TWI259837B

TWI259837B - Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis

Info

Publication number: TWI259837B
Application number: TW088107648A
Authority: TW
Inventors: Dario Neri; Lorenzo Tarli; Francesca Viti; Manfred Birchler
Original assignee: Eidgenossische Tech Hochscule
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2006-08-11
Also published as: CN1250571C; AU759207B2; PL345845A1; IS2522B; EE200000802A; HU225675B1; NO20005694L; CA2333833A1; DK1084145T3; CZ20004216A3; DE69926630D1; CA2333833C; ATE301676T1; AU4039899A; NO327732B1; ES2247802T3; US20070189963A1; HUP0102992A2; EP1084145A2; NO20005694D0

Description

1259837 612-618)，且可作為分子介入的標的。事實上，近來吾人已能運用螢光技術證實，抗ED-B單鏈Fv抗體片段（scFv)在患有腫瘤小鼠上會選擇性聚集於腫瘤血管處，及抗體親和力會左右標的的表現，參見 [Neri et al· (1997)· Nat Biotechnol. 15，1271-1275]及[國際專利申請號 PCT / GB97/01412, based on GB96 / 10967.3]。腫瘤標定在注射後24小時或稍晚即可被評估。目前已有各種不同的嘗試，試圖提高抗體與四^結構域之結合，以使其此用以標定腫瘤。

Peter 等人（Cell AdhesionandCommunication (1995)· 3, 67-89) 發現了多株抗體培養之不含纖維網蛋白（FN)序列之抗原，而非含完整ED-B結構域之抗原，並證明其特定且直接地結合至此結構域。然而，Peters等人的試劑有相當多的缺點：其抗血清須經聚木醣酶（N-glyCanase)作用方可辨識ED—队+)—仰。這使得此試劑不適合應，在腫瘤標定、造影及治療上，因為去糖基作用（deglya)sylati〇n) 不能在活體巾進行。作者亦指出他們所製作的抗體無法辨識哺乳動物細胞所產生之完整的ED-B(+)-FN。他們亦瞭解其無法製造出對ED—^结構域R具專一性之單株抗體，即使對其他纖維網蛋白的結構域 ED-A)已被製造出了。眾所週知，在上述的應用中，多株抗血法被接受的。經過多年的研究後，可辨識纖維網蛋白ED—B結構域且不須經過聚木醣酶作⑽單株抗體，只有本發賴使㈣韻體表現技術制1告屮炎。

Zang 等人（Matrix Biology 1994，14: 623-633)以狗的 ED—B j 構域製造㈣株抗血清。作者希望能與人的ED-B(+)—FN抗體有交又2 應，但並未賴驗。然而，作者們6意酬製作—個直接網蛋白ED-B結構域的單株抗體有其困難（page 631)。在西方墨點； (Westernblot)中，抗血清只有在以N—聚木醣_處理後方可辨識 (+)-FN。如前所述，聚木醣酶作用使得這些試劑不適合本發明的應用在酵素免疫試驗中，ED-B⑴-FN的辨認不須要去糖基化作用^ 1259837 只能在軟骨組織上，其係以變性試劑（4M尿素）萃取之並於膠質處理的塑黟上被概。作特_「_婦自分子與树素免疫試驗盤，塑膠表面的驛髓’轉缺抗絲位充分祕錄抗血清辨遇」。因為在活體顧上，纖維網蛋自無法觀性及娜f結合，而本發明之單株結合物因此提供了顯著的優點。日本專利謂_5提到抗㈣抗體。由文件上看疋否為述單株抗ED-B抗體並不是很清楚。再者，單一抗體（如在 JP02076598所述之抗體）似乎不可能含有—個抗原決定素於式⑴、⑵ 或（3)之胺基酸序列：

~(1) EGIPIFEDFVDSSVGY -(2) YTVTGLEPGIDYDIS -(3) NGGESAPTTLTQQT 乃基於以下證據： I) 一個單株抗體應能辨識一個已定義之抗原表位。 II) 纖維網蛋白ED-B結構域之三維結構已透過核磁共振分光儀確定。片段⑴、（2)及⑶位於ED—B結構之相向位置，而無法同時盘一個單株抗體結合。、此外’為了證實抗體之實用性，亦須證實其於腫瘤中的定位，如冋在毋需結構干賴麟理之生物檢體中，ED_B(+) FN結構的據。 BC1抗體（參見Carnem〇Ua的al 1992,】耵以ch挪撕 246891·)可觸__蛋自之結_ 7之抗原錄而非即―B 、、’。構域’其於ED-B、结構域的表現顯得相當模糊不明。此抗體對人類具全然專-性。因此，BC1抗體與本發明之抗體顯出不_反應性。甚至、， BC1抗體僅可辨認結構域7及缺㈣結構域之結構域7_8。這樣體表位能在活體_由纖維網蛋自分子之蛋白水解而產生。本發明= 『要他們具有ED-B結構域’他們便能夠局限在纖“蛋：於癌症^斷’尤其對原發或續發腫瘤影像，免疫閃爍掃晦為其 1259837 中一種選擇。在此方法中，病人在注射放射性同位素化合物（如連結某放射核種至一適當載體）後，以適當的裝置（如珈瑪相機）照相。對於閃爍造影之應用’為減少病人暴露在放射物質下，較常使用半衰期短的珈瑪幅射源，像鉻-99、碘-123或銦-111。在核子醫學科最常使用的核種是搭-99 (99mTc)，為半衰期6小時之伽馬幅射源。一般在病人注射含鉻—99之放射性藥物後約12至24小時可照相，然而，核種很可能在更短的時間累積於病變處。此外，如果抗體能快速、選擇性地定位於新生血管，將激勵研究人員尋找其他適合的分子來與抗體結合，以達到診斷及治療的目的。【發明概述】基於注射後可將腫瘤傷害定位數小時之放射性藥物之核子醫學需要，及抗體親和力對標定新生血管的影響，本發明之目的在於製造特別適用於纖維網蛋白之ED-B結構域之抗體，纖維網蛋白具有次毫微米級的解離常數(抗體-抗原親和力的定義及監測參見_ Μα (刪） Tm^inBiotechnol. 14, 465-470)。本發明之再一目的為提供具·

