HU225675B1 - Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use thereof for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis - Google Patents

Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use thereof for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis Download PDF

Info

Publication number
HU225675B1
HU225675B1 HU0102992A HUP0102992A HU225675B1 HU 225675 B1 HU225675 B1 HU 225675B1 HU 0102992 A HU0102992 A HU 0102992A HU P0102992 A HUP0102992 A HU P0102992A HU 225675 B1 HU225675 B1 HU 225675B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
domain
angiogenesis
fibronectin
antibodies
Prior art date
Application number
HU0102992A
Other languages
English (en)
Inventor
Dario Neri
Lorenzo Tarli
Francesca Viti
Manfred Birchler
Original Assignee
Eidgenoess Tech Hochschule
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/300,425 external-priority patent/US20030045681A1/en
Application filed by Eidgenoess Tech Hochschule filed Critical Eidgenoess Tech Hochschule
Publication of HUP0102992A2 publication Critical patent/HUP0102992A2/hu
Publication of HUP0102992A3 publication Critical patent/HUP0102992A3/hu
Publication of HU225675B1 publication Critical patent/HU225675B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgyát képezik szubnanomoláris affinitású antitestek, amelyek a fibronektin, az angiogenezis markerének ED-B-doménjára specifikusak. Szintén a találmány tárgyát képezi radioizotóppal jelölt, nagy affinitású ED-B elleni antitestek alkalmazása újonnan keletkező vérerek in vivő kimutatására és az antitesteket tartalmazó diagnosztikai reagenskészlet.
Ráadásul a találmány tárgyát képezik a fenti antitestek alkalmas fotoaktív molekulát (például fotoszenzitizátort) tartalmazó konjugátumai és azok alkalmazása új vérerek kimutatásában és/vagy koagulálásában.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható az angiogenezissel összefüggő patológiás állapotok és betegségek diagnosztikájában és terápiájában.
A tumorok nem képesek egy bizonyos tömeget elérve további növekedésre új vérerek kialakítása (angiogenezis) nélkül, és a hajszálerek sűrűsége és a tumor invazív jellege közötti összefüggést számos tumor esetében leközölték [Folkman, Natúré Med., 1: 27-31 (1995)]. Ráadásul az angiogenezis az oka a látás elvesztéséhez vezető ocularis rendellenességek többségének [Lee és munkatársai, Surv. Ophtamol. 43: 245-269 (1998); Friedlander, M. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93; 9764-9769 (1996)]. Az angiogenezis markereinek szelektív célba juttatására alkalmas molekulák lehetőséget nyújtanak vascularis proliferációval jellemezhető tumorok és más betegségek, mint például a diabetikus retinopátia és a korral összefüggő macularis dageneratio diagnózisára és terápiájára. Az agresszív, szolid tumorok többsége expresszál angiogenezismarkereket, és az intravénásán injektált specifikus kötő (molekulák) számára szükségszerűen könnyen hozzáférhetőek [Pasqualini és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 542-546 (1997); Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15:1271-1275 (1997)]. Az újonnan képződött erek célzott okklúziója a tumor infarktusát és visszahúzódását eredményezheti [O’Reilly és munkatársai, Natúré Med. 2: 689-692 (1996); Huang és munkatársai, Science 275:547-550 (1997)].
A fibronektin 91 tagú aminosavszekvenciából felépülő ED-S-doménja, amely azonos az egér, a patkány és az ember esetében, és amely specifikusan a neovascularis struktúrák körül felhalmozódó fibronektinbe alternatív összeillesztés („splicing) által kerül beillesztésre [Castellani és munkatársai, Int. J. Cancer 59: 612-618 (1994)], molekuláris beavatkozás célpontja lehet. Valójában az utóbbi időben fluoreszcens eljárások alkalmazásával kimutattuk, hogy egyláncú, ED-B elleni Fv-antitestfragmensek (scFv) szelektív módon a tumor vérereiben halmozódnak fel a tumort hordozó egerekben, és tapasztalatok szerint az antitest affinitása szabja meg a célba juttató teljesítményt [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997); a GB96/10967 3 számú szabadalmi bejelentésen alapuló PCT/GB97/01412 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés]. A tumor sikeres célba vételét az injektálás után 24 órával vagy későbbi időpontokban értékeltük ki.
Az ED-S-domén elleni antitestek tumor célba vételének alkalmazására történő termeltetésének különböző megközelítései ismeretesek.
Peters és munkatársai [Peters és munkatársai, Cell adhesion and Communication 3:67-89 (1995)] csak az intakt ED-B-domén szekvenciáját tartalmazó FN ellen termeltetett poliklonális antitesteket tártak fel, és kimutatták, hogy ezek specifikusan és direkt módon ehhez a doménhoz kötődnek.
Peters és munkatársai reagenseinek azonban van egy sor hátránya: az antiszérum az ED-B(+)-FN-t csak N-glikanázzal történő kezelés után ismeri fel. Ez a reagenseket alkalmatlanná teszi az olyan alkalmazásokra, mint a tumor megcélzása, képi megjelenítése és terápiája, mivel a deglikoziláció nem valósítható meg in vivő.
A szerzők maguk is elismerik, hogy az antitestek nem ismerik fel az emlőssejtek által termelt, teljes hosszúságú ED-B(+)-FN-l. Elismerik azt is, hogy mindeddig nem volt lehetséges a fibronektin ED-B-doménjára specifikus monoklonális antitest előállítása, még akkor sem, ha a fibronektin más doménjai (mint például az ED-A) ellen termeltettek antitesteket. A szakirodalomban jól ismert tény, hogy poliklonális antiszérumok nem elfogadottak a fenti alkalmazások céljaira.
A témában zajló, éveken át tartó intenzív kutatómunka után a fibronektin ED-S-doménját N-glikanázzal történő kezelés nélkül felismerő monoklonális antitestek előállítása csak a találmány szerinti megoldásban alkalmazott fágbemutatási („phage-display) eljárás alkalmazásával volt lehetséges.
Zang és munkatársai [Zang és munkatársai, Mátrix Biology 14: 623-633 (1994)] kutyaeredetű ES-S-domén ellen termeltetett poliklonális antiszérumot tárnak fel. A szerzők várakozásai szerint az antitestek a humán eredetű ED-B(+)-FN-ne\ keresztreaktivitást mutatnak, noha ezt nem tesztelték. A szerzők azonban elismerik a fibronektin ED-B-doménját direkt módon felismerő monoklonális antitestek előállításának bonyolultságát (613. old.). Az antiszérum az ED-B(+)-FN-t a Wesfern-blottal csak N-glikanázzal történő kezelés után ismeri fel. A fentiek szerint a glikanázzal történő emésztés szükségessége a reagenseket a találmány szerinti alkalmazásokra alkalmatlanná teszi.
Az ED-B(+)-FN ELISA-ban történő felismerése a deglikozilálás szükségessége nélkül csak abban az esetben történik meg, ha porcot denaturáló hatóanyaggal (4 M karbamid) extrahálunk, és a műanyagra zselatin alkalmazásával kötjük ki. A szerzők megjegyzik, hogy „az FN-molekula zselatinnal burkolt ELISA-lemezre történő kikötése valamilyen módon, az antiszérum általi felismeréshez megfelelően exponálhatja”. Az in vivő alkalmazások céljaira az FN nem denaturálható zselatinkötés által, ezért a találmány szerinti monoklonális kötőmolekulák nyilvánvaló előnyöket nyújtanak.
A JPO-2076598 számú és JPO-4169195 számú japán szabadalmi iratok tárgyát ED-B elleni antitestek képezik. Az iratokban nem írják le egyértelműen, hogy az ED-B elleni antitestek monoklonálisak-e. Ráadásul nem tűnik lehetségesnek az, hogy egyedi antitest (mint
HU 225 675 Β1 a JPO-2076598 számú japán szabadalmi iratban leírt antitest) „antigéndeterminánsa az (1), (2) vagy (3) képlet szerint leírható aminosavszekvencia:
(1) EGIPIFEDFVDSSVGY (2) YTVTGLEPGIDYDIS (3) NGGESAPTTLTQQT”.
Erre a következő bizonyítékok szolgálnak alapul:
(1) : Egy monoklonális antitest szükségszerűen jól definiált epitópot ismer fel.
(2) : A fibronektin ED-B-doménjának háromdimenziós szerkezetét NMR-spektroszkópiával meghatározták. Az (1), (2) és (3) szegmensek az ED-B-szerkezet oldalain helyezkednek el, és nem kötődhetnek egyidejűleg egy monoklonális antitesthez.
Ráadásul az alkalmazhatóság bizonyítása céljából bizonyítani kell az antitest tumorokban való lokalizálódását, valamint az EO-Sf+J-FN-struktúrák biológiai eredetű mintákban szerkezetromboló reagensekkel történő kezelés nélkül történő jelölődését.
A Carnemolla és munkatársai [Carnemolla és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267: 24 689-24 692 (1992)] által leírt SCf-antitest az FN 7. doménján elhelyezkedő epitópot ismer fel (amely a fibronektin ED-S-doménja jelenlétében eltemetett), és nem az ED-B-doménban levő epitópot. Ez szigorúan véve a humán eredetű fibronektin esetében igaz. így a BCf-antitest és a találmány szerinti antitestek különböző reaktivitást mutatnak. Ráadásul a SC1-antitest csak a 7. domént ismeri fel, és az EB-D-domén távollétében a fibronektin 7-8. doménját [Carnemolla és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267: 24 689-24 692 (1992)]. Az ilyen epitóp előállítható in vivő az FN-molekulák proteolitikus degradációjával. A találmány szerinti reagensek előnye az, hogy csak akkor lokalizálódnak az FN-molekulán vagy fragmensein, ha azok tartalmazzák az ED-S-domént.
A rákdiagnosztikában, közelebbről az elsődleges és másodlagos tumorléziók láthatóvá tételére előszeretettel alkalmazott eljárás az immunszcintiográfia. Az eljárás során a beteget alkalmas készülékkel (például gamma-detektorral) képalkotó eljárásnak vetjük alá radioizotóppal jelölt vegyület (például alkalmas hordozóhoz kapcsolt radionuklid) injektálása után. Szcintigráfiás alkalmazások céljaira tipikusan rövid életű gamma-emittereket alkalmaznak, mint például a technécium-99m, a jód—123 vagy az indlum-111, abból a célból, hogy a beteg ionizáló sugárzásnak való kitettségét minimalizálják.
A „Nuclear Medicine Department” (nukleáris orvostani osztály) által leggyakrabban alkalmazott radionuklid a technécium-99m (99mTc), egy hatórás féléletidejü gamma-emitter. A 99mTc-alapú sugárzó gyógyszerekkel injektált betegek tipikusan 12-24 órával az injekció után vizsgálhatóak képalkotó eljárásokkal; azonban az izotópoknak a konkrét léziókban történő felhalmozódása kívánatos korábbi Időpontokban.
Ráadásul amennyiben az újonnan kialakult vérerek gyors és szelektív lokalizálására alkalmas antitestek rendelkezésre állnak, ez a kutatókat arra ösztönzi, hogy az antitestekhez konjugátum céljából más, alkalmas molekulát keressenek diagnosztikai és/vagy terápiás előnyök elérése céljából.
