SK16792000A3 - Špecifické väzbové molekuly na scintigrafiu, konjugáty obsahujúce tieto molekuly a ich použitie - Google Patents
Špecifické väzbové molekuly na scintigrafiu, konjugáty obsahujúce tieto molekuly a ich použitie Download PDFInfo
- Publication number
- SK16792000A3 SK16792000A3 SK1679-2000A SK16792000A SK16792000A3 SK 16792000 A3 SK16792000 A3 SK 16792000A3 SK 16792000 A SK16792000 A SK 16792000A SK 16792000 A3 SK16792000 A3 SK 16792000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- antibody
- domain
- fibronectin
- angiogenesis
- antibodies
- Prior art date
Links
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 50
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims description 5
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 43
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 17
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims 1
- 150000003606 tin compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 15
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- -1 tungsten halogen Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- MWUYSCVVPVITMW-IGNZVWTISA-N Tyr-Tyr-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 MWUYSCVVPVITMW-IGNZVWTISA-N 0.000 description 2
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 2
- NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N acepromazine Chemical compound C1=C(C(C)=O)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005054 acepromazine Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 2
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 2
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 description 2
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 2
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- LWPHUVGDBNUVHA-GXZWQRSESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[[3-[2-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethylamino]-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCNC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LWPHUVGDBNUVHA-GXZWQRSESA-N 0.000 description 1
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-2,2-bis(chloromethyl)propane Chemical compound ClCC(CCl)(CCl)CCl KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 4-Chloro-ortho-toluidine Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1N CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- BLTRAARCJYVJKV-QEJZJMRPSA-N Ala-Lys-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O BLTRAARCJYVJKV-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- MAZZQZWCCYJQGZ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MAZZQZWCCYJQGZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- AWPWHMVCSISSQK-QWRGUYRKSA-N Asp-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O AWPWHMVCSISSQK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241001092081 Carpenteria Species 0.000 description 1
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N Iodine-123 Chemical compound [123I] ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100012330 Mus musculus F9 gene Proteins 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 101100005280 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N Pro-Asp-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DYJTXTCEXMCPBF-UFYCRDLUSA-N Pro-Tyr-Phe Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=CC=C3)C(=O)O DYJTXTCEXMCPBF-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N Ser-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 1
- IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N [3-[(2,4-dimethylphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1OP(O)(O)=O IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- 229960001736 buprenorphine Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004528 endothelial cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012483 real time interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A sucralfate Chemical compound O[Al](O)OS(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H]1O[C@@]1(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)O1 MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A 0.000 description 1
- 229960004291 sucralfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011806 swiss nude mouse Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
- A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Predkladaný vynález sa týka protilátok so subnanomolárnou afinitou špecifickou pre charakteristický epitop ED-8 domény fibronektínu, ktorý je markerom angiogenézy. Tiež sa týka použitia rádioaktívne značených vysokoafinitných anti-ED-8 protilátok na detekciu novo sa tvoriacich ciev in vivo a diagnostických kitov obsahujúcich uvedené protilátky.
v
Dalej sa vynález týka konjugátov skladajúcich sa z uvedených protilátok a vhodnej fotoaktívnej molekuly (napríklad fotosenzibilizátora) a ich použitia v detekcii a/alebo koagulácii novo vytvorených krvných ciev.
Doteraiší stav techniky
Nádory nemôžu rásť nad určitú hranicu bez toho, že by sa vytvorili nové cievy (bez angiogenézy) a korelácia medzi hustotou mikrokapilár a invazivitou nádoru bola opísaná pre mnoho nádorov (Folkman, 1995, Náture Med. 1: 2731). Okrem toho je angiogenéza podkladom mnohých očných ochorení, ktoré vedú ku strate zraku (Lee et al., Surv. Opthalmol. 43: 245-269, 1988; Friedlander, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9764-9769, 1996). Molekuly, ktoré môžu selektívne zamerať markery angiogenézy, umožnia diagnostiku a terapiu nádorov a iných ochorení charakterizovaných vaskulárnou proliferáciou, ako je diabetická retinopatia a makulárna degenerácia súvisiaca s vekom. Markery angiogenézy sú exprimované u väčšiny agresívnych pevných nádorov a mali by byť ľahko prístupné pre intravenózne podané špecifické ligandy (Pasqualini et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 542-546; Neri et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 1271-1275). Cielená oklúzia neovaskulatúry môže viesť k infarktu nádoru a k jeho kolapsu (O'Reilly et al., 1996), Náture Med. 2: 689-692; Huang et al., 1997, Science, 275: 547-550).
ED-B doména fibronektínu, sekvencia s 91 aminokyselinami identická u myší, potkanov a človeka, ktorá je inzertovaná alternatívnym zostrihom do fibronektínovej molekuly, sa špecificky akumuluje v okolí neovaskulatúry (Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612-618) a môže predstavovať cieľ pre molekulárnu intervenciu. Skutočne sme nedávno s použitím fluorescenčnej techniky ukázali, že jednoreťazcové Fv protilátkové fragmenty (scFv) proti ED-B sa,selektívne akumulujú v nádorových krvných eievach u myší s nádormi a že afinita protilátky zjavne určuje účinnosť cielenej väzby (Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271-1275; Medzinárodná patentová prihláška č.
PCT/GB97/01412, na základe GB96/10967.3). Cielená väzba na nádor bola hodnotená 24 hodín po injekcii alebo v neskorších časových intervaloch.
V odbore sú známe rôzne pokusy o získanie protilátok proti ED-B doméne, ktoré by mohli byť použité pre cielenú väzbu na nádor.
Peters et al. (Celí Adhesion and Communication, 1995, 3: 67-89) opisujú polyklonálne protilátky produkované proti antigénom neobsahujúcim žiadnu inú sekvenciu než intaktnú ED-B doménu a ukazujú, že tieto protilátky sa viažu priamo a špecificky na túto doménu.
Avšak, činidlá opisované Petersom a kol. majú rad nevýhod: antisérum od Petersa a kol. rozpoznáva ED-B(+)-FN len po spracovaní N-glykanázou. Toto spôsobuje, že sú tieto činidlá nevhodné pre aplikácie ako je cielená väzba na nádory, zobrazenie a terapia, pretože deglykosylácia nemôže byť uskutočnená in vivo. Autori sami uvádzajú, že ich protilátky nerozpoznávajú kompletný ED-B(+)-FN produkovaný cicavčími bunkami. Tiež uvádzajú, že bolo nemožné produkovať monoklonálne protilátky špecifické pre ED-B doménu fibronektínu, i napriek tomu, že boli produkované protilátky proti iným doménam fibronektínu (ako je ED-A). V odbore je dobre známe, že polyklonálne protilátky sú neprijateľné pre vyššie uvedené aplikácie.
napriek rokom intenzívneho výskumu v tejto oblasti môžu byť monoklonálne protilátky rozpoznávajúce ED-B doménu fibronektínu bez ošetrenia Nglykanázou produkované len s použitím fágových zobrazovacích techník, ako sú použité v predkladanom vynáleze.
Zang et al. (Matrix Biology, 1994, 14: 623-633) opisujú polyklonálne antisérum namierené proti psej ED-B doméne. Autori predpokladajú skríženú reaktivitu s ľudským ED-B(+)-FN, hoci táto reaktivita nebola testovaná. Avšak, autori opisujú ťažkosti súvisiace s prípravou monoklonálnych protilátok priamo rozpoznávajúcich ED-B doménu fibronektínu (strana 631). Antisérum rozpoznáva ED-B(+)-FN vo Westernovom prenose len po spracovaní N-glykanázou. Ako bolo uvedené vyššie, nutnosť spracovania glykanázou znemožňuje použitie v aplikáciách podľa predkladaného vynálezu.
Rozpoznávanie ED-B(+)-FN v ELISA prebieha bez nutnosti deglykosylácie, ale len na chrupavke extrahovanej denaturačným činidlom (4M močovinou) a zachytenej na plaste pomocou želatíny. Autori uvádzajú, že „väzba FN molekuly na želatínu naviazanú na plastový povrch platne pre ELISU môže nejakým spôsobom vystavovať epitopy tak, že môžu byť rozpoznané antisérom.“ Pretože v aplikáciách in vivo nemôže byť FN denaturovaný a naviazaný na želatínu, majú monoklonálne ligandy podľa predkladaného vynálezu zreteľné výhody.
Japonské patenty JP02076598 a JP04169195 opisujú anti-ED-B protilátky. Z týchto dokumentov nie je jasné, či sú opisované monoklonálne anti-ED-B protilátky. Okrem toho sa zdá nemožné, aby jediná protilátka (ako je protilátka opisovaná v JP02076598) mala antigénny determinant v aminokyselinovej sekveneii vzorca (1), (2) alebo (3):
- (1) EGIPIFEDFVDSSVGY;
- (2) YTVTGLEPGIDYDIS;
- (3) NGGESAPTTLTQQT;
z nasledujúcich dôvodov:
(i) monoklonálna protilátka by mala rozpoznávať dobre definovaný epitop;
(ii) trojrozmerová štruktúra ED-B domény Fibronektínu bola určená NMR spektroskopiou. Segmenty (1), (2) a (3) sa nachádzajú na opačných stranách ED-B štruktúry a nemôžu byť viazané súčasne jednou monoklonálnou protilátkou.
Ďalej, pre demonštrovanie užitočnosti protilátok by malo byť uvedené lokalizovanie nádoru, rovnako ako dôkaz farbenia ED-B(+)-FN štruktúr v biologických vzorcoch bez spracovania činidlami degradujúcimi štruktúru.
BC1 protilátka, ktorú opisuje Carnemolla et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 24689-24692, rozpoznáva epitop na doméne 7 FN, ale nie na ED-B doméne, ktorá je kryptická za prítomnosti ED-B domény fibronektínu. Je striktne špecifická pre človeka. Preto majú BC1 protilátka a protilátky podľa predkladaného vynálezu odlišnú reaktivitu. D8le, BC1 protilátka rozpoznáva doménu 7 samotnú a doménu 7-8 fibronektínu za neprítomnosti ED-B domény (Carnemolla et al., 1992, J. Biol. chem. 267: 24689-24692). Také epitopy môžu byť produkované in vivo proteolytickou degradáciou FN molekúl. Výhoda činidiel podľa predkladaného vynálezu spočíva v tom, že môžu lokalizovať FN molekuly alebo fragmenty len vtedy, pokiaľ obsahujú ED-B doménu.
Na diagnostiku nádorov, a presnejšie na zobrazenie primárnych a sekundárnych nádorových lézií, je imunoscintigrafia metódou voľby. V tomto vyšetrení sú pacienti snímkovaní vhodným prístrojom (napríklad gamma-kamerou) potom, ako im bola injekčné podaná rádioaktívne značená zlúčenina (napríklad radionuklid naviazaný na vhodné vehikulum). Na scintigrafické aplikácie sú obvykle používané izotopy s krátkym polčasom emitujúce gamma žiarenie, ako je technécium-99m, jód-123 alebo indium-111, ktorých použitie minimalizuje expozíciu pacienta ionizujúcemu žiareniu.
Najčastejšie používaným rádionuklidom na oddeleniach nukleárnej medicíny je technécium-99m (99mTc), gamma žiarič s polčasom 6 hodín. Pacienti po injekcii rádiofarmák na báze 99mTc môžu byť snímkovaní až do 12-24 hodín po injekcii; avšak, skoršia akumulácia nuklidu v lézii je žiaduca.
Ďalej, pokiaľ by boli dostupné protilátky schopné rýchlej a selektívnej lokalizácie novotvorených krvných ciev, tak by boli výskumníci stimulovaní na výskum nových vhodných molekúl na konjugovanie na protilátky, na dosiahnutie diagnostického a/alebo terapeutického účinku.
