EA005685B1

EA005685B1 - Антитело, взаимодействующее с доменом ed-b (+) фибронектина, и способы его применения

Info

Publication number: EA005685B1
Application number: EA200001169A
Authority: EA
Inventors: Дарио Нери; Лоренцо ТАРЛИ; Франческа Вити; Манфред Бирхлер
Original assignee: Айдгенессише Технише Хохшуле Цюрих
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2005-04-28
Also published as: HUP0102992A2; NZ508600A; IS2522B; SK16792000A3; CN1250571C; NO327732B1; WO1999058570A3; US20070189963A1; WO1999058570A2; DE69926630T2; AU759207B2; HUP0102992A3; CN1303393A; ATE301676T1; TR200003317T2; DK1084145T3; PL345845A1; DE69926630D1; ES2247802T3; PL199353B1

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам с субнаномолярной аффинностью, специфичным в отношении характерного эпитопа ED-B-домена фибронектина, маркера ангиогенеза. Оно относится также к применению меченных радиоактивным изотопом высокоаффинных анти-ED-B антител для обнаружения вновь образующихся кровеносных сосудов in vivo и к диагностическому набору, включающему указанное антитело. Оно относится также к конъюгатам, включающим указанные антитела и подходящие фотоактивные молекулы (например, разумно выбранный фотосенсибилизатор), и к их применению для избирательной опосредованной светом окклюзии новообразованных кровеносных сосудов.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам с субнаномолярной аффинностью, специфичным в отношении характерного эпитопа ΕΌ-Β-домена фибронектина, маркера ангиогенеза. Оно относится также к применению меченных радиоактивным изотопом высокоаффинных анти-ΕΌ-Β антител для обнаружения вновь образующихся кровеносных сосудов ίη νίνο и к диагностическому набору, включающему указанные антитела.

Помимо этого, настоящее изобретения относится к конъюгатам, включающим указанные выше антитела и подходящую фотоактивную молекулу (например, фотосенсибилизатор), и к их применению для обнаружения и/или коагуляции новообразованных кровеносных сосудов.

Предпосылки к созданию изобретения

Опухоли не способны расти свыше определенной массы без образования новых кровеносных сосудов (ангиогенеза), и для целого ряда опухолей сообщается о корреляции между плотностью микрососудов и инвазивностью опухоли (Ро1кшап (1995), Ыа1иге Меб., 1, 27-31). Помимо этого, ангиогенез лежит в основе большинства глазных болезней, которые приводят к потере зрения [Ьее е! а1., 8шг. Орй!а1то1. 43, 245-269 (1998); Рпеб1апбег, М. е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8сЕ И8А 93, 9764-9769 (1996)]. Молекулы, способные селективно нацеливаться на маркеры ангиогенеза, должны создать клинические возможности диагностики и терапии опухолей, а также других заболеваний, которые характеризуются сосудистой пролиферацией, таких как диабетическая ретинопатия и возрастная дегенерация желтого пятна сетчатки. Маркеры ангиогенеза экспрессируются большинством агрессивных солидных опухолей и должны быть легко доступными для специфичных связывающих агентов, инъецируемых внутривенно (Раэдиайш е! а1., (1997), Ыа!иге Вю!есЬпо1., 15, 542-546; Ееп е! а1. (1997), Ыа!иге Вю1есЬпо1., 15, 1271-1275). Прицельная окклюзия новообразованной сосудистой сети может привести к инфаркту и коллапсу опухоли (О'КеШу е! а1. (1996), ХаИие Меб., 2, 689-692; Ниапд е! а1. (1997), 8с1епсе, 275, 547-550).

ΕΌ-Β-домен фибронектина, последовательность из 91 аминокислоты, идентичная у мышей, крыс и людей, которая вставлена путем альтернативного сплайсинга в молекулу фибронектина, специфичным образом накапливается вокруг неоваскулярных структур (Са§!е11аш е! а1. (1994), 1п!. 1. Сапсег 59, 612-618) и может служить мишенью для молекулярного внедрения. Действительно, авторы настоящего изобретения недавно показали с помощью флюоресцентной методики, что одноцепочечные Ρν-фрагменты антиΕΌ-Β антител ЦсРу) селективно накапливаются в кровеносных сосудах опухолей у мышей, и что аффинность антител, как представляется, определяет механизм нацеливания (Ееп е! а1. (1997), Ыа!иге Βΐο^ο^οί, 15, 1271-1275; международная патентная заявка № ΡΟΓ/ΟΒ97/01412, на основе

ΟΒ96/10967.3). Нацеливание на опухоль определяли через 24 ч после инъекции или позднее.

Известно о различных попытках получить антитела против ΕΌ-В-домена, чтобы использовать их для нацеливания на опухоли.

Ре!ег§ е! а1. (Се11 Абйещоп апб Соштишса!юп 1995, 3:67-89) раскрывают поликлональные антитела, полученные к антигенам, не содержащим никакой другой последовательности ΡΝ, кроме интактного ΕΌΒ-домена, и показывают, что они специфично и непосредственно связываются с этим доменом.

Однако реагенты, полученные Ре!ег§ е! а1., имеют ряд недостатков: антисыворотки Ре!ег§ е! а1. распознают ΕΌ-Β(+)-ΡΝ только после обработки Ν-гликаназой. Это делает указанные реагенты непригодными для такого использования, как нацеливание на опухоли, визуализация и лечение, поскольку дегликозилирование нельзя осуществить ш νί\Ό. Авторы отдают себе отчет в том, что их антитела не распознают полноразмерный ΕΌ-Β(+)-ΡΝ, вырабатываемый клетками млекопитающих. Они также признают тот факт, что получение моноклональных антител, специфичных в отношении ΕΌ-Β-домена фибронектина было невозможно, несмотря на то, что антитела против других доменов фибронектина (таких как ΕΌ-А) были получены. Специалистам хорошо известно, что поликлональные антисыворотки неприемлемы для указанного выше использования.

Даже спустя годы интенсивных исследований в этой области моноклональные антитела, распознающие ΕΌ-Β-домен фибронектина без обработки Ν-гликаназой, можно получить только с помощью метода дисплея на фаге, который использовался в настоящем изобретении.

Ζηπβ е! а1. (Ма1пх Βώ^^ 1994, 14: 623-633) раскрывают поликлональную антисыворотку, полученную против ΕΌ-Β-домена собаки. Эти авторы предусматривают возможность перекрестного реагирования с ΕΌ-ΡΝ человека, хотя такой тест проведен не был. Однако эти авторы осознают трудность получения моноклональных антител, непосредственно распознающих ΕΌ-Β-домен фибронектина (стр. 631). Эта антисыворотка распознает ΕΌ-Β(+)-ΡΝ в анализе вестерн-блоттинга только после обработки Νгликаназой. Как было упомянуто выше, необходимость обработки Ν-гликаназой делает эти реагенты непригодными для применения по настоящему изобретению.

Распознавание ΕΌ-Β(+)-ΡΝ в анализе ΕΡΙ8Λ происходит без необходимости дегликозилирования, но только на хряще, экстрагированном денатурирующим агентом (4М мочевиной) и фиксированным на пластике с помощью желатина. Авторы отмечают, что «связывание молекулы ΡΝ с желатином, прикрепленным к пластиковой поверхности на планшете для анализа Ε^I8Λ. может каким-то образом экспонировать эти эпитопы в такой степени, которая достаточна для того, чтобы их могла распознавать антисы

- 1 005685 воротка». Поскольку при использовании ίη νίνο ΕΝ нельзя денатурировать и связать с желатином, моноклональные связывающие агенты по настоящему изобретению имеют явное преимущество.

Японские патенты ΙΡ02076598 и ΙΡ04169195 относятся к анти-ΕΌ-Β антителам. Из этих документов не ясно, моноклональные ли анти ΕΌ-Β антитела описаны. Помимо этого, представляется невозможным, что одно антитело (такое как антитело, описанное в ΙΡ02076598) имеет антигенную детерминанту в аминокислотной последовательности формул (1), (2) или (3):

-(1) ΕΟΙΡΙΕΕΌΕνΌδδνΟΥ

-(2) ΥΤνΤΟΌΕΡΟΙΌΥΌΙδ

-(3) ΝΟΟΕ8ΛΡΤΤΕΤΟΟΤ на основе следующих данных:

ί) Моноклональное антитело должно распознавать четко определенный эпитоп.

(й) Трехмерная структура ΕΌ-Β-домена фибронектина определена посредством ЯМРспектроскопии. Сегменты (1), (2) и (3) лежат на противоположных плоскостях ΕΌ-Β-структуры и не могут одновременно связываться одним моноклональным антителом.

Помимо этого, с целью показать полезность антител должна быть продемонстрирована их локализации в опухолях, а также данные, свидетельствующие об окрашивании структур ΕΌ-Β(+)-ΕΝ в биологических образцах без обработки разрушающими структуру реагентами.

Антитело ВС1, описанное Сагпето11а е! а1. 1992, I. Βίοι. Сйет. 267, 24689-24692, распознает эпитоп на 7 домене ΕΝ, но не на ΕΌ-Β-домене, который является латентным в присутствии ΕΌ-Β-домена фибронектина. Оно строго специфично для человека. Таким образом, антитело ВС1 и антитела по настоящему изобретению демонстрируют разную реактивность. Более того, антитело ВС1 распознает 7 домен отдельно и 7-8 домен фибронектина в отсутствии ΕΌ-Β-домена (Сагпето11а е! а1. 1992, 1. Βίο1. Сйет. 267, 24689-24692). Такие эпитопы могут вырабатываться ίη νίνο путем протеолитического расщепления молекул ΕΝ. Преимущество реагентов по настоящему изобретению заключается в том, что они могут локализоваться на молекулах или фрагментах ΕΝ только если они содержат ΕΌ-Β-домен.

Для диагностики рака и, более конкретно, для визуализации первичных и вторичных опухолевых поражений, иммуносцинтиграфия представляет собой методику выбора. При этой методике пациентам проводят томографию с помощью подходящего устройства (например, гамма-камеры), после того, как им инъецировали соединение, меченное радиоактивными изотопами (например, радионуклидом, связанным с подходящим носителем). Для применения при сцинтиграфии обычно используют короткоживущие гамма-излучатели, такие как технеций-99т, иод-123 или индий-111, с целью свести к минимуму воздействие ионизирующего облучения на пациента.