適當形式放射制位餘體’騎麟赃自之胸結構域，可於注射後數小時完成腫瘤偵測。 W 、本發明的觀點之一為，上述目的可藉由對纖維網蛋白的册—8結域的特殊抗縣位婦定親和力，及__抗原錄具有更佳= 力之抗體來完成。本發明的觀點之二為，上述抗體係用於快速標定新生血管。診斷為-診斷裝置，其包括該抗體及—或多種用於特徵⑼為，該抗體係賴於診斷及治療具有血管增生地選點之五為包括該抗體及—適#絲齡子（例如明智 ^擇樣物質）之結合物，及將其使用於新生血管之選擇性光媒^ 1259837 專門用語本發明所用之專門用語定義如下：

to- OA -抗體、协ί指y種免疫球蛋白，無論自然或部分或全部合成者。此名詞亦，ypeptide)或具有結合結構域為抗體結構域*同原者之 t。k些可由天然資源衍生出來，或部分或全部合成。抗體的例子包括_免疫球蛋自及其_之亞綱；片段包括抗原結合結構域，例如Fab、ScFv、Fv、dAb、Fd及diab〇dy。取單株及其他抗體並使用 DNA重組技術來製造保有原抗體特性的其他抗體或化學分子是可能的。此類技術包括導人DM，並將-抗體之免疫球蛋白的可變異區或互補限定區（CDRs)，編碼到不同的免疫球蛋白的固定區或固定區加外框區。可參見 EP+184187、GB 2188638A 或 EP+239400。融合瘤 (Hybridoma)或其他細胞產生抗體可能受到基因突變或其他變化，其可月b或不旎改變生成抗體的結合特性。由於抗體可由許多方法改變，『抗體』-詞應係任何特定結合成員或具有所需特性之結合結構域者。因此，該詞涵蓋抗體的抗體片段、衍生物、功能同等者及同原者，包括任何天然或部分或全部合成的，具有免疫球蛋白結合結構域之聚壯。亦包括與另一聚肚結合，含有免疫球蛋白結合結構域或等同物的特異(chimeric)分子。特異分子的培養及表示法參見Ep_A—〇12〇694及 EP-A-0125023。已有證明顯示完整抗體的片段亦可表現結合抗原的功能。結合片段的例子包括⑴由VL、VH、CL及CH1結構域組成的Fab 片段；（ii)由VH及CH1結構域組成的Fd片段；（iii)由單一抗體之 VL及VH結構域組成的Fv片段;（iv)由VH結構域組成的dAb片段(Ward et al· (1989));(v)分離的 CDR 區；（vi) F(ab，）2 片段，包括兩個相連Fab片段的二價片段；（νϋ)單鏈fv分子（scFv)，其中一 VH結構域及一 VL結構欲藉由一聚壯連結體相連，以使此二結構域結合形成抗原結合位址（Bird et al· (1998) Science, 242, 423-426. ; Huston etal. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-83) ； (viii) 雙性（bispecific)單鏈 FV 二聚物（PCT/US92/09965 ) ; (ix) 1259837 『dibodies』，由基因融合的多價或多特性的片段（W094/13804; Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90, 6444-6448)。Diabodies為聚壯的多聚物，每一個聚壯包括一免疫球蛋白輕鍵的結合區’及一包括一免疫球蛋白重鍵結合區的第二結構域，此二結構域被連結（例如被肽連結體連結），但不能彼此結合形成抗原結合位址。抗原結合位址係由多聚物内聚壯的第一結構域與多聚物内另一聚壯的第二結構域結合形成（WO94/13804)。此處使用之雙性抗體可為傳統的雙性抗體，並可用各種方法製造（H〇lliger and Winter (1993)，Curr· Opin· Biotech·，4，446-449)，例如化學製備或由混合hybridomas製備，或為上述之任何雙性抗體片段。較佳為，使用scFv 二聚物或diabodies而非完整抗體。Diabodie及scFv之建立不需FC 區’只使用可變異的結構域，有可能降低抗idi〇typic反應的效果。其他形式的雙性抗體包括單鏈CRAbs，參見[Nerietal. (1995)J. Mol. Biol·，246，367-373]。互補限疋£ (Complementarity-determining regions) ▲傳統上，抗體可變異結構域的互補限定區（CDRs)定義為高度可變異抗體軸，包含祕觸較抗原賊餘基f。本文巾，我們的 CDR定義及編號參照[Ch〇thia and Lesk (1987)】·難 901 - 917]。 · ·，， -等功能之變異形式仲分子（變異種）’其雖與另—分子（母株）具有結構差異， 2要相同處’及至少某些母分子的生物功能，例如與特殊位結合力。變異_形式可為片段、衍生物或突變種士異種、魅物或突變種可藉由加人、去除、個胺基酸於母分子，或盥i他分 ^ 次瓜或夕或蛋白質㈣# 、子連獲付。14些變化可在核甘酸

Fab 則抗體『Α』的體『Β』，但抗體『A UM、。或者’與酶、螢光等標記連結。例如，-抗體等===—β結構域的特殊抗原->、开夕式可為具有不同互補限定區序列的抗 10 1259837 『B』可辨認上述抗體『A』的相同抗原表位。、我們已由抗體嗤菌基因庫中分離出scFvb式的重組抗體，特別是纖維網蛋白的ED-B結構域，及於組織切片中辨認ED(+)_纖維網蛋白。這些抗體之一，E1，具有成和親和力以產生親和力更佳的抗體H1〇及 L19。抗體L19的纖維網蛋白的ED—B結構域的解離常數為次毫微莫耳濃度等級。將具有高度親和力的L19及L1· 3 (特別針對一種不相關抗原的抗體，雞蛋溶邊酵素）形成放射性同位素，並注射到有腫瘤的老鼠身上。腫瘤、血液或器官的生物分布（biodistribution)係於不同時間點得到，並以每一公克組織所注射劑量（％ID/g)之百分比表示。注射後3 小時，L19於腫瘤的％lD/g較血液的％1〇/2為佳，但作為陰性控制組的 L1· 3則不然。腫瘤與血液的比例在較長的時間點增加。此結果主張高親和力的L19為較有用的腫瘤標定劑，例如，對新生血管的免疫閃爍造影偵測。 -光敏物質光敏物質可定義為經由在水及/或氧氣中照射產生可與生物分子反應之毒性分子（例如單態氧（singlet 〇xygen))，因此可能引起生物標的如細胞、組織及體液的傷害。光敏物質在吸收波長大於600nm時特別有用。事實上，光穿透組織及體液在600-900nm範圍内會最大，參照[Wan et al. (198U Photochem· Photobiol· 34， 679-681]。照射後的光敏物質的標定傳送在治療新生血管疾病上係一引人的途徑，參照[Yarmush，M.L· etal· Antibody targetd photolysis· Crit

Therap. Drug Carrier System 10, 197-252 (1993); Rowe, P.M. Lancet 351，1496 (1998); Levy，J· Trends Biotechnol. 13，14-18 (1995)]，特別是選擇性摘除眼睛新生血管。可利用的治療模式，例如雷射光凝結，不是直接就是在給予光敏藥劑之後，受限於選擇性而典型的導致健康的組織及血管受傷害，參見[Macular Photocoagulation Study Group, Arch. Ophthalm. 122, 480-488 (1994); Haimovici, R. etal. 11 1259837