Podstata vynálezu
Vzhľadom k potrebe rádiofarmák schopných lokalizovať nádorové lézie počas niekoľkých hodín po injekcii, ktorá existuje v odbore nukleárnej medicíny, a vzhľadom k informácii, že afinita protilátky zjavne ovplyvňuje jej účinnosť v cielenom dôkaze angiogenézy, je predmetom predkladaného vynálezu príprava protilátok špecifických pre ED-B doménu fibronektínu s disociačnou konštantou v rade súbnanomolárnom (pre prehľad definícií a meranie afinity antigén-protilátka viď Neri et al., 1996, Trends in Biotechnol. 14: 465-470). Ďalším predmetom predkladaného vynálezu sú rádioaktívne značené protilátky vo vhodnom formáte, namierené proti ED-B doméne fibronektínu, ktoré detegujú nádorové lézie už niekoľko hodín po injekcii.
V jednom aspekte vynálezu sú tieto predmety dosiahnuté pomocou protilátky so špecifickou afinitou k charakteristickému epitopu ED-B domény fibronektínu a so zlepšenou afinitou k uvedenému ED-B epitopu.
V ďalšom aspekte predkladaného vynálezu je protilátka opísaná vyššie použitá na rýchle zacielenie markérov angiogenézy.
v
Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je diagnostický kit obsahujúci uvedenú protilátku a jedno alebo viac činidiel na detekciu angiogenézy.
Ešte ďalším aspektom predkladaného vynálezu je použitie uvedenej protilátky na diagnostiku a terapiu nádorov a ochorení, ktoré sú charakterizované vaskulárnou proliferáciou.
Konečne, významný aspekt predkladaného vynálezu predstavujú konjugáty obsahujúce uvedené protilátky a vhodné fotoaktívne molekuly (napríklad správne vybrané fotosenzibilizačné činidlo), a ich použitie na selektívnu svetlom sprostredkovanú oklúziu novo vytvorených krvných ciev.
Definície:
V predkladanom vynáleze sú použité niektoré termíny, ktoré majú nasledujúce významy.
Termín protilátka označuje imunoglobulín, či prirodzený, alebo celkom alebo čiastočne pripravený synteticky. Tento termín tiež zahrnuje akýkoľvek polypeptid alebo proteín majúci väzbovú doménu, ktorá je protilátkovou väzbovou doménou alebo ktorá je homologická k tejto doméne. Tieto môžu byť získané z prirodzených zdrojov, alebo môžu byť celkom alebo čiastočne pripravené synteticky. Príklady protilátok sú izotypy imunoglobulínov a podtriedy ich izotypov; fragmenty, ktoré obsahujú väzbovú doménu pre antigén, ako je Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; a diprotilátky. Je možné použiť monoklonálne alebo iné protilátky a použiť techniky rekombinantnej DNA technológie na produkciu iných protilátok alebo chimerických molekúl, ktoré si zachovávajú špecificitu pôvodnej protilátky. Také techniky môžu obsahovať vloženie DNA kódujúcej variabilný región imunoglobulínu alebo komplementaritu určujúcu regióny imunoglobulínov (CDR), konštantné regióny imunoglobulínov alebo konštantné regióny plus regióny pracovných rámcov rôznych imunoglobulínov. Viď napríklad EP-A-184187, GB 2188638A alebo EP-A-239400. Hybridómy alebo iné bunky produkujúce protilátku môžu byť podrobené genetickým mutáciám alebo iným zmenám, ktoré môžu a nemusia meniť väzbovú špecificitu produkovaných protilátok. Pretože protilátky môžu byť modifikované rôznymi spôsobmi, zahrnuje termín protilátka akékoľvek väzbové činidlá alebo substancie, ktoré obsahujú väzbovú doménu s požadovanou špecificitou. Preto tento termín zahrnuje fragmenty, deriváty, funkčné ekvivalenty a homológy protilátok, vrátane akýchkoľvek polypeptidov obsahujúcich imunoglobulínovú väzbovú doménu, či prirodzené, alebo celkom alebo čiastočne pripravené synteticky. Tiež sú týmto termínom zahrnuté chimérické molekuly obsahujúce väzbovú doménu imunoglobulínu alebo jej ekvivalent, fúzovanú na iný polypeptid. Klonovanie a expresia chimérických protilátok je opísaná v EP-A-0120694 a EP-A-0125023. Bolo preukázané, že fragmenty celej protilátky môžu pôsobiť ako väzbové antigény. Príklady väzbových fragmentov sú (i) Fab fragment skladajúci sa z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) Fd fragment skladajúci sa z VH a CH1 domén; (iii) Fv fragment skladajúci sa z VL a VH domén jednej protilátky; (iv) dAb fragment (Ward et al., 1989, Náture 9: 341, 544-546) skladajúci sa z VH domény; (v) izolované CDR regióny; (vi) F(ab')2 fragmenty, bivalentné fragmenty obsahujúce dva viazané Fab fragmenty; (vii) jednoreťazcové Fv molekuly (scFV), kde sú VH doména a VL doména naviazané pomocou polypeptidovej spojovacej skupiny, ktorá umožňuje asociáciu dvoch domén za vzniku väzbového miesta pre antigén (Bird et al., (1988), Science 242: 423-426; Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83); (viii) bišpecifické jednoreťazcové FV diméry (PCT/US92/09965) a (ix) diprotjlátky, multivalentné alebo multišpecifické fragmenty konštruované génovou fúziou (WO94/13804; Holliger et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448). Diprotilátky sú multiméry alebo polypeptidy, kde každý polypeptid obsahuje prvú doménu tvorenú väzbovým regiónom imunoglobulínového ľahkého reťazca a druhú doménu tvorenú väzbovým regiónom imunoglobulínového ťažkého reťazca, kde tieto dve domény sú naviazané (napríklad pomocou peptidovej spojovacej skupiny), ale nie sú schopné vzájomnej asociácie tvoriacej väzbové miesto pre antigén; väzbové miesta pre antigén sú tvorené asociáciou prvej domény jedného polypeptidu v multimére s druhou doménou iného polypeptidu v multimére (WO 94/13804). Pokiaľ sú použité bišpecifické protilátky, tak môžu byť použité bežné bišpecifické protilátky, ktoré môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi uvedenými v Holliger and Winter, 1993, Curr. Opin. Biotech., 4: 446-449, napríklad chemickou syntézou alebo z hybridných hybridómov, alebo môžu byť použité akékoľvek fragmenty bišpecifických protilátok, ako boli uvedené vyššie. Než použitie celých protilátok môže byť výhodnejšie použitie scFv dimérov alebo diprotilátok. Diprotilátky a scFv môžu byť pripravené bez Fc regiónu, s použitím len variabilných domén, čo potenciálne znižuje efekt anti-idiotypovej reakcie. Medzi ďalšie formy bišpecifických protilátok patria jednoreťazcové CRAb, ktoré sú opísané v Neri et al., ((1995), J. Mol. Biol. 246: 367-373).
Termín komplementaritu určujúce regióny (CDR) variabilných domén protilátky označuje tie hypervariabilné sekvencie protilátky, ktoré obsahujú zvyšky potrebné pre špecifické rozpoznávanie antigénu. V tomto vynáleze používame definíciu a číslovanie CDR uvedené v Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917.
Termín funkčne ekvivalentný variant označuje molekulu (variant), ktorá si aj napriek štrukturálnej odlišnosti od inej molekuly (pôvodnej molekuly) uchováva významnú homológiu a tiež aspoň nejakú biologickú funkciu pôvodnej molekuly, napríklad schopnosť väzby na určitý antigén alebo epitop. Varianty môžu byť vo forme fragmentov, derivátov alebo mutantov. Varianty, deriváty alebo mutanty môžu byť pripravené modifikáciou pôvodnej molekuly adíciou, deléciou, substitúciou alebo inzerciou jednej alebo viac aminokyselín, alebo väzbou na inú molekulu. Tieto zmeny môžu byť uskutočnené na nukleotidovej alebo proteínovej úrovni. Napríklad, kódovaný polypeptid môže byť Fab fragment, ktorý je potom naviazaný na Fc koncovku z iného zdroja. Alternatívne môže byť naviazaný marker ako je enzým, fluoresceín atd. Napríklad, funkčne ekvivalentný variant protilátky A proti charakteristickému epitopu ED-B domény fibronektínu môže byť protilátka B s odlišnou sekvenciou komplementaritu určujúcich regiónov, ale rozpoznávajúca rovnaký epitop ako protilátka A.
Izolovali sme rekombinantné protilátky v scFv forme z protilátkovej fágovej zobrazovacej knižnice, ktoré sú špecifické pre ED-B doménu fibronektínu a ktoré rozpoznávajú ED-B(+)-fibronektín v tkanivových rezoch. Jedna z týchto protilátok, El, bola upravovaná z hľadiska afinity so získaním protilátok H10 a L19 so zlepšenou afinitou. Protilátka L19 má disociačnú konštantu pre ED-B doménu fibronektínu v rade subnanomolárnych koncentrácií.
Vysoko-afinitné protilátky L19 a Dl.3 (protilátka špecifická pre irelevantný antigén, lyzozým zo slepačích vajec) boli rádioaktívne značené a boli injikované do myší s nádormi. Biodistribúcie v nádore, krvi a orgánoch boli stanovené v rôznych časoch a boli uvedené ako percento injikovanej dávky na gram tkaniva (%ID/g). Už 3 hodiny po injekcii bolo pre L19 %ID/g (nádor) lepšie než %ID/g (krv), ale nie pre negatívnu kontrolnú Dl.3. Pomery nádor.krv sa zvyšovali pri neskorších meraniach. Tieto údaje naznačujú, že vysoko-afinitná protilátka L19 môže byť užitočným činidlom cielene sa viažucim na nádory, vhodným napríklad na imunoscintigrafickú detekciu angiogenézy.
Fotosenzibilizačné činidlo môže byť definované ako molekula, ktorá po ožiarení a za prítomnosti vody a/alebo kyslíka, vyvolá tvorbu toxických mole9 kúl (napríklad singletového kyslíka) schopných reagovať s biomolekulami, ktoré potenciálne poškodzujú biologické ciele ako sú bunky, tkanivá alebo telesné kvapaliny. Fotosenzibilizačné činidla sú predovšetkým výhodné vtedy, ak absorbujú svetlo pri vlnových dĺžkach vyšších než 600 nm. Skutočne je prienik svetla v tkanivách a telesných kvapalinách maximálny pri 600-900 nm (Wan et al., 1981, Photochem. Photobiol. 34. 679-681). Cielené podanie fotosenzibilizačného činidla nasledované ožiarením je atraktívnym spôsobom na terapiu ochorení súvisiacich s angiogenézou (Yarmush, M.L. et al., Antibody Targeted photolysis, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 10: 197-252 (1993); Rowe, P.M., Lancet 351, 1496 (1998); Levy, J., Trends Biotechnol. 13: 14-18 (1995)), najmä na selektívni abláciu očnej neovaskulatúry. Dostupné terapeutické modality, ako je laserová fotokoagulácia, buď priama alebo po podaní fotosenzibilizačného činidla, sú obmedzené nedostatkom selektivity a obvykle vedú k poškodeniam zdravých tkanív a ciev (Macular Photocoagulation Study Group, Árch. Opthalm. 112: 480-488, (1994); Haimovici, R. et al., Curr. Eye Res. 16: 83-90 (1997); Schmidt-Erfurt, U. et al., Graefes Árch. Clin. Exp. Opthalmol. 236: 365-374 (1998)).