Наиболее часто применяемым в радиологических отделениях радионуклидом является технеций99т (99тΤс), гамма-излучатели с периодом полураспада шесть часов. Пациентам, которым ввели радиоизотопные фармацевтические средства на основе 99тΤс, можно проводить томографию вплоть до 12-24 ч после инъекции; однако, желательна аккумуляция нуклида в области поражения, представляющего интерес, в более ранние сроки.

Помимо этого, если будут получены антитела, способные быстро и избирательно локализоваться в новообразованных кровеносных сосудах, исследователи будут иметь стимул для поиска других подходящих молекул для конъюгации с этими антителами, с целью получения диагностических и/или терапевтических преимуществ.

Краткое описание сущности изобретения

С учетом потребности медицинской радиологии в радиоизотопных препаратах, способных локализоваться в опухолевых поражениях через несколько часов после инъекции, а также информации о том, что аффинность антител, как представляется, оказывает влияние на их действие по нацеливанию в область ангиогенеза, целью настоящего изобретения является получение антител, специфичных в отношении ΕΌ-Β-домена фибронектина, с субнаномолярной константой диссоциации (см. обзор литературы по определением и измерениям аффинности антитело-антиген, Ееп е! а1. (1996)), ΤΐΌηάδ ίη Β^οΐесйηο1. 14, 465-470). Еще одной целью настоящего изобретения является получение меченных радиоактивными изотопами антител в удобном виде, направленных против ΕΌ-Β-домена фибронектина, которые выявляют опухолевые поражения уже через несколько часов после инъекции.

Одной особенностью настоящего изобретения является то, что указанные цели достигаются с помощью антитела, обладающего специфичной аффинностью к характерному эпитопу ΕΌ-Β-домена фибронектина и улучшенной аффинностью к указанному эпитопу ΕΌ-Β.

Еще одной особенностью настоящего изобретения является то, что описанное выше антитело используется для быстрого нацеливания на маркеры ангиогенеза.

Еще одной особенностью настоящего изобретения является диагностический набор, включающий указанное антитело и один или более реагентов для выявления ангиогенеза.

Еще одной особенностью настоящего изобретения является применение указанного антитела для диагностики и лечения опухолей и заболеваний, которые характеризуются пролиферацией кровеносных сосудов.

- 2 005685

И наконец, важную особенность настоящего изобретения представляют конъюгаты, включающие указанные антитела и подходящие фотоактивные молекулы (например, разумно подобранный фотосенсибилизатор), и их применение для избирательной светоопосредованной окклюзии новообразованных кровеносных сосудов.

Терминология

В настоящем изобретении используется несколько технических выражений, объяснения которых приводятся ниже.

- Антитело

Описывается иммуноглобулин, как естественный, так и частично или полностью синтезированный. Этот термин также относится к любому полипептиду или белку, имеющему домен связывания, который представляет собой домен связывания антитела, или гомологичен такому домену. Они могут быть получены из естественных источников или частично или полностью синтезироваться. Примерами антител являются изотипы иммуноглобулинов и их изотипические подклассы; фрагменты, которые включают антиген-связывающий домен, такие как РаЬ, 5сРу, Ρν, бАЬ, Рб; и диательца. Можно использовать моноклональные и другие антитела и с помощью методик рекомбинантной ДНК получать другие антитела или химерные молекулы, которые сохраняют специфичность оригинального антитела. Такие методики могут включать встраивание ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или гипервариабельные участки (СЭЯ), одного антитела в константные области или в константные области плюс каркасные области другого иммуноглобулина. См., например, ЕР-А-184187, СВ 2188638А или ЕР-А239400. Гибридому или другую клетку, вырабатывающую антитело, можно подвергнуть генетической мутации или другим изменениям, которые могут изменять или не изменять специфичность связывания вырабатываемых антител. Поскольку антитела можно модифицировать с помощью целого ряда способов, термин антитело следует истолковывать как включающий любой специфично связывающийся член или вещество, имеющие домен связывания нужной специфичности. Таким образом, этот термин охватывает фрагменты, производные, функциональные эквиваленты и гомологи антител, включая любой полипептид, содержащий домен связывания иммуноглобулина, как натуральный, так и полностью или частично синтетический. Таким образом, сюда относятся также химерные молекулы, включающие домен связывания иммуноглобулина, или эквивалент, слитый с другим полипептидом. Клонирование и экспрессирование химерных антител описаны в ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023. Было показано, что фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются: (ί) РаЬ-фрагмент, состоящий из УБ-, УН-, СЬ- и СН1-доменов; (ίί) Рб-фрагмент, состоящий из УН- и СН1-доменов; (ш) Ρν-фрагмент, состоящий из УБ- и УН-доменов одного антитела; (ίν) бАЬ-фрагмент (АУагб е! а1. (1989), Ыа!иге, 9, 341, 544-546), состоящий из УН-домена; (ν) выделенные СЭЯ-участки; (νί) Р(аЬ')2-фрагменты, бивалентный фрагмент, включающий два связанных между собой РаЬ-фрагмента; (νίί) одноцепочечные молекулы Ρν (ксРу), в которых УН-домен и УЪ-домен связаны полипептидным линкером, который позволяет этим двум доменам ассоциировать с образованием антигенсвязывающего участка (Впб е! а1. (1988) 8с1еисе, 242, 423-426; Ни5!ои е! а1. (1988) Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 85, 5879-83); (νίίί) одноцепочечные димеры РУ с двойной специфичностью (РСТ/Б892/09955) и (ίχ) диательца, поливалентные или полиспецифичные фрагменты, построенные путем слияния генов (\УО94/13804; НоШЬег е! а1. (1993) Ргос. ИаИ. Асаб. 8сг И8А, 90, 6444-6448). Диательца представляют собой мультимеры полипептидов, каждый из которых включает первый домен, включающий участок связывания легкой цепи иммуноглобулина, и второй домен, включающий участок связывания тяжелой цепи иммуноглобулина; причем оба эти домена связаны друг с другом (например, посредством пептидного линкера), но не способны связываться друг с другом с образованием антигенсвязывающего участка; антиген-связывающие участки образуются путем связывания первого домена одного полипептида в мультимере со вторым доменом другого полипептида в этом же мультимере (\УО94/13804). В случае, если необходимо использовать антитела с двойной специфичностью, то они могут представлять собой обычные антитела с двойной специфичностью, которые можно изготовить различными способами (Но11фег апб \Уш1ег (1993), Сигг. Ορίη. Вю!есй., 4, 446-449), например, получить химические путем или с помощью гибридных гибридом, или они могут представлять собой любые фрагменты антител с двойной специфичностью, упомянутые выше. Использование димеров 5сΡν или диателец может быть более предпочтительным, чем использование целых антител. Диательца и 5сΡν можно изготовить без Рс-области, с использованием только вариабельных доменов, что потенциально уменьшает эффекты антиидиотипической реакции. Другие формы антител с двойной специфичностью включают одноцепочечные СЯАЬ, описанные Коп е! а1. ((1995), I. Мо1. Вю1., 246, 367-373).

- Гипервариабельные участки

Традиционно, гипервариабельные участки (СЭЯ) вариабельных доменов антитела идентифицируются как гипервариабельные последовательности антитела, содержащие остатки, необходимые для специфичного распознавания антигенов. В этом документе авторы ссылаются на определение и нумерацию СЭЯ, описанные Сйо!Ыа апб Бекк (1987), I. Мо1. Вю1., 196, 901-917.

- функционально эквивалентная вариантная форма

- 3 005685

Этот термин относится к молекуле (варианту), которая, хотя и имеет структурные различия с другой молекулой (родительской), но сохраняет определенную значительную гомологичность, а также по крайней мере часть биологической функции родительской молекулы, например, способность связываться с определенным антигеном или эпитопом. Варианты могут быть в форме фрагментов, производных или мутантов. Вариант, производное или мутант можно получить посредством модификации родительской молекулы, путем добавления, делеции, замещения или вставки одной или более аминокислот, или путем образования связи с другой молекулой. Эти изменения можно осуществлять на уровне нуклеотида или белка. Например, закодированный полипептид может представлять собой ЕаЬ-фрагмент, который затем присоединяют к Ес-хвост из другого источника. Альтернативно, можно присоединять маркер, такой как фермент, флюоресцеин и т.п. Например, функционально эквивалентная вариантная форма антитела А против характерного эпитопа ΕΌ-Β-домена фибронектина могла бы представлять собой антитело В с другой последовательностью гипервариабельных участков, но распознающее тот же эпитоп, что и антитело А.

Авторы настоящего изобретения выделили рекомбинантные антитела в ксЕу-формате, которые являются специфичными в отношении ΕΌ-Β-домена фибронектина и распознают ЕЭ-В(+)-фибронектин в срезах тканей, из банка фагового дисплея антител. Одно из этих антител, Е1, подвергали аффинному созреванию, с получением антител Н10 и Ь19, с улучшенной аффинностью. Антитело Ь19 имеет константу диссоциации для ΕΌ-Β-домена фибронектина в пределах субнаномолярных концентраций.

Высокоаффинные антитела Ь19 и Ό1.3 (антитело, специфичное в отношении постороннего антигена, лизоцима куриного яйца) метили радиоактивным изотопом и инъецировали мышам, имеющим опухоли. Через различные промежутки времени получали данные по биораспределению в опухоли, крови и органах, и выражали их в проценте инъецированной дозы на грамм ткани (%ΙΌ/γ). Уже через 3 ч после инъекции %ΙΌ/γ (опухоль) был лучше чем %ΙΌ/γ (кровь) для Ь19, но не для отрицательного контроля Ό1.3. Соотношения опухоль:кровь возрастали позднее. Это наводит на мысль о том, что высокоаффинное антитело Ь19 может служить подходящим агентом для нацеливания на опухоль, например, для иммуносцинтиграфического выявления ангиогенеза.