Cum Eye Res. 16, 83-90 (1997)； SchmidtOErfurth, U. et al ·

Graefs Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 236, 365-374 (1998)] 〇 ? 基於上述爭議可知，發現光敏物質的選擇性及特定性是非常重要的’例如，將其結合至適當_體分子。研發品·的健分子並非間早任務。甚至，不是所有的光敏分子都可以作為活體的媒介進入關鍵的位址。例如光敏物質的化學結構、溶解性'親脂性、黏著性及藥效等因子都可能關鍵性地影響光敏物質結合物的可標定性及功效。我們在此證明高親和力的L19抗體，特別是對纖維網蛋白的_ 結構域，經系統化地投藥，可在兔子的眼睛新生血管中，可選擇性定位該新形成的血管。L19抗體，經化學結合至光敏劑tin (IV) chl〇rine φ 並以紅光聽，可選擇性阻塞眼睛新生血f，並促騎助皮細胞的 /周亡。這麵果證實了新生眼睛血管可於體_原先存在的血管免疫化學性地被分別出來，並強烈建議照射後光敏物質的標定可有效治療：結合性眼睛疾病及其他與之有關的可能疾病。综上所述，本發明實施例確能達到所預期之使用功效，又其所揭露之具體構造’不僅未冒見諸於醜產品中，亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求，爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。 12 1259837 【圖式簡單説明】下列圖式係用以說明本發明之實施例：第1圖顯示設計之抗體噬菌體基因庫；第2圖顯示人類黑色素瘤C0L0-38細胞溶解液之二維膠片及西方墨點；第3圖顯示膠質母細胞瘤multiforme之免疫組織化學實驗；第4圖顯示抗體肋^複合物之穩定性分析；第5圖顯示患有腫瘤之小鼠在注射放射性同位素標示之抗體斷於體内之分布；第6圖顯示L19之胺基酸序列；第7圖顯示植入小球體的兔子眼睛；第8圖顯示兔子角膜切片之免疫組織化學分析；第9圖顯示兔子眼睛結構切片（角膜、虹膜、結膜），其使用紅色鹼性磷酸酵素基質及蘇木紫染色；第1〇圖顯示以螢光染劑標示之抗體於眼睛新生血管中；第11圖顯示肉眼觀察注射蛋白質及光敏物質的兔子眼睛於照射前後之情形；第12圖顯示注射蛋白質及光敏物質的兔子於紅光照射後，以顯微鏡分析兔子眼睛結構切片。圖式詳細説明第1圖顯示設計之抗體噬菌體基因庫。（a)抗體片段被表現於噬菌體上之pill融合如圖所示。在抗體的結合位址（以抗原的視角）， Vk CDRs脊骨是黃色，VH CDR脊骨是藍色。隨機突變之殘餘物在Vk CDR3 之91、93、94及96位置（黃色），在VH CDR3之95、96、97及98位置（藍色）。這些支鏈的钶（Cb)原子以較暗顏色表示。另外，灰色部分為CDR1與CDR2之殘留，其可經由突變增加抗體親和力。利用RasMol 程式（http://www. chemistry, ucsc. edu/wipke/teaching/rasmol. html)由 pdb 檔案建立 scFv 結構模型（Brookhaven ProteinDataBank; http//www2. ebi. ac· uk/pcserv/p dbdb. htm)。（b) PCR 放大及基因庫 13 1259837 複製策略。將DP47及DPK22 (見原文）之種株模板修改，以使CDRs區域產生突變。基因以矩形表示，CDRs則如矩形中的編號盒子。即及VL 片段在pDN332噬菌質體（phagemid)的媒介中被組合及繁殖。用以放大及組合的引子列示於底部。第2圖顯示二維膠片及西式墨點。（a)人類黑色素瘤c〇L〇-38細胞株之溶解液之銀染二維膠片，其中加入重組的ED-B-containing 7B89。此二7B89的點（圈）是由於蛋白質純化時利用His-tag之局部蛋白水解而來。（b)免疫點墨膠片，如同第2a圖所示者，以抗ED-ΒΕΙ (表一）及M2抗FLAG抗體作為偵測劑。只有7Β89的點被偵測到，確認由膠片點分離之重組抗體之專一性。第3圖顯示在多型性膠質母細胞瘤的連續切片上進行免疫組織化學分析，以scFvs El (A)、A2 (B)及G4 (C)染色，顯示出典型類腎小球之血管組織。比例尺：20微米。第4圖顯示抗體-ED-B複合物的穩定度。分析纖維網蛋白之即一β 結構域與3〇?¥3£1、1110及09之結合心）生物感測儀感測圖（祖(：〇1^ sensorgrams)，顯示由抗體之親和力成熟而改善解離分布。（b)以電泳膠片分析scFvs (ED-B)複合物。只有具高親合力之U9抗體能與以螢光標示之抗原形成穩定的複合物。螢光偵測的方法參見（Neri etal (1996). BioTechniques, 20, 708-712)° (c) scFv-(ED-B-biotinO複合物與超過100倍莫耳之非生物素 (unbiotinylated)之ED-B作競爭力測試，以電化發光法來監測 (Origenapparatus)。可看到L19-(ED-B)複合物之半衰期相當長。零色方塊：L19 ;中空三角形：H10。 ^ 第5圖顯示注射放射性同位素標示之抗體斷片，患有腫瘤小鼠之體内分布。腫瘤及血液的體内分布，以每克注射劑量的百分比表示，對時間作圖。相關器官的體内分布也同時被報告。 0 第6圖顯示抗體L19之胺基酸序列，包括重鍵（VH)，連結物，奉7 鏈（VL)。 " 14 1259837 ，7醜τ在兔子㈣植人浸泡過血管新錄冑之聚合物小球體。第8圖顯示兔子角騎生血管切片以U9抗體作免疫組織染色。第9圖顯示兔子眼睛結構以L19抗體染色之免疫組織分析。可見到在角膜（a)之新生血管·特有的紅色，但虹膜（b)及結膜⑹ 周圍血管則無。小箭頭：角膜表面細胞；大箭頭：血、

尺：50微米。 1J 第10醜示以螢光標示之抗麟對喊血#新生之免疫光學偵，。可觀察到在注餘體連結物f L19令5⑷之兔子，細新生血官（以箭頭標示）有很強的螢光反應，特別是纖維網蛋白之_ ^但對抗體HyHEL-10-Cy5 (b)則否。角膜切片之免疫榮光顯^更進-步確如9々5 (c)，而非HyHEL_1Q_Cy5⑷於角膜新生也管周圍定位。照片（a、b)約在抗體注射後8小時後，（c、d)則是在抗體注射後24小時取出眼角膜所拍攝得。p :小球體。、、第11圖顯示兔子以光敏複合物處理後，肉眼可見之眼睛影像。經 f射L19-PS之兔子眼睛’照射前⑷及以紅光歸16小時後⑻。箭頭指出凝結的新生血管，放射源照射16小時後，在Cy5螢光血管造影照片中’確認為低螢域應區⑷。吾人亦注意到此種結合在其他組織之血管未能觀測到，例如結膜血管。為了比較，用高螢光感應的有漏洞血管之Cy5螢光血管造影照片，及與之對應的未處理過^子眼睛彩色照片，顯示於⑷及⑻。照片（e、f、g)類似（a、b、c)，不過對應雜射兔子的是。valbumin—ps及騎紅光。未發現凝集現象，血管造影則顯示有漏洞血管之高螢光性。早期血管新生=以 L19-PS注射之兔子眼睛圖示於（i_1)e照片⑴為以紅絲射前及照片⑴為簡後16小時，表現蚊雜及聊性的辆導▲管凝固物（箭號）。在兔子安樂死後，被照射過的眼睛⑴立即產生也管阻塞是特別的證據，但同-兔子未被騎的眼睛⑴則無此現象。p . 小球體。箭頭指出角膜-鞏膜交會處（外緣）。在所有圖中，擴張的姓耻管可在邊緣上方觀察到，航肖膜血麵生射由至^ 觀察到。爪瓶 15 1259837 第12圖顯示選擇性血管阻塞之顯微分析。注射隱ibumin_ps(a、 e、i)或L19-PS (b、f、j)，並以放射線照射的兔子角膜的H/E染色切片（a、e、b、f :未蚊；丨、j :以聚甲_幻。大箭號指出具代表性未⑽（e、Ο或完全阻塞（f、]·)之血管。不同独放射線照射後以L19-PS為媒介’角膜血管新生之選擇性阻塞及有限的周邊血管損壞（嗜酸性）（b、f、j)，在同-隻兔子的結膜⑴及虹膜⑴都沒有顯示任何損傷。以螢光TUNEL試劑分析注射U9_ps (c、g)或 ovalbiMin-PS (d、h)受放射線照射之兔子，其切片顯示出不同數量的凋亡細胞。大箭頭指得是相關之血管組織。小箭頭指得是角膜表皮麵· 細胞。比例尺：1〇〇微米（a—d) ; 25微米（e—1) 下列實施例可更清楚的闡釋本發明。實施例1 : 鱼嘆菌體抵體基里庫分離出鉗纖维綢蛋白之RD-R結構域具特定性之人類scFv抗體片段

利用 VH(DP47; Tomlinson etal· (1992). J. Mol. Bil.，227, 776 798)及VL (DPK22; Cox etal· (1994)· Eur· J· Immunol·，24, 827-836)種株基因（見第丨圖關於複製及放大策略）複製人類抗體。使用部分變性的引子（第1圖）於PCR方法引領在CDR3上位置95一邱之隨機突變以產生基因庫的VH成份。基因庫的VH成份也是以相同的狀況產生，係藉由引領在CDR3上的位置91、93、94和96之隨機突變。 PCR 反應參見（Marks etal· (1991)· J. Mol. Biol·，222，581 -597)。 YU-VL scFv片段是由膠片純化之VH及VL片段，以PCR組合成（第1 圖，Clackson et al· (1991)· Nature，352，624-628)。以 300 單位之Ncol及300單位之Notl消化30μβ的純化VH-VL scFv片段，然後連結15μβ的Ncol/Not消化pM332噬菌質體載體。pDN332為噬菌質體 16 1259837 pHENl 之衍生物（Hoogenboom et al· (1991)· Nucl Acids Res，19, 4133-4137)，其中Notl位址與基因III前的琥珀型密碼子之間的序列被以下序列所取代，D3SD3-FLAG-His6標記之密碼(此1^6131.(1996)·

Nature Biotechnology, 14，385-390):

Notl D D D S D D D

Y K D D 5，-GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC

DDKHHHHHH amber GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG-3f 轉化為TGI大腸桿菌菌株之方法參見（Marks etal. 1991. J. Mol.

Biol·，222，581-597)，而噬菌體的製備係根據標準步驟（Nissimet al· (1994)· EMBOJ· 13，692-698)。隨機選擇五個複製體並定序以檢查是否有普遍的污染。重組纖維網蛋白片段ED-B及7B89，分別包括一個及四個第三型的鐵· 同源複製品’係由pQE12基表現載體（Qiagen，Chatsworth，CA， U.S.A.)表現出（Carnemolla et al· (1996). Int j Cancer， 68, 397-405 )〇重組纖維網蛋白ED-B結構域之選擇，參見（Carnemolla et al· (1996)· Intj Cancer，68, 397-405) (Zardietal· (1987)· EMBOJ·， 6，2337-2342 ) ’ 是在 i〇nM 濃度進行，以 biotin disulfide IHiydroxysuccinimide ester 接合之生物素抗原（試劑 B-4531; Sigma，

Buchs，Swizerland; 10)由二維膠片中溶離出，及披覆磁珠 17 1259837 (Dynabeads)之抗生蛋白鏈菌素（streptavidin)捕捉（Dynal，〇sl〇, Norway)。在1宅升反應中，每次淘選使用1〇13個噬菌體。噬菌體與抗原在2%的牛奶/PBS (MPBS)中培養10分鐘。將1〇〇μ1預先凍結的磁珠（10mg/ml ; Dynal，Oslo，Norway)加入 MPBS 溶液中。攪拌 5 分鐘後，磁珠藉磁力由溶液中分離，並以PBS—〇· 1%Tween—2〇 (pBST)沖洗 7人以PBS冲洗3次。沖提液以5〇〇μΐ，5〇nM的雙硫蘇醇 (dithiothreitol，DTT)培養2分鐘，來還原抗原與生物素間之雙硫鍵。磁珠再度被捕捉，而此溶液用來感染呈指數生長的tgi大腸桿菌。經過三次淘選，沖提出的噬菌體被用於影響Ηβ2151大腸桿菌呈指數生長’並固定在1· 5%洋菜培養基（2倍TY+1%葡萄糖+ 胺青黴素）。單一殖株在2倍TY+1%葡萄糖十忉叫以…胺青黴素環境下生長，亚以1毫莫耳IPTG、30°C、作用一個晚上，誘導抗體表現。取其上浮液藉由酵素免疫分析法以表面塗有抗生蛋自翻素的微滴定盤及1〇毫微莫耳biotinylated-ED-β篩選，並以抗FLAG M2抗體作為偵測試劑 UBI Kodak，New haven，CT)。有32°/❽篩選出的殖株為陽性反應，其中二個有很強的酵素免疫訊號（E1，A2，G4)被加以定序及更進一步特性化。

執行酵素免疫分析试驗利用從膠片點發現的生物素，此蛋白未被堯性，將其連結到鄰近纖維網蛋白結構域（重組蛋白含7B89結構域）’及許多不相關之抗原。抗體El，A2、G4及含ED-B之蛋白質的反應很強烈且特定。此一現象，連同這三個重組抗體可利用ED—B親和力笞柱由、、、田_上浮液來純化的事實，強烈建議他們可辯認一個位於肋-B 原生構造之抗體表位。不含肋—6結構域之纖維網蛋白片段未被偵測出任何反應（數據未顯示）。為了測试由膠片點分離的抗體是否與原生抗原有很好的親和力， 18 1259837 以BIAcore上的表面電漿共振進行即時交互作用分析，參見（Neri針 al· (1997)· Nature biotechnol·，15, 1271-1275)。E卜 A2 及 G4scFv 片段的單體部分與ED-B以107-108 M-l範圍的親和力内連結（表1)。再進一步測試抗體的特定性及實用性，二維膠電泳（2D_pAGE)免疫點墨法於人類黑色素瘤細胞株C0L0—38之溶胞液膠片上進行，再加入少量含重組7B89蛋白質的ED-B (第2圖>SCFV (E1)強烈且特定地將7B89點染色。抗體El、A2及G4將多重型膠質母細胞瘤之冷凍切片中含有纖維網蛋白的ED-B免疫侷限化，其為一侵入性的腦瘤併有相當明顯的血管新生。多重型膠質母細胞瘤檢體在手術後取出，並立即冷束在液態氮中（Camemolla et al· (1996)· lnt j· Cancer，68, 397一4〇5; Castellanietal· (1994)· Int. J. Cancer59，612-618)。簡言之，免疫染色係使用M2-抗-FLAG抗體（IBI Kodak)、生物素抗小鼠多株抗體（Sigma)、抗生蛋白鏈菌素一生物素鹼性構酸酶複合物染色組（扮〇細，

Mi lan，Italy )、naphtol-AS-MX- phosphate 及 fast-red TR (slGMA)。

Grill’s蘇木紫用來作對比染色，接著以甘油膠（Dak〇, CA)覆蓋封片（Castellani et al•⑽4)· Int· j·⑼时，％ 612-618)。，，利用類似的技術及抗體L19 (見下-實施例），吾人亦可將新生血管作特定染色，新生血管係以移植到兔子角膜的聚合物小球體誘發產生，該小賴先浸泡於血管新生物質，如血㈣歧絲或佛㈣旨 (phorbol ester)0 實施例2 分離q次毫微莫耳親和力轉金人類sd?v抗體五是

ScFv(El)被聰來職以cDR _物之雜數量賴改善其親和 19 1259837 力之可能性，CDR殘餘物位於抗原結合位址周邊（第la圖）。吾人同時將抗體VH之殘餘物31-33，50，52及54作突變，並於嗟菌體絲上表現相對應的整體。這些殘餘物頻繁地與抗原在已知的抗原—抗體複合物之三維結構中接觸。整套4χ 1〇8個複製體被選取用於與纖維網蛋白之 ED-B結構域結合。經過兩次淘選，96個個別複製體被篩選出，一個達 27倍親和力的抗體被分離出來（Η10 ;表1及2)。類似的情形在其他親和力成熟的抗體亦可觀察到，親和力的增進是由於與抗原的離解力變慢而非让〇11值之增加（^1^。七&1.(1996).6〇肪，169，147-155;

Ito，（1995)· J· Mol· Biol·，248，729-732)。抗體的輕鏈常被認為對鍵結親和力較無貢獻，如下列二事實所證明，不論是在天然或人工合成之抗體，即使沒有輕鏈仍可與抗原結合（Ward et al· (1989)· Nature, 341, 544-546 ； Hamers Casterman et al. (1993). Nature, 363, 446-448)。因此我們隨機選擇VL結構域的兩個殘餘物（32、50) 與抗原接觸，殘餘物（32、50)位於抗原結合位址的中央（第ia圖），且通常在三維結構中被發現。此包括400個複製體的基因庫被表現於噬菌體及選來連結抗原。從解離分布分析及koff量測鑑定出殖株 (L19)，並以Kd= 54pM結合至纖維網蛋白之ED-B結構域（表1及2); 其中解離分布分析使用BIAcore設備進行即時反應（Jonsson et al. (1991)· BioTechniques，11，620-627)，koff 量測使用電化發光偵測

之競爭試驗。親和力成熟度實驗方法如下：scFv(E1)基因以引子 LMBlbis (5，-GCC GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3，）和 DP47CDRlfor (55-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3’）進行PCR放大，以引發VH之CDR1中位置31至33 的隨機突變，另以引子 DP47CDRlback ( 5’-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT

CC-3’）和 DP47CDR2for (5’-GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC 20 1259837

MNN ΜΤ Μ丽 TAG GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3，）進行pcr放大，以引發VH之CDR2中位置50、52、54的隨機突變。ScFv基因剩餘片段蓋過 VH基因、連結器及VL基因的3’段，並以引子DP47CDR2back C TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3,）及 JforNot (5，-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ΤΊΤ GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3’）來放大 (94°C，1分鐘；60°C，1分鐘；72°C，1分鐘）。這三個pcr產物以膠片純化，並以引子LMBlbis及JforNot作PCR (21)聚合（94QC，1分鐘；60°C，1分鐘；72°C，1分鐘）。由PCR混合純化出單一 pcr產物，以Notl/Ncol消化並欲入Notl/Ncol消化之pDN332載體。大約9pg載體及3pg的插入基因被用在搬合反應之混合物，藉由紛鹽及酒精沉殿將其純化，再使之懸浮於50μ1無菌水，並於TG1大腸桿菌細胞電子元件中電穿孔（electroporate)。親和力成熟的基因庫包括4χ 1〇8個複製體。嗤菌體抗體粒子之製造參見（Nissim et al· (1994). EMBO J.， 13，692- 698)，被用在表面塗覆7B89之免疫管，進行第一次篩選 (0&1716111〇118 61&1.(1996).1111:.】.。311〇61'，68,397-405)。選定的噬菌體用於生物素ED-B之第二次淘選，接著以抗生蛋白鏈菌素塗抹之磁珠來捕捉（Dynal，Oslo, Norway ;見前段敘述）。經選擇後，約 25%的複製體在可溶性酵素免疫檢驗試劑呈陽性（關於實驗步驟見前面章節）。從酵素免疫分析中呈陽性之候選者，我們更進一步以BIAcore 辨認出具最低koff 之抗體（H10 ;表 1) (Jonssonetal. (1991)· Bio Techniques，11，620-627)。基因 scFv(HlO)以引子 LMBibis 及 DPKCDRlfor (5,-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TM MNN GCT GCT GCT MC ACT CTG ACT G)進行 PCR 放大，誘導VL之CDR1上位置32的隨機突變（編號參見chothia and Lesk (1987) J· Mol· Biol·，196，901-917)，同時以引子 DPKCDRlback 21 1259837 (5’-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-5’）及 DPKCDR2for (5，-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3’）引導 VL之CDR2上位置50的隨機突變。ScFv基因餘下部分以寡核甘酸 DPKCDR2back (5’-GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3’）及 JforNot 放大 (94°C，1分鐘；60°C，1分鐘；72°C，1分鐘）。這三個產物將被組合消化及複製到PDN332中，用在重鏈的突變發展。基因庫在3%BSA中與生物素ED-B培養30分鐘，接著以塗覆有抗生蛋白鏈菌素之微滴定盤捕捉10分鐘。噬菌體以20mM的DTT溶液沖提，並用於呈指數生長的 TG1大腸桿菌。藉由酵素免疫染色及BIAcore分析ED-B上浮液中96個複製體鑑定出複製體L19。抗ED-B之El、A2、G4、H10及L19之scFv抗體片段選擇性地染色於侵犯型腫瘤切片之新生血管（第3圖）。上述之抗ED-B抗體片段接著在1公升的2x TY培養基中植入一個單一新鮮菌落，方法參見（Pini et al· (1997). J. ImmUn〇l. Meth.， 206，171-182)’片段並於CNBr活化的壤脂糖凝勝（sepharose)管柱 (Pharmacia，Uppsala，Sweden)上進行親和力純化，該片段已先連結至 10mg 含 7B89 重組蛋白之 ED-B(Carnemollaetal· (1996). Int. J· Cancer，68，397-405)。滴入樣本後，以50毫升平衡緩衝液沖洗管柱（PBS, ImM EDTA，0.5M NaCl)。抗體片段接著以100毫莫耳的三乙胺溶離出，並立刻以1毫莫耳Hepes，pH=7中和，並在PBS中透析。 BIAcore親和力測試係以純化的抗體進行，如前述(Neri etai. (1997). Nature Biotechnol·，15，1271-1275)(第 4 圖）。用螢光劑標示重組 ED-B 之N 端（Carnemollaetal· (1996)· Int j Cancer, 68, 397-405; Neri etal· (1997)· Nat Biotechnol·，15，1271-1275)及紅外線螢光Cy5(Amersham)進行Band-shift分析(Nerietal. (1996). Nature 22 1259837 管柱，接著計量流動及沖提液的放射活性。裸鼠（12週大，瑞士裸鼠，雄性）於皮下移植鼠科F9畸胎癌（Neri et al· (1997) Nat

Biotechnol·，15，1271-1275)’將含 3pg(3-4 微居里）scfv 之 ι〇〇μΐ 鹽水注射於此裸鼠。腫瘤大小約50—250mg，因腫瘤太大其中心會壞死。然而標的試驗進行於較大腫瘤（3〇〇-600mg)所得結果相同。每一個時間點使用三隻動物。小鼠以人道的方式死亡，將器官稱重並計量放射活性。器官標的結果是以每一公克組織之抗體注射劑量之百分比來表示注射計量/公克hscFv (L19)迅速經血液由腎臟排出，不同於傳統的抗體它不會累積於肝臟或其他器官。注射3小時後，每克腫瘤· 組織約8%的劑量，接下來的數值下降是因為腫瘤在24—48小時内增加了 2倍。腫瘤·血液比值在注射L19後3、5及24小時分別為1· 9、3 9 及11· 8，但陰性對照抗體皆小於丨.〇。同位素標示scFv (L19)在注射後數小時優先選擇集中於腫瘤處，：因此建議可用在偵測病人血管新生之免疫閃爍造影。實施例4 抗ED-B抗體選擇性染色新形成眼暗血管由先前存在的血管形成的新生血管，係—潛藏許多疾病的特殊過每程’包括雜及大部分導致失明的眼睛疾病。選擇性標定及阻塞新血管將有利於診斷及治療。我們研究B-FN是否為眼睛新生金管的特定標記，及經由系統化投藥，以抗體職是^可選擇性地 (in vivG)標定眼睛新生血官結構。為達此目的，我們刺激兔子的角膜生長新血管，並可直接觀察新的企管，由手術植入含有血管内皮細胞生長因子或巴豆醇醋的 (f 7 « ) 〇 (sucralfate ； Merck, Darmstadt,

Germany) /含有800ng血管内皮細胞生長因子（Sigma)或棚叫巴豆 24 1259837 醇12-肉莖謹脂13-醋酸西旨（“PMA”，Sigma)的循環加熱球體被植入紐西蘭白雌兔的角膜，過程參照[D，Amat〇, R J.，etal.，prcc· %ti_

Acad· Sci· USA 91，4082-4085 (1994)]。以兩種因子引發新生血管，並每日監測兔子。由兩種因子形成的新血管在免疫組織化學 (immunohistochemical)中為強ED-B-陽性。在所有進一步的實驗中皆使用PMA球體。免疫組織化學研究顯示U9強烈染色兔子角膜中的新生血管（第8及9a圖），而非原先存在的眼睛血管（第％及c圖），或其他組織（未顯示資料）。免疫組織化學之實施參照[Carnem〇Ua, β· et al.，Int· J· Cancer 68，397-405 (1996)]所述。實施例5

眼睛新生血管使用前一實施例所述之兔子角膜模式，及一免疫光偵測 (I刪unophotodetection)方法[Neri, D· etal·，NatureBiotechnol. 15, 1271-111275 (1997)]，我們證實了 L19可藉由靜脈注射選擇性地標定眼睛新生血管，L19化學性地結合至紅色螢光Cy5，而非抗體片奴(HyHEL-10)-Cy5不相關的抗原（第i〇a&b圖）。生長的眼睛血管的螢光染色可於注射L19後，立即清晰地被偵測，並保存至少兩天，類似先刚新生血管的腫瘤觀察。後續以體外（ex viv〇)免疫螢光顯微鏡分析角膜切片確認L19的位置，而非血管結構周圍的HyHEL—1〇(第1〇c 及d圖）。根據抗體選擇性標定眼睛新生血管的證明，及抗抗體於不同物種的反應性，可確保未來的臨床研究。在以螢光血管攝影 (nu〇roangiography)發現傷害變明顯之前，免疫螢光影像有利於早期偵測風險型病患的眼睛新生血管。部分方法之詳細說明： 25 1259837 對於體外免疫螢光及某些h/e染色，角膜在包埋前被固定於4%聚曱-—(inPBS)中接受榮光偵測實驗的兔子被投予鎮靜劑 (5mg/kg)。對於標定實驗，將3· 5mg的scFv ([⑼广Cy5。明及2·故的 scFv(HyHEL-10)!-Cy5〇·83以靜脈注射至每一隻兔子（注射時間15分鐘）。角膜中心血管之強螢光可於注射]L19後立即觀察到，而非 HyHEL-10，並保留數小時。作為額外的特殊試驗，前一天注射 scFV〇iyHEL-10：K：y5並於螢光偵測中呈陰性的兔子，於第二天注射 scFv(L19)-Cy5，並在角膜新生血管中顯示出強烈螢光染色。對於螢光偵測，係以裝設有Cy5—激發濾光片（Chroma，Brattleb〇r〇，· VT，U.S.A·)之鶴絲鹵素燈（m〇dei schott KL 1500; Zeiss, Jena, Germany)來照射眼睛，燈具有二光導引裝置，其端點距眼睛約2公分。螢光之彳貞測係使用冷卻式5985單色CCD相機（Hamamatsu， Hamamatsu-City，Japan)，其裝設有 C-mount Canon Zoom Lens (V6xl6; 16- 100mm; 1:19)及50mm直徑的Cy5發射渡光片（Chroma)，並距離被照射的眼睛3〜4公分。收集時間（Acquisition time)為0· 4秒。

Cy5螢光血管攝影實驗係使用相同的實驗裝置，但靜脈注射〇. 25mg Cy5-Tris (Cy5-NHS 與 tris[hydroxymethyl]aminomethane 之中間產彎物，注射時間5秒）。收集時間為0.2秒。 ‘ 抗體片段為scFv形式。ScFv(L19)及scFv(HyHEL-10)的純化，及 _ 其以花青染料的N-hydroxysuccinimide (NHS)酯類標定過程，可參照 [Neri，D. etal·，Nature Biotechnol· 15，1271 -1275 (1997); R·， et al· (1999) Structure，7，381-390]。抗體：Cy5 於兩種抗體的標記比例分別為 1.5:1 及 1.2:1 °Cy5-NHS 係購自 Amercham Pharmacia Biotach(Zurich，Switzerland)，卵蛋白素（ovalbumin)係構自 Sigma (Buchs ， Switzerland)。 26 1259837 於標記反應後，藉使用與50mM磷酸，pH 7·4，lOOmM NaCl (PBS) 達平衡之MPD-10管柱（AmershamPharmacia Biotech)，抗體結合物由未被結合的紅色螢光或光敏物質中被分離。抗體結合物的免疫反應性係以抗原管柱[Neri，D· etal·，Nature Biotechnol. 15，1271-1275 (1997)]之親和力色層分析來監測，結果皆大於78%。免疫結合物係以十二硫酸鹽聚丙烯醯凝膠電泳法分析，並以訓[=30,000 Dalton (purity3 90%)之區帶位移。實施例6 人類抗體^JLL19—，化學結— 合至光敏物質Sn Πν) chlorine Μ，撰蟬性地標完j|J青数生血管，並以照射紅氽爽傳達其阻窠規象為測試選定血管之摘除是否可藉由抗體—媒介標定完成，我們讓兔子注射L19抗體片段或不相關的蛋白質，其位置不限於光敏物質七比 (IV) chlorine e6 (以下稱PS)連結的新生血管（卵蛋白素）。被注射的動物以紅光（light dose = 78 J/cm2)照射眼睛。代表性的結果如第11圖所示。於16小時照射後，一肉眼可見明顯的差異，在以U9—ps 處理的兔子上被觀察到，其具有角膜新血管的凝結，而非結膜或其他眼睛結構的血管。具有ind〇Cyanine f iuorophore Cy5 (第Uc圖）的螢光血管攝影確認了血管阻塞為特殊的低螢光區。相反地，在未照射而無新血管形成的眼睛中則觀察到高螢光區（第11(1及[1圖）。以肉眼觀察經ovalbumin-PS處理的兔子的照射血管，無論使用檢眼器或奶螢光血管攝影，結果皆無變化（第lle至g圖）。在早_角膜新生灰管中，照射相ί標定的L19-PS結合物的效果如第Hi至i圖所示。選擇性地凝結血管在活體動物上肉眼可見（第ni及〗圖），甚且於動物安樂死後亦立即清楚可見（第llk及1圖）。以顯微技術進一步研究光動力（ph〇t〇dynamic)傷害。照射後， 27 1259837

血&阻塞可藉由標準蘇木紫/曙紅（stan—腿t〇xyHn/e〇sin;H/E) 染色技術來細非gj定及以聚甲咖定的細切片，其細⑽—⑺處里的動物（第lib、f及j圖），而非以〇vaibumin—ps處理（第iia、e 及i圖）。以感光結合物標定的角膜細胞凋亡（ap〇pt〇sis)於螢光染色（TUNEL assay)中清晰可見（第Uc及g圖），但在陰性控制組中幾乎_不到（第lldAh圖）。血管中内皮細胞_亡如第叫圖所不之放大倍數圖。藉由螢光染色（TUNEL assay)(未圖示之）或H/E 染色（第Ilk及1圖），可觀察到經處理動物的虹膜、鞏膜及結膜的血管未受損。對於方便使用光擴散器或纖維光學技術照射之眼睛疾病，及其他與新生血管相關的病理，新生血管的選擇性光動力摘除有利於其治療。本研究的結果清楚證明眼睛新生血管可被選擇性地阻塞，而不傷及原先存在的血管及正常組織。部分方法之詳細說明：在連結至兔子的抗鼠多株抗體（Sigma)後，Tin(IV)chlorinee6 以其效力、可溶性及特徵自光敏物質中被選用。這些免疫結合物藉由紅色血液細胞的標定光分解來篩選，紅色血液細胞披覆一單株抗體，為特殊的人類 CD47 (#313441; Pharmingen，San Diego CA，U.S.A·)。 Tin (IV) chlorine e6 之製備參照[LU，χ·M. et al·，J. Immunol. Method 156, 85-99 (1992)]。為連結至蛋白質，tin (iv) chl〇rine e6

於室溫下於二甲基甲醢胺中，與超過倍莫耳的EDC (Ν’-3-dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide hydrochloride ; Sigma)及 NHS (N-hydroxysuccinimide ; Sigma)混合。產生的活化混合物再加到8倍體積的蛋白質溶液（1 mg/mi)中，並於室溫下培養1 小時。 28 1259837 於標定反應後，與50mM磷酸，pH 7.4，lOOmM NaCl (PBS)達平衡之PD-10管柱（AmershamPharmacia Biotech)被用於將抗體結合物由未被結合的紅色螢光或光敏物質中分離。抗體結合物的免疫反應性監測如先前實施例所述。於光殺滅（photokilling)實驗中，將兔子靜脈注射I2mg的scFv (L19) 1-tin (IV) chlorine e6〇.8 或 38mg 的 ovalbumin-tin (IV) chlorine e6〇.%，且實驗期間留置於黑暗中。注射8小時後，將兔子以 ketamin (35mg/kg) / xylazine (5 mg/kg) / acepromazin (1 rag/kg) 麻醉，而雙眼之一以Schott KL1500鈞鎢絲齒素燈照射13分鐘，鎢絲鹵素燈裝設有Cy5濾光片（Chroma)及兩個光導引裝置，其端點距離眼睛約1公分。照射區域約為lcm2，照射功率密度為1〇〇八：m2，使用 SL818 光偵測器（Newport Corp·，Irvine, CA，U.S.A·)監測。被照射的動物並無不適跡象。作為預防性措施，照射後的兔子施以止痛劑（buprenorphine 0· 03 mg/kg)。為監測光殺滅效果，檢測眼睛係使用檢眼器及眼底（fundus)照相機 KOWA SL-14 (GMP SA，Rennens， Lausanne，Switzerland)。5 隻兔子的每一隻皆以 tin (IV) chl〇rine e6結合物處理並照射單眼，另一眼則作為内部陰性控制組。作為額外的控制，只有兩隻被照射兔子未投予感光結合物。兔子以過劑量麻醉藥麻醉後，立刻將眼睛摘除，去除角膜，再放入組織石臘包埋機（Tissue Tek，Sakura Finetechnical，Tokyo,

Japan)中並冷凍。對於體外免疫螢光及某些H/E染色，角膜在包埋之刚以4%聚帽（in PBS)固定。5μιη的冷柬切片（cryostat secti〇n) 則供進-步的顯微分析。螢光染色⑴·eseent TUNEL咖狀）之實施係根據製造薇商的指示（R〇che Diagn〇stic，R〇tkreuz， Switzerland)〇 29 1259837 表2 : 抗ED-B scFv片段之親和力殖株 Kon (s，1) koff (s'1) Β koff (S，C Kd (Μ) * A2 1·5χ 105 2·8χ 10-3 — 1·9χ ΐ〇 8 G4 4. Οχ 104 3·5χ 10~3 - 8·7χ ι〇ι E1 1·6χ 105 6.5χ ΙΟ 3 — 4·1χ ι〇 8 H10 6·7χ 1〇4 5·6χ ΙΟ4 9.9χ ΙΟ'5 1·5χ ι〇 9 L19 1·1χ ΙΟ5 9·6χ ΙΟ 5 6. Οχ ΙΟ'4 5·4χ ΐ〇]ι Φ *) Kd = k〇ff / k〇n。對於高親和力之結合物H10及L19，因負電荷的枝酸化固態右故糖基質（negativeiy—charged carboxylated solid dextran matrix)的影響，由BIAcore實驗所得之kQff值不足信賴；因此由競爭實驗 (見實驗程序）所檢測之k()ff來計算Kd。kcjff為動力解離常數；Ln為動力結合常數’ Kd為解離常數。B係由BIAc〇re測得；C係與電化發光偵測競爭而測得。根據濃度測定值的精密度，數值準確度為± 50%。 31

Claims

1259#猛07648號專利申請案 95.2.22 \ 中文申請專利範圍替換本|95年2月）…一· ' j 拾、申請專利範圍I: 1 · 一種用於治療新k血管疾病的3組合物，其含有對纖維網蛋白（fibronectin)之ED-B結構域中獨特抗原決定區具有特定親合性之分離抗體，其中該抗體可辨認ED-B(+)纖維網蛋白，其中該抗體對該ED-B抗原決定區之親和力為次毫微分子級，且其中該抗體包含LI 9 scFv抗體分子之可變異結構域，其具有如下之胺基酸序列： SCAASGFTFS ISGSSGTTYY LQMNSLRAED LVTVSS LSLSPGERAT PGQAPRLLIY DFTLTISRLE EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT GDGSSGGSGGASTG EIVLTQSPGT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK YASSRATGIP DRFSGSGSGT PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK，或係 L19 之等功能性變異形式，其中L19具有前述胺基酸序列。 2. 如申請專利範圍第1項的組合物，其中該抗體係以54 pM 之Kd結合該纖維網蛋白之ED-B結構域。 3. 如申請專利範圍第1項的組合物，其中該抗體包含SEQ ID N0:19之VH結構域。 4.如申請專利範圍第1至3項中任一項的組合物，其中該抗體包含SEQ ID N0:21之VL結構域。 5·如申請專利範圍第1項的組合物，其中該抗體包含L1 9之片段、變異體或突變種。 98684-950222.doc 1259837 6 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項的組合物，其中該抗體為scFv形式。 7 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項的組合物，其中該抗體係一完整抗體。 8 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項的組合物，其中該抗體以放射性同位素示縱。 9·如申請專利範圍第1至3項中任一項的組合物，其中該抗體以放射性硬化示縱。 10· —種可用於快速標定新生血管疾病的組合物，其含有對纖維網蛋白之ED-B結構域中獨特抗原決定區具有特定親合性之分離抗體，其中該抗體可辨認ED-B(+)纖維網蛋白，其中該抗體對該ED-B抗原決定區之親和力為次毫微分子級，且其中該抗體包含LI9 scFv抗體分子之可變異結構域，其具有如下之胺基酸序列： SCAASGFTFS ISGSSGTTYY LQMNSLRAED LVTVSS LSLSPGERAT PGQAPRLLIY DFTLTISRLE EVQLLESGGG SFSMSWVRQA ADSVKGRFTI TAVYYCAKPF GDGSSGGSGGASTG LSCRASQSVS YASSRATGIP LVQPGGSLRL PGKGLEWVSS SRDNSKNTLY PYFDYWGQGT EIVLTQSPGT SSYLAWYQQK DRFSGSGSGT PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK，或係 L19 之等功能性變異形式，其中L1 9具有前述胺基酸序列。 11 ·如申請專利範圍第10項的組合物，係用於新生血管疾病 98684-950222.doc - 2 - 1259837 之免疫閃爍造影偵測。 12 ·如申請專利範圍第1 〇項的組合物，係用於偵測以血管增生為特徵之疾病。 13·如申請專利範圍第12項的組合物，其中該疾病係選自由下列疾病所組成之群：糖尿病視網膜病變、與年齡有關的黃斑病變及腫瘤。 14. 一種用於偵測新生血管疾病的診斷套組，其含有對纖維網蛋白之ED-B結構域中獨特抗原決定區具有特定親合性之分離抗體，其中該抗體可辨認ED-B(+)纖維網蛋白，其中該抗體對該ED-B抗原決定區之親和力為次毫微分子級，且其中該抗體包含LI9 scFv抗體分子之可變異結構域，其具有如下之胺基酸序列： EVQLLESGGG SFSMSWVRQA ADSVKGRFTI TAVYYCAKPF SCAASGFTFS ISGSSGTTYY LQMNSLRAED LVTVSS LSLSPGERAT PGQAPRLLIY DFTLTISRLE LVQPGGSLRL PGKGLEWVSS SRDNSKNTLY PYFDYWGQGT GDGSSGGSGGASTG EIVLTQSPGT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK YASSRATGIP DRFSGSGSGT PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK，或係L19之等功能性變異形式，其中L19具有前述胺基酸序列。 15_ —種抗體用於製備診斷新生血管之診斷劑之用途，其中該抗體可辨認ED-B( + )纖維網蛋白，其中該抗體對該ED_B 抗原決定區之親和力為次宅微分子級，且其中該抗體包含 98684-950222.doc - 3 - 1259837 Ll9 scFv抗體分子之可變異結構域，其具有如下之胺基酸序列： EVQLLESGGG SFSMSWVRQA ADSVKGRFTI TAVYYCAKPF GDGSSGGSGGASTG LSCRASQSVS YASSRATGIP LVQPGGSLRL PGKGLEWVSS SRDNSKNTLY PYFDYWGQGT EIVLTQSPGT SSYLAWYQQK DRFSGSGSGT SCAASGFTFS ISGSSGTTYY LQMNSLRAED LVTVSS LSLSPGERAT PGQAPRLLIY DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK，或係L19之等功能性變異形式，其中L19具有前述胺基酸序列。 16.如申請專利範圍第15項之用途，其中該診斷劑係用於診斷以血管增生為特徵之疾病。 17.如申請專利範圍第16項之用途，其中該疾病係選自由下列疾病所組成之群：糖尿病視網膜病變、與年齡有關的黃斑病變及腫瘤。 1 8. —種抗體用於製備治療新生血管之藥劑之用途，其中該抗體可辨認ED-B(+)纖維網蛋白，其中該抗體對該ED-B 抗原決定區之親和力為次毫微分子級，且其中該抗體包含Ll9 scFv抗體分子之可變異結構域，其具有如下之胺基酸序列： EVQLLESGGG SFSMSWVRQA ADSVKGRFTI 98684-950222.doc LVQPGGSLRL PGKGLEWVSS SRDNSKNTLY -4- SCAASGFTFS ISGSSGTTYY LQMNSLRAED 1259837 TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS GDGSSGGSGGASTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK，或係 L19 之等功能性變異形式，其中L19具有前述胺基酸序列。 19·如申請專利範圍第18項之用途，其中該藥劑係用於治療以血管增生為特徵之疾病。 20.如申請專利範圍第19項之用途，其中該疾病係選自由下列疾病所組成之群：糖尿病視網膜病變、與年齡有關的黃斑病變及腫瘤。 2 1.如申請專利範圍第1至3項中任一項的組合物，其中該抗體含一可導致血液凝結及血管阻塞之分子。 22. 如申請專利範圍第21項的組合物，其中可導致血液凝結及血管阻塞之分子係一光活性分子。 23. 如申請專利範圍第22項的組合物，其中該光活性分子係一光敏物質。 24. 如申請專利範圍第23項的組合物，其中該光敏物質之吸收波長大於600nm。 25. 如申請專利範圍第24項的組合物，其中該光敏物質係tin (IV) chlorine e6之衍生物。 2 6.如申請專利範圍第25項的組合物，其係呈用於治療與新生血管疾病有關之病變之可注射組合物形態。 27.如申請專利範圍第26項的組合物，其中該與新生血管疾 98684-950222.doc ~ 5 - 1259837 病有關之病變係由眼睛新生血管疾病所引起或與眼睛新生血管疾病有關。 98684-950222.doc -6-

B) Ncol a DP47 111 121 e· DPK22 Ml 121 ~ Ncol-H： VH d Linker Notl •g 一 h VL ,Notl Ncol Notl H m 12 1 I 3—「I· scFv裂殖物之PCR組合繁殖進入PDN332 H pel Β Η H tag pDN332 Amber

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