Z argumentov uvedených vyššie je zrejmé, že je mimoriadne dôležité objaviť spôsoby na zlepšenie selektivity a špecificity fotosenzibilizačných činidiel, napríklad pomocou ich konjugácie na vhodné nosičke. Je pravdepodobné, že vývoj kvalitných nosičov nebude jednoduchý. Okrem toho, je pravdepodobné, že nie všetky fotosenzibilizačné činidlá budú vhodné na prenos in vivo do vybraného miesta. Faktory ako je chemická štruktúra fotosenzibilizačného činidla, jeho rozpustnosť, lipofilnosť, priľnavosť a účinnosť budú pravdepodobne zásadne ovplyvňovať možnosť cieleného podania a účinnosť konjugátov obsahujúcich fotosenzibilizačné činidlá.
Preukázali sme, že vysoko-afinitná L19 protilátka, špecifická pre ED-B doménu fibronektínu, selektívne lokalizuje novo vytvorené krvné cievy v králičom modeli očnej angiogenézy po systémovom podaní. L19 protilátka, chemicky naviazaná na fotosenzibilizačné činidlo, ktorým je zlúčenina štvormocného cínu a chlóru e6 a ožiarená červeným svetlom, spôsobuje selektívnu oklúziu očnej neovaskulatúry a navodzuje apoptózu príslušných endotelových buniek.
Tieto výsledky dokazujú, že nové očné cievy môžu byť imunochemicky odlíšené od pôvodných očných ciev in vivo a naznačujú, že cielené podanie fotosenzibilizačných činidiel nasledované ožiarením môže byť účinné v liečbe očných ochorení spôsobujúcich slepotu a snáď i iných patologických stavov spojených s angiogenézou.
Prehľad obrázkov na pripojených výkresoch
Uskutočnenia predkladaného vynálezu sú ilustrované na nasledujúcich výkresoch, kde:
Obr. 1 ukazuje navrhnutú protilátkovú fágovú knižnicu;
Obr. 2 ukazuje 2D gély a Westernový prenos lyzátu ľudských melánomových COLO-38 buniek;
Obr. 3A, 3B a 3C ukazujú imunohistochemické pokusy na glioblastoma multiforme;
Obr. 4 ukazuje analýzu stability komplexov protilátka-(ED-B);
Obr. 5 ukazuje biodistribúciu rádioaktívne značených protilátkových fragmentov u myší nesúcich nádory;
Obr. 6 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu L19;
Obr. 7A a 7B ukazujú králičie oči s implantovanou peletou;
Obr. 8 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov z králičej rohovky;
Obr. 9 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov zo štruktúr králičieho oka (rohovky, dúhovky a spojivky) získaných s použitím červeného substrátu na alkalickú fosfatázu a hematoxylínu;
Obr 10 ukazuje lokalizáciu fluorescenčné značených protilátok v očnej neovaskulatúre.
Obr. 11 ukazuje makroskopický vzhľad očí králikov, ktorým bol injekčné podaný proteín naviazaný na fotosenzibilizačné činidlo, pred a po ožiarení.
Obr. 12 ukazuje mikroskopickú analýzu rezov z očných štruktúr králikov, ktorým bol injekčné podaný proteín naviazaný na fotosenzibilizačné činidlo a ktorí boli ožiarení červeným svetlom.
Podrobný opis obrázkov
Obr. 1 ukazuje navrhnutú protilátkovú fágovú knižnicu, (a) Protilátkové fragmenty sú zobrazené na fágu ako pili fúzia, ako je schematicky uvedené. Vo väzbovom mieste protilátky (priamy pohľad na antigén) je Vk CDR skelet uvedený žltou a VH CDR skelet je znázornený modrou. Zvyšky podrobené náhodnej mutagenézy sú v pozíciách 91, 93, 94 a 96 Vk CDR3 (žlté) a v pozíciách 95, 96, 97 a 98 VH CDR3 (modré). Cb atómy týchto vedľajších reťazcov sú znázornené tmavšími farbami. Tiež sú uvedené (šedé) zvyšky CDR1 a CDR2, ktoré môžu byť mutované na zlepšenie afinity protilátky. S použitím programu RasMol (http://www.chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html) boli štruktúry scFv modelované z pdb súboru ligm (Brookhaven Protein DataBank; http://www2.ebi.ac.uk/pcserv/pdbdb.htm). (b) PCR amplifikácia a klonovacia stratégia pre knižnicu. DP47 a DPK22 zárodkové templáty boli modifikované (viď text) na tvorbu mutácií v CDR3 regiónoch. Gény sú označené obdĺžničkami a CDR sú uvedené ako očíslované obdĺžničky v génoch. Potom boli zostavené VH a VL segmenty a boli klonované do pDN332 fágemidového vektora. Priméry (od SEQ ID NO: 11 do SEQ ID NO: 18) použité pri amplifikácii sú uvedené v dolnej časti obrázku.
Obr. 2 ukazuje: (a) farbenie 2D-PAGE lyzátu ľudských melanómových COLO-38 buniek striebrom, do ktorých bol vnesený rekombinantný 7B89 obsahujúci ED-B. Dve 7B89 škvrny (zakrúžkované) sú spôsobené čiastočnou proteolýzou His-koncovky použitej na prečistenie proteínu; (b) imunoprenos gélu identického s gélom z obr. 2a, s použitím anti-ED-B E1 (tabuľka 1) a M2 antiFLAG protilátok ako detekčných činidiel. Sú detegované len 7B89 škvrny, čo potvrdzuje špecificitu rekombinantnej protilátky izolovanej zo škvrny v géle.
Obr. 3A - 3C ukazujú imunohistochemické pokusy uskutočnené na sériových rezoch z glioblastoma multiforme, ktoré ukazujú typické glomerulom podobné vaskulárne štruktúry prifarbené s použitím scFV E1 (A), A2 (B) a G4 (C). Meradlo: 20 gm.
Obr. 4 ukazuje stabilitu komplexov protilátka-(ED-B). Analýza väzby scFV El, H10 a L19 na ED-B doménu fibronektínu. (a) BIAcore sensogramy uf I kazujúce zlepšené disociačné profily získané po afinitných úpravách protilátky, (b) Natívna gélová elektroforéza scFv-(ED-B) komplexov. Len vysoko-afinitná protilátka L19 môže tvoriť stabilné komplexy s fluorescenčné značeným antigénom. Fluorescenčná detekcia bola uskutočnená opísaným spôsobom (Neri et al., (1996), BioTechniques, 20: 708-712). (c) Kompetícia komplexu scFv-(EDB-biotín) so 100-násobným molárnym nadbytkom nebiotinylovaného ED-B, ako bola monitorovaná elektrochemoluminiscenciou s použitím prístroja Origen. Bol pozorovaný dlhý polčas komplexu L19-(ED-B). Plné štvorčeky: L19; prázdne trojuholníčky: H10.
Obr. 5 ukazuje biodistribúciu rádioaktívne značených protilátkových fragmentov u myší nesúcich nádory. Biodistribúcie v nádore a v krvi, vyjadrené ako percento injikovanej dávky na gram, sú umiestnené do grafu v závislosti od času. Tiež je uvedená relevantná orgánová biodistribúcia.
Obr. 6 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu protilátky L19 obsahujúcu ťažký reťazec (VH), spojovaciu skupinu a ľahký reťazec (VL).
Obr. 7A a 7B ukazujú králičie oči s implantovanými polymérovými peletami namočenými do angiogénnej substancie.
Obr. 8 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov z králičej rohovky s novotvorenými cievami, s použitím L19 protilátky.
Obr. 9 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov zo štruktúr oka, s použitím L19 protilátky. Špecifické červené zafarbenie je zrejmé okolo neovaskulárnych štruktúr v rohovke (a), ale nie okolo krvných ciev v dúhovke (b) a spojivke (c). Malé šípky: epitel rohovky Relevantné krvné cievy sú označené veľkými šípkami. Meradlá: 50 gm.
Obr. 10 ukazuje imunofotodetekciu fluorescenčné značených protilátok detegujúcich očnú angiogenézu. Silná fluorescenčná rohovková neovaskularizácia (označená šípkami) je pozorovaná u králikov, ktorým bol injekčné podaný protilátkový konjugát L19-Cy5 (a), špecifický pre ED-B doménu FN, ale u králikov, ktorým bol injekčné podaný protilátkový konjugát HyHEL-10-Cy5 (b). Imunofluorescenčná mikroskopia rohovkových rezov potvrdila, že L19-Cy5 (c), ale nie HyHEL-Cy5 (d), sa vyskytuje v okolí neovaskylatúry v rohovke. Rezy (a,b) boli získané 8 hodín po injekcii protilátky; (c,d) boli získané s použitím rohovkových rezov izolovaných od králikov 24 hodín po injekcii protilátky. P, peleta.
Obr. 11 ukazuje makroskopický vzhľad očí králikov, ktorým boli podané konjugáty obsahujúce fotosenzibilizačné činidlo. Oko králika, ktorému bol podaný L19-PS, pred (a) a 16 hodín po (b) ožiarení červeným svetlom. Šípka označuje koagulovanú neovaskulatúru, ktorá bola potvrdená ako hypofluorescenčná oblasť v Cy5 fluóroangiograme na obr. (c) 16 hodín po ožiarení. Povšimnite si, že žiadna koagulácia nie je pozorovaná v iných cievnych štruktúrach, napríklad v dilatovaných spojivkových cievach. Na porovnanie je uvedený fluóroangiogram s hyperfluorescenciou prepúšťajúcich ciev a príslušná farebná fotografia neliečeného králičieho oka je uvedená v (d) a (h). Obr. (e,f,g) sú analogické s (a,b,c), ale prislúchajú králikom, ktorým bol injekčné podaný ovalbumín-PS a ktoré boli ožiarené červeným svetlom. Nebola pozorovaná žiadna koagulácia a angiogram ukázal hyperfluorescenciu prepúšťajúcich ciev. Oči králikov v skorom štádiu angiogenézy, ktorým bol podaný L19-PS, sú uvedené na (i-1). Zobrazenie pred (I) a 16 hodín po ožiarení červeným svetlom (j) ukázali významnú a selektívnu svetlom indukovanú intravaskulárnu koaguláciu (šípka). Oklúzia ciev (Šípka) je najmä zreteľná v ožiarenom oku (1) králika bezprostredne po eutanázii, ale nie je detegovateľná v neožiarenom oku (k) rovnakého králika. P, peleta. Hroty označujú korneo-sklerálny prechod (limbus). Na všetkých obrázkoch sú preexistujúce dilatované spojivkové cievy viditeľné nad limbom, zatiaľ čo rast rohovkovej neovaskulatúry môže byť pozorovaný od limba smerom k pelete (P).
Obr. 12 ukazuje mikroskopickú analýzu selektívnej oklúzie krvných ciev. H/E rezy rohovky (a,e,b,f: nefixované; i,j: fixované paraformaldehydom) králikov, ktorým bol injekčné podaný ovalbumín-PS (a,e,i) alebo L19-PS (b,f,j) a ktoré boli ožiarené. Veľké šípky predstavujú nepoškodené (e,i) alebo celkom uzavreté (f,j) krvné cievy. Oproti selektívnej oklúzii rohovkovej neovaskulatúry a obmedzenému perivaskulárnemu postihnutiu (eosinofílii) spôsobenému L19-PS po ožiarení (b,j,f), nevykazujú cievy v spojivke (k) a dúhovke (1) u rovnakého králika známky poškodenia. Fluorescenčný TUNEL test ukázal rôzny počet apoptotických buniek v rezoch od ožiarených králikov, ktorým bol podaný L19-PS (c,g), alebo ovalbumín-PS (d,h). Veľké šípky ukazujú niektoré relevantné cievne štruktúry. Malé šípky ukazujú rohovkový epitel. Meradlo: 100 gm (a-d) a 25 gm (e-1).
Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Izolácia ľudských scFv protilátkových fragmentov špecifických pre ED-B doménu fibronektínu z protilátkovej fágovej zobrazovacej knižnice
Ľudská protilátková knižnica bola klonovaná s použitím VH (DP47;
Tomlison et al., (1992), J. Mol. Biol., 227: 776 - 798) a Vk (DPK22; Cox et al., (1994), Eur. J. Immunol. 24: 827 - 836) zárodočných génov (pre stratégiu klonovania a amplifikácie viď obr. 1). VH zložka knižnice bola vytvorená s použitím čiastočne degenerovaných primérov (obr. 1) (od SEQ ID NO 11 do SEQ ID NO: 18) pomocou techniky na báze PCR na vloženie náhodných mutácií v pozíciách 95 - 98 CDR3). VL zložka knižnice bola pripravená rovnakým spôsobom, vložením náhodných mutácií do pozícií 91, 93, 94 a 96 CDR3. PCR reakcie boli uskutočnené opísaným spôsobom (Marks et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597) VH-V1 scFv fragmenty boli pripravené pomocou PCR zostavenia (obr. 1; Clackson et al., (1991), Náture 352: 624 - 628) z VH a VL segmentov prečistených na géle. 30 gg prečistených VH-VL scFv fragmentov bolo dvojito trávených 300 jednotkami Ncol a Nôti, potom bol získaný materiál ligovaný do 15 gg Notl/Ncol tráveného pDN332 fágemidového vektora. pDN332 je derivát fagemidu pHENl (Hoogenboom et al., (1991), Nucl. Acids Res. 19: 4133 4137), v ktorom bola sekvencia medzi Notl miestom a amber kodónom pred génom 111 nahradená nasledujúcou sekvenciou kódujúcou D3SD3-FLAG-His6 koncovku (Neri et al., (1996)s Náture Biotechnology 14: 385 - 390).
Notl D D D S D D D Y K D D
5' - GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC
D D K H H H H H H amber GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG - 3'
Transformácie do TG1 kmeňa E.coli boli uskutočnené spôsobom podľa Marks et al. (1991, J. Mol. Biol. 222: 581 - 597) a fágy boli pripravené podľa štandardných protokolov (Nissim et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581 - 597). Náhodne bolo vybraných päť klonov a tieto boli sekvenované na overenie absencie kontaminácie.
Rekombinantné fibronektínové fragmenty ED-B a 7B89 obsahujúce jeden a štyri homologické repetitívne sekveneie typu III, v príslušnom poradí, boli exprimované z expresných vektorov na báze pQE12 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) spôsobom opísaným v literatúre (Carnemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397 - 405).
Selekcie proti rekombinantnej ED-B doméne fibronektínu (Carnemolla et al., 1992, Int. J Cancer 68: 397 - 405; Zardi et al., 1987, EMBO J., 6: 2337 2342) boli uskutočnené pri 10 nM koncentrácii s použitím antigénu biotinylovaného biotín-disulfid-N-hydroxysukcínimid esterom (činidlo B-453 1; Sigma, Buchs, Switzerland, 10) a eluovaného z 2D gélu, a streptavidínom potiahnutých Dynabeads gorálok (Dynal, Oslo, Norway). Pre každé kolo panelovania bolo použitých 1013 fágov, v 1 ml reakčnej zmesi. Fágy boli inkubované s antigénom v 2% mlieku/PBS (MPBS) po dobu 10 minút. Do tohto roztoku sa pridalo 100 gl Dynabeads (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Norway) vopred blokovaných v MPBS. Po 5 minútach miešania sa gorálky magneticky separovali z roztoku a
7-krát sa premyli PBS-0,1% Tween20 (PBST) a 3-krát PBS. Elúcia bola uskutočnená inkubáciou po dobu 2 minút s 500 μΐ 50 mM ditiotreitolu (DTT), pre redukciu disulfidových mostíkov medzi antigénom a biotínom. Gorálky boli znovu zachytené a získaný roztok bol použitý na infekciu exponenciálne rastúcich TG1 E.coli buniek. Po troch kolách panelovania bol elúovaný fág použitý na infekciu exponenciálne rastúcich HB2151 buniek E.coli, ktoré boli umiestnené na (£xTY + 1% glukóza + 100 pg/ml ampicilínu) - 1,5 % agarovej platne. Jednotlivé kolónie boli kultivované v 2xTY + 1% glukóze + 100 pg/ml ampicilínu a boli indukované cez noc pri 30 °C 1 mM IPTG na dosiahnutie produkcie protilátky. Vzniknuté supernatanty boli vyšetrované ELISA testom s použitím streptavidínom potiahnutých mikrotitračných platní spracovaných 10 nM biotinylovaným ED-P a anti-FLAG M2 protilátkou (IBI Kodak, New Haven, CT) ako detekčným činidlom. 32% vyšetrovaných kolónií bolo pozitívnych v tomto teste a tri z nich, ktoré mali najsilnejší ELSA signál (El, A2 a G4), boli sekvenované a ďalej charakterizované.
ELISA testy boli uskutočnené s použitím biotinylovaného ED-B získaného zo škvrny v géle, biotinylovaného ED-B, ktorý nebol denaturovaný, ED-B naviazané na susedné fibronektínové domény (rekombinantný protein obsahujúci 7B89 domény) a mnoho irelevantných antigénov. Protilátky El, A2 a G4 reagovali silne a špecificky so všetkými tromi proteínmi obsahujúcimi ED-B Táto skutočnosť, spolu so skutočnosťou, že všetky tri rekombinantné protilátky mohli byť prečistené z bakteriálnych supernatantov s použitím ED-B afinitnej kolóny, silne naznačuje, že rozpoznávajú epitop prítomný v prirodzenej konformácii ED-B. Žiadna reakcia nebola detegovaná pre fibronektínové fragmenty neobsahujúce ED-B doménu (údaje nie sú uvedené). Na testovanie toho, či majú protilátky izolované proti gélovej škvrne dobrú afinitu k prirodzenému antigénu, bola uskutočnená interakčná analýza v reálnom čase s použitím povrchovej plazmonovej rezonancie na BIAcore prístroji, podľa spôsobu uvedeného v literatúre (Neri et al., (1997), Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275). Monomérne frakcie El, A2 a G4 scFv fragmentov sa viazali na ED-B s afinitou v rozmedzí 107 - 108 M-l (tabuľka 1).
Ako ďalší test špecificky a použiteľnosti protilátky bol uskutočnený 2DPAGE imunoprenos, pri ktorom bol do gélu vnesený lyzát ľudskej melanómovej bunkovej línie COLO-38, do ktorého boli pridané minimálne množstvá 7B89 proteínu obsahujúceho ED-B (obr. 2). ScFv (El) farbil silne a špecificky len 7B89 škvrnu.
Protilátky El, A2 a G4 boli použité na imunolokalizáciu fibronektínu obsahujúceho ED-B (B-FN) v kryostatových rezoch z glioblastóma multiforme, čo je agresívny mozgový nádor s výraznou angiogenézou. Obr. 3 ukazuje sériové rezy z glioblastóma multiforme, s typickými glomerulám podobnými cievnymi štruktúrami sfarbenými do červená tromi protilátkami. Imunofarbenie rezov zo vzoriek glioblastóma multiforme zmrazených bezprostredne po chirurgickom odbere bolo uskutočnené spôsobom opísaným v literatúre (Carnemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397 - 405; Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612 - 618). Stručne, imunofarbenie bolo uskutočnené s použitím M2-anti-FLAG protilátky (IBI Kodak), biotinylovaných anti-myších polyklonálnych protilátok (Sigma), farbiaceho kitu obsahujúceho komplex streptavidín-biotín-alkalická fosfatáza (BioSpa, Milan, Italy) a naftol-AS-MX-fosfátu a fast red TR (Sigma). Gillov hematoxylín bol použitý ako kontrastné farbenie, po ktorom nasledovalo umiestnenie do glycergélu (Dáko, Carpenteria, CA), ako bolo opísané skôr (Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612 - 618).
Pomocou podobnej techniky a protilátky L19 (viď ďalší príklad) sme mohli tiež špecificky farbiť novo vytvorené cievy indukované implantáciou polymérových peliet ponorených do angiogénnej substancie, ako je vaskulárny endotelový rastový faktor alebo estery forbolu, do králičej rohovky.
Príklad 2 Izolácia ľudského scFv protilátkového fragmentu viažuceho sa na ED-B so subnanomolárnou afinitou
ScFv(El) bol vybraný na testovanie možnosti zlepšenia jeho afinity pomocou obmedzeného počtu mutácií CDR zvyškov lokalizovaných na periférii väzbového miesta pre antigén (obr. IA). Kombinatoriálne sme mutovali zvyšky 3 1 - 33, 50, 52 a 54 VH protilátky a zobrazili sme príslušný repertoár na fila18 mentóznom fágu Tieto zvyšky sa často vyskytujú v kontakte s antigénom v známych 3D-štruktúrach komplexov protilátka-antigén. Získaný repertoár 4 x 108 klonov bol selektovaný pre väzbu na ED-B doménu fibronektínu. Po dvoch kolách panelovania a po vyšetrení 96 jednotlivých klonov bola izolovaná protilátka s 27-krát vylepšenou afinitou (H10; tabuľky 1 a 2). V súlade s inými pozorovaniami pre afinitne - upravené protilátky sme pozorovali, že zlepšená afinita bola spôsobená skôr pomalšou disociáciou z antigénu než zlepšenými kon hodnotami (Schier et al., (1996), Gene, 169: 147 - 155; Ito (1995, J. Mol. Biol. 248. 729 - 732). Predpokladá sa, že ľahký reťazec protilátky prispieva menej k väzbovej afinite k antigénu, čo je podporované faktom, že ako prirodzené, tak syntetické protilátky bez ľahkého reťazca sa môžu stále ešte viazať na antigén (Ward et al., 1989, Náture 341: 544 - 546; Hamers-Casterman et al., 1993, Náture 363: 446 - 448). Z tohto dôvodu sme vybrali na randomizáciu len dva zvyšky (32 a 50) VL domény, ktoré sú umiestnené centrálne vo väzbovom mieste pre antigén (obr. la) a v 3D štruktúrach sa často vyskytujú v kontakte s antigénom. Získaná knižnica, obsahujúca 400 klonov, bola zobrazená na fágu a bola selektovaná pre väzbu na antigén. Z analýz disociačných profilov s použitím interakčnej analýzy v reálnom čase, uskutočnených pomocou BIAcore prístroja (Jonsson et al., 1991, BioTechniques, 11: 620 - 627) a meraní kOff pomocou kompetičných pokusov s elektrochemiluminiscenčnou detekciou, bol identifikovaný kloň (L19), ktorý sa viazal na ED-B doménu fibronektínu s Kd = 54 pM (tabuľky 1 a 2). Pokusy s afinitnými úpravami boli uskutočnené nasledujúcim spôsobom: Gén scFv(El) bol amplifikovaný PCR s použitím primárov LMBlbis (5'-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEQ ID NO. 1) a DP47CDRlfor (5'-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (SEQ ID NO: 2) na vloženie náhodných mutácií do pozícií 31 - 33 v CDR1 VH (na číslovanie: 28), a s primérmi DP47CDRlback (5'-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3') (SEQ ID NO. 3) a DP47CDR2for (5'-GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3') (SEQ ID NO: 4) na náhodnú mutáciu pozícií 50, 52, 54 v CDR2 VH. Zvyšný fragment scFv génu, v rozsahu 3'-časti VH génu, peptidovej spojovacej skupiny a VL génu, bol amplifikovaný s použitím primérov DP47CDR2back (5'-ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEQ ID NO: 5) a JforNot (5'-TCA TTC TCG
ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG3') (SEQ 1D NO: 6) (94 °C, 1 minúta, 60 °C, 1 minúta, 72 °C, 1 minúta). Tri získané PCR produkty boli prečistené na géle a boli zostavené PCR (21) s použitím primérov LMBlbis a JforNot (94 °C, 1 minúta, 60 °C, 1 minúta, 72 °C, 1 minúta). Získaný jediný PCR produkt bol prečistený z PCR zmesi, bol dvojito trávený Notl/Ncol a bol ligovaný do Notl/Ncol tráveného vektora pDN332. V ligačnej zmesi bolo použitých približne 9 pg vektora a 3 pg insertu, zmes bola prečistená fenolizáciou a zrážaním etanolom, bola resuspendované v 50 pl sterilnej vody a bola elektroporovaná do elektrokompetentných TGI buniek E.coli. Získaná afinitne - upravená knižnica obsahovala 4 x 108 klonov. Protilátkové fágové častice získané opísaným spôsobom (Nissim et al., 1994, EMBO J., 13: 692 - 698) boli použité na prvé kolo selekcie na imunoskúmavke potiahnutej 7B89 (Carnemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397 - 405). Selektované fágy boli použité na druhé kolo panelovania uskutočnené s biotinylovanou ED-B, po ktorom nasledovalo zachytenie na magnetických gorálkach potiahnutých streptavidínom (Dynal, Oslo, Norway; viď predchádzajúci odsek). Po selekcii bolo približne 25% klonov pozitívnych v solubilnom ELISA teste (pre protokol pokusu viď predchádzajúcu kapitolu). Z kandidátov pozitívnych v ELISA teste sme ďalej identifikovali jeden kloň (H10, tabuľka 1) s najnižšou hodnotou kOff podľa BIAcore analýzy (Jonsson et al., 1991, BioTechniques, 11: 620 - 627).
Gén scFV(H10) bol amplifikovaný PCR s použitím primérov LMBlbis a DPKCDRlfor (5'-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G-3') (SEQ ID NO: 7) na vloženie náhodných mutácií do pozície 32 v CDR1 VL (na číslovanie: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901 - 917), a s primérmi DPKCDRlback (5'-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-3') (SEQ ID NO: 8) a DPKCDR2for (5'-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (SEQ ID NO: 9) na vloženie náhodnej mutácie v pozícii 50 v CDR2 VL. Zvyšná časť scFv génu bola amplifikovaná s použitím oligonukleotidov DPKCDR2back (5'GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3') (SEQ ID NO: 10) a JforNot (94 °C, 1 minúta, 60 °C, 1 minúta, 72 °C, 1 minúta). Tri získané PCR produkty boli zostavené, trávené a klonované do pDN332 rovnako, ako bolo opísané vyššie na mutagenézu ťažkého reťazca. Získaná knižnica bola inkubovaná s biotinylova20 nou ED-B v 3% BSA po dobu 30 minút a potom bola zachytená na streptavidínom potiahnutej mikrotitračnej platni (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) počas 10 minút. Fágy boli eluované 20 mM roztokom DTT (1,4-ditio-DLtreitol, Fluka) a boli použité na infikovanie exponenciálne rastúcich TG1 buniek. Analýza väzby supernatantov z 96 kolónií na ED-B pomocou ELISA testu a BIAcore umožnila identifikáciu klonu L19. Anti-ED-B El, G4, A2, H10 a L19 scFv protilátkové fragmenty selektívne farbili novo vytvorené cievy v rezoch z agresívnych nádorov (obr. 3).
Vyššie uvedené fragmenty anti-ED-B protilátok boli potom produkované inokuláciou jednej čerstvej kolónie do 1 litra 2xTY média, ako bolo opísané v literatúre (Pini et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 171 - 182) a boli afinitne prečistené na sepharosovej kolóne aktivovanej CNBr (Pharmacia, Uppsala, Sween), v ktorej bolo naviazaných 10 mg 7B89 rekombinantného proteinu obsahujúceho ED-B (Carnemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397-405). Po naplnení bola kolóna premytá 50 ml rovnovážneho pufru (PBS, 1 ml EDTA, 0,5 M NaCl). Protilátkové fragmenty boli potom eluované 100 mM trietylamínom, ihneď boli neutralizované 1 M Hepes, pH 7 a boli dialyzované proti PBS. Afinitné merania pomocou BIAcore boli uskutočnené s prečistenými protilátkami, spôsobom uvedeným v literatúre (Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271 - 1275) (obr. 4). Analýza posunu prúžkov bola uskutočnená spôsobom uvedeným v literatúre (Neri et al., 1996, Nátur. Biotechnol. 14: 385 - 390), s použitím rekombinantnej ED-B fluorescenčné značenej na N-konci (Carnemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397 - 405; Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271 - 1275) infračerveným fluórofórom Cy5 (Amersham) (obr. 4). BIAcore analýza neumožňuje presné stanovenie kinetických parametrov na pomalé disociačné reakcie, z dôvodov možného opakovaného naviazania, základnej nestability a dlhých časov meraní nutných na zistenie toho, že disociačná fáza prebieha podľa jedného exponenciálneho profilu. Preto sme uskutočnili merania kinetickej disociačnej konštanty kOff pomocou kompetičných pokusov (Neri et al., 1996, Trends in Biotechnol. 14: 465 - 470) (obr. 4). Stručne, anti-ED-B protilátky (30 nM) boli inkubované s biotinylovanou ED-B (10 nM) po dobu 10 minút, za prítomnosti M2 anti-FLAG protilátky (0,5 pg/ml) a polyklonálneho anti-myšieho IgG (Sigma), ktorý bol vopred značený ruteníovým komplexom, ako je opísané v literatúre (Deaver, D.R., 1995, Náture 377: 758 - 760). Do tohto roztoku bola v paralelných reakciách v rôznu dobu pridávaná nebiotinylovaná ED-B (1 μΜ). Potom boli pridané streptavidínom potiahnuté Dynabeads, riedené v Origen Assay pufre (Deaver, D.R., 1995, Náture 377: 758 - 760) (20 μΐ, 1 mg/ml) a získané zmesi boli analyzované s použitím ORIGEN analyzátora (IGEN Inc., Gaithersburg, MD, USA). Tento prístroj deteguje elektrochemoluminiscenčný signál (ECL), ktorý koreluje s množstvom scFV fragmentu, ktorý zostáva naviazaný na biotinylovanú ED-B na konci kompetičnej reakcie. Graf ECL signálu versus kompetičná doba dáva profil, ktorý môže byť upravený pre jedinú exponenciálnu krivku s charakteristickou konštantou koff (obr. 4, tabuľka 2).
Príklad 3: Zameranie nádorov pomocou vysoko afinitného rádioaktívne značeného scFv špecifického pre ED-B doménu fibronektínu
Rádioaktívnym jódom značené scFv(L19) alebo scFv(D1.3) (irelevantná protilátka špecifická pre lyzozým slepačích vajec) boli intravenóznou injekciou podané myšiam s podkožné implantovaným myším F9 teratokarcinómom, rýchlo rastúcim agresívnym nádorom. Biodistribúcie protilátok boli stanovené v rôznych časoch (obr. 4). ScFv(L19) a scFv(D1.3) boli afinitne prečistené na antigénnej kolóne (Neri et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1273) a boli rádioaktívne značené jódom-125 s použitím Iodogen metódy (Pierce, Rockford, IL, USA). Rádioaktívne značené protilátkové fragmenty si zachovávali >80% imunoreaktivitu, ako bolo určené vnesením rádioaktívne značenej protilátky do antigénnej kolóny, po ktorom nasledovalo stanovenie rádioaktivity v prvej a druhej výtokovej frakcii. Holým myšiam (Swiss holé myši staré 12 týždňov, samci) s podkožné implantovaným F9 myším teratokarcinómom (Neri et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 1271-1273) boli injekčné podané 3 μg (3-4 pCi) scFv v 100 μΐ salinickom roztoku. Veľkosti nádorov boli 50-250 mg, pretože väčšie nádory majú tendenciu ku vzniku nekrotického centra. Avšak, pri pokusoch o zameranie väčších nádorov (300-600 mg) sa dosiahli v podstate rovnaké výsledky. Na každý čas boli použité tri zvieratá. Myši boli utrácané humánnym spôsobom a ich orgány boli zvážené a bola stanovená ich rádioaktivita. Výsledky pre representatívne orgány sú vyjadrené ako percento injikovanej dávky protilátky na gram tkaniva (% ID/g). ScFv(L19) je rýchlo eliminovaný z krvi ľadvinami; oproti bežným protilátkam sa neakumuluje v pečeni ani iných orgánoch. 8% injikovanej dávky na gram tkaniva sa lokalizuje v nádore už tri hodiny po injekcii; následné zníženie tejto hodnoty je spôsobené skutočnosťou, že nádor zdvojuje svoju veľkosť počas 24 - 48 hodín. Pomery nádor:kfv v 3, 5 a 24 hodine po injekcii sú 1,9, 3,9 a 11,8, v príslušnom poradí, pre L19, ale vždy nižšie než 1,0 pre protilátku slúžiacu ako negatívna kontrola.
Rádioaktívne značený scFv(L19) sa prednostne lokalizuje v nádoroch už niekoľko hodín po injekcii, čo ukazuje na jeho použiteľnosť na imunoscintigrafickú detekciu angiogenézy u pacientov.
Príklad 4: Anti-ED-B protilátky selektívne farbia novo vytvorené očné krvné cievy.
Angiogenéza, tvorba nových krvných ciev z preexistujúcich ciev, je charakteristickým procesom, ktorý je príčinou mnohých ochorení, vrátane nádorov a väčšiny očných ochorení vedúcich ku strate zraku. Schopnosť selektívne rozpoznať a okludovať neovaskulatúru prinesie nové diagnostické a terapeutické možnosti.
Skúmali sme, či je B-FN špecifickým markerom očnej angiogenézy a či môžu protilátky rozpoznávajúce B-FN selektívne rozpoznávať očné neovaskulárne štruktúry in vivo po systémovom podaní. Na tento účel sme stimulovali angiogenézu v králičej rohovke, ktorá umožnila priame pozorovanie novo vytvorených očných ciev, pomocou chirurgickej implantácie peliet obsahujúcich vaskulárny endotelový rastový faktor alebo ester forbolu (obr. 7). Sukralfátové (láskavý dar od Merck, Darmstad, Germany)/hydrónové pelety obsahujúce buď 800 ng vaskulárneho endotelového rastového faktoru (Sigma) alebo 400 ng forbol-12-myristát 13-acetátu (PMA, Sigma) boli implantované do rohovky samíc králikov plemena New Zealand White, spôsobom opísaným v literatúre (D'Amato, R J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4082 - 4085, 1994). An23 giogenéza bola indukovaná oboma faktormi. Králiky boli sledované denne. Pri použití oboch indukčných činidiel boli novo vytvorené krvné cievy silne pozitívne na ED-B pri imunohistochemickom vyšetrení. Na všetky ďalšie pokusy boli použité PMA pelety. Imunohistochemické vyšetrenia ukázali, že L19 silno farbí neovaskulatúru indukovanú v králičej rohovke (obr. 8, 9a), ale nie preexistujúce krvné cievy oka (obr. 9b,c) a iné tkanivá (údaje nie sú uvedené). Imunohistochemické vyšetrenia boli uskutočnené spôsobom opísaným v literatúre (Carnemolla, B. et al., Int. J. Cancer, 68: 397 - 405, 1996).
Príklad 5: Ľudský protilátkový fragment L19, ktorý sa viaže na ED-B so subnanomolárnou afinitou, rozpoznáva očnú angiogenézu in vivo
S použitím modelu angiogenézy na králičej rohovke, ktorý bol opísaný v predošlom príklade, a imunofotodetekčnej techniky (Neri, D. et al., Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275, 1997), sme preukázali, že L19, chemicky naviazaný na červený fluórofór Cy5, ale nie protilátkový fragment (HyHEL-10)-Cy5, namierený proti irelevantnému antigénu (obr. 10a,b), selektívne rozpoznáva očnú angiogenézu po intravenóznej injekcii. Fluorescenčné farbenie rastúcich očných ciev bolo jasne detegovateľné pri použití L19 ihneď po injekcii a pretrvávalo po dobu aspoň dvoch dní, analogicky s predošlými pozorovaniami pre nádorovú angiogenézu. Následná imunofluorescenčná mikroskopická analýza rezov z rohovky uskutočnená ex vivo potvrdila lokalizáciu L19, ale nie HyHEL-10, okolo vaskulárnych štruktúr (obr. 10c,d). Dôkaz rozpoznávania očnej neovaskularizácie protilátkou, spoločne s reaktivitou anti-B-FN protilátok u rôznych druhov, nabáda k ďalším klinickým výskumom. Imunofluorescenčné zobrazenie môže byť vhodné na včasnú detekciu očnej angiogenézy u rizikových pacientov, skôr než sa lézie stanú zreteľnými pri fluóroangiografii.
Niektoré metodologické podrobnosti:
Na vyšetrenie imunofluórescencie ex vivo a na niektoré H/E farbenia boli rohovky fixované v 4% paraformaldehyde v PBS pred ponorením. Pokusy fluo24 rescenčnej fotodetekcie boli uskutočnené na králikoch ukľudnených Acepromazínom v dávke 5 mg/kg. Na pokusy cieleného rozpoznávania bolo 3,5 mg scFv(L19)i-Cy5o,66 a 2,8 mg scFv(HyHEL-10)i-Cy50,g3 injikovaných intravenózne každému králikovi (doba injekcie = 15 minút). Silná fluorescencia v rohovkovej neovaskulatúre bola pozorovaná ihneď po injekci L19, ale nie HyHEL-10, a pretrvávala niekoľko hodín. V ďalšom teste na špecificitu bol králikom injekčné podaný deň vopred scFv(HyHEL-10)-Cy5 a králikom negatívnym pri fotodetekcii bol ďalší deň injikovaný scFv(L19)-Cy5 a bolo pozorované silné fluorescenčné farbenie rohovkových novo vytvorených ciev.
Na fluorescenčnú detekcii boli oči ožiarené wolfrámovou halogénovou lampou (model Schott KL1500; Zeiss, Jena, Germany) vybavenou Cy5 excitačným filtrom (Chromá, Brattleboro, VT, USA) a dvoma svetelnými kanálmi, ktorých konce boli umiestnené približne 2 cm od oka. Fluorescencia bola detegovaná chladenou C-5985 monochromatickou CCD-kamerou (Hamatsu, HamatsuCity, Japan), vybavenou C-upevnenou Canon Zoom šošovkou (V6xl6; 16-100 mm, 1: 1,9) a Cy5 emisným filtrom s priemerom 50 mm (Chromá), umiestneným vo vzdialenosti 3 - 4 cm od ožarovaného oka. Akvizičné časy boli 0,4 s.
Cy5 fluóroangiografické pokusy boli uskutočnené s rovnakým vybavením, ale s intravenóznou injekciou 0,25 mg Cy5-Tris (produkt reakcie medzi Cy5-NHS a tris(hydroxymetyl)-aminometánom; doba injekcie = 5 minút). Akvizičné časy boli 0,2 s.
Protilátkové fragmenty boli vo forme scFv. Prečistenie scFv(L19) a scFv(HyHEL-lO) a ich značenie N-hydroxysukcínimidovými estermi (NHS) indokyanínu bolo opísané v literatúre (Neri, D. et al., Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275, 1997, Fattorusso, R. et al., 1999, Structure 7: 381 - 390). Pomery protilátka:Cy5 pri značení boli pre tieto dve protilátky 1,5.1 a 1,2:1, v príslušnom poradí. Cy5-NHS bolo zakúpené od Amersham Pharmacia Biotech (Zurich, Switzerland) a ovalbumín od Sugma (Buchs, Switzerland).
Po značení boli protilátkové konjugáty separované od neinkorporovaného fluórofóru alebo fotosenzibilizátora s použitím PD-10 kolón (Amersham Pharmacia Biotech) uvedených do rovnováhy v 50 mM fosfátu, pH 7,4, 100 mM
NaCl, (PBS). lmunoreaktivita protilátkových konjugátov bola meraná afinitnou chromatografiou na antigénnych kolónach (Neri, D. et al., Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275, 1997) a vo všetkých prípadoch bola > 78%. Imunokonjugáty boli analyzované elektroforézou na dodecylsíran sodný-polyakrylamidových géloch a migrovali ako prúžok o MW = 30000 Daltonov (čistota 3 90%).
Príklad 6: Ľudský protilátkový fragment L19, chemicky konjugovaný na fotosenzibilizačné činidlo, ktorým bol chlorín štvormocného cínu ββ, selektívne rozpoznáva angiogenézu a spôsobuje oklúziu novo vytvorených ciev pri ožiarení červeným svetlom
Na testovanie toho, či môže byť pomocou selektívneho rozpoznávania protilátkou dosiahnutá selektívna ablácia ciev, sme injikovali králikom L19 protilátkový fragment alebo irelevantný proteín, ktorý sa nevychytáva v novo vytvorených cievach (ovalbumín), naviazaných na fotosenzibilizačné činidlo, ktorým bol chlorín štvormocného cínu ββ, (ktoré je tu označované ako PS). Oči zvierat, ktorým bola podaná injekcia, boli ožiarené červeným svetlom (dávka = 78 J/cm2). Reprezentatívne hodnoty sú uvedené na obr. 11. Nápadný makroskopický odlišný nález bol pozorovaný 16 hodín po ožiarení u králikov ošetrených L19-PS (obr. lla, b), s koaguláciou rohovkovej neovaskulatúry, ale nie ciev v spojivke či iných očných štruktúrach. Fluóroangiografia s indokyanínovým fluórofórom Cy5 (obr. 11c) potvrdila uzáver ciev, ktorý sa prejavil ako charakteristické hypofluorescenčné oblasti. Naopak, hyperfluorescenčné oblasti boli pozorované v prepúšťajúcej neovaskulatúre v neožiarených očiach (obr. lld, h). Žiadne makroskopické alterácie neboli pozorované v ožiarených cievach králikov ošetrených ovalbumínom-PS (obr. Íle - g), ani oftalmoskopicky, ani pri Cy5 fluóroangiografii. Efekt ožiarenia cielene podaného L19-PS konjugátu pri včasných štádiách rohovkovej angiogenézy je uvedený na obr. 11i - 1. Selektívne koagulované krvné cievy boli makroskopický viditeľné u živých zvierat (obr. 11i, j) a boli ešte zreteľnejšie u zvierat bezprostredne po utratení (obr. 11 k, 1).
Fotodynamické poškodenie bolo ďalej skúmané pomocou mikroskopických techník. Po ožiarení mohla byť oklúzia ciev detegovaná štandardnými technikami farbenia hematoxylínom/eozínom (H/E) ako v nefixovaných, tak v paraformaldehydom fixovaných rezoch z rohovky zvierat liečených L19-PS (obr. 11b, j, f), ale nie zvierat liečených ovalbumínom-PS (obr. lla, e, i). Apoptóza v časti rohovky cielene rozpoznanej konjugátom obsahujúcim fotosenzibilizačné činidlo bola jasne viditeľná vo fluorescenčnom TUNEL teste (obr. 11c, g), ale bola zle detegovateľná u negatívnych kontrol (obr. lld, h). Vyššie zväčšenie ukázalo apoptózu endotelových buniek v cievnych štruktúrach (obr. 1 lg). Ani v TUNEL teste (nie je ukázané), ani H/E farbením (obr. llk, 1) nebolo detegované žiadne poškodenie krvných ciev v dúhovke, sklére či spojivke liečených zvierat.
Selektívna fotodynamická ablácia neovaskulatúry bude prínosom pre liečbu očných ochorení a iných patologických stavov súvisiacich s angiogenézou, ktoré sú prístupné na ožiarenie pomocou svetelných difuzérov alebo optických vlákien. Výsledky tejto štúdie jasne ukazujú, že očná neovaskulatúra môže byť selektívne okludovaná bez poškodenia preexistujúcich krvných ciev a normálnych tkanív.
Niektoré technické podrobnosti:
Zlúčenina štvormocného cínu a chlóru ee bola vybraná z rôznych fotosenzibilizačných činidiel pre svoju účinnosť, rozpustnosť a špecificitu po naviazaní na králičiu anti-myšiu polyklonálnu protilátku (Sigma). Tieto imunokonjugáty boli testované na cielenú fotolýzu červených krviniek potiahnutých monoklonálnou protilátkou špecifickou pre ľudský CD47 (č. 313441A; Pharmingen, San Diego, CA, USA). Zlúčenina štvormocného cínu a chlóru ee bola pripravená spôsobom opísaným v literatúre (Lu, X.M. et al., J. Immunol. Methods, 156: 85 - 99, 1992). Pre väzbu na proteíny bola zlúčenina štvormocného cínu a chlóru ββ (2 mg/ml) miešaná po dobu 30 minút pri teplote okolia v dimetylformamide s 10-násobným molárnym nadbytkom EDC (N'-3dimetylaminopropyl-N-etylkarbodiimid, hydrochlorid, Sigma), a NHS (N27 hydroxysukcínimid, Sigma). Vzniknutá aktivovaná zmes sa potom pridala do 8násobného objemu proteínového roztoku (1 mg/ml) a uskutočnila sa inkubácia pri teplote okolia po dobu 1 hodiny.
Po značení boli protilátkové konjugáty separované od neinkorporovaného fluórofóru alebo fotosenzibilizátora s použitím PD-10 kolón (Amersham Pharmacia Biotech) uvedených do rovnováhy v 50 mM fosfátu, pH 7,4, 100 mM NaCl, (PBS). Imunoreaktivita protilátkových konjugátov bola meraná spôsobom opísaným v predchádzajúcom príklade.
V pokusoch týkajúcich sa fotodeštrukcie bolo králikom podaných intravenózne 12 mg scFv(L19)j- zlúčeniny štvormocného cínu a chlóru ββ (ο,β) alebo 38 mg ovalbumínuí - zlúčeniny štvormocného cínu a chlóru ββ (o.36), a králiky boli držané v tme počas trvania pokusu. 8 hodín po injekcii boli králiky uvedené do anestézie ketamínom (35 mg/kg/ xylazínom (5 mg/kg)/ acepromazínom (1 mg/kg)) a jedno z dvoch očí bolo ožarované po dobu 13 minút Schott KL 1500 wolframovou halogénovou lampou vybavenou Cy5 excitačným filtrom (Chromá) a dvoma svetelnými kanálmi, ktorých konce boli umiestnené približne 1 cm od oka. Ožiarená plocha bola približne veľkosti 1 cm2 a ožiarenie bolo uskutočnené dávkou 100 mW/cm2, ako bola zmeraná SL818 fotodetektorom (Newport Corp. Irvine, CA, USA). Neboli pozorované žiadne známky diskomfortu po ožiarení. Preventívne králiky dostali po ožiarení analgetiká (buprenorfín 0,03 mg/kg). Na sledovanie fotodeštrukcie boli oči vyšetrované oftalmoskopom a boli fotografované s použitím fundus kamery KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausanne, Switzerland). Päť králikov bolo ošetrených konjugátom obsahujúcim zlúčeninu štvormocného cínu a chlóru eg a ožiarených len na jedno oko, zatiaľ čo druhé oko slúžilo ako vnútorná negatívna kontrola. Ako ďalšia kontrola boli použité dva králiky, ktoré boli len ožiarené, ale nebol im podaný žiadny konjugát s fotosenzibilizátorom.
Ihneď po utratení králikov nadmernou dávkou anestetika boli bulby enukleované, rohovky boli odstránené, boli ponorené do Tissue Tek (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan) a zmrazené. Na imunofluorescenčné vyšetrenia ex vivo a na niektoré H/E farbenia boli rohovky fixované v 4% paraformaldehyde v PBS pred tým, než boli ponorené do Tissue Tek. Kryostatové rezy priemeru 5 gm boli použité na ďalšiu mikroskopickú analýzu. Fuorescenčné TUNEL testy boli uskutočnené podľa návodu výrobcu (Roche Diagnostic, Rotkreutz, Switzerland).
Tabuľka 1: Sekvencie vybraných anti-ED-B protilátkových klonov
Kloň | 31-33* | VH reťazec 50-54* | 95-98* | 32* | VL reťazec 50* | 91-96* |
A2 | SYA | AISGSG | GLSI | Y | G | NGWYPW |
G4 | SYA | AISGSG | SFSF | Y | G | GGWLPY |
E1 | SYA | AISGSG | FPFY | Y | G | TGRIPP |
H10 | SFS | SIRGSS | FPFY | Y | G | TGRIPP |
L19 | SFS | SIRGSS | FPFY | Y | Y | TGRIPP |
Relevantné aminokyselinové | pozície (*: | číslovanie | podľa Tomlinson et |
1995, EMBO J., 14: 4628 - 4638) protilátkových klonov izolovaných z navrhnutých syntetických knižníc. Jednopísmenové aminokyselinové kódy sú použité podľa štandardného IUPAC názvoslovia.
Tabuľka 2: Afinity anti-ED-B scFv fragmentov
Kloň | kon (s'’M'’) | koff(s-’)B | koff(s'1)c | Ka(M)* |
A2 | 1.5x10’ | 2.8 x 10’ | - | 1.9 x 10*’ |
G4 | 4.0 x IO4 | 3.5 x 10'3 | - | 8.7 x 10*’ |
EI | 1.6x10’ | 6.5 x IO*3 | - | 4.1 x 10** |
H10 | 6.7 x 104 | 5.6X104 | 9.9x10*’ | 1.5 x 10” |
L19 | 1.1 x 10’ | 9.6 x IO*3 | 6.0 x IO*4 | 5.4 x 10 |
*) Ká = koff/kon- Pre vysoko-afínitné ligandy H10 a L19 nie sú hodnoty kOff z BIAcore analýzy dostatočne presné z dôvodu vplyvu negatívne nabitej karboxylovanej pevnej dextránovej matrice; Kd hodnoty sú preto vypočítané z meraní KOff získaných v kompetičných pokusoch (viď príklady). k00, kinetická disociačná konštanta; kon, kinetická asociačná konštanta; kd, disociačná konštanta. B = meranie na BIAcore; C = meranie pomocou kompetície s elektrochemiluminiscenčnou detekciou. Hodnoty sú presné pre +/- 50%, podľa presného stanovenia koncentrácie.
Zoznam sekvencii <110> EUDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH <120> Špecifické väzbové molekuly pre scintigrafiu, konjugáty obsahujúce tieto molekuly a spôsoby liečby angiogenézy <130> 1900PTEP , t <140>
<141 >
<150> US 09/075338 <151> 1998-05-11 <150> US <151> 1999-04-28 <160> 21 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiáinej sekvencie: PCR primér: LMBlbis <400> 1 /
I gcggcccagc cggccatggc cgag 24 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiáinej sekvencie: PCR primér: DP47CDRlfor <400> 2 gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg 54 <210>3 <211> 23 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiáinej sekvencie- PCR primér: DP47CDRlback <400>3 atgagctggg tccgccaggc tcc 23 <210> 4 <2Il>60 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DP47CDR2for <400> 4 gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt 60 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DP47CDR2back <400> 5 acatactacg cagactccgt gaag <210>6 <211> 53 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <22Q>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: JforNot <400> 6 tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPKCDRlfor <400> 7 gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg <210> 8 <211> 23 <2 1 2> DNA <213> Arteficiálne sekveneie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekveneie: PCR primér: DPKCDRlback <400> 8 ttagcctggt accagcagaa acc 23 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Arteficiálne sekveneie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekveneie: PCR primér: DPKCDR2for <400> 9 gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 46 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Arteficiálne sekveneie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekveneie: PCR primér: DPKCDR2back <400> 10 gcatccagca gggccactgg c 21 <210> 11 <211>45 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie; PCR primér: DP47baNco <400> 11 gcggcccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45 <210> 12 <21I> 55 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: CDR3for <400> 12 ggttccctgg ccccagtagt caaatnnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: VHpullth <400> 13 gcggcccagc atgccatggc cgag 24 <210> 14 <211> 66 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér Jassm <400> 14 cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc cctggcccca 60 gtagtc 66 <211 > 62 <210> 15 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPK22assm <400> 15 gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt gacgcagtct 60 CC 62 <210> 16 <211> 63 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPK3for <400> 16 caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac agtaatacac 60 tgc 63 <210> 17 <211> 56 <2 12> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiáinej sekvencie: PCR primér: Jfornot <400> 17 gagtcaťtct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtccctťggc cgaacg 56 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>
<223> Opis arteficiáinej sekvencie: PCR primér: VLpullth <400> 18 gatgggtcca gtggcggtag cggg 24 <210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> VH protilátky špecifické pre ED-B doménu fibronektinu <400> 19
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser íle Ser Gly Ser Sér Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115 <210> 20 <211> 14 <2 1 2> PRT <2 1 3> protilátková spojovacia skupina <400> 20
Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> VL protilátky špecifické pre ED-B doménu fibronektínu <400>'21
Glu íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser
25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 íle Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg íle Pro 85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lye
100
105
Τ') 167^-2/000
4l
Claims (24)
1. Protilátka so špecifickou afinitou pre charakteristický epitop ED-B domény fibronektínu, kde uvedená protilátka má afinitu k uvedenému ED-B epitopu v subnanomolárnych koncentráciách.
2. Protilátka podľa nároku l, kde uvedená protilátka rozpoznáva ED-B(+) fibronektín.
3. Protilátka podľa nároku l, kde uvedená protilátka je v scFv formáte.
4. Protilátka podľa nároku 3, kde uvedená protilátka je rekombinantná protilátka.
5. Protilátka podľa nároku 3, ktorej afinita je zlepšená vložením obmedzeného počtu mutácií v jej zvyškoch CDR.
6. Protilátka podľa nároku 5, kde zvyšky sú zvyšky 31 - 33, 50 a 52 a 54 VH a dva zvyšky 32 a 50 VL domény, ktoré boli mutované.
7. Protilátka podľa nároku l, kde uvedená protilátka sa viaže na ED-B doménu fibronektínu s Kd 54 pM.
8. Protilátka podľa nároku 1, majúca nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:
VH evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS (SEQIDNO:19) spojovacia skupina
GDGSSGGSGGASTG (SEQ ID NO:20)
VL
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS ssylawyqqk PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEQFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK (SEQ ID NO: 21)
9. Protilátka podľa nároku 1, kde uvedená protilátka je funkčne ekvivalentný variant L19.
10 Protilátka podľa nároku 9, kde uvedená protilátka je rádioaktívne značená.
11. Protilátka podľa nároku 10, kde uvedená protilátka je značená rádioaktívnym jódom.
12. Použitie protilátky so špecifickou afinitou pre charakteristický epitop ED-B domény fibronektínu, ktorá má zlepšenú afinitu k uvedenej ED-B doméne, na rýchle cielené zameranie markérov angiogenézy.
13. Použitie podľa nároku 12, ktoré je určené na imunoscintigrafickú detekciu angiogenézy.
14. Použitie podľa nároku 13, ktoré je určené na detekciu ochorení charakterizovaných vaskulárnou proliferáciou, ako je diabetická retinopatia, starecká makulárna degenerácia alebo nádory.
15. Použitie podľa nároku 12, v ktorom protilátka lokalizuje príslušné tkanivá počas troch až štyroch hodín, najlepšie počas 3 hodín, po injekcii.
16. Diagnostický kit obsahujúci protilátku so špecifickou afinitou pre charakteristický epitop ED-B domény fibronektínu, kde uvedená protilátka má zlepšenú afinitu k uvedenej ED-B doméne, a jedno alebo viac činidiel potrebných na detekciu angiogenézy.
17. Použitie protilátky so špecifickou afinitou pre charakteristický epitop ED-B domény fibronektínu, kde uvedená protilátka má zlepšenú afinitu k uvedenej ED-B doméne, na diagnostiku a terapiu nádorov a ochorení charakterizovaných vaskulárnou proliferáciou.
18. Konjugáty, vyznačujúce sa tým, že obsahujú protilátku podľa nároku 1 a molekulu schopnú indukovať koaguláciu krvi a uzatvorenie krvnej cievy.
19. Konjugáty podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že molekulou schopnou indukovať koaguláciu krvi a uzatvorenie krvnej cievy je fotoaktívna molekula.
t I
20. Konjugáty podľa nároku 19, vyznačujúce sa tým, že fotoaktívnou molekulou je fotosenzibilizačné činidlo.
21. Konjugáty podľa nároku 20, vyznačujúce sa tým, že fotosenzibilizačné r
činidlo absorbuje svetlo vlnovej dĺžky väčšej než 600 nm.
22. Konjugáty podľa nároku 21, vyznačujúce sa tým, že fotosenzibilizačné činidlo je derivát zlúčeniny štvormocného cínu s chlórom ee.
23. Použitie konjugátu podľa nároku 18 na prípravu injekčného prostriedku na liečbu patologických stavov súvisiacich s angiogenézou.
24. Použitie podľa nároku 23, v ktorom je patologický stav súvisiaci s angiogenézou spôsobený alebo spojený s očnou angiogenézou.
ι/η /ί?9-·ΖοοΟ
2/17 f U ^^-2000
Obr. 1 B) a + DP47 πύττι-►- DPK22 >, '(U e
•H
M d
I >
o p t <
2 o α o o h“ o < o
R o o o o o ~ o o o o & o
P w
H θ’ P U O W O ~ O O o o
O
I— υ
o tυ α
υ <
O
O
I H čg o x
Oq ’ H o o n u o“ o o
ÍO jQ o o < F υ o p < p H o Q O o O O o
H <
o o o o < < o υ <
o čô tr
Q υ
>1 g
h-Ί >
o o
o o
ŕ o
υ o
h“ o
o ŕ
o o
<
o o
t £
o i-4 o
z
Q
M
Or
W
OT s
P o
$ &
P o o o o o o
U[s
Pn r“ ··
FO O QS o <o P P M F p p F o. < O « P tS £ < o p P P H O P O < h— < < < OOP
2 k. _
O ·=
D)
3/17
Obr. 2A
4/17
IPG (nelineárny gradient) (pH) --►
Obr. 2B i
5/17
Obr. 3A e/n f v f^T^-TJOOO tt m
u o
71/
7/17
U m
•
O
8/17 f1/ ¢679-2000
O 400 800 1200 1600 2000 čas (s) .Σ2 *5 c
o o
CO
Έ ‘e ^5 o
E o
o o
C
O ω
o ŕ>N *CÚ
JD (D
Xi če
Obr. 4 ρΐ/
9/17
Obr. 5
10/17
TV
ω
Obr.
X >
11/17 deň 9/kráIik 2/vľavo/PMA ! deň 9/kráIik 1/vľavo/VEGF
Obr. 7A
12/17 deň 9/králik 4/vľavo/PMA
Obr. 7B
13/17 ?l/ /é?9-Z.OOO
Obr. 8 'fU
14/17
15/17
Obr. 10
16/17 f/ 467^-2-1)00
Obr. 11
17/17
Obr. 12
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US7533898A | 1998-05-11 | 1998-05-11 | |
US09/300,425 US20030045681A1 (en) | 1998-05-11 | 1999-04-28 | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
PCT/EP1999/003210 WO1999058570A2 (en) | 1998-05-11 | 1999-05-11 | Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use therefor for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK16792000A3 true SK16792000A3 (sk) | 2001-05-10 |
SK286822B6 SK286822B6 (sk) | 2009-06-05 |
Family
ID=26756726
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1679-2000A SK286822B6 (sk) | 1998-05-11 | 1999-05-11 | Protilátka so špecifickou afinitou pre epitop ED-B domény fibronektínu, konjugáty obsahujúce tieto molekuly a použitie týchto konjugátov |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070189963A1 (sk) |
EP (1) | EP1084145B1 (sk) |
JP (1) | JP2002514405A (sk) |
CN (1) | CN1250571C (sk) |
AT (1) | ATE301676T1 (sk) |
AU (1) | AU759207B2 (sk) |
BR (1) | BRPI9910394B8 (sk) |
CA (1) | CA2333833C (sk) |
CZ (1) | CZ300495B6 (sk) |
DE (1) | DE69926630T2 (sk) |
DK (1) | DK1084145T3 (sk) |
EA (1) | EA005685B1 (sk) |
EE (1) | EE05435B1 (sk) |
ES (1) | ES2247802T3 (sk) |
HU (1) | HU225675B1 (sk) |
IL (1) | IL139452A0 (sk) |
IS (1) | IS2522B (sk) |
NO (1) | NO327732B1 (sk) |
NZ (1) | NZ508600A (sk) |
PL (1) | PL199353B1 (sk) |
SK (1) | SK286822B6 (sk) |
TR (1) | TR200003317T2 (sk) |
TW (1) | TWI259837B (sk) |
WO (1) | WO1999058570A2 (sk) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5965132A (en) | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
US6749853B1 (en) | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
GB9610967D0 (en) | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
DE69932084T2 (de) * | 1999-01-05 | 2007-06-28 | The Flinders University Of South Australia, Bedford Park | Antikörperfragmente zur lokalen Behandlung von Augenerkrankungen |
DE19932688B4 (de) | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
DE19947559A1 (de) * | 1999-09-24 | 2001-04-19 | Schering Ag | Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung |
US6319273B1 (en) * | 1999-12-16 | 2001-11-20 | Light Sciences Corporation | Illuminating device for treating eye disease |
CA2399866C (en) * | 2000-02-24 | 2011-05-10 | Philogen S.R.L. | Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions |
CA2400622A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis |
RU2280254C2 (ru) * | 2000-09-07 | 2006-07-20 | Шеринг Акциенгезельшафт | РЕЦЕПТОР EDb-ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА |
DE10045803A1 (de) * | 2000-09-07 | 2002-04-11 | Schering Ag | Rezeptor der EDb Fibronektin-Domäne |
US20030100010A1 (en) * | 2001-11-23 | 2003-05-29 | George Jackowski | Fibrinogen biopolymer Marker predictive of type II diabetes |
US20030118657A1 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-26 | West Jennifer L. | Treatment of disease states characterized by excessive or inappropriate angiogenesis |
BR0306715A (pt) * | 2002-01-03 | 2004-12-28 | Schering Ag | Métodos para diagnóstico e tratamento de tumores |
DE60333820D1 (de) * | 2002-01-03 | 2010-09-30 | Bayer Schering Pharma Ag | Konjugate mit einem für die ed-b-domäne von fibronectin spezifischen antikörper, und deren verwendung zum nachweis und zur behandlung von tumoren |
DE60330652D1 (de) * | 2002-03-11 | 2010-02-04 | Bayer Schering Pharma Ag | Antikörper aus anti-ed-b l19 gerichtet auf tumorblutgefässe |
MX337052B (es) | 2002-07-15 | 2016-02-11 | Univ Texas | Peptidos que se enlazan a fosfatidiletanolamina y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cancer. |
DE10324447A1 (de) | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
DE10348319A1 (de) * | 2003-10-17 | 2005-05-19 | Schering Ag | Bindemoleküle für die Extra-Domäne B von Fibronectin zur Detektion von atherosklerotischen Plaques |
US7785591B2 (en) | 2004-10-14 | 2010-08-31 | Morphosys Ag | Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies |
EP1957531B1 (en) * | 2005-11-07 | 2016-04-13 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences |
JP2009514540A (ja) * | 2005-11-09 | 2009-04-09 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 機能−阻止抗−ed−b−フィブロネクチン抗体(private)の同定及び特徴化 |
EP1842553A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-10 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule |
EP1925664A1 (en) | 2006-11-15 | 2008-05-28 | Scil proteins GmbH | Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin |
ES2382058T3 (es) | 2008-01-17 | 2012-06-04 | Philogen S.P.A. | Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos |
EP2100621A1 (en) | 2008-03-10 | 2009-09-16 | mivenion GmbH | Polyether polyol dendron conjugates with effector molecules for biological targeting |
JP2009244154A (ja) | 2008-03-31 | 2009-10-22 | Nationa Hospital Organization | 老化、および血管障害を伴う疾患の検定のための組成物、キットおよび方法 |
EP2116555A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma |
WO2010056889A2 (en) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of an antibody and a rare-earth based crystal |
BR112012014194A2 (pt) | 2009-12-14 | 2017-01-10 | Scil Proteins Gmbh | um método para identificar proteínas ubiquitinas modificadas hetero-multiméricas com capacidade de ligação a ligandos |
WO2011110490A1 (en) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Process for the production of radioactively labelled scfv antibody fragments, kits and compositions |
WO2012171541A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins |
WO2012172055A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
WO2013010749A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-24 | Philogen S.P.A | Sequential anti - ctla4 and targeted il-2 therapy |
RU2481839C2 (ru) * | 2011-08-16 | 2013-05-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития" | Способ лечения ишемической болезни сердца с дистальным или диффузным поражением коронарных артерий |
WO2013186329A1 (en) | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Scil Proteins Gmbh | Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains |
WO2014094799A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Scil-Proteins-Gmbh | Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life |
CN104395342B (zh) * | 2013-06-06 | 2017-07-04 | 合肥立方制药股份有限公司 | 人源抗纤连蛋白ed‑b结构域的抗体及其用途 |
EP3253785B1 (en) | 2015-02-06 | 2019-04-10 | Navigo Proteins Gmbh | Novel egfr binding proteins |
KR102064396B1 (ko) | 2015-07-16 | 2020-01-09 | 나피고 프로타인스 게엠베하 | 신규한 면역글로불린-결합 단백질 및 친화도 정제에서의 이의 용도 |
JP2018520675A (ja) | 2015-07-20 | 2018-08-02 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングNavigo Proteins GmbH | ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法 |
EP3378947B1 (en) * | 2015-11-16 | 2024-01-24 | Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. | Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia |
CN109310780A (zh) | 2016-05-04 | 2019-02-05 | 纳维格蛋白质有限公司 | 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物 |
GB201612317D0 (en) | 2016-07-15 | 2016-08-31 | Philogen Spa | Antibody compositions |
US11230576B2 (en) | 2016-08-11 | 2022-01-25 | Navigo Proteins Gmbh | Alkaline stable immunoglobulin-binding proteins |
AU2017344440B2 (en) | 2016-10-17 | 2020-07-30 | Pfizer Inc. | Anti-EDB antibodies and antibody-drug conjugates |
GB201621806D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Philogen Spa | Immunocytokines with progressive activation mechanism |
WO2019062877A1 (zh) * | 2017-09-30 | 2019-04-04 | 合肥立方制药股份有限公司 | 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白 |
US11414466B2 (en) | 2017-11-07 | 2022-08-16 | Navigo Proteins Gmbh | Fusion proteins with specificity for ED-B and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
WO2019185792A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Philogen S.P.A | Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors |
WO2020070150A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Philogen S.P.A | Il2 immunoconjugates |
EP3660039A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-03 | Philogen S.p.A. | Il2 immunoconjugates |
EP4359429A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Cytune Pharma | Interleukin 15 variants |
BR112023027312A2 (pt) | 2021-06-23 | 2024-03-12 | Cytune Pharma | Imunocitocina |
WO2023131611A1 (en) | 2022-01-04 | 2023-07-13 | Philogen S.P.A. | Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor |
WO2024028258A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Philochem Ag | Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents |
WO2024047237A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | Philogen S.P.A. | Tnf alpha and interleukin-2 combination therapy for non-melanoma skin cancer |
WO2024052333A1 (en) | 2022-09-06 | 2024-03-14 | Philochem Ag | Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9610967D0 (en) * | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
-
1999
- 1999-05-10 TW TW088107648A patent/TWI259837B/zh active
- 1999-05-11 TR TR2000/03317T patent/TR200003317T2/xx unknown
- 1999-05-11 ES ES99923571T patent/ES2247802T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 DE DE69926630T patent/DE69926630T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 EA EA200001169A patent/EA005685B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 DK DK99923571T patent/DK1084145T3/da active
- 1999-05-11 EE EEP200000802A patent/EE05435B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 CA CA2333833A patent/CA2333833C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 WO PCT/EP1999/003210 patent/WO1999058570A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-11 SK SK1679-2000A patent/SK286822B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 AT AT99923571T patent/ATE301676T1/de active
- 1999-05-11 BR BRPI9910394 patent/BRPI9910394B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 EP EP99923571A patent/EP1084145B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 HU HU0102992A patent/HU225675B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 AU AU40398/99A patent/AU759207B2/en not_active Expired
- 1999-05-11 CZ CZ20004216A patent/CZ300495B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 NZ NZ508600A patent/NZ508600A/xx unknown
- 1999-05-11 PL PL345845A patent/PL199353B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-05-11 IL IL13945299A patent/IL139452A0/xx unknown
- 1999-05-11 CN CNB998060526A patent/CN1250571C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-11 JP JP2000548372A patent/JP2002514405A/ja active Pending
-
2000
- 2000-11-10 IS IS5708A patent/IS2522B/is unknown
- 2000-11-10 NO NO20005694A patent/NO327732B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-12-13 US US11/637,810 patent/US20070189963A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU759207B2 (en) | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis | |
US8097254B2 (en) | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis | |
JP2009280607A (ja) | フィブロネクチンのed−bドメインに対する抗体、それを含有する抱合体、および、腫瘍および血管新生関連の疾病の診断および治療をするためのそれの用途 | |
AU2001242432A1 (en) | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis | |
JP5221641B2 (ja) | 腫瘍転移の血管新生と関連するフィブロネクチンのed−a抗原 | |
KR102002739B1 (ko) | 류마티스 관절염과 연관된 항원 | |
KR20050010081A (ko) | 피브로넥틴 ed-b 도메인에 대한 항체, 그 제조방법 및용도 | |
US20030176663A1 (en) | Specific binding molecules for scintigraphy | |
MXPA00011017A (en) | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis | |
BG65163B1 (bg) | Антитела за ed-b домен на фибронектин, съдържащи ги конюгации и използването им за диагноза и лечение на тумори и болестни състояния, свързани с ангиогенезата | |
KR100494530B1 (ko) | 피브로넥틴ed-b도메인에대한항체,그제조방법및용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20120511 |