- Фотосенсибилизатор

Фотосенсибилизатор можно определить как молекулу, которая после облучения и в присутствии воды и/или кислорода, будет генерировать токсические виды молекул (например, атомарный кислород), способные реагировать с биомолекулами, потенциально вызывая, таким образом, повреждение биологических мишеней, таких как клетки, ткани и жидкости организма. Фотосенсибилизаторы особенно полезны, когда они поглощают длины волн свыше 600 нм. На самом деле, проникновение света в ткани и жидкости организма является максимальным в пределах длин волн 600-900 нм |^Уап с1 а1. (1981), Р1юЮсйет. РЬо1оЬю1. 34, 679-681].

Прицельная доставка фотосенсибилизаторов, за которой следует облучение, представляет собой привлекательный подход к терапии заболеваний, связанных с ангиогенезом [Уаттикй, М.Ь. е1 а1., АпбЬойу 1агде1ей рйо1о1ук1к, Стй. Веу. Тйетар. Όπΐβ Сатег КуДетк 10, 197-252 (1993); Ро\\'е. Р.М., Ьапсе! 351, 1496 (1998); Ьеуу, I. Тгепйк Вю1есЬпо1. 13, 14-18 (1995)], особенно для избирательного удаления новообразованных кровеносных сосудов глаза. Использование имеющихся терапевтических способов, таких как лазерная фотокоагуляция, как непосредственная, так и после введения фотосенсибилизирующих агентов, ограничено отсутствием избирательности и обычно приводит к повреждению здоровых тканей и сосудов [Маси1аг РНоЮсоащйайоп К1ийу Отоир. Агс1. Ор1Иа1т. 112, 480-488 (1994); Натоуюц В. е1 а1., Сигг. Еуе Век. 16, 83-90 (1997); КсЬт1й1-Ег£иг(й, и. е! а1.; ОгаеГек Агс1. С1ш. Ехр. ОрЫйа1то1. 236, 364-374 (1998)].

Принимая во внимание аргументы, представленные выше, можно видеть, что открытие новых путей улучшения избирательности и специфичности фотосенсибилизаторов является крайне важным, например, путем конъюгирования их с подходящей молекулой-носителем. Очевидно, разработка молекулносителей хорошего качества окажется нетривиальной задачей. Более того, возможно, что не все фотосенсибилизаторы будут пригодны для поставки носителем в область, представляющую интерес, ΐη у1уо. Такие факторы как химическое строение, растворимость, липофильность, надежность связи с носителем и мощность фотосенсибилизатора, вероятно, будут коренным образом влиять на меткость и эффективность конъюгатов фотосенсибилизатора.

Авторы в настоящем документе показывают, что высокоаффинное антитело Ь19, специфичное в отношении ΕΌ-Β-домена фибронектина, после системного введения избирательно локализуется в новообразованных кровеносных сосудах в экспериментах на кроликах с ангиогенезом глаз. Антитело Ь19, химически соединенное с фотосенсибилизирующим агентом хлорином олова (IV) е₆ и облученное красным светом, опосредовало избирательную окклюзию новообразованных кровеносных сосудов глаза и способствовало апоптозу соответствующих эндотелиальных клеток. Эти результаты показывают, что новообразованные кровеносные сосуды глаза можно отличать от ранее существовавших сосудов с помощью иммунохимических методов ίη у1уо, и настоятельно предполагают, что прицельная доставка фотосенсибилизаторов с последующим облучением может быть эффективной при лечении глазных болезней, приводящих к слепоте, и, возможно, при лечении других заболеваний, связанных с ангиогенезом.

- 4 005685

Краткое описание чертежей

Варианты осуществления настоящего изобретения иллюстрируются следующими чертежами:

фиг. 1 показывает схему библиотеки фагового дисплея антител;

фиг. 2 - 2Ό гели и вестерн-блоттинг лизата клеток СОЬО-38 меланомы человека;

фиг. 3А, 3В, 3С - иммунохимические эксперименты на полиформной глиобластоме;

фиг. 4 - анализ стабильности комплексов антитело-(ЕП-В);

фиг. 5 - биораспределение мышей с опухолями, которым инъецировали фрагменты антител, меченные радиоактивным изотопом;

фиг. 6 показывает аминокислотную последовательность Ь19;

фиг. 7 А и 7В - глаза кролика с импланитированной гранулой;

фиг. 8 - иммуногистохимический анализ срезов роговицы глаза кролика;

фиг. 9 - иммуногистохимический анализ срезов глазных структур кроликов (роговицы, радужной оболочки и конъюнктивы) с использованием красного субстрата щелочной фосфатазы и гематоксилина;

фиг. 10 показывает локализацию антител с флюоресцентной меткой в новообразованных кровеносных сосудах глаза;

фиг. 11 - макроскопически вид глаз кроликов, которым инъецировали белки, связанные с фотосенсибилизаторами, до и после облучения;

фиг. 12 - микроскопический анализ срезов глазных структур кроликов, которым инъецировали белки, связанные с фотосенсибилизаторами, и облучали красным светом.

Подробное описание чертежей

Фиг. 1 показывает:

Схема библиотеки фагового дисплея антитела.

(a) Фрагменты антитела размещаются на фаге как слияние рШ, как изображено схематически. В участке связывания антитела (общий вид антигенов) каркас Ук СОК. обозначен желтым цветом, каркас УН СОК обозначен синим цветом. Остатками, подверженными случайным мутациям, являются положение Ук С.ПВ3 91, 93, 94 и 96 (желтый цвет) и положение УН СИК.3 95, 96, 97 и 98 (синий цвет). Атомы углерода этих боковых цепей показаны более темными цветами. Показаны также (серым цветом) остатки С.ПВ1 и СИК.2, которые можно подвергать мутациям для улучшения аффинности антитела. С помощью компьютерной программы К.а§Мо1 (ййр://тетете.сйет181гу.ис8С.еби/^1рке/1еасЫпд/га8то1.й1т1), была смоделирована структура ксЕу из рбЬ файла 11дт (Вгоокйауеп Рго1еш Эа1а Вапк; ййр://^те^2.еЬгас.ик/рс8егу/рб£сК1Ь.Ыт).

(b) ПЦР-амплификация и стратегия клонирования библиотек. Микробные линейные матрицы ΌΡ47 и ΌΡΚ22 были модифицированы (см. текст) для генерации мутаций в СИК.3-областях. Гены обозначены прямоугольниками, а СОК. - пронумерованными квадратами внутри прямоугольника. Затем осуществили сборку УН- и УЪ-сегментов и клонировали в фагемидный вектор рПЫ332. Праймеры (от 8ЕО ΙΌ N0:11 до 8Е0 ΙΌ N0:18), использованные в амплификации и сборке перечислены в нижней части листа.

Фиг. 2 показывает электрофорез в полиакриламидном геле 2Ό и вестерн-блоттинг (а) Окрашивание серебром после 2Ό-ΡΆΟΕ лизата клеток СОЬО-38 меланомы человека, к которым был добавлен рекомбинантный ΕΌ-В-содержащий 7В89. Два 7В89 пятна (кружок) образовались в результате частичного протеолиза Ηίδ-метки, использованной для очистки белка, (Ь) Иммуноблоттинг геля, идентичный таковому, изображенному на фиг. 2а, с использованием анти-ЕО-В Е1 (табл. 1) и М2 анти-ЕЬАС антител в качестве реагента-детектора. Были выявлены только пятна 7В89, что подтверждает специфичность рекомбинантного антитела, выделенного из гелевого пятна.

Фиг. 3А-3С показывают:

Иммуногистохимические эксперименты на серийных срезах полиформной глиобластомы, демонстрирующие типичные клубочкоподобные сосудистые структуры, окрашенные с помощью ксЕу Е1 (А), А2 (В) и С4 (С). Толщина срезов: 20 мкм.

Фиг. 4 показывает:

Стабильность комплексов антитело-(ЕП-В). Анализ связывания ксЕу Е1, Н10 и Ь19 с ΕΌ-Вдоменом фибронектина. (а) Сенсограммы ЫАсоге, показывающие улучшенные показатели диссоциации, полученные после аффинного созревания антител. (Ь) Нативный электрофорез в геле комплексов ксЕу(ΈΌ-В). Только высокоаффинное антитело Ь19 может образовывать стабильный комплекс с антигеном, меченным флюоресцентной меткой. Определение флюоресценции было выполнено как описывают (№п е! а1., (1996), ВкТесйшдцек, 20, 708-712).

(c) Конкуренция комплекса §сЕу-(ЕП-В-биотин) со 100-кратным молярным избытком небиотинилированного ЕО-В, которую наблюдали с помощью электрохемилюминесценции с использованием аппарата Огфеп. Можно наблюдать продолжительный период полужизни комплекса Ь19-(ЕП-В). Черные квадраты: Ь19; незакрашенные треугольники: Н10.

Фиг. 5 показывает:

Биораспределение мышей с опухолями, которым инъецировали фрагменты антител, меченные радиоактивным изотопом.

- 5 005685

Данные по биораспределению в опухоли и крови, выраженные как процент инъецированной дозы на грамм, нанесены на график в зависимости от времени. Приведены также данные по относительному биораспределению в органах.

Фиг. 6 показывает аминокислотную последовательность антитела Б19, включающего тяжелую цепь (УН), линкер и легкую цепь (УБ).

Фиг. 7А и 7В показывают глаза кролика с имплантированными полимерными гранулами, пропитанными ангиогенными веществами.

Фиг. 8 показывает иммуногистохимический анализ срезов роговицы глаза кролика с новообразованными кровеносными сосудами, окрашенными антителом Б19.

Фиг. 9 показывает иммуногистохимическое исследование глазных структур с использованием антитела Б19. Наблюдалось специфическое красное окрашивание вокруг новообразованных кровеносных структур в роговице (а), но не вокруг кровеносных сосудов радужной оболочки (Ь) и конъюнктивы (с). Маленькие стрелки: роговичный эпителий. Кровеносные сосуды, о которых идет речь, обозначены большими стрелками. Толщина срезов 50 мкм.

Фиг. 10 показывает иммунофотодетекцию антител с флюоресцентной меткой, нацеленных на ангиогенез глазных структур. Сильно выраженное новообразование кровеносных сосудов в роговице (обозначенное стрелкой) наблюдалось у кроликов, которым инъецировали конъюгат антитела Б 19-Су 5 (а), специфичного в отношении ΕΌ-Β-домена ΓΝ, и не наблюдалось при инъекции антитела НуНЕЬ-10-Су5 (Ь). Иммунофлюоресцентная микроскопия срезов роговицы подтвердила, что именно Ь19-Су5 (с), а не НуНЕБ-10-Су5 (б) локализуется вокруг новообразованных кровеносных структур в во-роговице. Изображения (а,Ь) были получены спустя 8 ч после инъекции антитела; (с,б) были получены с использованием срезов роговицы, выделенных от кроликов спустя 24 ч после инъекции антитела. Р, гранула.

Фиг. 11 показывает макроскопические изображения глаз кроликов, которым инъецировали конъюгаты с фотосенсибилизаторами. Глаз кролика, которому инъецировали Б19-РБ до (а) и спустя 16 ч после облучения красным светом (Ь). Стрелка указывает коагулированные новообразованные сосуды, что подтверждается как гипофлюоресцентная область на Су5 флюороангиограмме панели (с) спустя 16 ч после облучения. Нужно отметить, что в других сосудистых структурах коагуляции не наблюдается, например, в расширенных сосудах конъюнктивы. Для сравнения показана Су5 флюороангиограмма с гиперфлюоресценцией просачиваемых сосудов и соответствующая цветная фотография не меченный глаз кролика на (б) и (11). Изображения (е, ί, д) аналогичны (а, Ь, с), но принадлежат кролику, которому инъецировали овальбумин-РБ и которого облучали красным светом. Коагуляции не наблюдается, а ангиограмма демонстрирует гиперфлюоресценцию просачиваемых сосудов. Глаза кролика на ранней стадии ангиогенеза, которому инъецировали Б19-РБ, показаны на (ί-1). Изображения до (ί) и спустя 16 ч после облучения красным светом ()) выявляют обширную и избирательную индуцированную светом внутрисосудистую коагуляцию (стрелка). Окклюзия сосудов (стрелка) особенно очевидна в облученном глазе (1) кролика немедленно после умерщвления и не обнаруживается в необлученном глазе (к) того же кролика. Р, гранула. Острия стрелок указывают край роговицы (лимб). На всех рисунках над лимбом видны ранее существовавшие расширенные конъюнктивальные сосуды, в то время как можно наблюдать рост новообразованных сосудов роговицы из лимба по направлению к грануле (Р).

Фиг. 12 показывает микроскопический анализ избирательной окклюзии кровеносных сосудов. Н/Е срезы роговицы (а, е, Ь, £: нефиксированные; ί, р фиксированные параформальдегидом) кроликов, которым инъецировали овальбумин-РБ (а, е, ί) или Б19-РБ (Ь, £, _)) и которых облучали. Большие стрелки указывают показательные примеры неповрежденных (е, ί) или полностью окклюзированных (ί, _)) кровеносных сосудов. В противоположность избирательной окклюзии новообразованных сосудов роговицы и ограниченному периваскулярному повреждению (эозиновилии), опосредованным Б19-РБ, после облучения (Ь, £, _)), сосуды конъюнктивы (к) и радужной оболочки (1) у того же кролика не имеют признаков повреждения. Флюоресцентный анализ ΤϋΝΕΕ выявляет различное количество апоптотических клеток в срезах от облученных кроликов, которым инъецировали Б19-РБ (с, д) или овальбумин-РБ (б, 1). Большие стрелки указывают некоторые сосудистые структуры, о которых идет речь. Маленькие стрелка указывают эпителий роговицы. Толщина срезов: 100 мкм (а-б) и 25 мкм (е-1).

Настоящее изобретение более подробно описывается в следующих примерах.

Пример 1. Выделение ксГу-фрагментов антител человека, специфичных в отношении ΕΌ-Β-домена фибронектина, из библиотеки фагового дисплея антител.

Библиотеку антител человека клонировали с использованием УН ЩР47; Тотйпкоп с1 а1. (1992), I. Мо1. Вю1., 227, 776-798) и Ук ЩРК22; Сох е1 а1. (1994), Еиг. I. 1ттипо1., 24, 827-836) микробных линейных генов (см. фиг. 1, на которой отображена стратегия клонирования и амплификации). УН-компонент библиотеки был создан с использованием частично вырожденных праймеров (фиг. 1) (БЕО ΙΌ ΝΟ: 11 БЕО ΙΌ ΝΟ: 18) в методике на основе ПЦР, с внесением случайных мутаций на позициях 95-98 СЭРЗ. УЪ-компонент библиотеки генерировали таким же способом, путем внесения случайных мутаций на позициях 91, 93, 94 и 96 ί.’ΌΡ3. ПЦР-реакции выполняли как описано (Магкк е1 а1. (1991), I. Мо1. Вю1., 222, 581-597). УН-УБ ксГу-фрагменты конструировали посредством ПЦР-сборки (фиг. 1; С1асккоп е1 а1. (1991), №1иге, 352, 624-628), из очищенных посредством электрофореза в геле УН- и УБ-сегментов. 30

- 6 005685 мкг очищенных УН-УЪ ксЕу-фрагментов дважды подвергали ферментативному расщеплению с помощью 300 единиц Ысо1 и Νοΐΐ, затем вшивали в 15 мкг обработанного №11/№о1 фагемидного вектора ρΌΝ332. ρΌΝ332 является производным фагемиды ρΗΕΝΙ (НоодепЬоот е! а1. (1991), №с1. Ас1бк Кек., 19, 4133-4137), в котором последовательность между сайтом №11 и янтарь-кодоном, предшествующая гену III, была замещена следующей последовательностью, кодирующей метку Ό3§Ό3-ΕΕΆΟ-Ηίκ6 (№ιϊ е! а1. (1996), №1иге Вю!есйпо1о§у, 14, 385-390):

ΝοΡΙ β β В 3 В В β

Υ К Β Β

5' -ССС ССС ССА САТ САС САТ ТСС САС САТ САС ТАС ААС САС САС БВКНННННН янтарь

САС САС ААС САС САТ САС САТ САС САТ ТАС-3 '

Трансформации в штамм Е.сой ТС1 выполняли согласно Магкк е! а1. (1991, 1. Мо1. Вю1., 222, 581597), а фаги получали согласно стандартным методикам (Νίκκίιη е! а1. (1994), 1. Мо1. Вю1., 222, 581-597). Пять клонов отбирали случайным образом и секвенировали на предмет отсутствия первазивной контаминации.

Рекомбинантные ΕΌ-В- и 7В89-фрагменты фибронектика, содержащие один и четыре гомологичных повторностей типа III, соответственно, экспрессировали из экспрессирующих векторов на основе р0Е12 (01адеп. Сйа!кгог1й, СА, И8А), как описано (Сатешо11а е! а1. (1996), Ш!. 1. Сапсег, 68, 397-405).

Селекцию против рекомбинантного ΕΌ-В-домена фибронектина (Сагпето11а е! а1. (1996), Ш!. 1. Сапсег, 68, 397-405, ΖηΓάί е! а1. (1987), ЕМВО 1., 6, 2337-2342) осуществляли в концентрации 10 нМ, с использованием антигена, биотинилированного с помощью Ν-гидроксисукцинимидного эфира дисульфида биотина реагент В-4531; 81дта, Висйк, 8\\'Цхег1апб; 10) и элюированного из 2Ό геля и ловушки ЭупаЬеабк со стрептавидиновым покрытием (Эупа1, Ок1о, №ггау). Для каждого цикла пэннинга использовали 1013 фагов, в 1 мл реакции. Фаги инкубировали с антигеном в 2% молочной среде в физиологическом растворе с фосфатным буфером (МРВ8) в течение 10 мин. К этому раствору добавляли 100 мкл ЭупаЬеабк (10 мг/мл; Эупа1, Ок1о, №ггау), предварительно блокированных в МРВ8. После 5-минутного перемешивания гранулы выделяли из раствора с помощью магнита и семь раз промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером и 0,1% Твином-20 (РВ8Т) и трижды - физиологическим раствором с фосфатным буфером. Элюцию осуществляли путем инкубации в течение 2 мин с 500 мкл 50 мМ дитиотреитола (ЭТТ), для восстановления дисульфидного мостика между антигеном и биотином. Гранулы вновь отделяли и полученный раствор использовали для инфицирования клеток Е.со11 ТС1 в стадии экспоненциального роста. После трех циклов пэннинга элюированный фаг использовали для инфицирования клеток Е.со11 НВ2151 в стадии экспоненциального роста и засевали на планшеты с (2χΊΎ + 1% глюкоза + 100 мкг/мл ампициллина) - 1,5% агаром. Отдельные колонии выращивали на 2хТУ + 0,1% глюкоза + 100 мкг/мл ампициллина, и индуцировали в течение ночи при 30° 1 мМ ГРТО для достижения экспрессии антител. Полученные надосадочные жидкости подвергали скринингу посредством ЕЫ8А с использованием микротитрационных планшетов со стрептавидиновым покрытием, обработанных 10 нМ биотинилированным ЕЭ-В и анти-ЕЕЛО М2 антителом (И Кобак, №\ν Науеп, СТ) в качестве реагентадетектора. 32% прошедших скрининг клонов в этом исследовании были положительными, и три из них, которые показали наиболее сильный сигнал в анализе ЕЬТЗА (Е1, А2 и 04), секвенировали и далее охарактеризовывали.

Анализы ЕЫ8А выполняли с использованием биотинилированного ЕЭ-В, выделенного из гелевого пятна, биотинилированного ЕЭ-В, который не был денатурирован, ЕЭ-В, связанного со смежными доменами фибронектина (рекомбинантный белок, содержащий 7В89-домены) и ряда посторонних антигенов. Антитела Е1, А2 и 04 мощно и специфично реагировали со всеми тремя ЕЭ-В-содержащими белками. Этот факт, а также тот факт, что эти три рекомбинантных антитела могут быть очищены из бактериальных супернатантов на колонке с иммобилизованным ЕЭ-В, настоятельно наводят на мысль о том, что они распознают эпитоп, имеющийся в нативной конформации ЕЭ-В. С фрагментами фибронектина, которые не содержали ЕЭ-В-домен, реакция отсутствовала (данные не представлены).