A találmány összefoglalása
Tekintettel arra, hogy a nukleáris gyógyászat területén szükség van az injektálás után néhány órával a tumorléziók lokalizálására alkalmas radioizotópos gyógyászati készítményekre, valamint arra az információra, hogy az antitest affinitása a jelek szerint hatással van az angiogenezis sikeres célba vételét jellemző képességre, a találmány célja a fibronektin ED-S-doménjára specifikus, szubnanomoláris disszociációs konstanssal jellemezhető antitest előállítása [lásd az antigénaffinitás definícióját és méréseket ismertető összefoglalót: Neri és munkatársai, Trends in Biotechnol. 14: 465-470 (1996)]. A találmány szerinti megoldás kidolgozásával célunk volt továbbá alkalmas formában levő, a fibronektin ED-S-doménja elleni, radioizotópos jelöléssel ellátott antitestek előállítása, amelyek az injektálással történő bejuttatás után néhány órával tumorléziót detektálnak.
A találmány egyik szempontja szerint a találmány ilyen céljait olyan antitest által valósítjuk meg, amely a fibronektin ED-S-doménja jellegzetes epitópjához specifikus affinitással rendelkező és az ED-B-epitóphoz javított affinitást mutat.
A találmány egy további szempontja szerint a fenti antitestet az angiogenezis gyors célba vételére alkalmas markerként alkalmazzuk.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti antitestet és az angiogenezis detektálását szolgáló, egy vagy több reagenst tartalmazó diagnosztikai reagenskészlet.
A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti antitest alkalmazása vascularis proliferációval jellemezhető tumorok és betegségek diagnosztikájában és terápiájában.
Végül: a találmány egy lényeges szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti antitestet és alkalmas fotoaktív molekulákat (például hozzáértéssel kiválasztott fotoszenzitízátort) tartalmazó konjugátumok és alkalmazásuk új vérerek szelektív okklúziójában.
Terminológia
A leírásban alkalmazunk néhány kifejezést, amelyekre az alábbi definíciókat adjuk meg.
- Antitest
A kifejezés immunglobulinra vonatkozik, amely lehet természetes, részben vagy egészen szintetikusan előállított. A kifejezés magában foglal bármely polipeptidet vagy fehérjét, amely kötőhelye antitest kötődoménja, vagy azzal homológ kötődőmén. Ez származhat természetes forrásból, vagy lehet részben vagy egészen szintetikusan előállított. Az antitestekre példaként szolgálnak az immunglobulin-izotípusok és izotípusos alosztályaik; antigénkötő domént, mint például Fab-t, scFv-t, dAb-t vagy Fd-t tartalmazó fragmensek, és diantitestek („diabodies”). Lehetséges eljárás a monoklonális antitestből vagy más antitestből kiindulva rekombi3
HU 225 675 Β1 náns DNS eljárással más antitestek, vagy az eredeti antitest specificitását megtartó kiméra molekulák létrehozása. Ilyen eljárás többek között egy antitest-immunglobulin variábilis régióját vagy a komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-ek) kódoló DNS és egy másik immunglobulin konstans régiójához, vagy konstans régióját és a vázszekvenciát (vázszerkezetet) tartalmazó régióhoz történő kapcsolása. Lásd például az EPA184187 számú és az EPA239400 számú európai közzétételi iratot, és a GB 2188638A számú nagy-britanniai szabadalmi iratot. Antitestet termelő hibridómasejt vagy más sejt lehet alávetve genetikai mutációnak vagy más változtatásnak, amely megváltoztathatja (vagy ellenkezőleg: nem változtatja meg) a termelt antitestek specificitását. Mivel az antitestek számos módon módosíthatóak, az „antitest” kifejezést úgy értelmezzük, hogy az magában foglal bármely, a kívánt specificitású kötődoménnal rendelkező kötőpartnert vagy anyagot. így a kifejezés magában foglal antitestfragmenseket, antitestszármazékokat, funkcionális ekvivalenseket és homológokat, többek között bármely, immunglobulin-kötődomént tartalmazó, természetes vagy részben vagy egészen szintetikus eredetű polipeptidet. Az olyan kiméra molekulákat, amelyek immunglobulin-kötődomént vagy ekvivalensét más polipeptiddel fuzionálva tartalmaznak, szintén antigénnek nevezzük. Kiméra antitestek klónozásának és expresssziójának leírását megtaláljuk az EPA0120694 számú és az EPA0125023 számú európai közzétételi iratban. Kimutatták, hogy teljes antitestek fragmensei funkcionálhatnak kötőantigénekként. A kötőfragmensekre példákként szolgálhatnak: (1): a VL-, VH-, CL- és CHrdoménokból álló Fab-fragmens; a VH- és a CHrdoménokból álló Fd-fragmens; (3) a „szimpla („single” vagy monovalens) antitest VL- és VH-doménjából álló Fv-fragmens; (4) a VH-doménból álló dAb-fragmens [Ward és munkatársai, Natúré, 9: 341, 544-546 (1989)]; (5) izolált CDR-régiók; (6) két kapcsolt Fab-fragmenst tartalmazó bivalens F(ab’)2-fragmens; (7) egyláncú Fv-molekulák (scFv), ahol a VH-domén és a VL-domén olyan polipeptidkapcsolóval kapcsolódik, amely lehetővé teszi a két dómén asszociációját antigénkötő hely kialakítására [Bírd és munkatársai, Science 242: 423-426 (1988); Huston és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83 (1988)]; (8) bispecificitású, egyláncú FV-dimerek [PCT/US92/09965 számú nemzetközi bejelentés], és (9) diantitestek („diabodies”), génfúzióval előállított multivalens vagy multispecifikus fragmensek [WO94/13804 számú nemzetközi közzétételi irat; Holliger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]. A diantitestek polipeptidek multimerjei, amelyek mindegyike tartalmaz egy immunglobulin-könnyűlánc kötőrégióját tartalmazó első domént és egy immunglobulin-nehézlánc kötőrégióját tartalmazó második domént, és a két dómén egymással össze van kapcsolva (például peptidkapcsolóval), de egymással nem kapcsolódhatnak antigénkötő helyet kialakítva: az antigénkötő hely a multimeren belül az egyik polipeptid első doménja és egy másik polipeptid második doménja közötti asszociáció által alakul ki [WO94/13804 számú nemzetközi közzétételi irat]. Ha bispecifikus antitesteket alkalmazunk, ezek lehetnek hagyományos bispecifikus antitestek, amelyeket Holliger és Winter szerint [Holliger és Winter, Curr. Opin. Biotech. 4: 446-449 (1993)] előállíthatunk például kémiai eljárásokkal vagy hibrid hibridómák alkalmazásával, vagy lehetnek bármely, fenti bispecifikus antitestfragmensek. A teljes antitestekkel szemben előnyösek az scFv-fragmensek vagy a diantitestek. A diantitesteket és scFv-ket előállíthatjuk Fc-régió nélkül, csak a variábilis domént alkalmazva, az antiidiotípusreakciók hatásait potenciálisan csökkentve. Bispecifikus antitestek más formái többek között a Neri és munkatársai [Neri és munkatársai, J. Mól. Bioi. 46: 367-373 (1995)] által leírt antitestek.
- Komplementaritást meghatározó régiók
Hagyományosan antitest variábilis doménjai komplementaritást meghatározó régiói alatt azokat a hipervariábilis antitestszekvenciákat értjük, amelyek a specifikus antigénfelismeréshez alapvető fontosságúak. A leírásban a CDR definícióját és számozását Chothia és Lesk [Chothia és Lesk, J. Mól. Bioi. 196: 901-917 (1987)] szerint értelmezzük.
- Funkcionálisan ekvivalens változatformák
Ez a kifejezés olyan molekulát (változatot) jelöl, amely egy másik molekulához (az eredeti molekulához) viszonyítva szerkezeti különbségeket mutat, azonban valamilyen, szignifikáns mértékű homológiával, és az eredeti molekula biológiai funkciói közül legalább néhánnyal, például bizonyos antigén vagy epitóp kötésének képességével rendelkezik. A változatok lehetnek fragmensek, származékok vagy mutánsok formájában. Változatot, származékot vagy mutánst az eredeti molekulából egy vagy több aminosav addíciójával, deléciójával, helyettesítésével vagy inszerciójával nyerhetjük. Ezeket a változtatásokat nukleotid- vagy fehérjeszinten hajthatjuk végre. Például a kódolt polipeptid lehet az Fab-fragmens, amelyet egy más forrásból származó Fc-végződéshez illesztünk. Alternatívaként, köthetünk hozzá markert, mint például enzimet, fluoreszceint stb. Például a fibronektin ED-B-doménja jellegzetes epitópja elleni „A”-antitest funkcionálisan ekvivalens formája lehet az olyan „B”-antitest, amely a komplementaritást meghatározó régióban más szekvenciájú, de az „A”-antitesttel azonos epitópot ismer fel.
A fibronektin ED-B-doménjára specifikus, és szöveti metszetekben ED-S-fibronektint felismerő rekombináns antitesteket izoláltunk scFv formában antitest-fágbemutatási („phage display”) könyvtárból. Az egyik, E1-antitestet affinitási érlelési eljárásnak vetettük alá a javított affinitású H10- és az L19-antitestek előállítása céljából. Az L19-es antitest a fibronektin ED-B-doménjával szubnanomoláris tartományba eső disszocíációs konstanssal kötődik.
A nagy affinitású L19-es és a D1.3-as antitesteket (egy irreleváns antigénre, a tyúktojás-eredetű lizozimra specifikus antitest) radioizotóppal jelöltük, és tumort hordozó egerekbe injektáltuk. A tumorra, a vérre és a szervekre vonatkozó biológiai eloszlást különböző időpontokban meghatároztuk, és az injektált dózis/gramm
HU 225 675 Β1 szövet (%ID/g) százalékos értékben fejeztük ki. Az injektálás után már három óra elteltével az L19 tumor %ID/g-értéke jobb volt, mint a vér-%ID/g-érték, de a negatív kontrollként szolgáló D1.3-nál nem volt jobb. A tumorvér arányok növekedtek hosszabb idő elteltével. Ez azt valószínűsíti, hogy a nagy affinitású L19-es antitest alkalmas lehet tumort megcélzó hatóanyagként, például angiogenezis immunszcintigráfiás detektálására.
- Fotoszenzitizátor
A fotoszenzitizátort meghatározhatjuk olyan molekulaként, amely besugárzás és víz és/vagy oxigén jelenlétében a biomolekulákkal reakcióba lépő, toxikus molekulafélék (például „szinglet” oxigént) keletkezéséhez vezetnek, ezáltal potenciálisan a biológiai célpontok, mint például sejtek, szövetek vagy testnedvek károsodásához vezetnek.
A fotoszenzitizátorok különösen alkalmasak akkor, ha elnyelésük 600 nm feletti hullámhossznál van. Valójában a szövetek és testnedvek fényáteresztő képessége a 600-900 nm-es tartományban maximális [Wan és munkatársai, Photochem. Photobiol. 34: 679-681 (1981)].
A fotoszenzitizátorok célzott bejuttatása és az azt követő besugárzás az angiogenezissel összefüggő betegségek terápiájához visz közelebb [Yarmush, M. L. és munkatársai, Antibody targeted photolysis. Crit. Rév. Therap. Drug. Carrier Systems 10: 197-525 (1993); Rowe, P. M. Láncét 351:1496 (1998); Levy, J. Trends Biotechnoi. 13: 14-18 (1995)], különösen az ocularis neovasculatura szelektív eltávolítása esetében. A rendelkezésre álló terápiás módozatok, mint a direkt módon vagy akár fotoszenzitizátor hatóanyag beadása után végrehajtott lézeres fotokoaguláció, a szelektivitás hiánya miatt korlátozott, és tipikusan az egészséges szövetek és erek károsodásához vezetnek [Macular Phoyocoagulation Study Group, Arch. Ophtalm. 112: 480-488 (1994); Haimovici, R. és munkatársai, Curr. Eye Rés. 16:83-90 (1997); Schmidt-Erfurt, U. és munkatársai, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthamol. 236:365-374 (1998)].
A fenti érvek alapján beláthatjuk, hogy maximálisan fontos lenne a fotoszenzitizátorok szelektivitásának és specificitásának javítására szolgáló eljárások feltárására, ilyen eljárás például alkalmas hordozóval alkotott konjugátum képzése. Valószínű, hogy jó minőségű hordozómolekulák kifejlesztése nem magától értetődő feladat. Ráadásul valószínű, hogy nem minden fotoszenzitizátor alkalmas in vivő a kérdéses helyre történő szállításra. A fotoszenzitizátor kémiai szerkezete, oldhatósága, lipofil jellege, „tapadóssága” és hatásossága valószínűleg kritikus módon befolyásolják a célbajuttathatóságot és a fotoszenzitizátorkonjugátum hatékonyságát.
Kimutattuk, hogy a fibronektin ED-B-doménjára specifikus, nagy affinitású L19-antitest az okuláris angiogenezis egérmodelljénél szelektív módon az újonnan képződött vérereknél lokalizálódik szisztémás beadás során.
Az ón(IV)-klorin-e6 fotoszenzitizáló hatóanyaghoz kémiailag kapcsolt, és vörös fénnyel megvilágított
L19-antitest az ocularis neovasculatura szelektív okklúzióját közvetítette, és elősegítette a megfelelő endotélsejtek apoptózisát. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az új ocularis vérerek immunkémiai eljárással in vivő megkülönböztethetőek a már létezőektől, és erősen valószínűsítik azt, hogy a fotoszenzitizátorok célzott bejuttatása, és ezt követő besugárzása hatásos lehet a vakságot okozó szembetegségek, és esetleg más, az angiogenezissel összefüggő patológiás állapotok kezelésében.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírását adjuk meg.
A találmány megvalósítási módjait illusztráljuk a következő ábrákkal.
1. ábra: tervezett antitest-fágkönyvtárt mutat be;
2. ábra: a humán melanómaeredetű COLO-38sejtek lizátumainak 2 dimenziós l/Vesfern-blotjai;
3A., 3B. és 3C. ábra: a glioblastoma multiforme immunhisztokémiai kísérleteket mutatja be;
4. ábra: az antitest-(ED-Bj komplexek stabilitását mutatja be;
5. ábra: a radioizotóppal jelölt antitest biológiai eloszlását mutatja az antitestfragmenssel injektált, tumoros egér esetében;
6. ábra: az L19 aminosavszekvenciáját mutatja be;
7A. és 7B. ábra: nyúlszemek beültetett gömbökkel;
8. ábra: nyúleredetű cornea-metszetek immunhisztokémiai vizsgálatát mutatja be;
9. ábra: a nyulak szemstruktúrametszetei (cornea, iris és conjunctiva) immunhisztokémiai vizsgálatai, vörös alkalikus foszfatáz szubsztrát és hematoxillin alkalmazásával;
10. ábra: fluoreszcens jelölésű antitestek lokalizálódása az ocularis neovasculaturában;
11. ábra: a fotoszenzitizátorral kapcsolt fehérjével injektált nyulak szemének makroszkópos megjelenése, a besugárzás előtt és után;
12. ábra: a fotoszenzitizátorral kapcsolt fehérjével injektált és vörös fénnyel besugárzott nyulak szemstruktúrametszeteinek mikroszkópos analízisét mutatja be.
Az alábbiakban részletesen is ismertetjük az ábrákat.
1. ábra: Tervezett antitest-fágkönyvtár. (a) Az antitestfragmensek a fágon p///-fúzióként vannak bemutatva, amint azt vázlatosan ábrázoltuk. Az antitestkötő helyen (az antigén felől nézve) a Vk-CDR váza sárga, a VH-CDR-váz kék. A random mutációknak kitett aminosavak a Vk-CDR3 esetében a 91., a 93., a 94. és a 96. pozícióban (sárga), és a VH-CDR3 esetében a 95., a 96., a 97. és a 98. pozícióban (kék) vannak. Az említett oldalláncok Cb-atomjait sötétebb színekkel jelöltük. Szürke jelöléssel kiemeltük a CDR1 és CDR2 csoportjait is, amelyeket mutációnak vethetünk alá az antitestaffinitás javítása céljából. A RasMol program alkalmazásával (http://www.chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html) az scFv szer5
HU 225 675 Β1 kezetét a pdb ligm-file (Brookhaven Protein Data Bank http://www2.ebi.ac.uk./pcserv/pdbdb.htm) modelleztük. (b) PCR-amplifikálás és könyvtárklónozási stratégia. A DP47 és DPK22 germline templátokat módosítottuk (lásd a szöveget) abból a célból, hogy a CDR3-régiókba mutációkat vigyünk be. A géneket négyszögekkel jelöltük, és a GDR-eket a négyszögeken belül számozott kockaként tüntettük fel. A VH- és a t/í-szegmenseket ezután egyesítettük, és pDN332-fágemidvektorba klónoztuk. Az amplifikálásban és az egyesítésben alkalmazott láncindítókat (a 11-18. a. sz. szekvenciákat) a leírás végén soroljuk fel.
2. ábra: 2 dimenziós gélek és Wesfern-blotok. (a) Olyan, humán eredetű COÍO-38-melanomasejtek lizátumának ezüsttel festett 2D-PAG£-gélképe, amelyekhez rekombináns ED-B-tartalmú 7B89-et adtunk. A két 7B89-folt (bekarikázva) a fehérjetisztításra alkalmazott H/s-végződés részleges proteolízisének eredménye, (b) A 2a. ábrán bemutatottal azonos gél immunblotja, detektálóreagensként ED-B elleni E1-antitesteket és FLAG elleni M2-antitestet alkalmaztunk. Csak a 7B89-foltokat detektáltuk, ez a gélfoltbói izolált rekombináns antitest specificitását igazolja.
3A-3C. ábrák: A glioblastoma multiforme scFv-E1 (A), scFv-A2 (B) és scFv-G4 (C) alkalmazásával festett sorozatmetszetein végrehajtott immunhisztokémiai kísérleteket mutatja be, amelyek tipikus, glomerulus jellegű vascularis szerkezetet mutatnak. A skálajel 20 pm-t jelöl.
4. ábra: Az antitest-ED-S komplexek stabilitása. Az scFv-E1, scFv-H10 és scFv-L19 a fibronektin ED-B-doménjához való kötésének vizsgálata, (a) Az antitest affinitási érlelése során nyert, jobb disszociációs profilokat mutató S/Acore-szenzogramokat mutatja be. (b) Az scFv-(ED-B) komplex natív gélt alkalmazó elektroforetikus vizsgálatát mutatja be. Csak a nagy affinitású L19-antitest képez a fluoreszcens jelöléssel ellátott antigénnel stabil komplexet. A fluoreszcens detektálást a korábban leírtak szerint hajtottuk végre [Neri és munkatársai, BíoTechniques 20: 708-712 (1996)]. (c) Az scFv-(ED-B-biotin) komplex kompetíciója 100-szoros moláris feleslegben jelen lévő nem biotinilált ED-S-vel, elektrokemilumineszcencia mérésével követve, Or/'gen-készülék alkalmazásával. Az L19-(ED-B) esetében hosszú féléletidejű komplexet figyelhettünk meg. Fekete körök: 119; üres háromszög: H10.
5. ábra: Biológiai eloszlás a radioizotóppal jelölt antitestfragmenssel injektált tumoros egér esetében. A tumor és a vér biológiai eloszlását az injektált dózis/gramm százalékában fejeztük ki, és az idő függvényében ábrázoltuk. A releváns szervek biológiai eloszlását is megadjuk.
6. ábra: A nehéz láncot (VH), a kapcsolót és a könnyű láncot (VL) tartalmazó Lf9-antitest aminosavszekvenciáját mutatja be.
7A. és 7B. ábra: Olyan nyúlszemeket mutatunk be, amelyekbe angiogén anyagba áztatott polimer gömböket ültettünk.
8. ábra: Nyulak comea-metszetei immunhisztokémiás analízisének képét mutatja be L19-cel festődött, újonnan kialakult vérerekkel.
9. ábra: Ocularis struktúrák immunhisztokémiai vizsgálatai az L/9-antitest alkalmazásával. Specifikus vörös festődést figyeltünk meg a corneában (a), de az iris (b) körül nem, és a conjunctivában (c) sem. Kis nyilak: cornea-epithelium. A releváns vérereket nagy nyilakkal jelöltük. Skálajel: 50 pm.
10. ábra: A fluoreszcens jelölést hordozó antitesttel megcélzott ocularis angiogenezis immunfotodetektálását mutatja be. Erősen fluoreszcens comealis neovascularisatiót (nyíllal jelölve) figyeltünk meg az FN ED-S-doménjára specifikus L19-Cy5-ös antitestkonjugátummal injektált nyulak esetében, de a HyHEL-10-Cy5-ös antitesttel injektált nyulak esetében nem figyeltük meg a jelenséget. A cornea-metszetek immunfluoreszcens mikroszkópiás vizsgálata megerősítette, hogy az L19-CY5 (a) a cornea neovascularis struktúrái körül lokalizálódik, ellentétben a HyHEL-10-Cy5-tel (d). Az (a, b) képeket 8 órával az antitestinjektálás után vettük fel, a (c, d) képeket az antitestinjektálás után 24 órával injektált nyulak cornea-metszeteiről készítettük. P: gömbök.
11. ábra: Fotoszenzitizátorkonjugátummal kezelt nyulak szeméről készült makroszkopikus képek. Az L19-PS-se\ injektált nyulak szeme vörös fénnyel történő megvilágítás előtt (a) és után (b). A nyilak koagulált neovasculaturát jelölnek, amit a 16 órával a megvilágítás után készült (c) képen bemutatott Cy5-fluoro-angiogram hipofluoreszcens területe is bizonyít. Megjegyezzük, hogy nem figyeltünk meg koagulációt más vascularis struktúrákban, például a kitágult conjunctivalis erekben, összehasonlításképp a szivárgó erek hiperfluoreszcenciát mutató Cy5-fluoro-angiogramját, és a nem kezelt nyúl szeméről készült megfelelő színes fotót a (d) és (h) képen mutatjuk be. Az (e, f, g) képek az (a, b, c) képek analógjai, azonban az ovalbumin-PS-sel injektált és vörös fénnyel megvilágított nyulakról készültek. Nem figyeltünk meg koagulációt, és az angiogram a szivárgó erek hipofluoreszcenciáját mutatta ki. A korai stádiumú angiogenezist mutató, LP19-PS-se\ injektált nyulak szemét az (i-l) képeken mutatjuk be. A vörös fénnyel történő megvilágítás előtt (i) és 16 órával azután G) extenzív, és szelektív, fénnyel indukált intravascularis koagulációt mutat. Az ér okklúziója (nyíl) különösen nyilvánvaló volt a megvilágított szemű nyúl esetében, közvetlenül a feláldozás után (1), de nem volt detektálható ugyanazon nyúl nem megvilágított szeménél (k). P: gömb. Nyílheggyel jelöltük a corneo-scleralis kapcsolatot (limbus). Minden ábra esetében a kitágult, korábban már létező conjunctivalis erek a limbus felett láthatók, azonban a cornealis neovascularisatio a limbustól a gömb (P) irányában figyelhető meg.
A 12. ábra mutatja be a szelektív vérérokklúziót. AcMNPV ovalbumin-L19-PS-sel (a, e, i) vagy L19-PS-se\ (b, f, j) injektált és megvilágított nyulak H/E-comea metszeteinek (a, e, i: nem fixált; i, j: paraformaldehidben fixált) mikroszkópos analízisét mutatja
HU 225 675 Β1 be. Nagy nyilakkal jelezzük a nem károsodott (e, i) és teljes okklúziót szenvedett (f, j) vérereket. Az LPS-PS által a megvilágítás után közvetített, a cornealis neovasculaturát érintő szelektív okklúzióval és a korlátozott perivascularis károsodással (eozinofília) szemben a conjunctiva (k) és az iris (I) erei ugyanazon nyúl esetében nem mutatják károsodás jeleit. A fluoreszcens TŰNÉL mérési eljárás az apoptotikus sejtek különböző mennyiségét jelzi az LP19-PS-se\ (c, g) vagy ovalbumin-PS-sel (d, h) injektált, megvilágított nyulakböl származó metszetekben. A nagy nyilak néhány releváns vascularis struktúrát jelölnek. A kis nyilak cornealis epitheliumot jelölnek. Skálajelek: 100 pm (a-d) és 25 pm (e—I).
A következő példákkal a találmányt részletesebben is leírjuk.
1. példa
A fibronektin ED-B-doménjára specifikus, humán eredetű scfV-antitestfragmensek izolálása antitest-fágbemutatási („phage display”) könyvtárból Humán eredetű antitestkönyvtárt klónoztunk VH [DP47; Tomlinson és munkatársai, J. Mól. Bioi. 227: 776-798 (1992)] és Vk [DPK22; Cox és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 24: 827-836 (1994)] átöröklődő („germline”) génekből (lásd az 1. ábrán a klónozási és amplifikálási stratégiát). A könyvtár VW-komponensének előállításakor részlegesen degenerált láncindítókat alkalmaztunk (1. ábra) (11. a. sz. - 18. a. sz.) PCR-ala5 pú eljárásban a 95-98. pozíciókban random mutációk bevitele céljából. A könyvtár VL-komponensét ugyanúgy állítottuk elő: CDR3-régiók 9., 93., 94. és 96. pozíciójában random mutációk bevitelével. A PCR reakciókat a leírtak szerint [Marks és munkatársai, J. Mól. Bioi.
222: 581-597 (1991)] hajtottuk végre. A VH-VL scPv-fragmenseket PCR alkalmazásával történő egyesítéssel („PCR-assembly”) hajtottuk végre [1. ábra, Clackson és munkatársai, Natúré, 352: 624-628 (1991)], gélből izolált VH-és VL-szegmensekből. 30 pg tisztított VH-VL scEv-fragmenst emésztettünk kettős emésztéssel, Ncol és Ncotl 300-300 egységével, azután 15 pg Ncol/Ncotl-gye\ emésztett pDN332-1ágemidvektorba ligáltuk. A pDN332 a pHENÍ-fágemid származéka [Hoogenboom és munkatársai, Nucl.
Acids Rés. 19: 4133-4137 (1991)], amelyben a Nofí-hely és a lll gént megelőző amjber-kodon közötti szekvenciát a következő, D3sD3-FLAG-His6-VMa\ékot kódoló következő, D3sD3-FLAG-His6-to\dalékot kódoló szekvenciával helyettesítettük [Neri és munkatársai,
Natúré Biotechnology 14: 385-390 (1996)]:
Notl D D D S D D D
Y K D D
5'-GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC DDKHHHHHH „amber
GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG-3'
A transzformációt E. coli TGI-törzsébe Marks és munkatársai [Marks és munkatársai, J. Mól. Bioi. 222: 581-597 (1991)], és fágokat állítottunk elő standard 35 előiratoknak megfelelően [Nissim és munkatársai, J.
Mól. Bioi. 222: 581-597 (1991)]. Öt kiónt választottunk ki random módon, és szekvenáltuk az elszórt szennyeződések jelenlétének kizárása céljából.
Az egy, illetve négy lll típusú ED-B-s és 7B89-es rekombináns fibronektinfragmenseket pQE12-alapú expressziós vektorokból (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) expresszáltuk, a leírtak szerint [Carnemolla és munkatársai, Int. J. Cancer 68: 397-405 (1996)].
A fibronektin ED-S-doménja iránti szelekciót [Carnemolla és munkatársai, Int. J. Cancer, 68: 397-405 (1996); Zardi és munkatársai, EMBO J. 6: 2337-2342 (1987)] 10 nM-os koncentráció mellett hajtottuk végre, diszulfid-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel biotinilált antigén alkalmazásával (B-4531 reagens; SIGMA, Buch, 50 Svájc; 10), 2 dimenziós gélből eluáltuk, és sztreptavidinnel burkolt Dyna-gyöngyökhöz kötöttük (Dynal, Oslo, Norvégia). 1013 fágot alkalmaztunk minden mosásnál, ml-es reakció-térfogatban. A fágokat 2% tejet tartalmazó PBS-ben (MPBS) inkubáltuk 10 percig. Az oldat- 55 hoz 100 pl, MPBS-ben előblokkolt Dyna-gyöngyöket adtunk (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Norvégia). 5 perces keverés után a gyöngyöket mágneses térben elválasztottuk az oldatból, és hétszer mostuk 0,1% Tween-20-at tartalmazó PBS-sel (PBST), és háromszor PBS-sel. Az elúciót 2 perces, 500 pM ditio-treitolos (DTT) inkubálással hajtottuk végre, az antigén és a biotin közötti diszulfidhíd redukálása céljából. A gyöngyöket újra megkötöttük, és az eredményül kapott oldatot alkalmaztuk exponenciális növekedési fázisban levő TG 1-es E. co//sejtek fertőzésére. Háromszori mosás után az eluált fágot alkalmaztuk exponenciális növekedési fázisban levő 40 HB2151-es E. coli sejtek fertőzésére, és kilemezeltük (2*TY+0,1% glükóz+100 pg/ml ampicillin) - 1,5% agart tartalmazó táptalajra. Egyedi telepeket növesztettünk 2*TY+0,1% glükóz+100 pg/ml ampicillin lemezeken, és egy éjszakán át indukáltuk 30 °C-on, 1 mM IPTG-vel 45 antitestexpresszió kiváltása céljából. Az eredményül kapott felülúszókat ELISA alkalmazásával szkríneltük 10 nM biotinilált ED-S-vel kezelt, sztreptavidinnel burkolt mikrotiterlemezek és FLAG elleni M2-antitestek detektálóreagensként történő alkalmazásával (IBI Kodak, New Haven, CT). A szkrínelt kiónok 32%-a volt pozitív ebben a mérési eljárásban, és a legerősebb EL/SA-jelet adó három kiónt (Ε1, A2 és G4) szekvenáltuk, és további jellemzésnek vetettük alá.
Az EL/SA-méréseket gélfoltból kinyert, biotinilált ED-B, biotinilált, nem denaturált ED-B, szomszédos fibronektindoménokhoz kapcsolt ED-B (a 7689-doménokat tartalmazó rekombináns fehérje) és számos, irreleváns antigén alkalmazásával hajtottuk végre. Az E1-, A2- és G4-antitestek mindhárom ED-S-tartalmú fehér60 jevel erős és specifikus reakciót adtak. Ez a tény, és
HU 225 675 Β1 az, hogy a három rekombináns antitest tisztítható bakteriális felülúszókból ED-S-affinitási oszlop alkalmazásával, nagyon valószínűvé teszi azt, hogy az antitestek ED-B natív konformációjában jelen lévő epitópot ismernek fel. Nem detektáltunk reakciót olyan fibronektinfragmensekkel, amelyek nem tartalmaznak ED-B-domént (az adatokat nem mutatjuk be).
Annak tesztelése céljából, hogy a gélfolttal izolált antitestek a natív antigénnel szemben jó affinitással rendelkeznek-e, valós idejű („real-time) kölcsönhatási analízist hajtottunk végre felszíni plazmonrezonancia alkalmazásával, ö/Acore-készülékkel, a leírtak szerint [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)]. Az E1, A2 és G4 scEv-fragmensek az ED-S-hez 107-108 M_1-es tartományba eső affinitással kötődtek (1. táblázat).
Az antitestspecificitás és alkalmazhatóság további tesztelése céljából 2D-PAGE-immunblotot hajtottunk végre; olyan, humán eredetű, COLO-38-as melanoma-sejtvonal lizátumát futtatva gélen, amelyhez ED-B-tartalmú, rekombináns 7B89-fehérje minimális mennyiségét adtuk (2. ábra). Az scFV(E1) csak a 7B89-es foltot festette erősen és specifikusan.
Az E1-, A2- és G4-antitesteket alkalmaztuk kriosztátmetszetekben az ED-S-tartalmú fibronektin (B-FN) immunlokalizálása céljából a gliblastoma multiforme, egy agresszív, kiemelkedő mértékű angiogenetikus folyamatokkal jellemezhető humán agytumor esetében. A 3. ábra gliblastoma multiforma sorozatmetszeteit mutatja be, a tipikus, glomerulus jellegű vascularis struktúrákkal, amelyeket a három antitest vörösre fest. A sebészeti beavatkozást követően azonnal nitrogénben lefagyasztott gliblastoma multiforme minták metszeteinek immunológiai festését a leírtak szerint hajtottuk végre [Camemolla és munkatársai, Int. J. Cancer 68:397-405 (1996); Castellani és munkatársai, Int. J. Cancer 59: 612-618 (1994)]. Röviden: az immunológiai festést FLAG elleni M2-antitest (IBI Kodak), biotinilált, egér elleni poliklonális antitestek (Sigma), sztreptavidin-biotin alkalikus foszfatáz komplex festő reagenskészlet (BioSpa, Milano, Olaszország), naftol-AS-MX-foszfát és fast-red-TR (Sigma) alkalmazásával hajtottuk végre. G/'//-féle hematoxillint alkalmaztunk ellenfestékként, és a korábbiakban leírtak szerint [Castellani és munkatársai, Int. J. Cancer 59: 612-618 (1994)] glycergelben (Dako, Carpenteria, CA) montíroztunk.
Hasonló eljárások és az L19-es antitest (lásd a következő példát) alkalmazásával megvalósítottuk olyan, újonnan keletkező vérerek specifikus festését is, amelyek keletkezését nyulak corneájába ültetett angiogén jellegű anyagban, mint például vaszkuláris endoteliális növekedési faktorban vagy forbol-észterben áztatott polimer gömbök beültetésével váltottunk ki.
2. példa
Az ED-B-hez szubnanomoláris affinitással kötődő humán scFv-antitestfragmens izolálása Az scFv(E1)-et választottuk ki annak tesztelésére, hogy lehetséges-e affinitásának javítása az antigénkötő hely perifériáján elhelyezkedő CDR-aminocsoportokban korlátozott számú mutációval (1. ábra). Kombinatorikus mutációnak vetettük alá a 31-33., az 50., az 52. és az 54. aminosavakat az antitest VH-doménjában, és a megfelelő repertoárt filamentózus fágon „bemutattuk”. Ezekről az aminosavakról állapítottuk meg az antitest-antigén komplexek ismert 3 dimenziós szerkezete alapján, hogy nagy gyakorisággal kapcsolódnak az antigénnel. Az eredményül kapott, 4*10® kiónt tartalmazó repertoárt választottuk ki a fibronektin ED-B-doménjának kötésére. Kétszeri mosás és 96 egyedi klón szkrínelése után 27-szeresen javított affinitással rendelkező antitestet izoláltunk (H10, 1. és 2. táblázat). A mások által megfigyeltekhez hasonlóan a javított affinitás inkább az antigénről való lassabb disszociációnak tulajdonítható, mint a javított kon-értékeknek [Schier és munkatársai, Gene 169: 147-155 (1996); lto. J. Mól. Bioi. 248: 729-732 (1995)]. Feltételezik, hogy az antitest könnyű lánca sok esetben kevésbé járul hozzá az antigén kötési affinitásához, amit az a tény támaszt alá, hogy a könnyű láncuktól megfosztott természetes vagy mesterséges antitestek még képesek az antigénhez való kötődésre [Ward és munkatársai Natúré 341: 544-546 (1989); Hamers-Casterman és munkatársai, Natúré 363: 446-448 (1993)]. Ezért a VL-doménnak csak azt a két aminosavát (32. és 50.) vetettük alá random mutagenezisnek, amelyek az antigénkötő hely központjában helyezkednek el (1. ábra), és a 3 dimenziós szerkezetekben gyakran megfigyelhető az antigénnel való érintkezésük. Az eredményül kapott, 400 kiónt tartalmazó könyvtárt fágon történő bemutatásnak vetettük alá, és antigénkötés szempontjából szelektáltuk. Valós idejű („realtime”), S/Acore-készülék alkalmazásával végrehajtott kölcsönhatási analízis [Johnsson és munkatársai, BioTechnoques, 11:620-627 (1991)] és a koff elektrokemilumineszcens detektálást alkalmazó kompetíciós mérése alapján azonosítottunk egy kiónt (L19), amely a fibronektin ED-B-doménjához 54 pM-os Kd-vel kötődik (1. és 2. táblázat). Az affinitási érlelési kísérleteket a következők szerint hajtottuk végre. Az scFv(E1)-gént a következő láncindítók alkalmazásával PCR-rel amplifikáltuk: LMBIbis (5’-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (1. a. sz.) és DP47CDR1for (5’-GA GCC TGG CGG ACC CAG ATA ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (2. a. sz.) a VH-domén CDR1-régiójában a 31-33. pozíciókba random mutációk bevitelére, és DP47CDDR1back (5’-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3’) (3. a. sz.) és DP47CDR2for (5’-GTC TGC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3’) (4. a. sz.) VH-domén CDR2-régiójában az 50., 52., 54. pozíciók random mutagenezise céljából. Az scFv-gén fennmaradó VH-gén 3'-részét, a peptidkapcsolót és a VL-gént lefedő fragmensét a következő láncindítók alkalmazásával amplifikáltuk: DP47CDR2back (5’-ACA TAC TAC GCA GAC TGG GTG AAG-3’) (5. a. sz.) és JforNot (5’-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3’) (6. a. sz.) (94 °C, 1 perc, 60 °C, 1 perc, 72 °C, 1 perc). Az ered8
HU 225 675 Β1 menyül kapott három PCR-terméket gélből tisztítottuk, és PCR alkalmazásával összeállítottuk (21) az
LMBIbis és JforNot láncindítók alkalmazásával (94 °C, perc, 60 °C, 1 perc, 72 °C, 1 perc). Az eredményül kapott, egyedi PCR-terméket a PCR-elegyből tisztítottuk, Notl/Ncol alkalmazásával kettős emésztésnek vetettük alá, és Notl/Ncol-gye\ emésztett pDN332-vektorba ligáltuk. Megközelítőleg 9 pg vektort és 3 pg inzertet alkalmaztunk a ligálási elegyben, amelyet fenolozással és etanolos kicsapással tisztítottunk, 50 μΙ steril vízben reszuszpendáltunk, és elektrokompetens TGI-es E. coli sejtekbe juttattuk elektroporációval. Az eredményül kapott affinitási érlelési könyvtár 4*10® kiónt tartalmazott. A leírtak szerint előállított antitest-fágrészecskéket [Nissim és munkatársai, EMBO J. 13: 692-698 (1994)] alkalmaztunk a 7B89-cel burkolt immuncső [Carnemolla és munkatársai Int. J. Cancer 68: 397-405 (1996)] alkalmazásával történő elsődleges szelekcióban. A kiválasztott fágokat alkalmaztuk biotinilált ED-B-t alkalmazó második mosás/áztatásban, majd a sztreptavidinnel burkolt mágneses gyöngyökkel való kikötésben (Dynal, Oslo, Norvégia, lásd az előző fejezetet). A szelekciót követően megközelítőleg a kiónok 25%-a adott pozitív jelet az oldatfázisú ELISA-ban (a kísérleti előiratot lásd az előző fejezetben). Az EL/SA-mérésben pozitívnak bizonyult jelöltek közül a továbbiakban BIAcoreanalízissei azonosítottuk a legalacsonyabb kofrértéket adót (H10 1. táblázat) [Johnsson és munkatársai, BioTechniques 11:620-627 (1991)].
Az scFv(H10)-gént PCR-rel amplifikáltuk az LMBIbis és a DPKCDRIfor (5’-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G-3’) (7. a. sz.) láncindítók alkalmazásával a VL-domén CDR1-régiójában a 32. pozícióban random mutáció bevitelére [a számozást lásd: Chotia és Lesk, J. Mól. Bioi. 196: 901-917 (1987)], és a következő láncindítókkal: DPKCDRIback (5’-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-3’) (8. a. sz.) és DPKCDR2for (5-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (9. a. sz.) a VL-domén CDR2-régiójának 50. pozíciójánál random mutációk bejuttatása céljából. Az scFv-gén fennmaradó részét amplifikáltuk a DPKCDR2back (5-GCA TTC AGC AGG GCC AGT GGC-3’) (10. a. sz.) és a JforNot láncindítók alkalmazásával (94 °C, 1 perc, 60 °C, 1 perc, 72 °C, 1 perc). A három, eredményül kapott terméket összekapcsoltuk, emésztettük és pDN322-be klónoztuk a nehéz lánc mutagenezisénél leírtak szerint. A kapott könyvtárt biotinilált ED-B-vel inkubáltuk 3% BSA-ban 30 percig, majd sztreptavidinnel burkolt mikrotiterlemezre (Boehringer Mannheim GmbH, Németország) kötöttük 10 percen át. A fágokat 20 mM DTT-oldattal (1,4-ditio-DL-treitol, Fluka) eluáltuk, és exponenciális növekedési szakaszban levő TG-s sejtek fertőzésében alkalmaztuk.
A 96 telep ED-S-kötési analízise ELISA és BIAcora alkalmazásával az L19-es klón azonosításához vezetett. Az ED-B elleni E1-es, G4-es, A2-es, H10-es és L19-es scFV-antitestfragmensek szelektív módon festik az újonnan kialakuló vérereket agresszív tumorok metszetein (3. ábra).
A fent említett ED-B elleni antitestfragmenseket ezután előállítottuk egyedi, friss tenyészet fertőzésével 1 liter 2*TY tápközegben a leírtak szerint [Pini és munkatársai, J. Immunoi. Meth. 206: 171-182 (1997)], és affinitási tisztítási eljárásnak vetettük alá CNBr-aktivált Sepharose oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Svédország), amelyre 10 mg ED-BD-tartalmú 7B89-es rekombináns fehérjét [Camemolla és munkatársai, Int. J. Cancer 68: 397-405 (1996)] kötöttünk. Az oszlopra töltés után az oszlopot 50 ml ekvilibrálópufferrel mostuk (PBS, mM EDTA, 0,5 M NaCI). Az antitestfragmenseket ezután 100 mM trietanol-aminnal eluáltuk, azonnal semlegesítettük 1 M Hepessel (pH 7), és PBS-sel szemben dializáltuk. A BIAcore affinitási méréseket tisztított antitestekkel hajtottuk végre a leírtak szerint [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)] (4. ábra). A sáveltolódási analízist a leírtak szerint hajtottuk végre [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnology 14: 385-390 (1996)] az N-terminálison fluoreszcens jelölést hordozó rekombináns ED-B alkalmazásával [Carnemolla és munkatársai, Int. J. Cancer 68: 397-405 (1996); Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)] hajtottuk végre, az infravörös Cy5-fluorofór (Amersham) alkalmazásával (4. ábra). A B/Acore-analízis nem mindig teszi lehetővé a lassú disszociációval jellemezhető reakciók kinetikai paramétereinek pontos meghatározását a lehetséges újrakötődési effektusok és az alapvonal instabil volta miatt, és azért, mert hosszú mérési idők szükségesek annak megállapítására, hogy a disszociációs fázis egyszerű exponenciális profilt követ-e. Ezért a kinetikus disszociációs konstans (koff) meghatározása céljából kompetíciós kísérleteket hajtottunk végre [Neri és munkatársai, Trends in Biotechnoi. 14: 465—470 (1996)] (4. ábra). Röviden: ED-B elleni antitesteket (30 nM) inkubáltunk biotinilált ED-B-vel (10 nM) 10 percig, FLAG elleni A42-antitestek (0,5 pg/ml), és előzőleg ruténiumkomplexszel a leírás szerint jelölt [Deaver, D. R., Natúré 377: 758-60 (1995)] poliklonális, egér elleni IgG (Sigma) jelenlétében. Ehhez az oldathoz, párhuzamos kísérletekben, nem biotinilált ED-B-t (1 pg) adtunk különböző időpontokban. Ezután sztreptavidinnel burkolt, Origen mérési pufferben hígított Dyna-gyöngyöket [Deaver, D. R., Natúré 377: 758-60 (1995)] adtunk hozzá (20 pl, 1 mg/ml), és az eredményül kapott keverékeket ORIGEN analizátorral (IGEN Inc. Gaithersburg, MD USA). Ez a készülék olyan elektrokemilumineszcens jelet (ECL) detektál, amely a kompetíciós reakció végén még a biotinilált ED-B-hez kapcsolódó scFv-fragmens mennyiségével arányos. Az ECL jel ábrázolása a kompetíciós idő függvényében olyan profilt ad, amelyhez egyetlen, koff karakterisztikus konstanssal jellemezhető exponenciális görbe illeszthető (4. ábra, 2. táblázat).
3. példa
Tumorok célba vétele nagy affinitásé, radioizotóppal jelzett, a fibronektin ED-B-doménjára specifikus scFV-vel
Radioaktív jóddal jelzett scFv(L19)-et vagy scFv(D1.3)-at (a csirketojás-eredetű lizozimra specifi9
HU 225 675 Β1 kus, irreleváns antitest) intravénás injekcióban beadtunk szubkután módon beültetett patkányeredetű F9-teratokarcinómát (egy gyorsan növő agresszív tumort) hordozó egereknek. Az antitest biológiai eloszlását különböző időpontokban meghatároztuk (4. ábra). Az scFv(L19)-et és az scFv(D1.3)-at affinitási tisztításnak vetettük alá antigénoszlopon [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)], és jód-125-tel jelöltük a /odogen-eljárás alkalmazásával (Perce, Rockford, IL, USA). Az izotóppal jelzett antitestek immunreaktivitásuk több mint 80%-át megtartották, amit úgy határoztunk meg, hogy a jelzett antitesteket antigénoszlopra töltöttük, majd az átfolyó és az eluált frakciók radioaktivitását meghatároztuk. Beültetett, szubkután, patkányeredetű F9-teratokarcinómát hordozó nude egereket (12 hetes Swiss nude egerek, hímek) [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)] 3 gg (3-4 gCi) scFV-vel 100 gl sóoldatban beoltottunk. A tumor mérete 50-250 mg volt, mivel nagyobb tumor nekrotikus központot tartalmazhat. Nagyobb tumorokkal (300-600 mg) végrehajtott célzási kísérletek azonban alapvetően ugyanilyen eredményre vezettek. Három állatot alkalmaztunk minden időpont felvételére. Az állatokat feláldoztuk, és a szerveket mértük, és radioaktivitást határoztunk meg. A reprezentatív szervek célzási eredményeit az injektált antitest dózisa/gramm szövet százalékában (%ID/g) fejeztük ki. az scFV(L19) gyorsan kiürült a vérből a veséken át; a hagyományos antitestekkel szemben nem akkumulálódott a májban és más szervekben. 8% (injektált dózis/szövet gramm) a tumorban lokalizálódik már három órával az injektálás után; ez az érték azért csökken, mert a tumor nagysága megduplázódik a következő 24-48 órában. Az injektálás után 24 órával a tumor/vér arányok az L19 esetében 1,9, 3,9 és 11,8 volt, azonban mindig 1,0 alatt volt a negatív kontrollként alkalmazott antitest esetében.
Az izotóppal jelölt scFV(L19) elsődlegesen a tumorokon lokalizálódik már néhány órával az injektálás után, azt valószínűsítve, hogy alkalmas angiogenezis immunszcintigráfiás detektálására betegekben.
4. példa
Az ED-B elleni antitestek szelektív módon festik az újonnan kialakuló ocularis vérereket Az angiogenezis (új vérerek kialakulása a már létezőkből) sok betegség, többek között a rák és a látás elvesztéséhez vezető ocularis rendellenességek alapját képező, jellemző folyamat. A neovasculatura szelektív célba vételének és okkludálásának képessége diagnosztikai és terápiás lehetőségeket kínál.
Azt vizsgáltuk, hogy a B-FN az ocularis angiogenezis specifikus jelzője-e, és azt, hogy a B-FN-t felismerő antitestek alkalmasak-e ocularis neovascularis struktúrák szelektív célba vételére in vivő, szisztémás beadás során. Ezért vascularis endothelialis növekedési faktort vagy forbol-észtert tartalmazó gyöngyök sebészeti eljárással történő beültetésével angiogenezist stimuláltunk nyulak corneájában, ez lehetővé teszi az újonnan kialakuló vérerek közvetlen megfigyelését (7. ábra). 800 ng vascularis endothelialis növekedési faktort (Sigma) vagy 400 ng forbol-12-mirisztát-13-acetátot (PMA, Sigma) tartalmazó sucralfate/hydron gömböket (a Merck ajándéka, Darmstadt, Németország) ültettünk be New Zealand White nőstény nyulak comeájába, a leírtak szerint [D’Armato, R. J. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4082-4085 (1994)]. Angiogenezist indukáltunk mindkét faktorral. A nyulakat naponta ellenőriztük. Mindkét indukálószer által indukált, újonnan kialakuló vérerek erős FD-B-pozitivitást mutattak immunhisztokémiai mérés alapján. Minden további kísérletben PÍWA-gömböket alkalmaztunk.
Az immunhisztokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy az L19 erősen festi a nyulak corneájában indukált neovasculaturát (8., 9a. ábra), de a szem már előzőleg jelen levő vérereit (9b., c.) és más szövetek vérereit (az adatokat nem mutatjuk be) nem festi. Az immunhisztokémiát a leírtak szerint hajtottuk végre [Carnemolla, B. és munkatársai, Int. J. Cancer 68:397-405 (1996)].
5. példa
Az ED-B-hez szubnanomoláris affinitással kötődő, humán eredetű L19-antitestfragmens alkalmas az ocularis angiogenezist in vivő célba vételére Az angiogenezis előző példánál leírt nyúlmodellje és az immunfotodetektálási eljárás [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)] alkalmazásával bebizonyítottuk, hogy az L19 a vörös Cy5-fluorofórral kapcsolva [irreleváns antigén elleni (HyHEL-10)-Cy5 antitestfragmens azonban nem] intravénás injekcióban beadva az ocularis angiogenezist szelektív módon megcélozza. A növekedő ocularis erek fluoreszcens festődése világosan detektálható L19-cel azonnal az injektálást követően, és a festődés legalább két napig fennmaradt, a tumor angiogenezisénél előzőleg megfigyeltek szerint. A cornea-metszetek ezt követő, ex vivő immunfluoreszcens mikroszkópos analízise megerősítette a vascularis struktúrák körüli lokalizálódást az L19 esetében, de a HyHEL-10 esetében nem (10c., d. ábra).
Az ocularis neovascularisatio antitestalapú, szelektív, sikeres célba vételének bizonyítása, valamint a B-FN elleni antitestek reaktivitásának különböző fajokban történő kimutatása a jövőben lehetséges klinikai vizsgálatokat garantálja. Az immunfluoreszcens képalkotás alkalmas lehet az ocularis angiogenezis korai kimutatására a veszélyeztetett betegek esetében, mielőtt a léziók a fluoro-angiográfiában megnyilvánulnának.
Néhány módszertani részlet
Az ex vivő immunfluoreszcencia céljaira és néhány esetben a H/E festésekhez a comeát 4% paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben fixáltuk beágyazás előtt. A fluoreszcens fotodetektálási kísérleteket 5 mg/kg acepromazin nyugtatóval kezelt nyulakon hajtottuk végre. A célzási kísérletekben 3,5 mg scFv(L19).i-Cy50 66-ot és 2,8 mg scFvíHyHEL-IOj-i-CySo.es-at adtunk be intravénás injekcióban minden nyúlnak (injektálási idő: 15 perc). A comealis neovasculatura erős fluoreszcenciáját figyeltük meg már közvetlenül az L19 injektálása után (a HyHEL-10 injektálása után azonban nem), és a
HU 225 675 Β1 jelenség néhány órán át fennállt. A specificitás egy kiegészítő tesztjeként az előző napon scFv(HyHEL-10)-Cy5-tel injektált és a fluoreszcens fotodetektálási mérésben negatív nyulakat a következő napon scFv(L19)-Cy5-tel injektáltuk, és a comealis angiogenezis erős fluoreszcens festődését mutattuk ki.
A fluoreszcens detektáláshoz a szemet Cy5-excitációs filterrel (Chroma, Brattleboro, VT, USA) és két fényvezetővel (melyek végeit a szemtől körülbelül 2 cm-es távolságban helyeztünk el) felszerelt volfrám-halogénlámpával világítottuk meg (Schott KL1500-as modell, Zeiss, Jena, Németország). A fluoreszcenciát hűtött, C-mount Canon Zoom lencsékkel (V6*16, 16-100 mm; 1,9) és 50 mm átmérőjű Cy5-emissziós filterrel (Chroma) felszerelt, a megvilágított szemtől 3-4 cm távolságban elhelyezett C-5985-ös monokróm CCD-kamerával (Hamamatsu, Hamamatsu-City, Japan) detektáltuk. A felvételi idő 0,4 s volt.
A Cy5-fluoro-angiográfiás kísérleteket ugyanazzal a kísérleti elrendezéssel hajtottuk végre, azonban intravénásán 0,25 mg Cy5-Trist [a Cy5-NHS és trisz(hidroxi-metil)-amino-metán köztitermékét] adtunk be (injektálási idő: 5 s). A felvételi idő 0,2 s volt.
Az antitestfragmensek scFV formában voltak. Az scFV(L19) és az scFv(HyHEL-IO) tisztítását és N-hidroxi-szukcinimid indocianin-észtereivel (NHS) történő jelölésének leírását a következő közleményekben megtaláljuk: Neri, D. és munkatársai, Natúré Biotechnol. 15: 1271-1275 (1997); Fattorusse, R. és munkatársai, Structure 7; 381-390 (1999). Az antitest/Cy5 jelölés aránya a két antitest esetében 1,5:1 és 1,2:1 volt. A Cy5-NHS-t az Amersham Pharmacia Biotechtől (Zürich, Svájc), az ovalbumint a S/gmától (Buchs, Svájc) szereztük be.
A jelölési reakció után a konjugátumokat a be nem épült fluorofórtól vagy fotoszenzitizátortól PBS-sel (50 mM foszfát, pH 7,4, 100 mM NaCI) ekvilibrált PD- fO-oszlopok (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával választottuk el. Az antitestkonjugátumok immunreaktivitását antigénoszlopok alkalmazásával, affinitási kromatográfiával mértük [Neri és munkatársai, Natúré Biotechnoi. 15: 1271-1275 (1997)], és minden esetben 78%-nál magasabb értéket kaptunk. Az immunkonjugátumokat nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid-gélelektroforézissel vizsgáltuk, és ezek 30 000 dalton méretű sávként mozogtak (tisztaság3: 90%).
6. példa
Az Sn(IV)-klorid fotoszenzitizátorral kémiailag konjugált L19-es, humán eredetű antitestfragmens szelektív módon célozza meg az ocularis angiogenezist, és vörös fénnyel megvilágítva az angiogenezis okklúzióját közvetíti
Annak tesztelésére, hogy a szelektív éreltávolítás megvalósítható-e az antitest által közvetített célzás által, nyulakat injektáltunk az e6 ón(IV)-klorin-e6 fotoszenzitizátorral (PS) kapcsolt L19-es antitestfragmenssel vagy egy olyan, irreleváns fehérjével, amely nem lokalizálódik az újonnan kialakuló vérerekben (ovalbumin).
Az injektált állatok szemét vörös fénnyel megvilágítottuk (fénydózis: 78 J/cm2). A reprezentatív eredményeket a 11. ábrán mutatjuk be. Feltűnő makroszkopikus különbséget figyeltünk meg a megvilágítás után 16 órával az L19-PS-sel kezelt nyulaknál (11a., b. ábra): a comealis neovasculatura esetében koagulációt figyeltünk meg, de a conjunctiva vagy más, ocularis struktúrák ereiben nem. Az indocianin Cy5 fluorofór fluoro-angiográfiája (11c. ábra) megerősítette az érokklúziót jellegzetes hipofluoreszcens területként. Ezzel szemben a nem megvilágított szemek esetében a szivárgó neovasculatura hiperfluoreszcens területeit figyeltük meg (11d., h. ábra). Nem detektáltunk makroszkopikus változást az ovalbumin-PS-sel kezelt nyulak megvilágított ereiben (11 e—g. ábrák) az ophthalmoscopia és a Cy5-fluoro-angiográfia alkalmazásával sem. A comealis angiogenezis korai stádiumaiban a megcélzott L19-PS-konjugátum megvilágításának hatását a 11 i-1. ábrákon mutatjuk be. A szelektív módon koagulált vérerek makroszkóposán láthatóak voltak az élő állatok esetében (11i-j. ábrák), és még nyilvánvalóbbá váltak az állatoknál közvetlenül a feláldozás után (11k., I. ábra).
A fotodinamikus károsodást tovább vizsgáltuk, mikroszkópos eljárások alkalmazásával, A megvilágítás után az erek okklúzióját standard hematoxilin/eozin (H/E) festési eljárásokkal detektálhattuk a nem fixált és a paraformaldehidben fixált comea-metszeteken, az L19-PS-sel kezelt (11b., f., j.) állatok esetében, de az ovalbumin-PS-sel kezelt állatok esetében nem (11a., e., i. ábra). A cornea fotoszenzitizátorkonjugátummal megcélzott részében az apoptózis tisztán látható volt a fluoreszcens TU/VEÍ-vizsgálatban (11c., g. ábra), azonban alig volt detektálható a tintával festett negatív kontrolinál (11d., h. ábra). Nagyobb nagyításnál látható volt a vascularis struktúrák endotélsejtjeinek apoptózisa (11g. ábra). Nem volt megfigyelhető károsodás a kezelt állatoknál az iris, a sclera és a conjunctiva esetében a TUNEL-mérésben (nem mutatjuk be) és a H/E festésben (11 k., I. ábra) sem.
A neovasculatura szelektív, fotodinamikus eltávolítása az ocularis rendellenességek és más, angiogenezissel összfüggő, és fényszórási vagy száloptikai eljárások alkalmazásával történő megvilágítás számára elérhető patológiás állapotok kezelésében hasznosnak ígérkezik. A leírt vizsgálatok eredményei tisztán demonstrálják, hogy az ocularis neovasculatura szelektíven okkludálható a már korábban létező vérerek és normálszövetek károsodása nélkül.
Néhány módszertani részlet
Az ón(IV)-klorin-ee-ot választottuk a fotoszenzitizátorok készletéből a nyúleredetü, egér elleni pollklonális antitesttel (Sigma) történő kapcsolás utáni hatékonyság, oldhatóság és specificitás alapján. Az immunkonjugátumokat a humán CD47-re specifikus antitesttel (313441A, Pharmingen, San Diego CA, USA) burkolt vörösvértestek célzott fotolízlsével szkríneltük. Az ón(IV)-klorin-eg-ot a leírtak szerint állítottuk elő [Lu, X. M. és munkatársai, J. Immunoi. Methods 156: 85-99 (1992)]. A fehérjékhez való kapcsolás céljából az ón(IV)-klorin-e6-ot (2 mg/ml) 30 percig kevertük dime11
HU 225 675 Β1 til-formamidban EDC (N’-3-dimetil-amino-propil-Netil-karbodiimid-hidroklorid, Sigma) és NHS (N-hidroxi-szukcinimid, Sigma) tízszeres moláris feleslegében. Az eredményül kapott, aktivált keveréket ezután nyolcszoros térfogatú fehéjeoldathoz adtuk (1 mg/ml) és szobahőmérsékleten inkubáltuk 1 órán át.
A jelölési reakció után a konjugátumokat a be nem épült fluorofórtól vagy fotoszenzitizátortól PBS-sel (50 mM foszfát, pH 7,4, 100 mM NaCI) ekvilibrált PD- 10-oszlopok (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával választottuk el. Az antitestkonjugátumok immunreaktivitását az előző példánál leírtak szerint mértük.
A fotokémiai eljárással történő megsemmisítési (photokilling) kísérletekhez a nyulakat intravénásán injektáltuk 12 mg scFv(L19)i-ón(IV)-klorin-e6o.8-tal vagy 38 mg ovalbumin-ón(IV)-klorin-e6o 36-tal injektáltuk, és a kísérlet ideje alatt sötétben tartottuk. Az injektálás után 8 órával a nyulakat ketamin (35 mg/kg)+xilazin (5 mg/kg)+aceprozamin (1 mg/kg) keverékével elaltattuk, és az egyik szemet 13 percen át Cy5-filterrel (Chroma) és két fényvezetővel (melyek végeit a szemtől körülbelül 1 cm-es távolságban helyeztünk el) felszerelt Schott KL1500 volfrám-halogénlámpával megvilágítottuk. A megvilágított terület megközelítőleg 1 cm2 volt, 100 mW/cm2 megvilágítási teljesítménysűrűséggel, amit S1828-fotodetektorral (Newport Corp.,
Irvine, CA, USA) mértünk. A megvilágítás után nem figyeltünk meg az állatoknál nyugtalanságot („discomfort”). Megelőzésképpen a nyulak fájdalomcsillapítókat kaptak a megvilágítás után (0,03 mg/kg burenorfint). A fotokémiai eljárással történő megsemmisítés követése céljából a szemeket ophthalmoscopia alkalmazásával vizsgáltuk és KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausanne, Svájc) fundus-kamera alkalmazásával fény10 képeztük. Öt nyulat kezeltünk mindegyik ón(IV)-klorid-e6 konjugátummal, és csak az egyik szemet világítottuk meg, a másik belső, negatív kontrollként szolgált. További kontrollként két nyulat megvilágítottunk, de nem kaptak fotoszenzitizátorkonjugátumot.
A nyulak altatószer-túladagolással történő feláldozása után a szemeket azonnal kivettük, a corneákat eltávolítottuk, és Tissue Tekbe ágyazva (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan) lefagyasztottuk. Az ex vivő immunfluoreszcenciás mérésekhez és a H/E festések közül néhány esetben a corneákat 4% paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben fixáltuk a beágyazás előtt. 5 pm-es kriosztátmetszeteket alkalmaztunk a további mikroszkópos analízisekben. A fluoreszcens TUΛ/EÍ-méréseket a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre (Roche Dioagnostic, Rotkreuz, Svájc).
1. táblázat
A kiválasztott ED-B elleni antitestklónok szekvenciája
VH-lánc vL-lánc
Klón 31-33* 50-54* 95-98* 32* 50* 91-96*
A2 SYA AISGSG GLSI Y G NGWYPW
G4 SYA AISGSG SFSF Y G GGWLPY
E1 SYA AISGSG SPFY Y G TGRIPP
H10 SFS SIRGSS FPFY Y G TGRIPP
L19 SFS SIRGSS FPFY Y Y TGRIPP
A tervezett szintetikus könyvtárakból izolált antitestklónok releváns aminosavpozíciói (‘számozás: Tomlinson és munkatársai szerint) [Tomlinson és munkatársai, EMBO J. 14:4628-4638 (1995)]. Egybetűs aminosavkódot alkalmaztunk a standard /L/PAC-nómenklatúra szerint.
2. táblázat
Az ED-B elleni scFv-fragmensek affinitása
Klón kon (s-1M'1) koffís'1)6 koff(s-1)c Kd(M)*
A2 1,5*10® 2,8*10-3 - 1,9*10-5
G4 4,0*10“ 3,5*10-3 - 8,7*10-5
E1 1,6*10® 6,5*10-3 - 4,1*10-5
H10 6,7*10“ 5,6*10-4 9,9*10-® 1,5*10-9
L19 1,1*10® 9,6*10-® 6,0*10-® 5,4*10-11
*) Kd=koff/kon. A nagy affinitással kötődő H10 és L19 esetében a SMcore-mérésekböl származó kof(-értékek nem kellőképpen megbízhatóak a negatív töltésű szilárd karboxilát-dextrán-mátrix miatt; a Kd-értékeket így a kompetíciós kísérletekben kapott koff-értékekből számítottuk (lásd a kísérleti eljárásoknál).
koff, kinetikai disszociációs konstans; kon, kinetikai asszociációs konstans; Kd, disszociációs konstans. B: B/Acore-ral mérve; C: elektrokemilumineszcens detektálás alkalmazásával, kompetícióval mérve. Az értékek pontossága±50%, a koncentrációmeghatározások pontossága alapján.
HU 225 675 Β1
SZEKVENCIALISTA (210) 1 (211) 24 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: LMBIbis (400) 1 gcggcccagc cggccatggc cgag (210)2 (211) 54 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DP47CDR1for (400) 2 gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg (210) 3 (211) 23 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DP47CDR1back (400) 3 atgagctggg tccgccaggc tcc (210) 4 (211) 60 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DP47CDR2for (400) 4 gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt (210) 5 (211) 24 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DP47CDR2back (400) 5 acatactacg cagactccgt gaag (210)6 (211) 53 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: JforNot (400) 6 tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg (210) 7 (211) 47 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220)
HU 225 675 Β1 (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DPKCDRIfor (400) 7 gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 47 (210)8 (211) 23 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DPKCDRIback (400) 8 ttagcctggt accagcagaa acc 23 (210) 9 (211) 46 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DPKCDR2for (400) 9 gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 46 (210) 10 (211)21 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DPKCDR2back (400) 10 gcatccagca gggccactgg c 21 (210) 11 (211) 45 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DP47baNco (400) 11 gcggcccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45 (210)12 (211) 55 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: CDR3for (400) 12 ggttccctgg ccccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atact 55 (210) 13 (211) 24 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: VHpullth (400) 13 gcggcccagc atgccatggc cgag 24 (210) 14 (211) 66
HU 225 675 Β1 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: Jassm (400) 14 cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc cctggcccca gtagtc (210) 15 (211) 62 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DPK22assm (400) 15 gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt gacgcagtct cc (210) 16 (211) 63 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: DPK3for (400) 16 caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac agtaatacac tgc (210) 17 (211) 56 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: JforNot (400) 17 gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtcccttggc cgaacg (210) 18 (211) 24 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító: VLpullth (400) 18 gatgggtcca gtggcggtag cggg (210) 19 (211) 116 (212) PRT (213) VH antitest specifikusan a fibronektin ED-B doménjához (400) 19
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
HU 225 675 Β1
Ser Met Ser Trp Val 35 Arg Gin Alá 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Alá Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Alá Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115 (210) 20 (211) 14 (212) PRT (213) antitest linker
(220)
(400) 20
Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Alá Ser Thr Gly
1 5 10
(210) 21
(211) 108
(212) PRT
(213) VH antitest specifil kusan a fibro nektin ED-B dóméi njához
(400) 21
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Alá Thr Leu Ser Cys Arg Alá Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Alá Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Alá Ser Ser Arg Alá Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Alá Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (26)

1. A fibronektin ED-B-doménjának jellegzetes epitópjával szemben specifikus affinitást mutató izolált antitest, amelynek a ED-S-epitóppal szemben mutatott affinitása szubnanomoláris tartományba esik.
2. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely ED-B(+)-fibronektint ismer fel.
3. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely a fibronektin ED-S-doménjához 54 pM-os Kd-értékkel kötődik.
4. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely az scFvantitest-molekula alábbi aminosavszekvenciájú variábilis doménját tartalmazza:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS GDGSSGGSGGASTG
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK
5. A 4. igénypont szerinti antitest, amely a 19. a. sz. szerinti VH-domént tartalmaz.
6. A 4. igénypont szerinti antitest, amely a 21. a. sz. szerinti VL-domént tartalmaz.
7. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely L19 funkcionálisan ekvivalens változata, ahol az L19 aminosavszekvenciája a 19., 20. és 21. azonosító számon megadott szekvencia.
8. A 7. igénypont szerinti antitest, amely L19 fragmensét, változatát vagy mutánsát tartalmazza.
9. A 8. igénypont szerinti antitest, amely ED-B(+)-fibronektint ismer fel.
10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antitest, amely scFv formában van.
11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antitest, amely teljes antitest.
12 Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti antitest, amely radioizotóppal jelölt.
13. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti antitest, amely radioizotópként jódizotóppal van jelölve.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti antitest angiogenezis markereinek gyors célba juttatására szolgáló eljárásban történő alkalmazásra.
15. A 14. igénypont szerinti antitest angiogenezis 5 immunszcintigráfiás detektálására.
16. A 15. igénypont szerinti antitest vascularis proliferációval jellemezhető betegségek, mint például diabeticus retinopathia, korral összefüggő macularis degeneratio vagy tumorok detektálására.
10
17. Diagnosztikai reagenskészlet, amely 1-13.
igénypontok bármelyike szerinti antitestet és angiogenezis detektálásához szükséges egy vagy több reagenst tartalmaz.
18. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti anti15 test alkalmazása tumorok és vascularis proliferációval jellemezhető betegségek diagnózisára szolgáló diagnosztikai szer előállításában.
19. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti antitest alkalmazása tumorok és vascularis proliferációval
20 jellemezhető betegségek terápiájára szolgáló gyógyszer előállításában.
20. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti antitestet és a vér koagulációjának és a vérerek okklúziójának indukálására alkalmas molekulát tartalmazó konju25 gátum.
21. A 20. igénypont szerinti konjugátum, amely a vér koagulációjának és a vérerek okklúziójának indukálására alkalmas molekulaként fotoaktív molekulát tartalmaz.
30
22. A 21. igénypont szerinti konjugátum, amely fotoaktív molekulaként fotoszenzitizátort tartalmaz.
23. A 22. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a fotoszenzitizátor elnyelése 600 nm feletti hullámhossztartományban van.
35
24. A 23. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a fotoszenzitizátor ón(IV)-klorin-e6 származéka.
25. A 20-24. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum alkalmazása az angiogenezissel összefüggő patológiás állapotok kezelésére szolgáló injektálható
40 készítmény előállítására.
26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az angiogenezissel összefüggő patológiás állapotot ocularis angiogenezis okozza, vagy azzal függ össze.
HU0102992A 1998-05-11 1999-05-11 Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use thereof for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis HU225675B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7533898A 1998-05-11 1998-05-11
US09/300,425 US20030045681A1 (en) 1998-05-11 1999-04-28 Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
PCT/EP1999/003210 WO1999058570A2 (en) 1998-05-11 1999-05-11 Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use therefor for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0102992A2 HUP0102992A2 (hu) 2001-11-28
HUP0102992A3 HUP0102992A3 (en) 2003-09-29
HU225675B1 true HU225675B1 (en) 2007-06-28

Family

ID=26756726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0102992A HU225675B1 (en) 1998-05-11 1999-05-11 Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use thereof for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20070189963A1 (hu)
EP (1) EP1084145B1 (hu)
JP (1) JP2002514405A (hu)
CN (1) CN1250571C (hu)
AT (1) ATE301676T1 (hu)
AU (1) AU759207B2 (hu)
BR (1) BRPI9910394B8 (hu)
CA (1) CA2333833C (hu)
CZ (1) CZ300495B6 (hu)
DE (1) DE69926630T2 (hu)
DK (1) DK1084145T3 (hu)
EA (1) EA005685B1 (hu)
EE (1) EE05435B1 (hu)
ES (1) ES2247802T3 (hu)
HU (1) HU225675B1 (hu)
IL (1) IL139452A0 (hu)
IS (1) IS2522B (hu)
NO (1) NO327732B1 (hu)
NZ (1) NZ508600A (hu)
PL (1) PL199353B1 (hu)
SK (1) SK286822B6 (hu)
TR (1) TR200003317T2 (hu)
TW (1) TWI259837B (hu)
WO (1) WO1999058570A2 (hu)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
DE69932084T2 (de) * 1999-01-05 2007-06-28 The Flinders University Of South Australia, Bedford Park Antikörperfragmente zur lokalen Behandlung von Augenerkrankungen
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
DE19947559A1 (de) * 1999-09-24 2001-04-19 Schering Ag Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung
US6319273B1 (en) * 1999-12-16 2001-11-20 Light Sciences Corporation Illuminating device for treating eye disease
CA2399866C (en) * 2000-02-24 2011-05-10 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
CA2400622A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
RU2280254C2 (ru) * 2000-09-07 2006-07-20 Шеринг Акциенгезельшафт РЕЦЕПТОР EDb-ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА
DE10045803A1 (de) * 2000-09-07 2002-04-11 Schering Ag Rezeptor der EDb Fibronektin-Domäne
US20030100010A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-29 George Jackowski Fibrinogen biopolymer Marker predictive of type II diabetes
US20030118657A1 (en) * 2001-12-04 2003-06-26 West Jennifer L. Treatment of disease states characterized by excessive or inappropriate angiogenesis
BR0306715A (pt) * 2002-01-03 2004-12-28 Schering Ag Métodos para diagnóstico e tratamento de tumores
DE60333820D1 (de) * 2002-01-03 2010-09-30 Bayer Schering Pharma Ag Konjugate mit einem für die ed-b-domäne von fibronectin spezifischen antikörper, und deren verwendung zum nachweis und zur behandlung von tumoren
DE60330652D1 (de) * 2002-03-11 2010-02-04 Bayer Schering Pharma Ag Antikörper aus anti-ed-b l19 gerichtet auf tumorblutgefässe
MX337052B (es) 2002-07-15 2016-02-11 Univ Texas Peptidos que se enlazan a fosfatidiletanolamina y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cancer.
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
DE10348319A1 (de) * 2003-10-17 2005-05-19 Schering Ag Bindemoleküle für die Extra-Domäne B von Fibronectin zur Detektion von atherosklerotischen Plaques
US7785591B2 (en) 2004-10-14 2010-08-31 Morphosys Ag Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies
EP1957531B1 (en) * 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
JP2009514540A (ja) * 2005-11-09 2009-04-09 バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 機能−阻止抗−ｅｄ−ｂ−フィブロネクチン抗体（ｐｒｉｖａｔｅ）の同定及び特徴化
EP1842553A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule
EP1925664A1 (en) 2006-11-15 2008-05-28 Scil proteins GmbH Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin
ES2382058T3 (es) 2008-01-17 2012-06-04 Philogen S.P.A. Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos
EP2100621A1 (en) 2008-03-10 2009-09-16 mivenion GmbH Polyether polyol dendron conjugates with effector molecules for biological targeting
JP2009244154A (ja) 2008-03-31 2009-10-22 Nationa Hospital Organization 老化、および血管障害を伴う疾患の検定のための組成物、キットおよび方法
EP2116555A1 (en) 2008-05-08 2009-11-11 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma
WO2010056889A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of an antibody and a rare-earth based crystal
BR112012014194A2 (pt) 2009-12-14 2017-01-10 Scil Proteins Gmbh um método para identificar proteínas ubiquitinas modificadas hetero-multiméricas com capacidade de ligação a ligandos
WO2011110490A1 (en) 2010-03-09 2011-09-15 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Process for the production of radioactively labelled scfv antibody fragments, kits and compositions
WO2012171541A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
WO2012172055A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins
WO2013010749A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Philogen S.P.A Sequential anti - ctla4 and targeted il-2 therapy
RU2481839C2 (ru) * 2011-08-16 2013-05-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития" Способ лечения ишемической болезни сердца с дистальным или диффузным поражением коронарных артерий
WO2013186329A1 (en) 2012-06-13 2013-12-19 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains
WO2014094799A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Scil-Proteins-Gmbh Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life
CN104395342B (zh) * 2013-06-06 2017-07-04 合肥立方制药股份有限公司 人源抗纤连蛋白ed‑b结构域的抗体及其用途
EP3253785B1 (en) 2015-02-06 2019-04-10 Navigo Proteins Gmbh Novel egfr binding proteins
KR102064396B1 (ko) 2015-07-16 2020-01-09 나피고 프로타인스 게엠베하 신규한 면역글로불린-결합 단백질 및 친화도 정제에서의 이의 용도
JP2018520675A (ja) 2015-07-20 2018-08-02 ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法
EP3378947B1 (en) * 2015-11-16 2024-01-24 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia
CN109310780A (zh) 2016-05-04 2019-02-05 纳维格蛋白质有限公司 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物
GB201612317D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Philogen Spa Antibody compositions
US11230576B2 (en) 2016-08-11 2022-01-25 Navigo Proteins Gmbh Alkaline stable immunoglobulin-binding proteins
AU2017344440B2 (en) 2016-10-17 2020-07-30 Pfizer Inc. Anti-EDB antibodies and antibody-drug conjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
WO2019062877A1 (zh) * 2017-09-30 2019-04-04 合肥立方制药股份有限公司 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白
US11414466B2 (en) 2017-11-07 2022-08-16 Navigo Proteins Gmbh Fusion proteins with specificity for ED-B and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
EP4359429A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Cytune Pharma Interleukin 15 variants
BR112023027312A2 (pt) 2021-06-23 2024-03-12 Cytune Pharma Imunocitocina
WO2023131611A1 (en) 2022-01-04 2023-07-13 Philogen S.P.A. Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor
WO2024028258A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Philochem Ag Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents
WO2024047237A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Philogen S.P.A. Tnf alpha and interleukin-2 combination therapy for non-melanoma skin cancer
WO2024052333A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Philochem Ag Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9610967D0 (en) * 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods

Also Published As

Publication number Publication date
ES2247802T3 (es) 2006-03-01
EP1084145B1 (en) 2005-08-10
DE69926630D1 (de) 2005-09-15
CN1250571C (zh) 2006-04-12
PL345845A1 (en) 2002-01-14
HUP0102992A3 (en) 2003-09-29
IL139452A0 (en) 2001-11-25
BRPI9910394B8 (pt) 2021-07-06
EA005685B1 (ru) 2005-04-28
NO327732B1 (no) 2009-09-14
ATE301676T1 (de) 2005-08-15
IS2522B (is) 2009-07-15
AU4039899A (en) 1999-11-29
CA2333833A1 (en) 1999-11-18
NZ508600A (en) 2003-03-28
TR200003317T2 (tr) 2001-07-23
CZ20004216A3 (en) 2001-05-16
SK286822B6 (sk) 2009-06-05
IS5708A (is) 2000-11-10
DK1084145T3 (da) 2005-12-19
HUP0102992A2 (hu) 2001-11-28
EA200001169A1 (ru) 2001-04-23
NO20005694L (no) 2001-01-10
SK16792000A3 (sk) 2001-05-10
TWI259837B (en) 2006-08-11
BRPI9910394B1 (pt) 2013-07-02
AU759207B2 (en) 2003-04-10
EP1084145A2 (en) 2001-03-21
PL199353B1 (pl) 2008-09-30
BRPI9910394A (pt) 2001-01-09
WO1999058570A3 (en) 2000-03-16
CZ300495B6 (cs) 2009-06-03
CN1303393A (zh) 2001-07-11
EE05435B1 (et) 2011-06-15
CA2333833C (en) 2011-01-25
NO20005694D0 (no) 2000-11-10
US20070189963A1 (en) 2007-08-16
JP2002514405A (ja) 2002-05-21
WO1999058570A2 (en) 1999-11-18
EE200000802A (et) 2002-06-17
DE69926630T2 (de) 2006-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU759207B2 (en) Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
US8097254B2 (en) Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
JP2009280607A (ja) フィブロネクチンのｅｄ−ｂドメインに対する抗体、それを含有する抱合体、および、腫瘍および血管新生関連の疾病の診断および治療をするためのそれの用途
US9096670B2 (en) Antibodies of the ED-B domain of fibronectin, their construction and uses
AU2001242432A1 (en) Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US20030176663A1 (en) Specific binding molecules for scintigraphy
MXPA00011017A (en) Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
BG65163B1 (bg) Антитела за ed-b домен на фибронектин, съдържащи ги конюгации и използването им за диагноза и лечение на тумори и болестни състояния, свързани с ангиогенезата
KR100494530B1 (ko) 피브로넥틴ed-b도메인에대한항체,그제조방법및용도
MXPA98009732A (en) Antibodies for the fibronectin ed-b domain, its construction and u

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees