a, b). Nastąpiła koagulacja neounaczynienia rogówki, ale nie naczyń w spojówce lub innych strukturach ocznych. Fluoroangiografia z fluoroforem indocjaninowym Cy5 (fig. 11c) potwierdziła zatkanie naczyń przez charakterystyczny obszar zmniejszenia fluorescencji (hipofluorescencja) w przeciwieństwie do zwiększenia fluorescencji (hiperfluorescencja) w ciągle przeciekającym neounaczynieniu w oku, które nie było naświetlone (fig. 11d, h). Nie stwierdzono zmian makroskopowych w oku podczas - badania oftalmoskopowowym lub przez fluoroangiografię Cy5 u naświetlanych królików, którym podano albuminę jaja kurzego-PS (fig. 11e-g). Skutek naświetlania skierowanego koniugatu L19-PS we wczesnych stadiach angiogenezy rogówkowej przedstawiono na fig. 11i-l. Selektywnie skoagulowane naczynia krwionośne były makroskopowo widoczne u żywych zwierząt (fig. 11i, j), i lepiej widoczne u zwierząt bezpośrednio po eutanazji (fig. 11k, l).
Następnie fotodynamiczne uszkodzenia badano przy pomocy technik mikroskopowych. Po naświetlaniu zamykanie naczyń mogło być wykryte przy pomocy standardowych technik barwienia
PL 199 353 B1 hematoksylina/eozyna (H/E) zarówno w nieutrwalonych jak i w utrwalonych paraformaldehydem skrawkach rogówek zwierząt poddanych działaniu L19-PS (fig. 12b, f, j). Natomiast nie zaobserwowano zamykania przeciekających naczyń krwionośnych u zwierząt poddanych działaniu albuminy jaja kurzego-PS (fig. 12a, e, i). Apoptoza w części rogówki, do której skierowano koniugat fotouczulacza była wyraźnie widoczna w fluorescencyjnym teście TUNEL (fig. 12c, g), ale trudno wykrywalna w kontrolach negatywnych (fig. 12d,h). Powię kszenie obrazu pokazywał o apoptozę komórek ś ródbłonka w strukturach naczyń (fig. 12g). Nie obserwowano uszkodzeń naczyń krwionośnych tęczówki, twardówki oraz spojówki leczonych zwierząt ani w teście TUNEL (nie prezentowane) ani przez barwienie H/E (fig. 12k, l).
Selektywne i fotodynamiczne usunięcie neounaczynienia pozwala mieć nadzieję na skuteczne leczenie zaburzeń widzenia i innych patologii związanych z angiogenezą, w narządach które są dostępne do naświetlania przy pomocy rozpraszaczy światła lub techniki włókien optycznych.
Wyniki tych badań wyraźnie pokazują, że neounaczynienie oczne może być selektywnie zamykane bez uszkadzania istniejących wcześniej naczyń krwionośnych i normalnych tkanek.
Kilka szczegółów metodologicznych:
Chlorek cyny (IV) e6 wybrano z wielu fotouczulaczy na podstawie ich siły, rozpuszczalności i specyficzności po sprzężeniu z króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi anty-mysimi (Sigma). Te immunokoniugaty badano przez skierowaną fotolizę czerwonych krwinek opłaszczonych monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi dla ludzkiego CD47 (#313441 A; Pharmingen, San Diego CA. U.S.A.). Chlorek cyny (IV) e6 przygotowano w sposób wcześniej opisany [Lu, X.M. i inni,. J. Immunol. Methods 156, 85-99 (1992)1. Do sprzęgania z białkami chlorek cyny (IV) e6 (2 mg/ml) mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w dimetyloformamidzie z dziesięciokrotnym molarnym nadmiarem EDC (chlorowodorkiem N'-3-dimetyloaminopropyl-N-etylokarbodiimidu, Sigma) i NHS (N-hydoksysukcynimidu, Sigma). Powstałą aktywowaną mieszaninę dodano do osiem razy większej objętości roztworu białka (1 mg/ml) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
Po reakcji znakowania koniugaty przeciwciał oddzielono od niewłączonego fluoroforu (barwnika) lub fotouczulacza przy pomocy kolumn PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) równoważonych 50 mM fosforanem, pH 7,4, 100 mM NaCl (PBS). Immunoreaktywność koniugatów przeciwciał zmierzono jak opisano w poprzednim przykładzie.
Do doświadczeń zamykania cieknących żył światłem, królikom podano dożylnie 12 mg scFv(L19)1-chlorek cyny (IV) e60,8 lub 38 mg albuminy jaja kurzego-chlorek cyny (IV) e60,36. Zwierzęta trzymano w ciemności podczas trwania doświadczenia. Osiem godzin po podaniu króliki wprowadzono w anestezjologiczny stan uśpienia ketaminą (35 mg/kg)/ksylazinę (5 mg/kg)/acepromazin (1 mg/kg) i jedno z dwóch oczu naświetlano przez 13 minut halogenową lampą wolframową (Schott KL1500) wyposażoną w filtr Cy5 (Chroma) i dwa światłowody, które gasną, gdy są umieszczone w odległości 1 cm od oka. Naświetlany obszar był wielkości około 1 cm2, a moc naświetlania 100 mW/cm2, co zmierzono przy pomocy fotodetektora SL818 (Newport Corp., Irvine. CA, U.S.A.). Po naświetlaniu nie obserwowano u zwierząt objawów dyskomfortu. W celach zapobiegawczych do pomiarów zwierzęta po naświetlaniu otrzymały środki znoszące czucie bólu (buprenorfina 0,03 mg/kg). Do monitorowania zamykania naczyń przy pomocy światła oczy zbadano oftalmoskopem i sfotografowano przy pomocy aparatu fotografującego KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausanne, Szwajcaria) dno oka. Pięciu królikom podano każdy z koniugatów chlorek cyny (IV) e6 i naświetlano tylko jedno oko, a drugie oko służyło, jako wewnętrzna kontrola negatywna. Dla dodatkowej kontroli dwa dodatkowe króliki tylko naświetlano, ale nie podano im koniugatu przeciwciała z fotouczulaczem.
Zaraz po eutanazji królików przez przedawkowanie narkozy oczy wyłuszczono, usunięto rogówkę, a następnie zatopiono w Tissue Tek (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japonia) i zamrożono. Do ex vivo immunofluorescencji i dla niektórych barwień H/E, rogówki utrwalano w 4% parafomaldehydzie w PBS przed zatopieniem. Skrawki kriostat o grubości 5 μm zastosowano do dalszej analizy mikroskopowej.
Fluorescencyjny test TUNEL przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Diagnostic, Rotkreuz, Szwajcaria).
PL 199 353 B1
T a b e l a 1
Sekwencje wybranych klonów przeciwciał anty-ED-B.
| łańcuch VH | łańcuch VL | |||||
| Klon | 31-33* | 50-55* | 99-102* | 33* | 50* | 92-97* |
| A2 | SYA | AISGSG | GLSI | Y | G | NGWYPW |
| G4 | SYA | AISGSG | SFSF | Y | G | GGWLPY |
| E1 | SYA | AISGSG | FPFY | Y | G | TGRIPP |
| H10 | SFS | SIRGSS | FPFY | Y | G | TGRIPP |
| L19 | SFS | SISGSS | PFPY | F | Y | TGRIPP |
Odpowiednie pozycje aminokwasowe (*: numeracja według Tomlinson i inni, (1995) EMBO J., 14, 4628-4638) klonów przeciwciał wyizolowanych z zaprojektowanych syntetycznych bibliotek. Jednoliterowy kod aminokwasów zastosowano według standardowej nomenklatury IUPAC.
T a b e l a 2
Powinowactwa fragmentów przeciwciał scFv względem domeny ED-B fibronektyny.
| Klon | kon(s'1M·1) | koff(s'1)B | koff(S'1)C | Kd(M)* |
| A2 | 1,5 x 105 | 2,8 x 10'3 | - | 1,9 x 10'8 |
| G4 | 4,0 x 104 | 3,5 x 10'3 | - | 8,7 x 10'8 |
| E1 | 1,6 x 105 | 6,5 x 10'3 | - | 4,1 x 10'8 |
| H10 | 6,7 x 104 | 5,6 x 110-4 | 9,9 x 10'5 | 1,5 x 10'9 |
| L19 | 1,1 x 105 | 9,6 x 10'5 | 6,0 x 10'6 | 5,4 x 10'11 |
*)Kd = koff/kon - dla fragmentów H10 i L19 wiążących z dużym powinowactwem wartości koff z doświadczeń BIAcore nie były wystarczająco wiarygodne ze względu na wpływ ujemnie naładowanej karboksylowanej stałej matrycy dekstranowej; zatem wartości Kd wyznacza się z pomiarów koff uzyskanych w doświadczeniach kompetycyjnych (procedury doświadczalne).
koff, kinetyczna stała dysocjacji kon kinetyczna stała asocjacji Kd, stała dysocjacji B - zmierzone przy pomocy BIAcore c - zmierzone przez kompetycję z detekcją elektrochemiluminescencyjną.
Wartości są dokładne ± 50% na podstawie precyzji wyznaczania stężeń.
Lista sekwencji <110> EIDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH <120> Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało, koniugat zawierający przeciwciało i zastosowanie koniugatu
| <130> | 1900PTEP |
| <140> | |
| <150> | US 09/075338 |
| <151> | 11-05-1998 |
| <150> | US |
| <151> | 28-04-1999 |
| <160> | 21 |
| <170> | Patentln Ver. 2.0 |
PL 199 353 B1 <210> 1 <211> q24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: LMBlbis <400> 1 gcggcccagc cggccatggc cgag 24 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DP47CDRlfor <400> 2 gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg 54 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DP47CDRlback <400> 3 atgagctggg tccgccaggc tcc 23 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DP47CDR2for <400> 4 gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt 60 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DP47CDR2back <400> 5 acatactacg cagactccgt gaag 24 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: JforMot <400> 6 tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg 53 <210> 7 <211> 47 <212> DNA
PL 199 353 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DPKCDRlfor <400> 7 gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 47 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DPKCDRlback <400> 8 ttagcctggt ccagcagaa ace 23 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DPKCDR2for <400> 9 gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 46 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DPKCDR2back <400> 10 gcatccagca gggccactgg c 21 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DP47baNco <400> 11 gcggcccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: CDR3for <400> 12 ggttccctgg ccccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg 55 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: YHpullth <400> 13
PL 199 353 B1 gcggcccagc atgccatggc cgag <210> 14 <211> 66 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: Jassm <400> 14 cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc gtagtc <210> 15 <211> 62 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DPK22assm <400> 15 gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt cc <210> 16 <211> 63 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: DPK3for <400> 16 caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac tgc cctggcccca 60 gacgcagtct 60 62 agtaatacac 60 63 <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PGR: Jfornot <400> 17 gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtcccttggc cgaacg 56 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja 35 <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter PCR: YLpullth <400> 18 gatgggtcca gtggcggtag cggg 24 <210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> Łańcuch VH przeciwciała specyficznego dla domeny ED-B fibronektyny <400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
PL 199 353 B1
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Łącznik przeciwciała <400> 20
Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> VL przeciwciała specyficzna dla domeny ED-B fibronektyny <400> 21
| Glu | Ile Val Leu Thr | Gin Ser Pro Gly Thr Leu | Ser | Leu | Ser | Pro | Gly | ||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||
| Glu | Arg Ala | Thr Leu | Ser Cys Arg | Ala Ser Gln | Ser | Val | Ser | Ser | Ser |
| 20 | 25 | 30 | |||||||
| Phe | Leu Ala | Trp Tyr | Gln Gin Lys | Pro Gly Gln | Ala | Pro | Arg | Leu | Leu |
| 35 | 40 | 45 |
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (23)
- Zastrzeżenia patentowe1. Wyizolowane przeciwciało o specyficznym powinowactwie do charakterystycznego epitopu Ekstra Domeny B fibronektyny, gdzie przeciwciało ma subnanomolarne powinowactwo do wymienionego epitopu Extra Domeny B i rozpoznaje Ekstra Domenę B (+) fibronektyny.
- 2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże domenę ED-B fibronektyny ze stałą dysocjacji Kd = 5,4 pM.
- 3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada ciężki łańcuch zmiennej domeny VH o sekwencji opisanej w SEQ ID NO.19.
- 4. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada następującą sekwencję aminokwasową:EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSSISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LOJMNSLRAED TAVYYCAKPFPL 199 353 B1PYFDYWGQGT LVTVSS GDGSSGGSGGAS EIVLTQSPGT LSLSPGERATLSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK
- 5. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest funkcjonalną odmianą L19 z sekwencją opisaną w SE ID NOs.19,20,21.
- 6. Przeciwciało według zastrz. 1-5, znamienne tym, że jest jednołańcuchową formą przeciwciała złożoną ze zmiennych części (scFv).
- 7. Przeciwciało według zastrz. 1-5, znamienne tym, że jest jedną cząsteczką, która cała jest przeciwciałem.
- 8. Przeciwciało według zastrz. 1-7, znamienne tym, że jest radioaktywnie wyznakowane.
- 9. Przeciwciało według zastrz. 1-8, znamienne tym, że jest wyznakowane radioaktywnym jodem.
- 10. Przeciwciało jak określono w zastrz. 1-9, do zastosowania w metodzie szybkiej lokalizacji znacznika angiogenezy.
- 11. Przeciwciało według zastrz. 10 do zastosowania do immunoscyntygraficznego wykrywania angiogenezy.
- 12. Przeciwciało według zastrz. 11 do zastosowania do detekcji chorób charakteryzujących się proliferacją naczyń krwionośnych, takich jak retinopatia cukrzycowa, związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej lub nowotwory.
- 13. Zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało jak określono w zastrz. 1-9 oraz jeden lub więcej odczynników niezbędnych do wykrywania angiogenezy.
- 14. Zastosowanie przeciwciała jak określono w zastrz. 1-9 do wytwarzania środka do diagnostyki nowotworów i chorób związanych z proliferacją naczyń krwionośnych.
- 15. Zastosowanie przeciwciała jak określono w zastrz. 1-9 do wytwarzania lekarstwa do terapii chorób nowotworowych i chorób związanych z proliferacją naczyń krwionośnych.
- 16. Koniugat zawierający przeciwciało jak określono w zastrz. 1-9 oraz cząsteczkę zdolną do wywoływania koagulacji krwi i zamknięcia naczynia krwionośnego.
- 17. Koniugat według zastrz. 16, w którym cząsteczka zdolna do wywołania koagulacji krwi i zamknięcia naczynia krwionośnego jest cząsteczką fotoaktywną.
- 18. Koniugat według zastrz. 17, w którym cząsteczka fotoaktywną jest fotouczulaczem.
- 19. Koniugat według zastrz. 18, w którym fotouczulacz absorbuje przy długości fali ponad 600 nm.
- 20. Koniugat według zastrz. 19, w którym fotouczulacz jest pochodną chlorku cyny (IV) eg.
- 21. Koniugat jak określono w zastrz. 16-20 do zastosowania w leczeniu ludzkich i zwierzęcych nowotworów i chorób związanych z proliferacją naczyń krwionośnych.
- 22. Zastosowanie koniugatu jak określono w zastrz. 16-20 do wytwarzania kompozycji do iniekcji przeznaczonej do leczenia patologii związanych z angiogenezą.
- 23. Zastosowanie koniugatu według zastrz. 22, w którym patologia związana z angiogenezą jest wywołana angiogenezą oczną lub jest towarzysząca angiogenezie ocznej.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7533898A | 1998-05-11 | 1998-05-11 | |
| US09/300,425 US20030045681A1 (en) | 1998-05-11 | 1999-04-28 | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL345845A1 PL345845A1 (en) | 2002-01-14 |
| PL199353B1 true PL199353B1 (pl) | 2008-09-30 |
Family
ID=26756726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL345845A PL199353B1 (pl) | 1998-05-11 | 1999-05-11 | Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało, koniugat zawierający przeciwciało i zastosowanie koniugatu |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070189963A1 (pl) |
| EP (1) | EP1084145B1 (pl) |
| JP (1) | JP2002514405A (pl) |
| CN (1) | CN1250571C (pl) |
| AT (1) | ATE301676T1 (pl) |
| AU (1) | AU759207B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI9910394B8 (pl) |
| CA (1) | CA2333833C (pl) |
| CZ (1) | CZ300495B6 (pl) |
| DE (1) | DE69926630T2 (pl) |
| DK (1) | DK1084145T3 (pl) |
| EA (1) | EA005685B1 (pl) |
| EE (1) | EE05435B1 (pl) |
| ES (1) | ES2247802T3 (pl) |
| HU (1) | HU225675B1 (pl) |
| IL (1) | IL139452A0 (pl) |
| IS (1) | IS2522B (pl) |
| NO (1) | NO327732B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ508600A (pl) |
| PL (1) | PL199353B1 (pl) |
| SK (1) | SK286822B6 (pl) |
| TR (1) | TR200003317T2 (pl) |
| TW (1) | TWI259837B (pl) |
| WO (1) | WO1999058570A2 (pl) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965132A (en) | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
| US6749853B1 (en) | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
| GB9610967D0 (en) | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
| DE69932084T2 (de) * | 1999-01-05 | 2007-06-28 | The Flinders University Of South Australia, Bedford Park | Antikörperfragmente zur lokalen Behandlung von Augenerkrankungen |
| DE19932688B4 (de) | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
| DE19947559A1 (de) * | 1999-09-24 | 2001-04-19 | Schering Ag | Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung |
| US6319273B1 (en) * | 1999-12-16 | 2001-11-20 | Light Sciences Corporation | Illuminating device for treating eye disease |
| CA2399866C (en) * | 2000-02-24 | 2011-05-10 | Philogen S.R.L. | Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions |
| CA2400622A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis |
| RU2280254C2 (ru) * | 2000-09-07 | 2006-07-20 | Шеринг Акциенгезельшафт | РЕЦЕПТОР EDb-ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА |
| DE10045803A1 (de) * | 2000-09-07 | 2002-04-11 | Schering Ag | Rezeptor der EDb Fibronektin-Domäne |
| US20030100010A1 (en) * | 2001-11-23 | 2003-05-29 | George Jackowski | Fibrinogen biopolymer Marker predictive of type II diabetes |
| US20030118657A1 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-26 | West Jennifer L. | Treatment of disease states characterized by excessive or inappropriate angiogenesis |
| BR0306715A (pt) * | 2002-01-03 | 2004-12-28 | Schering Ag | Métodos para diagnóstico e tratamento de tumores |
| DE60333820D1 (de) * | 2002-01-03 | 2010-09-30 | Bayer Schering Pharma Ag | Konjugate mit einem für die ed-b-domäne von fibronectin spezifischen antikörper, und deren verwendung zum nachweis und zur behandlung von tumoren |
| DE60330652D1 (de) * | 2002-03-11 | 2010-02-04 | Bayer Schering Pharma Ag | Antikörper aus anti-ed-b l19 gerichtet auf tumorblutgefässe |
| MX337052B (es) | 2002-07-15 | 2016-02-11 | Univ Texas | Peptidos que se enlazan a fosfatidiletanolamina y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cancer. |
| DE10324447A1 (de) | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
| DE10348319A1 (de) * | 2003-10-17 | 2005-05-19 | Schering Ag | Bindemoleküle für die Extra-Domäne B von Fibronectin zur Detektion von atherosklerotischen Plaques |
| US7785591B2 (en) | 2004-10-14 | 2010-08-31 | Morphosys Ag | Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies |
| EP1957531B1 (en) * | 2005-11-07 | 2016-04-13 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences |
| JP2009514540A (ja) * | 2005-11-09 | 2009-04-09 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 機能−阻止抗−ｅｄ−ｂ−フィブロネクチン抗体（ｐｒｉｖａｔｅ）の同定及び特徴化 |
| EP1842553A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-10 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule |
| EP1925664A1 (en) | 2006-11-15 | 2008-05-28 | Scil proteins GmbH | Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin |
| ES2382058T3 (es) | 2008-01-17 | 2012-06-04 | Philogen S.P.A. | Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos |
| EP2100621A1 (en) | 2008-03-10 | 2009-09-16 | mivenion GmbH | Polyether polyol dendron conjugates with effector molecules for biological targeting |
| JP2009244154A (ja) | 2008-03-31 | 2009-10-22 | Nationa Hospital Organization | 老化、および血管障害を伴う疾患の検定のための組成物、キットおよび方法 |
| EP2116555A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma |
| WO2010056889A2 (en) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of an antibody and a rare-earth based crystal |
| BR112012014194A2 (pt) | 2009-12-14 | 2017-01-10 | Scil Proteins Gmbh | um método para identificar proteínas ubiquitinas modificadas hetero-multiméricas com capacidade de ligação a ligandos |
| WO2011110490A1 (en) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Process for the production of radioactively labelled scfv antibody fragments, kits and compositions |
| WO2012171541A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins |
| WO2012172055A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
| WO2013010749A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-24 | Philogen S.P.A | Sequential anti - ctla4 and targeted il-2 therapy |
| RU2481839C2 (ru) * | 2011-08-16 | 2013-05-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития" | Способ лечения ишемической болезни сердца с дистальным или диффузным поражением коронарных артерий |
| WO2013186329A1 (en) | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Scil Proteins Gmbh | Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains |
| WO2014094799A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Scil-Proteins-Gmbh | Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life |
| CN104395342B (zh) * | 2013-06-06 | 2017-07-04 | 合肥立方制药股份有限公司 | 人源抗纤连蛋白ed‑b结构域的抗体及其用途 |
| EP3253785B1 (en) | 2015-02-06 | 2019-04-10 | Navigo Proteins Gmbh | Novel egfr binding proteins |
| KR102064396B1 (ko) | 2015-07-16 | 2020-01-09 | 나피고 프로타인스 게엠베하 | 신규한 면역글로불린-결합 단백질 및 친화도 정제에서의 이의 용도 |
| JP2018520675A (ja) | 2015-07-20 | 2018-08-02 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ | ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法 |
| EP3378947B1 (en) * | 2015-11-16 | 2024-01-24 | Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. | Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia |
| CN109310780A (zh) | 2016-05-04 | 2019-02-05 | 纳维格蛋白质有限公司 | 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物 |
| GB201612317D0 (en) | 2016-07-15 | 2016-08-31 | Philogen Spa | Antibody compositions |
| US11230576B2 (en) | 2016-08-11 | 2022-01-25 | Navigo Proteins Gmbh | Alkaline stable immunoglobulin-binding proteins |
| AU2017344440B2 (en) | 2016-10-17 | 2020-07-30 | Pfizer Inc. | Anti-EDB antibodies and antibody-drug conjugates |
| GB201621806D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Philogen Spa | Immunocytokines with progressive activation mechanism |
| WO2019062877A1 (zh) * | 2017-09-30 | 2019-04-04 | 合肥立方制药股份有限公司 | 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白 |
| US11414466B2 (en) | 2017-11-07 | 2022-08-16 | Navigo Proteins Gmbh | Fusion proteins with specificity for ED-B and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
| WO2019185792A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Philogen S.P.A | Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors |
| WO2020070150A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Philogen S.P.A | Il2 immunoconjugates |
| EP3660039A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-03 | Philogen S.p.A. | Il2 immunoconjugates |
| EP4359429A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Cytune Pharma | Interleukin 15 variants |
| BR112023027312A2 (pt) | 2021-06-23 | 2024-03-12 | Cytune Pharma | Imunocitocina |
| WO2023131611A1 (en) | 2022-01-04 | 2023-07-13 | Philogen S.P.A. | Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor |
| WO2024028258A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Philochem Ag | Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents |
| WO2024047237A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | Philogen S.P.A. | Tnf alpha and interleukin-2 combination therapy for non-melanoma skin cancer |
| WO2024052333A1 (en) | 2022-09-06 | 2024-03-14 | Philochem Ag | Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9610967D0 (en) * | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
-
1999
- 1999-05-10 TW TW088107648A patent/TWI259837B/zh active
- 1999-05-11 TR TR2000/03317T patent/TR200003317T2/xx unknown
- 1999-05-11 ES ES99923571T patent/ES2247802T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 DE DE69926630T patent/DE69926630T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 EA EA200001169A patent/EA005685B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 DK DK99923571T patent/DK1084145T3/da active
- 1999-05-11 EE EEP200000802A patent/EE05435B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 CA CA2333833A patent/CA2333833C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 WO PCT/EP1999/003210 patent/WO1999058570A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-11 SK SK1679-2000A patent/SK286822B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 AT AT99923571T patent/ATE301676T1/de active
- 1999-05-11 BR BRPI9910394 patent/BRPI9910394B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 EP EP99923571A patent/EP1084145B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 HU HU0102992A patent/HU225675B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 AU AU40398/99A patent/AU759207B2/en not_active Expired
- 1999-05-11 CZ CZ20004216A patent/CZ300495B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 NZ NZ508600A patent/NZ508600A/xx unknown
- 1999-05-11 PL PL345845A patent/PL199353B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 IL IL13945299A patent/IL139452A0/xx unknown
- 1999-05-11 CN CNB998060526A patent/CN1250571C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 JP JP2000548372A patent/JP2002514405A/ja active Pending
-
2000
- 2000-11-10 IS IS5708A patent/IS2522B/is unknown
- 2000-11-10 NO NO20005694A patent/NO327732B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-12-13 US US11/637,810 patent/US20070189963A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL199353B1 (pl) | Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało, koniugat zawierający przeciwciało i zastosowanie koniugatu | |
| US8097254B2 (en) | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis | |
| JP2009280607A (ja) | フィブロネクチンのｅｄ−ｂドメインに対する抗体、それを含有する抱合体、および、腫瘍および血管新生関連の疾病の診断および治療をするためのそれの用途 | |
| KR100741452B1 (ko) | 피브로넥틴 ｅｄ-ｂ 도메인에 대한 항체, 그 제조방법 및용도 | |
| JP5221641B2 (ja) | 腫瘍転移の血管新生と関連するフィブロネクチンのｅｄ−ａ抗原 | |
| KR102002739B1 (ko) | 류마티스 관절염과 연관된 항원 | |
| AU2001242432A1 (en) | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis | |
| US20030176663A1 (en) | Specific binding molecules for scintigraphy | |
| MXPA00011017A (en) | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis | |
| KR100494530B1 (ko) | 피브로넥틴ed-b도메인에대한항체,그제조방법및용도 | |
| BG65163B1 (bg) | Антитела за ed-b домен на фибронектин, съдържащи ги конюгации и използването им за диагноза и лечение на тумори и болестни състояния, свързани с ангиогенезата | |
| MXPA98009732A (en) | Antibodies for the fibronectin ed-b domain, its construction and u |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120511 |