С целью проверить, обладают ли антитела, выделенные против гелевого пятна, хорошей аффинностью в отношении нативного антигена, был выполнен анализ взаимодействия в условиях реального времени с использованием резонанса поверхностного плазмона с использованием инструмента ВМсоге, как описано (№п е! а1. (1997), №11иге Вю!есйпо1., 15, 1271-1275). Мономерные фракции ксЕу-фрагментов Е1, А2 и 04 связываются с ЕЭ-В с аффинностью в пределах 107-108 М-1 (табл. 1).

В качестве дополнительного испытания специфичности и пригодности антител был выполнен анализ 2П-РАОЕ иммуноблоттинга, с пропусканием через гель лизата клеточной линии СОЬО-38 меланомы человека, к которому были добавлены минутные количества ЕЭ-В-содержащего рекомбинантного белка 7В89 (фиг. 2). ксЕу(Е1) сильно и специфично окрашивали только пятно 7В89.

Антитела Е1, А2 и 04 использовали для иммунной локализации ЕЭ-В-содержащего фибронектина (В-ΕΝ) в замороженных срезах полиформной глиобластомы, агрессивной опухоли головного мозга чело

- 7 005685 века с выраженными процессами ангиогенеза. Фиг. 3 показывает серийные срезы полиформной глиобластомы, с типичными клубочкоподобными сосудистыми структурами, окрашенными в красный цвет этими тремя антителами. Иммунное окрашивание срезов образцов полиформной глиобластомы, замороженных в жидком азоте немедленно после хирургического удаления, выполняли, как описано (Сагпето11а е! а1. (1996), Ιηΐ. 1. Сапсег, 68, 397-405, Са81е11аш е! а1. (1994), Ιηΐ. 1. Сапсег, 59, 612-638). Вкратце, иммунное окрашивание выполняли с использованием М2-анти-РЬАС антитела (ΙΒΙ Кобак), биотинилированных антимышиных поликлональных антител (81дта), набора для окрашивания с комплексами стрептавидинбиотина и щелочной фосфатазы (В1о8ра, Мйап, Йа1у) и нафтол-А8-МХ-фосфата и быстрого красного ТВ (8щта). Гематоксилин Гилла использовали как противокраску, с последующей заливкой в глицергель (Вако. СагреШепа. СА), как сообщалось ранее (Сайейаш е! а1. (1994), Ιη!. 1. Сапсег, 59, 612-618).

Используя сходную методику и антитело Ь19 (см. следующий пример), авторы настоящего изобретения смогли также специфично окрасить новообразованные кровеносные сосуды, индуцированные имплантированием в роговицу глаза кролика полимерных гранул, пропитанных ангиогенными веществами, такими как сосудистый эндотелиальный фактор роста или сложные эфиры форбола.

Пример 2. Выделение ксРу-фрагментов антител человека, связывающихся с ΕΌ-Β с субнаномолярной аффинностью.

§сРу(Е1) выбрали для тестирования возможности улучшения его аффинности с ограниченным числом мутаций остатков СИВ, расположенных на периферии антигенсвязывающего участка (фиг. А). Авторы настоящего изобретения комбинационно мутировали остатки 31-33, 50, 52 и 54 УН антитела, и распределяли соответствующий спектр на нитчатом фаге. Установлено, что эти остатки часто контактируют с антигеном в известных трехмерных структурах комплексов антитело-антиген. Полученный спектр из 4 х 10⁸ клонов отбирали на предмет связывания с ΕΌ-Β-доменом фибронектина. После двух циклов пэннинга и скрининга 96 отдельных клонов было выделено антитело с улучшенной в 27 раз аффинностью (Н10; табл. 1 и 2). В полном соответствии с тем, что наблюдали другие исследователи, изучавшие аффинное созревание антител, улучшенная аффинность была обусловлена скорее более медленной диссоциацией от антигена, чем улучшенными значениями коп (8сЫег е! а1. (1996), Сепе, 169, 147-155, Йо (1995), 1. Мо1. Вю1., 248, 729-732). Распространено мнение, что легкая цепь антитела вносит меньший вклад в антигенсвязывающую аффинность, что подтверждается тем фактом, что как натуральные, так и искусственные антитела, лишенные легкой цепи, все же могут связываться с антигеном (АУагб е! а1. (1989), ЫаШге, 341, 544-546, Натега-Сайегтап е! а1. (1993), ИаШте, 363, 446-448). По этой причине авторы настоящего изобретения предпочли рандомизировать только два остатка (32 и 50) УЪ-домена, которые расположены в центре антигенсвязывающего участка (фиг. 1а) и, как часто обнаруживают, контактируют с антигеном в пространственных структурах. Полученную библиотеку, содержавшую 400 клонов, распределяли на фаге и отбирали на предмет связывания с антигеном. По результатам анализа параметров диссоциации с использованием анализа взаимодействия в условиях реального времени с помощью инструмента ВМсоге (1оп8§оп е! а1. (1991), Во1Тесйп1дце8, 11, 620-627) и измерений величин ко££ с помощью конкурентных экспериментов с электрохемилюминесцентным обнаружением, был идентифицирован клон (Ь19), который связывался с ΕΌ-Β-доменом фибронектина с величиной Кб = 54 пМ (табл. 1 и 2). Эксперименты по аффинному созреванию были выполнены следующим образом. Ген §сРу(Е1) подвергали ПЦР-амплификации с использованием праймеров ΕΜΒ1Μδ (5'-ССС ССС САС ССС ССС АТС ССС САС-3') (8ЕО ΙΌ N0:1) и ОР47СПВ1£ог (5'-СА ССС ТСС ССС АСС САС СТС АТМ ΝΝΜ ΝΝΜ ИИССТА ААС СТС ААТ ССА САС ССТ С-3 ') (8ЕО ΙΌ N0: 2) для внесения случайных мутаций в положения 31-33 в СЭВ1 УН (для нумерации: 28) и праймеров ПР47СЭВ1Ьаск (5'-АТС АСС ТСС СТС ССС САС ССТ СС-3') (8ЕО ΙΌ N0:3) и ОР47СПВ2£ог (5'-СТС ТСС СТА СТА ТСТ ССТ АСС ΜΝΝ АСТ АСС ΜΝΝ ААТ ΜΝΝ ТСА САС ССА СТС САС ССС СТТ-3 ' ) (8ЕО ΙΌ Ν0: 4) для внесения случайных мутаций в положения 50, 52, 54 в СПВ2 УН. Оставшийся фрагмент гена ксРу, покрывающий 3 -часть гена УН, пептидный линкер и ген УЪ, амплифицировали с использованием праймеров ПР47СПВ2Ьаск (5'-АСА ТАС ТАС ССА САС ТСС СТС ААС-3') (8ЕО ΙΌ Ν0:5) и Йог\о1 (5'-ТСА ТТС ТСС АСТ ТСС ССС ССС ТТТ САТ ТТС САС СТТ ССТ ССС ТТС ССС САА СС-3') (8ЕО ΙΌ Ν0: 6) (94°С 1 мин, 60°С 1 мин, 72°С 1 мин). Три полученные ПЦР-продукта очищали на гелевой колонке и осуществляли сборку с помощью ПЦР (21) с использованием праймеров ΕΜΒΦίδ и йог№1 94°С 1 мин, 60°С 1 мин, 72°С 1 мин). Полученный один ПЦР-продукт очищали от ПЦР-примесей, дважды подвергали ферментативному расщеплению с помощью Nо!1/Nсо1 и вшивали в обработанный ШО/Жо! вектор ρΌΝ332. Приблизительно 9 мкг вектора и 3 мкг вставки использовали в смеси для лигирования, которую очищали путем фенолизации и осаждения этанолом, ресуспендировали в 50 мкл стерильной воды и элекропорировали в электрокомпетентные клетки Е.сой ТСГ Полученная библиотека аффинного созревания содержала 4 х 10⁸клонов. Частицы антитело-фаг, полученные, как описано (Νίδδίιη е! а1. (1994), ΕΜΒ0 1., 13, 692-698), использовали для первого цикла отбора на пробирках для иммунного анализа с покрытием 7В89 (Сагпето11а е! а1. (1996 , ΙπΕ 1. Сапсег, 68, 397-405). Отобранные фаги использовали для второго цикла пэннинга, выполненного с биотинилированным ЕО-Β, с последующим захватом магнитными гранулами со стрептавидиновым покрытием (Оупа1, 0§1о, Еоггау; см. предыдущий абзац). После селекции приблизительно 25% клонов оказались положительными в растворимом ЕЫ8А (см. протокол эксперимента в пре

- 8 005685 дыдущей главе). Из кандидатов, положительных по результатам ЕЫ8А, авторы настоящего изобретения далее идентифицировали один (Н10; табл. 1) с наиболее низкой величиной ко£Г с помощью анализа ΒΙΑсоге Цопззоп е! а1. (1991), ВоГТесйшдиез, 11, 620-627).

Ген зсРу(Н10) был подвергнут ПЦР-амплификации с использованием праймеров ЬМВ1Ь1з и ИРКСИЯ1£от (5'-С ТТТ СТС СТС СТА ССА ССС ΝΑΑ ΜΝΝ ОСТ ОСТ ОСТ ААС АСТ СТС АСТ 6) (8ЕО ΙΌ N0: 7) для внесения случайных мутаций в положения 32 в СИЯ1 УЪ (для нумерации: Сйо!Ыа апб Ьезк (1987), I. Мо1. Вю1., 196, 901-917) и праймеров ИРКСИЯ1Ьаск (5'-ТТА ССС ТСС ТАС САС САС ААА СС-5') (8Ер ГО N0:8) И ИРКСИЯ2£ог (5'-ССС АСТ ССС ССТ ССТ ССА ТСС ΜΝΝ АТА САТ САС САС ССТ ССС АСС С-3') (8Е0 ΙΌ N0: 9) для внесения случайной мутации в положения 50 в СИЯ2 УЪ. Оставшуюся часть гена зсЕу амплифицировали с использованием олигонуклеотидов ИРКСИЯ2Ьаск (5'-ССА ТСС АСС АСС ССС АСТ ССС-3') (8Ер ГО N0:10) и ИогЦоС (94°С 1 мин, 60°С 1 мин, 72°С 1 мин). Три полученные продукта собирали, расщепляли и клонировали в рИ№32, как описано выше для мутагенеза тяжелой цепи. Полученную библиотеку инкубировали с биотинилированным ЕИ-В в 3% В8А (бычий сывороточный альбумин) в течение 30 мин, с последующим захватом на микротитрационном планшете со стрептавидиновым покрытием (Воейппдет Маппйе1ш СтЬН, Сегтапу) в течение 10 мин. Фаги элюировали с использованием 20 мМ раствора ИТТ (1,4-дитио-ИГ-треитол, Р1ика) и использовали для инфицирования клеток ТС1 в стадии экспоненциального роста. Анализ связывания ЕИ-В супернатантами от 96 колоний посредством ЕП8А и В1Асоге позволил идентифицировать клон Ь19. зсРу-фрагменты анти-ЕИ-В Е1, С4, А2, Н10 и Ь19 антител избирательно окрашивают новообразованные кровеносные сосуды в срезах агрессивных опухолей (фиг. 3).

Упомянутые выше фрагменты анти-ЕИ-В антител затем получали путем инокулирования одной свежей колонии в 1 л среды 2хТУ, как было описано ранее Р1ш е! а1. ((1997), 1. 1ттипо1. Ме111.. 206, 171182) и аффинной очистки на колонке с сефарозой, активированной СЖг (Рйатшааа, Ирр8а1а, 8^ебеп), которую связывали с 10 мг ЕИ-В-содержащего рекомбинантного белка 7В89 (Сагпето11а е! а1. (1996), 1п! I. Сапсег, 68, 397-405). После загрузки колонку промывали 50 мл уравновешивающего буфера (РВ8, 1 мМ ЕИТА, 0,5М №1С1). Фрагменты антител затем элюировали 100 мМ триэтиламином, немедленно нейтрализовали 1М Нерез, рН 7, и диализировали против РВ8. Определение аффинности посредством В1Асоге выполняли с очищенными антителами, как описано (№τί е! а1. (1997), №11иге Вю!есйпо1., 15, 12711275 [фиг. 4]. Анализ сдвига полос выполняли, как описано (№п е! а1. (1996), №11иге Вю!есйпо1оду, 14, 385-390), с использованием рекомбинантного ЕИ-В с флюоресцентной меткой на Оконце (Сагпето11а е! а1. (1996), 1п!. I. Сапсег, 68, 397-405, №τί е! а1. (1597), №11иге Вю£есЬпо1., 15, 1271-1275) инфракрасным флюорофором Су5 (Атетзйат) [фиг. 4]. Анализ В1Асоге не всегда позволяет точно определить кинетические параметры реакций медленной диссоциации, возможно, из-за эффектов повторного связывание исходной нестабильности и длительного времени измерения, необходимого для того, чтобы убедиться, что фаза диссоциации соответствует единому экспоненциальному параметру. Авторы настоящего изобретения, таким образом, осуществляли измерение константной величины ко££ кинетической диссоциации с помощью конкурентных экспериментов (№п е! а1. (1996), Тгепбз ш Вю!есйпо1., 14, 465-470) [фиг. 4]. Вкратце, анти-ЕИ-В антитела (30 нМ) инкубировали с биотинилированным ЕИ-В (10 нМ) в течение 10 мин в присутствии М2 анти-РГАС антитела (0,5 мкг/мл) и поликлонального антимышиного 1дС (81дта), которые предварительно метили комплексом рутения, как описано (Иеаует, И. Я. (1995), №!ите, 377, 758-760). К этому раствору, в параллельных реакциях, добавляли неиотинилированный ЕИ-В (1 мкМ) в различное время, затем добавляли гранулы бупаЬеаб со стрептавидиновым покрытием, разбавленные буфером 0гщеп Аззау Ви££ег (20 мкл, 1 мг/мл) (Иеаует, И. Я. (1995), №!ите, 377, 758-760), и полученные смеси анализировали с помощью анализатора 0ЯIСЕN (IСЕN 1пс., СайтетзЬигд, МИ И8А). Этот инструмент выявляет электрохемилюминесцентный сигнал (ЭХЛ), который коррелирует с количеством зсРу-фрагмента, все еще связанного с биотинилированным ЕИ-В к концу конкурентной реакции. График ЭХЛ сигнала в зависимости от времени конкурентного связывания представляет из себя параметр, который может быть снабжен единой экспонентой с показательной константной величиной ко££ [фиг. 4; табл. 2].

Пример 3. Нацеливание на опухоли высокоаффинными зсРу с радиоизотопной меткой, специфичными в отношении ЕИ-В-домена фибронектина.

Меченные радиоактивным иодом зсРу(Ь19) или зсРу(И1.3) (постороннее антитело, специфичное в отношении лизоцима куриного яйца) инъецировали внутривенно мышам с имплантированной под кожу мышиной тератокарциномой Р9, быстро растущей агрессивной опухолью. Биораспределение антител было получено через различные интервалы времени (фиг. 4). зсРу(Ь19) и зсРу(И1.3) подвергали аффинной очистке на колонке с антигеном (№τί е! а1. (1997), №11иге Вю!есйпо1., 15, 1271-1273) и метили радиоактивным изотопом иодом-125 с помощью метода иодогена (Р1егсе, ЯоскГотф 1Ь, И8А). Меченные радиоактивным изотопом фрагменты антитела сохраняли > 80% своей иммунореактивности, по оценке нагрузки антитела, меченного радиоизотопной меткой, в колонку с антигеном, с последующим подсчетом радиоактивности протекающей через колонку и элюированной фракций. Бестимусным мышам (возраст 12 недель, самцы швейцарской бестимусной мыши) с имплантированной под кожу мышиной тератокарциномой Р9 (№τί е! а1. (1997), №11иге Вю!есйпо1., 15, 1271-1273) инъецировали 3 мкг (3-4 мкКи)

- 9 005685

8сРу в 100 мкл физиологического раствора. Размеры опухоли составляли 50-250 мг, поскольку более крупные опухоли имеют тенденцию некротизироваться в центре. Однако эксперименты по нацеливанию, выполненные на более крупных опухолях (300-600 мг), дали практически те же результаты. Для каждого отрезка времени использовали трех животных. Мышей умерщвляли гуманным способом, органы взвешивали и подсчитывали их радиоактивность. Результаты нацеливания представленных органов выражали в виде процента инъецированной дозы антитела на грамм ткани (%ГО/г). §сРу(Ь19) быстро выводится из крови через почки; в противоположность обычным антителам, он не накапливается в печени или других органах. Восемь процентов инъецированной дозы на грамм ткани локализуется в опухоли уже через три часа после инъекции; последующее снижение этой величины происходит вследствие того факта, что опухоль увеличивается в размерах вдвое через 24-48 ч. Соотношения опухоль:кровь через 3, 5 и 24 ч после инъекции составляли 1,9, 3,9 и 11,8, соответственно, для Ь19, но были всегда ниже 1,0 для антитела, служившего отрицательным контролем.

8сРу(Ь19) с радиоактивной меткой предпочтительным образом локализуется на опухолях уже через несколько часов после инъекции, что предполагает его пригодность для иммуносцинтиграфического обнаружения ангиогенеза у пациентов.

Пример 4. Анти-ΕΌ-Β антитела избирательно окрашивают новообразованные кровеносные сосуды глаза.

Ангиогенез, образование новых кровеносных сосудов из ранее существовавших, является характерным процессом, лежащим в основе многих заболеваний, включая рак и большинство глазных болезней, которые приводят к потере зрения. Способность избирательно нацеливаться на новообразованные сосуды и окклюзировать их открывает новые диагностические и терапевтические возможности.

Авторы настоящего изобретения проводили исследование, направленное на решение вопроса о том, является ли Β-ΡΝ специфичным маркером ангиогенеза в глазных структурах и могут ли антитела, распознающие Β-ΡΝ, избирательно нацеливаться на новообразованные сосуды глаза ίη νίνο после системного введения. Для решения этого вопроса авторы настоящего изобретения стимулировали ангиогенез в роговице кролика, что позволяет производить прямые наблюдения новообразованных кровеносных сосудов, посредством хирургической имплантации гранул, содержавших сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕРС) или сложный эфир форбола (фиг. 7). Гранулы из сукралфата (любезный дар компании Мегск, ЭагтМабБ Сегшапу)/гидрона, содержавшие по 800 нг сосудистого эндотелиального фактора роста (81дша) или 400 нг 32-миристат-13-ацетат форбола (РМА; 81дша), имплантировали в роговицу самок Новозеландского белого кролика, как описано [П'Аша1о, КД., е! а1., Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8сг, И8А, 91, 40824085 (1994)]. Ангиогенез индуцировали с помощью обоих факторов. Наблюдение за кроликами осуществляли ежедневно. По результатам иммуногистохимического анализа новообразованные кровеносные сосуды, индуцированные обоими веществами, были резко ΕΌ-Β-положительны. Во всех дальнейших экспериментах использовали гранулы РМА.

Иммуногистохимические исследования показали, что Ь19 сильно окрашивает новообразованные сосуды, индуцированные в роговице кролика (фиг. 8; 9а), но не окрашивает ранее существовавшие кровеносные сосуды глаза (фиг. 9Ь, с), и другие ткани (данные не представлены). Иммуногистохимический анализ выполняли как описано [Сатето11а, В. е! а1., Ιη!. 1. Сапсег, 58, 397-405 (1996)].

Пример 5. Фрагмент Ь19 антитела человека, связывающийся с ΕΌ-Β с субнаномолярной аффинностью, нацеливается на ангиогенез глазных структур ίη νίνο.

Используя экспериментальную модель ангиогенеза на роговице кролика, описанную в предыдущем примере, и методику иммунофотодетекции |(№п, Ό, е! а1. №1иге ΒίοΚΟιηοΕ 15, 1271-1273 (1997)], авторы настоящего изобретения показали, что Ь19, химически соединенный с красным флюорофором Су5, а не с фрагментом антитела (НуНЕЬ-10)-Су5, направленного против постороннего антигена (фиг. 10а, Ь), избирательно нацеливается на ангиогенез глаза после внутривенной инъекции. Флюоресцентное окрашивание растущих сосудов глаза четко выявлялось с помощью Ь19 немедленно после инъекции, и сохранялось по меньшей мере в течение двух дней, аналогично предыдущим наблюдениям по ангиогенезу в опухолях. Последующий ех νίνο иммунофлюоресцентный микроскопический анализ срезов роговицы подтвердил локализацию Ь19, но не НуНЕЬ-10, вокруг сосудистых структур (фиг. 10с, б). Демонстрация избирательного нацеливания на новообразованные кровеносные сосуды глаза с помощью антител, вместе с реактивностью анти-Β-ΡΝ антител в различных видах, служат основанием для проведения клинических исследований в будущем. Получение иммунофлюоресцентного изображения может быть полезным для раннего выявления ангиогенеза глазных структур у пациентов группы риска, до того, как повреждения станут видными при флюороангиографии.

Некоторые методологические детали

Для анализа иммунофлюоресценции ех νίνο и для некоторых окрашивании Н/Е роговицы фиксировали в 4% параформальдегиде в ΡΒ8 перед заливкой. Эксперименты по флюоресцентной фотодетекции выполняли на кроликах, седатированных ацеропромазином в дозе 5 мг/кг. Для экспериментов по нацеливанию каждому кролику внутривенно инъецировали 3,5 мг 5сРу (Ь19)1-Су5₀,₆₆ < 2,8 мг 5сРу (НуНЕЬ-10)₁Су5₀,₈₃ (время инъекции = 15 мин). Сразу же после инъекции Ь19, но не НуНЕЬ-10, наблюдали интенсивную флюоресценцию в новообразованных сосудах роговицы, которая сохранялась в течение несколь

- 10 005685 ких часов. В качестве добавочного теста на специфичность кроликам, которым в предыдущий день инъецировали 3θΕν(ΗνΗΕΕ-10)-ί.'ν5 и которые показывали отрицательные результаты при флюоресцентной фотодетекции, инъецировали на следующий день зсЕу(Е19)-С'у5 и наблюдали интенсивное флюоресцентное окрашивание новообразованных сосудов роговицы.

Для выявления флюоресценции глаз освещали вольфрамовой галогеновой лампой (модель 8с1ю11 КЬ 1500; 2е133. 1епа, Сегтапу). снабженной фильтром возбуждения Су5 (С1гота, ΒπΠΙΗΕοιό. УГ, υδΑ) и двумя световодами, концы которых помещали на расстоянии приблизительно 2 см от глаза. Флюоресценцию выявляли с помощью охлажденной С-5985 монохромной ССЭ-камеры (Натата1зи, Натата1зиСИу, 1арап), оборудованной увеличивающей линзой Сагюп в С-образной оправе (У6 х 16; 16-100 мм; 1:1,9) и фильтром эмиссии Су 5 диаметром 50 мм (СЬгота), помещенной на расстоянии 3-4 см от облученного глаза. Время обнаружения составляло 0,4 с.

Эксперименты Су5 флюороангиографии выполняли по той же экспериментальной схеме, но внутривенно инъецировали 0,25 мг ίλ·5-Τπ3 (продукт реакции Су5-ЫН8 и трис [гидроксиметил] аминометана; время инъекции = 5 с). Время обнаружения составляло 0,2 с.

Фрагменты антител имели формат зсЕу. Очистка зсЕу(Е19) и !^Εν(Η\·ΗΕΕ-10) и их мечение Νгидроксисукцинимидными (ΝΗ8) эфирами индоцианиновых красителей описаны в других источниках (№п, Ό, е! а1. №11иге Βίο1^1ηο1., 15, 1271-1273 (1997); ΕπΙΦα^ο, В., е! а1. (1999), 8!гис!иге, 7, 381-390]. Соотношение антитело: метка Су5 для этих двух антител составляло 1,5:1 и 1,2:1, соответственно. Су5ΝΗ8 приобретали в компании ЛтегзНат РЬагтааа Βίο^Η (ΖιιγχΙγ 8ч11хег1апб), овальбумин - в компании 8щта (ΒικΗ^ 8\\Ц/ег1ап6).

После мечения конъюгаты антител отделяли от невключенного флюорофора или фотосенсибилизатора на колонках ΡΌ-10 (ЛтегзНат Рйагтас1а Βίο^Η), уравновешенных в 50 мМ фосфате, рН 7,4, 100 мМ №1С1 (ΡΒ8). Иммунореактивность конъюгатов антител определяли с помощью аффинной хроматографии на колонках с антигеном (Νοπ, Ό, е! а1. №11иге Βίο^ΗποΓ 15 1271-1273 (1997) и во всех случаях она составляла > 78%. Иммуноконъюгаты анализировали с помощью электрофореза в додецилсульфат натрия - полиакриламидном геле и они мигрировали в виде полосы Μν = 30 000 дальтон (чистота ³90%).

Пример 6. Фрагмент Ь19 антитела человека, химически конъюгированный с фотосенсибилизатором хлорина 8п (IV) е₆, избирательно нацеливается на ангиогенез глазных структур и опосредует его окклюзию после облучения красным светом.

Для того, чтобы установить, можно ли достичь избирательного устранения сосудов посредством нацеливания с помощью антител, авторы настоящего изобретения инъецировали кроликам фрагмент антитела Ь19 или посторонний белок, который не локализуется в новообразованных кровеносных сосудах (овальбумин), соединенный с фотосенсибилизатором хлорина олова (IV) е₆ (далее упоминается как Ρδ). Глаза животных, получивших инъекцию, облучали красным светом (световая доза = 78 дж/см²). Репрезентативные результаты изображены на фиг. 11. Разительную макроскопическую разницу наблюдали через 16 ч после облучения у кроликов, которым вводили Π9-Ρδ (фиг. 11а, Ь) в отношении коагуляции новообразованных сосудов роговицы, но не сосудов конъюнктивы или других глазных структур. Флюороангиография с индоцианиновым флюорофором Су 5 (фиг. 11с) подтвердила окклюзию сосудов в виде характерной гипофлюоресцентной зоны. Напротив, гипофлюоресцентные зоны наблюдались в просачиваемых новообразованных сосудах необлученных глаз (фиг. 116, Η). В облученных сосудах кроликов, которым вводили овальбумин-Ρδ (фиг. 11е-д), не было выявлено макроскопических изменений, как по результатам офтальмоскопии, так и при Су5 флюороангиографии. Влияние облучения при действии нацеленного конъюгата Π9-Ρ8 на ранние стадии ангиогенеза роговицы показано на фиг. 111-1. Избирательно коагулированные кровеносные сосуды были макроскопически видимыми у живых животных (фиг. 111, _)) и даже еще более очевидными у животных сразу после умерщвления (фиг. 11к, 1).

Фотодинамическое повреждение далее изучали с помощью микроскопической техники. После облучения окклюзию сосудов можно выявить с помощью стандартного окрашивания гематоксилинэозином (Н/Е) как в нефиксированных, так и в фиксированных срезах роговицы у животных, которым вводили Π9-Ρδ (фиг. 11Ь, £, Д но не у животных, которым вводили овальбумин-Ρδ (фиг. 11а, е, 1). Апоптоз в той части роговицы, на которую были нацелены конъюгаты с фотосенсибилизатором, был отчетливо виден при флюоресцентном исследовании ΤϋΝΕΓ (фиг. 11с, д), но с трудом выявлялся в отрицательных контролях с чернилами (фиг. 116, Η). При более сильном увеличении был виден апоптоз эндотелиальных клеток в сосудистых структурах (фиг. 11д). Никакого повреждения кровеносных сосудов радужной оболочки, склеры и конъюнктивы у леченных животных не наблюдалось как при исследовании ΤυΝΕΓ (не показано), так и при окрашивании Н/Е (фиг. 11к, 1).

Избирательное фотодинамическое уничтожение новообразованных сосудов обещает стать благоприятным способом лечения глазных болезней и других патологических состояний, связанных с ангиогенезом, которые доступны облучению с помощью рассеивателей света или световолоконной оптической техники. Результаты этого исследования ясно показывают, что новообразованные сосуды глаза можно избирательно окклюзировать без повреждения ранее существовавших кровеносных сосудов и нормальных тканей.

- 11 005685

Некоторые методологические детали

Хлорин олова (IV) е₆ был выбран из ряда фотосенсибилизаторов с учетом их мощности, растворимости и специфичности, после соединения с кроличьим антимышиным поликлональным антителом (81дта). Эти иммуноконъюгаты подвергали скринингу путем направленного фотолиза эритроцитов, покрытых моноклональным антителом, специфичным в отношении СЭ47 человека (#313441 А; РИагттдеп, 8ап О1едо СА, И8А). Хлорин олова (IV) е₆ был получен как описано [Би, Х.М. е! а1., I. 1ттипо1. Ме1Ио4з 156, 85-99 (1992)]. Для связывания с белками хлорин олова (IV) е₆ перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре в диметилформамиде с десятикратным молярным избытком ЕЭС (гидрохлорида Х'-3-диметиламинопропил-Ы-этилкарбодимида, 81дта) и ΝΗ8 (Ν-гидроксисукцинимида, 81дта). Полученную активированную смесь затем добавляли к восьмикратному объему раствора белка (1 мг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч.

После мечения конъюгаты антител отделяли от невключенного флюорофора или фотосенсибилизатора на колонках РО-10 (Атегзйат РЬагтасча Бю1ееИ), уравновешенных в 50 мМ фосфате, рН 7,4, 100 мМ №С1 (РВ8). Иммунореактивность конъюгатов антител определяли как описано в предыдущем примере.

Для экспериментов по фотоуничтожению кроликам внутривенно инъецировали 12 мг зсЕу (Б 19)хлорина олова (IV) е6₀,₈ или 38 мг овальбумина-хлорина олова (IV) е6₀,₃₆ и содержали их в темноте в течение всего эксперимента. Через восемь часов после инъекции кроликам проводили анестезию кетамином 35 кг/кг/ксилазином (5 мг/кг)/ацеропромазином (1 мг/кг) и один из двух глаз облучали в течение 13 мин вольфрамовой галогеновой лампой 8сйо11 КБ 1500, снабженной фильтром Су5 (СИгота) и двумя световодами, концы которых помещали на расстоянии 1 см от глаза. Освещаемая область составляла приблизительно 1 см², при плотности мощности облучения 100 мВатт/см², по измерению фотодетектором 8Б818 (\е\\рог! Согр., куше, С А, И8А). После облучения признаков дискомфорта у животных не наблюдалось. В качестве предупредительной меры после облучения кроликам вводили анальгетики (0,03 мг/кг бупренорфина). Для наблюдения за фотоуничтожением глаза исследовали с помощью офтальмоскопа и фотографировали с помощью камеры для глазного дна КОАА 8Б-14 (ОМР 8А, Кеппепз, Баизаппе, 8\117ег1ап4). По пять кроликов получали один из конъюгатов с хлорином олова (IV) е₆, затем животным облучали только один глаз, а другой глаз служил внутренним отрицательным контролем. В качестве дополнительного контроля двух кроликов только облучали, но не вводили им конъюгатов с фотосенсибилизатором.

Немедленно после умерщвления кроликов посредством передозировки анестетика производили энуклеацию глаз, удаляли роговицы, затем заливали их в Т1ззие Тек (8акига Ете1ескшса1, Токуо, 1арап) и замораживали. Для анализа иммунофлюоресценции ех у1уо и для некоторых видов окрашивания Н/Е роговицы перед заливкой фиксировали в 4% параформальдегиде в РВ8. Замороженные в криостате срезы толщиной 5 мкм использовали для дальнейшего микроскопического анализа. Анализы флюоресценции ΤϋΝΕΕ выполняли в соответствии с инструкциями производителя (Коске О1адпоз!1с, Ко1кгеи7, 8ш!2ег1ап4).

Таблица 1. Последовательности отобранных клонов анти-ΕΌ-Β антител

Клон	УН-цепь	УЪ-цепь
	31-33*	50-54*	95-98*	32*	50*	91-96*
А2	3ΥΑ	ΑΙ3333	<ЗЪ31	Υ	О	Ν3ΜΥΡΜ
С4	3ΥΑ	А1333<3	ЗРЗЕ	Υ	<3	33ΜΕΡΥ
Е1	8ΥΑ	А13СЗСЗ	ΡΡΡΥ	Υ	<3	ТСЖ.1РР
НЮ	ЗЕЗ	3ΙΚ333	ΡΡΡΥ	Υ	3	Τ3ΚΙΡΡ
Ь19	ЗЕЗ	3ΙΒ333	ΡΡΡΥ	Υ	Υ	ТСЖ.1РР

Соответствующие аминокислотные положения клонов антител, (*: нумерация согласно Тотйпзоп е! а1. (1995), ЕМВО I., 14, 4628-4638), выделенных из сконструированных синтетических библиотек. Одинарные аминокислотные коды используются согласно стандартной номенклатуре ГОРАС.

- 12 005685

Таблица 2. Аффинность анти-ΕΌ-Β зсТу-фрагментов

Клон	коп (е¹М¹)	ко££ (з'¹) ^в	ко££ (θ'¹) ^с	Κ_ά(Μ) *
Ά2	1,5 х 10⁵	2,8 х 10’³	-	1, 9 х 10'⁸
04	4,0 х 10⁴	3,5 х 10'³	-	8,7 х 10’⁸
Е1	1,6 х 10⁵	6,5 х 10'³	-	4,1 х 10'⁸
НЮ	6,7 х 10⁴	5,6 х 10’⁴	9, 9 х 10'⁵	1,5 х 10’⁹
Ь19	1,1 х 10⁵	9,6 х 10’⁵	6,0 х 10’⁶	5,4 х 10’¹¹

*) Кб = ко££/коп. Для связывающихся с высокой аффинностью Н10 и £19 величины ко££ по результатам экспериментов с использованием В1Асоге недостаточно надежны из-за эффектов отрицательно заряженного карбоксилированного твердого декстранового матрикса; величины К^б, таким образом, рассчитаны по измерениям ко££, полученным в конкурентных экспериментах (протоколы экспериментов). к_о££, кинетическая константа диссоциации; к_оп, кинетическая константа ассоциации; К_б, константа диссоциации. В = измерено с использованием В1Асоге; С = измерено путем конкуренции с электрохемилюминесцентным обнаружением. Правильность величин составляет +/- 50%, на основе точности определений концентрации.

Перечень последовательностей <110> ЕЮСЕЫОЕ3313СНЕ ТЕСНШЗСНЕ НОСНЗЗСНЦЪЕ ζυκιΟΗ <120> СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ МОЛЕКУЛЫ ДЛЯ СЦИНТИГРАФИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОНЪЮГАТЫ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ АНГИОГЕНЕЗА <130> 1900РТЕР <140>

<141>

<150> иЗ 09/075,338 <151> 1998-05-11 <15о> из <151> 1999-04-28 <160> 21 <170> РаСепЫп Уег. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер: ЬМВ1Ыз <400> 1 дсддсссадс сддссаЬддс сдад <210> 2 <211> 54

- 13 005685 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ϋΡ4 7СОК1£ог <400> 2 дадссЕддсд дасссадсЕс аЕшпптппптп пдсСаааддЕ дааЕссадад дсЕд <210> 3 <211> 23 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер: ОР47СОР.1Ьаск <400> 3 аТдадсТддд Ессдссаддс Есс <210> 4 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ОР47СОК2Гог <400> 4 дРсРдсдЕад саЬдЕддЕас стппасЕасс тппааЬтппЕ дадасссасЬ ссадссссЕб.

- 14 005685 <210> 5 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ОР47СОК2£ог <400> 4 дРсЬдсдСад РаОдЪддЕас стппасРасс тппаа£тпп£ дадасссасЪ ссадссссЬЬ <210> 5 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер: ОР4 7СПН.2Ьаск <400> 5 асаДасРасд садасРссдР даад <210> 6 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер: ΟΈογΝοϊ <400> 6

РсаРРсЪсда сЪЬдсддссд сЕ^ЕдаНЬЬс сассЕЬдРс ссЕРддссда асд

- 15 005685 <210> 7 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ОРКСЭЕ1£ог <400> 7 дЕРРсРдсРд дРассаддсВ аатппдсРдс СдсВаасасВ срдасвд <210> 8 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> ’ <223> Описание искусственной последовательности: ПЦР праймер:ОРКСОЕ1Ьаск <400> 9

ВВадссЬддЕ ассадсадаа асе <210> 9 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ΏΡΚΟΌΚ2 £ог <400> 9 дссадВддсс сВдсРддаРд стппаВадаВ даддадссРд ддадсс

- 16 005685 <210> 10 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ОРКСОК2Ьаск <400> 10 дсаРссадса дддссасРдд с <210> 11 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ϋΡ4 7ЬаЫсо <400> 11 дсддсссадс аРдссаРддс сдаддрдсад сРдРРддадР сРддд <210> 12 <211> 55 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ПЦРпраймер:ΟΌΚ3 £ог <400> 12 ддРРсссРдд ссссадРадР сааатпшппп тпптппРРРс дсасадРааР аРасд

- 17 005685

<210 >	13
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

Описание искусственной последовательности: ПЦР-

праймер: УНриНЫп <400> 13 дсддсссадс аЕдссаЕддс сдад

<210>	14
<211>	66
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

праймер:Даззш <400> 14 сссдсЕассд ссасЕддасс саЕсдссасО сдадасддрд ассадддРЕс ссОддсссса дРадкс

<210>	15
<211>	62
<212>	днк
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

праймер:ЦРК22аззш <400> 15 даЕдддЦсса дрддсддЕад сдддддсдсд ЕсдасЕддсд аааЕЕдЕдЕЕ

- 18 005685

дасдсадЪсЕ	сс
<210>	16
<211>	63
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

праймер:ϋΡΚ3 £ог <400> 16 сассЪЪддДс ссЪЕддссда асдЪшппсдд тппшппасст ппсДдсЕдас адЪааЕасас Рдс

<210>	17
<211>	56
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

праймер:ОТогпоЪ <400> 17 дадРсаСДсД сдасСХдадд ссдсСЕДдаЬ ЕРссассЕЕд дДсссРЬддс сдаасд

<210>	18
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

праймер: УЬриНЪЬ

- 19 005685 <400> 18 даРдддРсса дРддсддРад сддд <210> 19 <211> 24 <212> РЕТ <213> УН антитела, специфичная в отношении ΕΌ-Β-домена фибронектина <400> 19

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

С1и

Зег

С1у

Ьеи

Уа1

О1п

Рго

С1у

1

5

10

15

О1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТНг

РЬе

Зег

20

25

30

Зег

Рйе

Зег

Меб

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С31у

Ьуз

С1у

Ьеи

35

40

45

С1и

Тгр

Уа1

Зег

Не

Зег

С1у

Зег

С1у

ТИг

ТНг

Туг

50

55

60

А1а

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

РИе

ТЪг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

65

70

75

Ьуз

Аз η

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

80

85

90

ТИг

А1а

Уа1

Туг

Суз

А1а

Ьуз

Рго

РИе

Рго

Туг

РЬе

Азр

Туг

95

100

105

Тгр

С1у

С1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

110

115

<210> 20 <211> 14 <212> РК.Т <213> линкер антитела

<400> 20

С1у Азр С1у Зег Зег С1у О1у Зег С1у С1у А1а Зег ТЬе С1у

10

- 20 005685 <210> 21 <211> 108 <212> РКТ <213> V!· антитела, специфичная в отношении ЕЬ-В-домена фибронектина <400> 21

61ц

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

(31у

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

1

5

10

15

е1у

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

20

25

30

Зег

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

О1п

Ьуз

Рго

С1у

□ΙΝ

А1а

Рго

35

40

45

Агд

Беи

11е

Туг

А1а

Зег

Агд

А1а

ТЬг

С1у

11е

РГО

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

Е1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

65

70

75

Не

Зег

Агд

Ьеи

С1и

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

80

85

90

<31п

ТЬг

Е1у

Агд

11е

Рго

ТЬг

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

100 105

О1и Не Ьуз

Claims

1. Выделенное антитело, представляющее собой антитело Ь19 или его функционально эквивалентную вариантную форму, которое распознает характерный эпитоп ЕЭ-(В)+ домена фибронектина со специфичной аффинностью и обладает константой диссоциации (Кб) в отношении указанного домена фибронектина менее 1 х 10^-9 М, или фрагмент указанного антитела.

2. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающееся тем, что Кб составляет 5,4 х 10^-11 М.

3. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающееся тем, что содержит вариабельный домен фрагмента £^Ρν антитела Ь19, имеющий следующую аминокислотную последовательность: