SK286822B6

SK286822B6 - Protilátka so špecifickou afinitou pre epitop ED-B domény fibronektínu, konjugáty obsahujúce tieto molekuly a použitie týchto konjugátov

Info

Publication number: SK286822B6
Application number: SK1679-2000A
Authority: SK
Inventors: Dario Neri; Lorenzo Tarli; Francesca Viti; Manfred Birchler
Original assignee: Eidgen�ssische Technische Hochschule Z�rich
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2009-06-05
Also published as: HUP0102992A2; NZ508600A; IS2522B; SK16792000A3; CN1250571C; EA005685B1; NO327732B1; WO1999058570A3; US20070189963A1; WO1999058570A2; DE69926630T2; AU759207B2; HUP0102992A3; CN1303393A; ATE301676T1; TR200003317T2; DK1084145T3; PL345845A1; DE69926630D1; ES2247802T3

Abstract

Sú opísané protilátky so subnanomolárnou afinitou špecifickou pre charakteristický epitop ED-B domény fibronektínu, markera angiogenézy. Ďalej je opísané použitie rádioaktívne značených vysokoafinitných ED-B protilátok na detekciu novotvorených krvných ciev in vivo, diagnostická súprava obsahujúca uvedenú protilátku, konjugáty obsahujúce uvedené protilátky, vhodné fotoaktívne molekuly (napríklad správne vybrané fotosenzibilizačné činidlo) a ich použitie na selektívny, svetlom sprostredkovaný uzáver novotvorených ciev.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka protilátok so subnanomolámou afinitou špecifickou pre charakteristický epitop ED-B domény fibronektínu, ktorý je markerom angiogenézy. Tiež sa týka použitia rádioaktívne značených vysokoafinitných anti-ED-8 protilátok na detekciu novo sa tvoriacich ciev in vivo a diagnostických kitov obsahujúcich uvedené protilátky.

Ďalej sa vynález týka konjugátov skladajúcich sa z uvedených protilátok a vhodnej fotoaktivnej molekuly (napríklad fotosenzibilizátora) a ich použitia v detekcii a/alebo koagulácii novovytvorených krvných ciev.

Doterajší stav techniky

Nádory nemôžu rásť nad určitú hranicu bez toho, že by sa vytvorili nové cievy (bez angiogenézy) a korelácia medzi hustotou mikrokapilár a invazivitou nádoru bola opísaná pre mnoho nádorov (Folkman, 1995, Náture Med. 1: 27-31). Okrem toho je angiogenéza podkladom mnohých očných ochorení, ktoré vedú ku strate zraku (Lee et al., Surv. Opthalmol. 43: 245-269, 1988; Friedlan-der, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9764-9769, 1996). Molekuly, ktoré môžu selektívne zamerať markery angiogenézy, umožnia diagnostiku a terapiu nádorov a iných ochorení charakterizovaných vaskulárnou proliferáciou, ako je diabetická retinopatia a makuláma degenerácia súvisiaca s vekom. Markery angiogenézy sú exprimované pri väčšine agresívnych pevných nádorov a mali by byť ľahko prístupné pre intravenózne podané špecifické ligandy (Pasqualini et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 542-546; Neri et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 1271-1275). Cielená oklúzia neovaskulatúry môže viesť k infarktu nádoru a k jeho kolapsu (O'Reilly et al., 1996), Náture Med. 2: 689-692; Huang et al., 1997, Science, 275: 547-550). ED-B doména fibronektínu, sekvencia s 91 aminokyselinami identická u myší, potkanov a človeka, ktorá je inzertovaná alternatívnymi zostrihom do fibronektínovej molekuly, sa špecificky akumuluje v okolí neovaskulatúry (Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612-618) a môže predstavovať cieľ pre molekulárnu intervenciu. Skutočne sme nedávno s použitím fluorescenčnej techniky ukázali, že jednoreťazcové Fv protilátkové fragmenty (scFv) proti ED-B sa selektívne akumulujú v nádorových krvných cievach pri myšiach s nádormi a že afinita protilátky zjavne určuje účinnosť cielenej väzby (Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271-1275; Medzinárodná patentová prihláška č. PCT/GB97/01412, na základe GB96/10967.3). Cielená väzba na nádor bola hodnotená 24 hodín po injekcii alebo v neskorších časových intervaloch.

V odbore sú známe rôzne pokusy o získanie protilátok proti ED-B doméne, ktoré by mohli byť použité pre cielenú väzbu na nádor.

Peters et al. (Celí Adhesion and Communication, 1995, 3: 67-89) opisujú polyklonálne protilátky produkované proti antigénom neobsahujúcim žiadnu inú sekvenciu než intaktnú ED-B doménu a ukazujú, že tieto protilátky sa viažu priamo a špecificky na túto doménu.

Ale, činidlá opisované Petersom a kol. majú rad nevýhod: antisérum od Petersa a kol. rozpoznáva ED-B(+)-FN len po spracovaní N-glykanázou. Toto spôsobuje, že sú tieto činidlá nevhodné pre aplikácie, ako je cielená väzba na nádory, zobrazenie a terapia, pretože deglykosylácia nemôže byť uskutočnená in vivo. Autori sami uvádzajú, že ich protilátky nerozpoznávajú kompletný ED-B(+)-FN produkovaný cicavčími bunkami. Tiež uvádzajú, žc bolo nemožné produkovať monoklonálne protilátky špecifické pre ED-B doménu fibronektínu, i napriek tomu, že boli produkované protilátky proti mým doménam fibronektínu (ako je ED-A). V odbore je dobre známe, že polyklonálne protilátky sú neprijateľné pre uvedené aplikácie.

I napriek rokom intenzívneho výskumu v tejto oblasti môžu byť monoklonálne protilátky rozpoznávajúce ED-B doménu fibronektínu bez ošetrenia N-glykanázou produkované len s použitím fágových zobrazovacích techník, ako sú použité v predkladanom vynáleze.

Zang et al. (Matrix Biology, 1994, 14. 623-633) opisujú polyklonálne antisérum namierené proti psej ED-B doméne. Autori predpokladajú skríženú reaktivitu s ľudským ED-B(+)-FN, hoci táto reaktivita nebola testovaná. Ale autori opisujú ťažkosti súvisiace s prípravou monoklonálnych protilátok priamo rozpoznávajúcich ED-B doménu fibronektínu (strana 631). Antisérum rozpoznáva ED-B(+)-FN vo Westemovom prenose len po spracovaní N-glykanázou. Ako bolo uvedené, nutnosť spracovania glykanázou znemožňuje použitie v aplikáciách podľa predkladaného vynálezu.

Rozpoznávanie ED-B(+)-FN v EL1SA prebieha bez nutnosti deglykosylácie, ale len na chrupavke extrahovanej denaturačným činidlom (4M močovinou) a zachytenej na plaste pomocou želatíny. Autori uvádzajú, že „väzba FN molekuly na želatínu naviazanú na plastový povrch platne pre ELISU môže nejakým spôsobom vystavovať epitopy tak, že môžu byť rozpoznané antisérom.“ Pretože v aplikáciách in vivo nemôže byť FN denaturovaný a naviazaný na želatínu, majú monoklonálne ligandy podľa predkladaného vynálezu zreteľné výhody.

Japonské patenty JP02076598 a JP04169195 opisujú anti-ED-B protilátky. Z týchto dokumentov nie je jasné, či sú opisované monoklonálne anti-ED-B protilátky. Okrem toho sa zdá nemožné, aby jediná protilátka (ako je protilátka opisovaná v JP02076598) mala „antigénny determinant v aminokyselinovej sekvencii vzorca (1), (2) alebo (3):

- (1) EGIPIFEDFVDSSVGY;

- (2) YTVTGLEPGIDYDIS;

- (3) NGGESAPTTLTQQT; z nasledujúcich dôvodov:

(i) monoklonálna protilátka by mala rozpoznávať dobre definovaný epitop;

(ii) trojrozmerová štruktúra ED-B domény fibronektínu bola určená NMR spektroskopiou. Segmenty (1), (2) a (3) sa nachádzajú na opačných stranách ED-B štruktúry a nemôžu byť viazané súčasne jednou monoklonálnou protilátkou.

Ďalej, na demonštrovanie užitočnosti protilátok by malo byť uvedené lokalizovanie nádoru, rovnako ako dôkaz farbenia ED-B(+)-FN štruktúr v biologických vzorcoch bez spracovania činidlami degradujúcimi štruktúra.

BC1 protilátka, ktorú opisuje Camemolla et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 24689-24692, rozpoznáva epitop na doméne 7 FN, ale nie na ED-B doméne, ktorá je kryptická za prítomnosti ED-B domény fibronektínu. Je striktne špecifická pre človeka. Preto majú BC1 protilátka a protilátky podľa predkladaného vynálezu odlišnú reaktivitu. D81e, BC1 protilátka rozpoznáva doménu 7 samotnú a doménu 7-8 fibronektínu za neprítomnosti ED-B domény (Camemolla et al., 1992, J. Biol. chem. 267: 24689-24692). Také epitopy môžu byť produkované in vivo proteolytickou degradáciou FN molekúl. Výhoda činidiel podľa predkladaného vynálezu spočíva v tom, že môžu lokalizovať FN molekuly alebo fragmenty len vtedy, pokiaľ obsahujú ED-B doménu.

Na diagnostiku nádorov, a presnejšie na zobrazenie primárnych a sekundárnych nádorových lézií, je imunoscintigrafia metódou voľby. V tomto vyšetrení sú pacienti snímkovaní vhodným prístrojom (napríklad gamma-kamerou) potom, ako im bola injekčné podaná rádioaktívne značená zlúčenina (napríklad radionuklid naviazaný na vhodné vehikulum). Na scintigrafické aplikácie sú obvykle používané izotopy s krátkym polčasom emitujúce gamma žiarenie, ako je technécium-99m, jód-123 alebo indium-111, ktorých použitie minimalizuje expozíciu pacienta ionizujúcemu žiareniu.

Najčastejšie používaným rádionuklidom na oddeleniach nukleárnej medicíny je technécium-99m (99mTc), gamma žiarič s polčasom 6 hodín. Pacienti po injekcii rádiofarmák na báze 99mTc môžu byť snímkovaní až do 12-24 hodín po injekcii; ale skoršia akumulácia nuklidu v lézii je žiaduca.

Ďalej, pokiaľ by boli dostupné protilátky schopné rýchlej a selektívnej lokalizácie novotvorených krvných ciev, tak by boli výskumníci stimulovaní na výskum nových vhodných molekúl na konjugovanie na protilátky, na dosiahnutie diagnostického a/alebo terapeutického účinku.

Podstata vynálezu

Vzhľadom na potrebu rádiofarmák schopných lokalizovať nádorové lézie počas niekoľkých hodín po injekcii, ktorá existuje v odbore nukleárnej medicíny, a vzhľadom na informáciu, že afinita protilátky zjavne ovplyvňuje jej účinnosť v cielenom dôkaze angiogenézy, je predmetom predkladaného vynálezu príprava protilátok špecifických pre ED-B doménu fibronektínu s disociačnou konštantou v rade subnanomolámom (pre prehľad definícií a meranie afinity antigén-protilátka pozri Neri et al., 1996, Trends in Biotechnol. 14: 465-470). Ďalším predmetom predkladaného vynálezu sú rádioaktívne značené protilátky vo vhodnom formáte, namierené proti ED-B doméne fibronektínu, ktoré detegujú nádorové lézie už niekoľko hodín po injekcii.

V jednom aspekte vynálezu sú tieto predmety dosiahnuté pomocou protilátky so špecifickou afinitou k charakteristickému epitopu ED-B domény fibronektínu, kde uvedená potilátka má afinitu k tomuto ED-B epitopu v subnanomolámych koncentráciách.

V ďalšom aspekte predkladaného vynálezu je opísaná protilátka použitá na rýchle zacielenie markerov angiogenézy.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je diagnostický kit obsahujúci uvedenú protilátku a jedno alebo viac činidiel na detekciu angiogenézy.

Ešte v ďalšom aspekte predkladaného vynálezu je uvedená protilátka použitá pri diagnostike a terapii nádorov a ochorení, ktoré sú charakterizované vaskulámou proliferáciou.

Konečne, významný aspekt predkladaného vynálezu predstavujú konjugáty obsahujúce uvedené protilátky a vhodné fotoaktívne molekuly (napríklad správne vybrané fotosenzibilizačné činidlo), a ich použitie na selektívnu svetlom sprostredkovanú oklúziu novovytvorených krvných ciev.

Definície:

V predkladanom vynáleze sú použité niektoré termíny, ktoré majú nasledujúce významy.

Termín „protilátka“ označuje imunoglobulín, či prirodzený, alebo celkom, alebo čiastočne pripravený synteticky. Tento termín tiež zahrnuje akýkoľvek polypeptid alebo protein majúci väzbovú doménu, ktorá je protilátkovou väzbovou doménou alebo ktorá je homologická k tejto doméne. Tieto môžu byť získané z prirodzených zdrojov, alebo môžu byť celkom alebo čiastočne pripravené synteticky. Príklady protilátok sú izotypy imunoglobulínov a podtriedy ich izotypov; fragmenty, ktoré obsahujú väzbovú doménu pre antigén, ako je Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; a diprotilátky. Je možné použiť monoklonálne alebo iné protilátky a použiť techniky rekombinantnej DNA technológie na produkciu iných protilátok alebo chimerických molekúl, ktoré si zachovávajú špecificitu pôvodnej protilátky. Také techniky môžu obsahovať vloženie DNA kódujúcej variabilný región imunoglobulinu alebo komplementaritu určujúcu regióny imunoglobulínov (CDR), konštantné regióny imunoglobulínov alebo konštantné regióny plus regióny pracovných rámcov rôznych imunoglobulínov. Pozri napríklad EP-A-184187, GB 2188638A alebo EP-A-239400. Hybridómy alebo iné bunky produkujúce protilátku môžu byť podrobené genetickým mutáciám alebo iným zmenám, ktoré môžu a nemusia meniť väzbovú špecificitu produkovaných protilátok. Pretože protilátky môžu byť modifikované rôznymi spôsobmi, zahrnuje termín „protilátka“ akékoľvek väzbové činidlá alebo substancie, ktoré obsahujú väzbovú doménu s požadovanou špecifícitou. Preto tento termín zahrnuje fragmenty, deriváty, funkčné ekvivalenty a homológy protilátok, vrátane akýchkoľvek polypeptidov obsahujúcich imunoglobulínovú väzbovú doménu, či prirodzené, alebo celkom, alebo čiastočne pripravené synteticky. Tiež sú týmto termínom zahrnuté chimérické molekuly obsahujúce väzbovú doménu imunoglobulinu alebo jej ekvivalent, fuzovanú na iný polypeptid. Klonovanie a expresia chimérických protilátok je opísaná v EP-A-0120694 a EP-A-0 125023. Bolo preukázané, že fragmenty celej protilátky môžu pôsobiť ako väzbové antigény. Príklady väzbových fragmentov sú (i) Fab fragment skladajúci sa z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) Fd fragment skladajúci sa z VH a CH1 domén; (iii) Fv fragment skladajúci sa z VL a VH domén jednej protilátky; (iv) dAb fragment (Ward et al., 1989, Náture 9: 341, 544-546) skladajúci sa z VH domény; (v) izolované CDR regióny; (vi) F(ab')₂ fragmenty, bivalentné fragmenty obsahujúce dva viazané Fab fragmenty; (vii) jednoreťazcové Fv molekuly (scFV), kde sú VH doména a VL doména naviazané pomocou polypeptidovej spojovacej skupiny, ktorá umožňuje asociáciu dvoch domén za vzniku väzbového miesta pre antigén (Bird et al., (1988), Science 242: 423-426; Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83); (viii) bišpecifické jednoreťazcové FV diméry (PCT/US92/09965) a (ix) „diprotilátky“, multivalentné alebo multišpecifické fragmenty konštruované génovou fúziou (WO94/13804; Holliger et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448). Diprotilátky sú multiméry alebo polypeptidy, kde každý polypeptid obsahuje prvú doménu tvorenú väzbovým regiónom imunoglobulínového ľahkého reťazca a druhú doménu tvorenú väzbovým regiónom imunoglobulinového ťažkého reťazca, kde tieto dve domény sú naviazané (napríklad pomocou peptidovej spojovacej skupiny), ale nie sú schopné vzájomnej asociácie tvoriacej väzbové miesto pre antigén; väzbové miesta pre antigén sú tvorené asociáciou prvej domény jedného polypeptidu v multimére s druhou doménou iného polypeptidu v multimére (WO 94/13804). Pokiaľ sú použité bišpecifické protilátky, tak môžu byť použité bežné bišpecifické protilátky, ktoré môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi uvedenými v Holliger and Winter, 1993, Curr. Opin. Biotech., 4: 446-449, napríklad chemickou syntézou alebo z hybridných hybridómov, alebo môžu byť použité akékoľvek fragmenty bišpecifických protilátok, ako boli uvedené. Než použitie celých protilátok môže byť výhodnejšie použitie scFv dimérov alebo diprotilátok. Diprotilátky a scFv môžu byť pripravené bez Fc regiónu, s použitím len variabilných domén, čo potenciálne znižuje efekt anti-idiotypovej reakcie. Medzi ďalšie formy bišpecifických protilátok patria jednoreťazcové CRAb, ktoré sú opísané v Neri et al., ((1995), J. Mol. Biol. 246: 367-373).

Termín „komplementaritu určujúce regióny (CDR)“ variabilných domén protilátky označuje tie hypervariabilné sekvencie protilátky, ktoré obsahujú zvyšky potrebné pre špecifické rozpoznávanie antigénu. V tomto vynáleze používame definíciu a číslovanie CDR uvedené v Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917.

Termín „funkčne ekvivalentný variant“ označuje molekulu (variant), ktorá si aj napriek štrukturálnej odlišnosti od inej molekuly (pôvodnej molekuly) uchováva významnú homológiu a tiež aspoň nejakú biologickú funkciu pôvodnej molekuly, napríklad schopnosť väzby na určitý antigén alebo epitop. Varianty môžu byť vo forme fragmentov, derivátov alebo mutantov. Varianty, deriváty alebo mutanty môžu byť pripravené modifikáciou pôvodnej molekuly adíciou, dcléciou, substitúciou alebo inzerciou jednej alebo viac aminokyselín, alebo väzbou na inú molekulu. Tieto zmeny môžu byť uskutočnené na nukleotidovej alebo proteínovej úrovni. Napríklad, kódovaný polypeptid môže byť Fab fragment, ktorý je potom naviazaný na Fc koncovku z iného zdroja. Alternatívne môže byť naviazaný marker, ako je enzým, fluoresceín atď. Napríklad, funkčne ekvivalentný variant protilátky „A“ proti charakteristickému epitopu ED-B domény fibronektínu môže byť protilátka „B“ s odlišnou sekvenciou komplementaritu určujúcich regiónov, ale rozpoznávajúca rovnaký epitop ako protilátka „A“.

Izolovali sme rekombinantnú protilátky v scFv forme z protilátkovej fágovej zobrazovacej knižnice, ktoré sú špecifické pre ED-B doménu fibronektínu a ktoré rozpoznávajú ED-B(+)-fibronektín v tkanivových rezoch. Jedna z týchto protilátok, El, bola upravovaná z hľadiska afinity so získaním protilátok H10 a L19 so zlepšenou afinitou. Protilátka L19 má disociačnú konštantu pre ED-B doménu fibronektínu v rade subnanomolámych koncentrácií.

Vysokoafinitné protilátky L19 a D 1.3 (protilátka špecifická pre irelevantný antigén, lyzozým zo slepačích vajec) boli rádioaktívne značené a boli injikované do myší s nádormi. Biodistribúcie v nádore, krvi a orgánoch boli stanovené v rôznych časoch a boli uvedené ako percento injikovanej dávky na gram tkaniva (% ID/g). Už 3 hodiny po injekcii bolo pre L19 %ID/g (nádor) lepšie než %ID/g (krv), ale nie pre negatívnu kontrolnú D 1.3. Pomery nádor : krv sa zvyšovali pri neskorších meraniach. Tieto údaje naznačujú, že vysokoafinitná protilátka L19 môže byť užitočným činidlom cielene sa viažucim na nádory, vhodným napríklad na imunoscintigrafickú detekciu angiogenézy.

„Fotosenzibilizačné činidlo“ môže byť definované ako molekula, ktorá po ožiarení a za prítomnosti vody a/alebo kyslíka vyvolá tvorbu toxických molekúl (napríklad singletového kyslíka) schopných reagovať s biomolekulami, ktoré potenciálne poškodzujú biologické ciele, ako sú bunky, tkanivá alebo telesné kvapaliny. Fotosenzibilizačné činidlá sú predovšetkým výhodné vtedy, ak absorbujú svetlo pri vlnových dĺžkach vyšších než 600 nm. Skutočne je prienik svetla v tkanivách a telesných kvapalinách maximálny pri 600-900 nm (Wan et al., 1981, Photochem. Photobiol. 34: 679-681). Cielené podanie fotosenzibilizačného činidla nasledované ožiarením je atraktívnym spôsobom na terapiu ochorení súvisiacich s angiogenézou (Yarmush, M. L. et al., Antibody Targeted photolysis, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 10: 197-252 (1993); Rowe, P. M., Lancet 351, 1496 (1998); Levy, J., Trends Biotechnol. 13. 14-18 (1995)), najmä na selektívnu abláciu očnej neovaskulatúry. Dostupné terapeutické modality, ako je laserová fotokoagulácia, buď priama, alebo po podaní fotosenzibilizačného činidla, sú obmedzené nedostatkom selektivity a obvykle vedú k poškodeniam zdravých tkanív a ciev (Macular Photocoagulation Study Group, Árch. Opthalm. 112: 480-488, (1994); Haimovici, R. et al., Curr. Eye Res. 16: 83-90 (1997); Schmidt-Erfurt, U. et al., Graefes Árch. Clin. Exp. Opthalmol. 236:365-374 (1998)).

Z uvedených argumentov je zrejmé, že je mimoriadne dôležité objaviť spôsoby na zlepšenie selektivity a špecificity fotosenzibilizačných činidiel, napríklad pomocou ich konjugácie na vhodnej nosičke. Je pravdepodobné, že vývoj kvalitných nosičov nebude jednoduchý. Okrem toho je pravdepodobné, že nie všetky fotosenzibilizačné činidlá budú vhodné na prenos in vivo do vybraného miesta. Faktory, ako je chemická štruktúra fotosenzibilizačného Činidla, jeho rozpustnosť, lipofilnosť, priľnavosť a účinnosť budú pravdepodobne zásadne ovplyvňovať možnosť cieleného podania a účinnosť konjugátov obsahujúcich fotosenzibilizačné činidlá.

Preukázali sme, že vysokoafinitná L19 protilátka, špecifická pre ED-B doménu fibronektínu, selektívne lokalizuje novovytvorené krvné cievy v králičom modeli očnej angiogenézy po systémovom podaní. Ľ19 protilátka, chemicky naviazaná na fotosenzibilizačné činidlo, ktorým je zlúčenina štvormocného cínu a chlóru e₆ a ožiarená červeným svetlom, spôsobuje selektívnu oklúziu očnej neovaskulatúry a navodzuje apoptózu príslušných endotelových buniek.

Tieto výsledky dokazujú, že nové očné cievy môžu byť imunochemicky odlíšené od pôvodných očných ciev in vivo a naznačujú, že cielené podanie fotosenzibilizačných činidiel nasledované ožiarením môže byť účinné v liečbe očných ochorení spôsobujúcich slepotu a snáď i iných patologických stavov spojených s angiogenézou.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Uskutočnenia predkladaného vynálezu sú ilustrované na nasledujúcich výkresoch, kde: obr. 1 ukazuje navrhnutú protilátkovú fágovú knižnicu;

obr. 2 ukazuje 2D gély a Westemový prenos lyzátu ľudských melanómových COLO-38 buniek;

obr. 3A, 3B a 3C ukazujú imunohistochemické pokusy na glioblastoma multiforme;

obr. 4 ukazuje analýzu stability komplexov protilátka-(ED-B);

obr. 5 ukazuje biodistribúciu rádioaktívne značených protilátkových fragmentov pri myšiach nesúcich nádory;

obr. 6 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu L19;

obr. 7Λ a 7B ukazujú králičie oči s implantovanou peletou;

obr. 8 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov z králičej rohovky;

obr. 9 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov zo štruktúr králičieho oka (rohovky, dúhovky a spojivky) získaných s použitím červeného substrátu na alkalickú fosfatázu a hematoxylínu;

obr. 10 ukazuje lokalizáciu fluorescenčné značených protilátok v očnej neovaskulatúre;

obr. 11 ukazuje makroskopický vzhľad očí králikov, ktorým bol injekčné podaný proteín naviazaný na fotosenzibilizačné činidlo, pred a po ožiarení.

obr. 12 ukazuje mikroskopickú analýzu rezov z očných štruktúr králikov, ktorým bol injekčné podaný proteín naviazaný na fotosenzibilizačné činidlo a ktoré boli ožiarené červeným svetlom.

Podrobný opis obrázkov

Obr. 1 ukazuje navrhnutú protilátkovú fágovú knižnicu, (a) protilátkové fragmenty sú zobrazené na fágu ako pili fúzia, ako je schematicky uvedené. Vo väzbovom mieste protilátky (priamy pohľad na antigén) je Vk CDR skelet uvedený žltou a VH CDR skelet je znázornený modrou. Zvyšky podrobené náhodnej mutagenéze sú v pozíciách 91, 93, 94 a 96 Vk CDR3 (žlté) a v pozíciách 95, 96, 97 a 98 VH CDR3 (modré). Cb atómy týchto vedľajších reťazcov sú znázornené tmavšími farbami. Tiež sú uvedené (šedé) zvyšky CDR1 a CDR2, ktoré môžu byť mutované na zlepšenie afinity protilátky. S použitím programu RasMol (http://www.chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html) boli štruktúry scFv modelované z pdb súboru ligm (Brookhaven Proteín DataBank; http://www2.ebi.ac.uk/pcserv/pdbdb.htm). (b) PCR amplifikácia a klonovacia stratégia pre knižnicu. DP47 a DPK22 zárodkové templáty boli modifikované (pozri text) na tvorbu mutácií v CDR3 regiónoch. Gény sú označené obdĺžničkami a CDR sú uvedené ako očíslované obdĺžničky v génoch. Potom boli zostavené VH a VL segmenty a boli klonované do pDN332 fágemidového vektora. Priméry (od SEQ ID NO: 11 do SEQ ID NO. 18) použité pri amplifikácii sú uvedené v dolnej časti obrázka.

Obr. 2 ukazuje: (a) farbenie 2D-PAGE lyzátu ľudských melanómových COLO-38 buniek striebrom, do ktorých bol vnesený rekombinantný 7B89 obsahujúci ED-B. Dve 7B89 škvrny (zakrúžkované) sú spôsobené čiastočnou proteolýzou His-koncovky použitej na prečistenie proteínu; (b) imunoprenos gélu identického s gélom z obr. 2a, s použitím anti-ED-B El (tabuľka 1) a M2 anti-FLAG protilátok ako detekčných činidiel. Sú detegované len 7B89 škvrny, čo potvrdzuje špecificitu rekombinantnej protilátky izolovanej zo škvrny v géli.

Obr. 3A - 3C ukazujú imunohistochemické pokusy uskutočnené na sériových rezoch z glioblastoma multiforme, ktoré ukazujú typické glomerulom podobné vaskuláme štruktúry prifarbené s použitím scFV El (A), A2 (B) a G4 (C). Meradlo: 20 pm.

Obr. 4 ukazuje stabilitu komplexov protilátka-(ED-B). Analýza väzby scFV El, H10 a L19 na ED-B doménu fibronektínu. (a) BIAcore sensogramy ukazujúce zlepšené disociačné profily získané po afinitných úpravách protilátky, (b) natívna gélová elektroforéza scFv-(ED-B) komplexov. Len vysokoafinitná protilátka L19 môže tvoriť stabilné komplexy s fluorescenčné značeným antigénom. Fluorescenčná detekcia bola uskutočnená opísaným spôsobom (Neri et al., (1996), BioTechniques, 20: 708-712). (c) Kompetícia komplexu scFv-(ED-B-biotín) so 100-násobným molárnym nadbytkom nebiotinylovaného ED-B, ako bola monitorovaná elektrochemoluminiscenciou s použitím prístroja Origen. Bol pozorovaný dlhý polčas komplexu L19-(ED-B). Plné štvorčeky: L19; prázdne trojuholníčky: H10.

Obr. 5 ukazuje biodistribúciu rádioaktívne značených protilátkových fragmentov pri myšiach nesúcich nádory. Biodistribúcie v nádore a v krvi, vyjadrené ako percento injikovanej dávky na gram, sú umiestnené do grafu v závislosti od času. Tiež je uvedená relevantná orgánová biodistribúcia.

Obr. 6 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu protilátky L19 obsahujúcu ťažký reťazec (VH), spojovaciu skupinu a ľahký reťazec (VL).

Obr. 7A a 7B ukazujú králičie oči s implantovanými polymérovými peletami namočenými do angiogénnej substancie.

Obr. 8 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov z králičej rohovky s novotvorenými cievami, s použitím L19 protilátky.

Obr. 9 ukazuje imunohistochemické farbenie rezov zo štruktúr oka, s použitím L19 protilátky. Špecifické červené zafarbenie je zrejmé okolo neovaskulárnych štruktúr v rohovke (a), ale nie okolo krvných ciev v dúhovke (b) a spojivke (c). Malé šípky: epitel rohovky. Relevantné krvné cievy sú označené veľkými šípkami. Meradlá: 50 pm.

Obr. 10 ukazuje imunofotodetekciu fluorescenčné značených protilátok detegujúcich očnú angiogenézu. Silná fluorescenčná rohovková neovaskularizácia (označená šípkami) je pozorovaná pri králikoch, ktorým bol injekčné podaný protilátkový konjugát L19-Cy5 (a), špecifický pre ED-B doménu FN, ale pri králikoch, ktorým bol injekčné podaný protilátkový konjugát HyHEL-10-Cy5 (b). Imunofluorescenčná mikroskopia rohovkových rezov potvrdila, že L19-Cy5 (c), ale nie HyHEL-Cy5 (d), sa vyskytuje v okolí neovaskulatúry v rohovke, rezy (a,b) boli získané 8 hodín po injekcii protilátky; (c,d) boli získané s použitím rohovkových rezov izolovaných od králikov 24 hodín po injekcii protilátky. P, peleta.

Obr. 11 ukazuje makroskopický vzhľad očí králikov, ktorým boli podané konjugáty obsahujúce fotosenzibilizačné činidlo. Oko králika, ktorému bol podaný L19-PS, pred (a) a 16 hodín po (b) ožiarení červeným svetlom. Šípka označuje koagulovanú neovaskulatúru, ktorá bola potvrdená ako hypofluorescenčná oblasť v Cy5 fluóroangiograme na obr. (c) 16 hodín po ožiarení. Povšimnite si, že žiadna koagulácia nie je pozorovaná v iných cievnych štruktúrach, napríklad v dilatovaných spojivkových cievach. Na porovnanie je uvedený fluóroangiogram s hyperfluorescenciou prepúšťajúcich ciev a príslušná farebná fotografia neliečeného králičieho oka je uvedená v (d) a (h). Obr. (e,f,g) sú analogické s (a,b,c), ale prislúchajú králikom, ktorým bol injekčné podaný ovalbumín-PS a ktoré boli ožiarené červeným svetlom. Nebola pozorovaná žiadna koagulácia a angiogram ukázal hyperfluorescenciu prepúšťajúcich ciev. Oči králikov v skorom štádiu angiogenézy, ktorým bol podaný L19-PS, sú uvedené na (i-1). Zobrazenie pred (I) a 16 hodín po ožiarení červeným svetlom (j) ukázali významnú a selektívnu svetlom indukovanú intravaskulámu koaguláciu (šípka). Oklúzia ciev (šíp ka) je najmä zreteľná v ožiarenom oku (1) králika bezprostredne po eutanázii, ale nie je detegovateľná v neožiarenom oku (k) rovnakého králika. P, peleta. Hroty označujú komeo-sklerálny prechod (limbus). Na všetkých obrázkoch sú preexistujúce dilatované spojivkové cievy viditeľné nad limbom, zatiaľ čo rast rohovkovej neovaskulatúry môže byť pozorovaný od limba smerom k pelete (P).

Obr. 12 ukazuje mikroskopickú analýzu selektívnej oklúzie krvných ciev. H/E rezy rohovky (a,e,b,f: nefixované; i,j: fixované paraformaldehydom) králikov, ktorým bol injekčné podaný ovalbumin-PS (a,e,i) alebo L19-PS (b,f,j) a ktoré boli ožiarené. Veľké šípky predstavujú nepoškodené (e,i) alebo celkom uzavreté (f,j) krvné cievy. Oproti selektívnej oklúzii rohovkovej neovaskulatúry a obmedzenému perivaskulámemu postihnutiu (eosinofílii) spôsobenému L19-PS po ožiarení (b,j,f), nemajú cievy v spojivke (k) a dúhovke (1) pri rovnakom králikovi známky poškodenia. Fluorescenčný TUNEL test ukázal rôzny počet apoptotických buniek v rezoch od ožiarených králikov, ktorým bol podaný L19-PS (c,g) alebo ovalbumín-PS (d,h). Veľké šípky ukazujú niektoré relevantné cievne štruktúry. Malé šípky ukazujú rohovkový epitel. Meradlo: 100 pm (ad) a 25 pm (e-1).

Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Izolácia ľudských scFv protilátkových fragmentov špecifických pre ED-B doménu fibronektínu z protilátkovej fágovej zobrazovacej knižnice

Ľudská protilátková knižnica bola klonovaná s použitím VH (DP47; Tomlison et al., (1992), J. Mol. Biol., 227: 776 - 798) a Vk (DPK22; Cox et al., (1994), Eur. J. Immunol. 24: 827 - 836) zárodočných génov (pre stratégiu klonovania a amplifikácie pozri obr. 1). VH zložka knižnice bola vytvorená s použitím čiastočne degenerovaných primérov (obr. 1) (od SEQ ID NO: 11 do SEQ ID NO: 18) pomocou techniky na báze PCR na vloženie náhodných mutácií v pozíciách 95 - 98 CDR3). VL zložka knižnice bola pripravená rovnakým spôsobom, vložením náhodných mutácií do pozícií 91, 93, 94 a 96 CDR3. PCR reakcie boli uskutočnené opísaným spôsobom (Marks et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597) VH-V1 scFv fragmenty boli pripravené pomocou PCR zostavenia (obr. 1; Clackson et al., (1991), Náture 352: 624 - 628) z VH a VL segmentov prečistených na géli. 30 pg prečistených VH-VL scFv fragmentov bolo dvojito trávených 300 jednotkami Ncol a Nôti, potom bol získaný materiál ligovaný do 15 pg Notl/Ncol tráveného pDN332 fágemidového vektora. pDN332 je derivát fagemidu pHENl (Hoogenboom et al., (1991), Nucl. Acids Res. 19: 4133 4137), v ktorom bola sekvencia medzi Notl miestom a „amber“ kodónom pred génom III nahradená nasledujúcou sekvenciou kódujúcou D3SD3-FLAG-His6 koncovku (Neri et al., (1996), Náture Biotechnology 14: 385 - 390).

Notl D D D S DDD

Y K D D

5' - GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC

D D K H H H H H H amber

GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG - 3’

Transformácie do TG1 kmeňa E. coli boli uskutočnené spôsobom podľa Marks et al. (1991, J. Mol. Biol. 222: 581 - 597) a fágy boli pripravené podľa štandardných protokolov (Nissim et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581 - 597). Náhodne bolo vybraných päť klonov a tieto boli sekvenované na overenie absencie kontaminácie.

Rekombinantné fibronektínové fragmenty ED-B a 7B89 obsahujúce jeden a štyri homologické repetitívne sekvencie typu III, v príslušnom poradí, boli exprimované z expresných vektorov na báze pQE12 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) spôsobom opísaným v literatúre (Camemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397 - 405).

Selekcie proti rekombinantnej ED-B doméne fibronektínu (Camemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397 - 405; Zardi et al., 1987, EMBO J., 6: 2337 -2342) boli uskutočnené pri 10 nM koncentrácii s použitím antigénu biotinylovaného biotín-disulfid-N-hydroxysukcínimid esterom (činidlo B-4531; Sigma, Buchs, Switzerland; 10) a eluovaného z 2D gélu, a streptavidínom potiahnutých Dynabeads gorálok (Dynal, Oslo, Norway). Pre každé kolo panelovania bolo použitých 1013 fágov, v 1 ml reakčnej zmesi. Fágy boli inkubované s antigénom v 2 % mliekiúPBS (MPBS) počas 10 minút. Do tohto roztoku sa pridalo 100 pl Dynabeads (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Norway) vopred blokovaných v MPBS. Po 5 minútach miešania sa gorálky magneticky separovali z roztoku a 7-krát sa premyli PBS-0,1 % Tween20 (PBST) a 3-krát PBS. Elúcia bola usku točnená inkubáciou počas 2 minút s 500 μΐ 50 mM ditiotreitolu (DTT), pre redukciu disulfidových mostíkov medzi antigénom a biotínom. Gorálky boli znovu zachytené a získaný roztok bol použitý na infekciu exponenciálne rastúcich TG1 E. coli buniek. Po troch kolách panelovania bol eluovaný fág použitý na infekciu exponenciálne rastúcich HB2151 buniek E. coli, ktoré boli umiestnené na (2xTY + 1% glukóza + 100 pg/ml ampicilínu) - 1,5 % agarovej platne. Jednotlivé kolónie boli kultivované v 2xTY +1% glukóze + 100 pg/ml ampicilínu a boli indukované cez noc pri 30 °C 1 mM IPTG na dosiahnutie produkcie protilátky. Vzniknuté supematanty boli vyšetrované ELISA testom s použitím streptavidínom potiahnutých mikrotitračných platní spracovaných 10 nM biotinylovaným ED-P a anti-FLAG M2 protilátkou (IBI Kodak, New Haven, CT) ako detekčným činidlom. 32 % vyšetrovaných kolónií bolo pozitívnych v tomto teste a tri z nich, ktoré mali najsilnejší EĽSA signál (El, A2 a G4), boli sekvenované a ďalej charakterizované.

ELISA testy boli uskutočnené s použitím biotinylovaného ED-B získaného zo škvrny v géle, biotinylovaného ED-B, ktorý nebol denaturovaný, ED-B naviazané na susedné fibronektínové domény (rekombinantný proteín obsahujúci 7B89 domény) a mnoho irelevantných antigénov. Protilátky El, A2 a G4 reagovali silne a špecificky so všetkými tromi proteínmi obsahujúcimi ED-B. Táto skutočnosť, spolu so skutočnosťou, že všetky tri rekombinantné protilátky mohli byť prečistené z bakteriálnych supematantov s použitím ED-B afinitnej kolóny, silne naznačuje, že rozpoznávajú epitop prítomný v prirodzenej konformácii ED-B. Žiadna reakcia nebola detegovaná pre fibronektínové fragmenty neobsahujúce ED-B doménu (údaje nie sú uvedené). Na testovanie toho, či majú protilátky izolované proti gélovej škvrne dobrú afinitu k prirodzenému antigénu, bola uskutočnená interakčná analýza v reálnom čase s použitím povrchovej plazmonovej rezonancie na BIA -core prístroji, podľa spôsobu uvedeného v literatúre (Neri et al., (1997), Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275). Monoméme frakcie El, A2 a G4 scFv fragmentov sa viazali na ED-B s afinitou v rozmedzí 107 -108 M-l (tabuľka 1).

Ako ďalší test špecificity a použiteľnosti protilátky bol uskutočnený 2D-PAGE imunoprenos, pri ktorom bol do gélu vnesený lyzát ľudskej melanómovej bunkovej línie COLO-38, do ktorého boli pridané minimálne množstvá 7B89 proteínu obsahujúceho ED-B (obr. 2) ScFv (El) farbil silne a špecificky len 7B89 škvrnu.

Protilátky El, A2 a G4 boli použité na imunolokalizáciu fibronektinu obsahujúceho ED-B (B-FN) v kryostatových rezoch z glioblastoma multiforme, čo je agresívny mozgový nádor s výraznou angiogenézou. Obr. 3 ukazuje sériové rezy z glioblastoma multiforme, s typickými glomerulám podobnými cievnymi štruktúrami sfarbenými do červená tromi protilátkami. Imunofarbenie rezov zo vzoriek glioblastoma multiforme zmrazených bezprostredne po chirurgickom odbere bolo uskutočnené spôsobom opísaným v literatúre (Camemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397 - 405; Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612 - 618). Stručne, imunofarbenie bolo uskutočnené s použitím M2-anti-FLAG protilátky (IBI Kodak), biotinylovaných anti-myších polyklonálnych protilátok (Sigma), farbiaceho kitu obsahujúceho komplex streptavidín-biotín-alkalická fosfatáza (BioSpa, Milan, Italy) a naftol-AS-MX-fosfátu a „fast red TR“ (Sigma). Gillov hematoxylin bol použitý ako kontrastné farbenie, po ktorom nasledovalo umiestnenie do glycergélu (Dáko, Carpenteria, CA), ako bolo opísané skôr (Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612 - 618).

Pomocou podobnej techniky a protilátky L19 (pozri ďalší príklad) sme mohli tiež špecificky farbiť novovytvorené cievy indukované implantáciou polymérových peliet ponorených do angiogénnej substancie, ako je vaskulámy endotelový rastový faktor alebo estery forbolu, do králičej rohovky.

Príklad 2: Izolácia ľudského scFv protilátkového fragmentu viažuceho sa na ED-B so subnanomolamou afinitou

ScFv(El) bol vybraný na testovanie možnosti zlepšenia jeho afinity pomocou obmedzeného počtu mutácií CDR zvyškov lokalizovaných na periférii väzbového miesta pre antigén (obr. 1 A). Kombinatoriálne sme mutovali zvyšky 31 - 33, 50, 52 a 54 VH protilátky a zobrazili sme príslušný repertoár na filamentóznom fágu. Tieto zvyšky sa často vyskytujú v kontakte s antigénom v známych 3D-štruktúrach komplexov protilátka-antigén. Získaný repertoár 4 x 10⁸ klonov bol selektovaný pre väzbu na ED-B doménu fibronektinu. Po dvoch kolách panelovania a po vyšetrení 96 jednotlivých klonov bola izolovaná protilátka s 27-krát vylepšenou afinitou (H10; tabuľky 1 a 2). V súlade s inými pozorovaniami pre afinitne - upravené protilátky sme pozorovali, že zlepšená afinita bola spôsobená skôr pomalšou disociáciou z antigénu než zlepšenými kon hodnotami (Schier et al., (1996), Gene, 169: 147 - 155; Ito (1995, J. Mol. Biol. 248: 729 - 732). Predpokladá sa, že ľahký reťazec protilátky prispieva menej k väzbovej afinite k antigénu, čo je podporované faktom, že tak prirodzené, ako syntetické protilátky bez ľahkého reťazca sa môžu stále ešte viazať na antigén (Ward et al., 1989, Náture 341: 544 - 546; Hamers-Casterman et al., 1993, Náture 363: 446 - 448). Z tohto dôvodu sme vybrali na randomizáciu len dva zvyšky (32 a 50) VL domény, ktoré sú umiestnené centrálne vo väzbovom mieste pre antigén (obr. la) a v 3D štruktúrach sa často vyskytujú v kontakte s antigénom. Získaná knižnica, obsahujúca 400 klonov, bola zobrazená na fágu a bola selektovaná pre väzbu na antigén. Z analýz disociačných profilov s použitím interakčnej analýzy v reálnom čase, uskutočnených pomocou BIAcore prístroja (Jonsson et al., 1991, BioTechniques, 11: 620 - 627) a meraní k_oľľpomocou kompetičných pokusov s elektrochcmiluminiscenčnou detekciou, bol identifikovaný kloň (L 19), ktorý sa viazal na ED-B doménu fibronekti nu s Kd = 54 pM (tabuľky 1 a 2). Pokusy s afínitnými úpravami boli uskutočnené nasledujúcim spôsobom: Gén scFv(El) bol amplifikovaný PCR s použitím primérov LMBlbis (5'-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEQID NO: 1) a DP47CDRlfor (5'-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (SEQ ID NO: 2) na vloženie náhodných mutácií do pozícií 31 - 33 v CDR1 VH (na číslovanie: 28), a s primérmi DP47CDRlback (5'-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3’) (SEQ ID NO: 3) a DP47CDR2for (5'-GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3') (SEQ ID NO: 4) na náhodnú mutáciu pozícií 50, 52, 54 v CDR2 VH. Zvyšný fragment scFv génu, v rozsahu 3’-časti VH génu, peptidovej spojovacej skupiny a VL génu, bol amplifikovaný s použitím primérov DP47CDR2back (5'-ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEQ ID NO: 5) a JforNot (5’-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3') (SEQ ID NO: 6) (94 °C, 1 minúta, 60 °C, 1 minúta, 72 °C, 1 minúta). Tri získané PCR produkty boli prečistené na géli a boli zostavené PCR (21) s použitím primérov LMBlbis a JforNot (94 °C, 1 minúta, 60 °C, 1 minúta, 72 °C, 1 minúta). Získaný jediný PCR produkt bol prečistený z PCR zmesi, bol dvojito trávený Notl/Ncol a bol ligovaný do Notl/Ncol tráveného vektora pDN332. V ligačnej zmesi bolo použitých približne 9 vektora a 3 pg insertu, zmes bola prečistená fenolizáciou a zrážaním etanolom, bola resuspendovaná v 50 μΐ sterilnej vody a bola elektroporovaná do elektrokompetentných TGI buniek E. coli. Získaná afinitne - upravená knižnica obsahovala 4 x 10⁸ klonov. Protilátkové -fágové častice získané opísaným spôsobom (Nissim et al., 1994, EMBO J., 13: 692 - 698) boli použité na prvé kolo selekcie na imunoskúmavke potiahnutej 7B89 (Camemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397 -

- 405). Selektované fágy boli použité na druhé kolo panelovania uskutočnené s biotinylovanou ED-B, po ktorom nasledovalo zachytenie na magnetických gorálkach potiahnutých streptavidínom (Dynal, Oslo, Norway; pozri predchádzajúci odsek). Po selekcii bolo približne 25 % klonov pozitívnych v solubilnom ELISA teste (pre protokol pokusu pozri predchádzajúcu kapitolu). Z kandidátov pozitívnych v ELISA teste sme ďalej identifikovali jeden kloň (H10, tabuľka 1) s najnižšou hodnotou k_cff podľa BIAcore analýzy (Jonsson et al., 1991, BioTechniques, 11: 620 - 627).

Gén scFV(H10) bol amplifikovaný PCR s použitím primérov LMBlbis a DPKCDR1 for (5’-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G-3') (SEQ ID NO: 7) na vloženie náhodných mutácii do pozície 32 v CDR1 VL (na číslovanie: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901

- 917), a s primérmi DPKCDRlback (5'-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-3') (SEQ ID NO: 8) a DPKCDR2for (5'-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (SEQ ID NO: 9) na vloženie náhodnej mutácie v pozícii 50 v CDR2 VL. Zvyšná časť scFv génu bola amplifikovaná s použitím oligonukleotidov DPKCDR2back (5'-GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3') (SEQ ID NO: 10) a JforNot (94 °C, 1 minúta, 60 °C, 1 minúta, 72 °C, 1 minúta). Tri získané PCR produkty boli zostavené, trávené a klonované do pDN332 rovnako, ako bolo opísané na mutagenézu ťažkého reťazca. Získaná knižnica bola inkubovaná s biotinylovanou ED-B v 3 % BSA počas 30 minút a potom bola zachytená na streptavidínom potiahnutej mikrotitračnej platni (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) počas 10 minút. Fágy boli eluované 20 mM roztokom DTT (1,4-ditio-DL-treitol, Fluka) a boli použité na infikovanie exponenciálne rastúcich TGI buniek. Analýza väzby supernatantov z 96 kolónií na ED-B pomocou ELISA testu a BIAcore umožnila identifikáciu klonu L19. Anti-ED-B El, G4, A2, H10 a L19 scFv protilátkové fragmenty selektívne farbili novovytvorené cievy v rezoch z agresívnych nádorov (obr. 3).

Uvedené fragmenty anti-ED-B protilátok boli potom produkované inokuláciou jednej čerstvej kolónie do 1 litra 2xTY média, ako bolo opísané v literatúre (Pini et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206. 171 - 182) a boli afinitne prečistené na sepharosovej kolóne aktivovanej CNBr (Pharmacia, Uppsala, Sween), v ktorej bolo naviazaných 10 mg 7B89 rekombinantného proteínu obsahujúceho ED-B (Camemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397-405). Po naplnení bola kolóna premytá 50 ml rovnovážneho pufra (PBS, 1 ml EDTA, 0,5 M NaCl). Protilátkové fragmenty boli potom eluované 100 mM trietylamínom, ihneď boli neutralizované 1 M Hepes, pH 7 a boli dialyzované proti PBS. Afinitné merania pomocou BIAcore boli uskutočnené s prečistenými protilátkami, spôsobom uvedeným v literatúre (Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271 - 1275) (obr. 4). Analýza posunu prúžkov bola uskutočnená spôsobom uvedeným v literatúre (Neri et al., 1996, Nátur. Biotechnol. 14: 385 - 390), s použitím rekombinantnej ED-B fluorescenčné značenej na N-konci (Camemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397 - 405; Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271 - 1275) infračerveným fluórofórom Cy5 (Amersham) (obr. 4). BIAcore analýza neumožňuje presné stanovenie kinetických parametrov na pomalé disociačné reakcie, z dôvodov možného opakovaného naviazania, základnej nestability a dlhých časov meraní nutných na zistenie toho, že disociačná fáza prebieha podľa jedného exponenciálneho profilu. Preto sme uskutočnili merania kinetickej disociačnej konštanty ko_ff pomocou kompetičných pokusov (Neri et al., 1996, Trends in Biotechnol. 14: 465 - 470) (obr. 4). Stručne, anti-ED-B protilátky (30 nM) boli inkubované s biotinylovanou ED-B (10 nM) počas 10 minút, za prítomnosti M2 anti-FLAG protilátky (0,5 pg/ml) a polyklonálneho anti-myšieho IgG (Sigma), ktorý bol vopred značený ruteníovým komplexom, ako je opísané v literatúre (Deaver, D. R., 1995, Náture 377: 758 - 760). Do tohto roztoku bola v paralelných reakciách v rôznu dobu pridávaná nebiotinylovaná ED-B (1 μΜ). Potom boli pridané streptavidínom potiahnu té Dynabeads, riedené v Origen Assay pufre (Deaver, D. R., 1995, Náture 377: 758 - 760) (20 μΐ, 1 mg/ml) a získané zmesi boli analyzované s použitím ORIGEN analyzátora (IGEN Inc., Gaithersburg, MD, USA). Tento prístroj deteguje elektrochemoluminiscenčný signál (ECL), ktorý koreluje s množstvom scFV fragmentu, ktorý' zostáva naviazaný na biotinylovanú ED-B na konci kompetičnej reakcie. Graf ECL signálu versus kompetičná doba dáva profil, ktorý môže byť upravený pre jedinú exponenciálnu krivku s charakteristickou konštantou k„_rf (obr. 4, tabuľka 2).

Príklad 3: Zameranie nádorov pomocou vysokoafinitného rádioaktívne značeného scFv špecifického pre EDB doménu fibronektínu

Rádioaktívnym jódom značené scFv(L19) alebo scFv(D1.3) (irelevantná protilátka špecifická pre lyzozým slepačích vajec) boli intravenóznou injekciou podané myšiam s podkožné implantovaným myším F9 teratokarcinómom, rýchlo rastúcim agresívnym nádorom. Biodistribúcie protilátok boli stanovené v rôznych časoch (obr. 4). ScFv(L19) a scFv(D1.3) boli afinitne prečistené na antigénnej kolóne (Neri et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1273) a boli rádioaktívne značené jódom-125 s použitím Iodogen metódy (Pierce, Rockford, IL, USA). Rádioaktívne značené protilátkové fragmenty si zachovávali >80 % imunoreaktivitu, ako bolo určené vnesením rádioaktívne značenej protilátky do antigénnej kolóny, po ktorom nasledovalo stanovenie rádioaktivity v prvej a druhej výtokovej frakcii. Holým myšiam (Swiss holé myši staré 12 týždňov, samce) s podkožné implantovaným F9 myším teratokarcinómom (Neri et al., 1997, Náture Biotechnol. 15: 1271-1273) boli injekčné podané 3 pg (3-4 pCi) scFv v 100 μΐ salinickom roztoku. Veľkosti nádorov boli 50-250 mg, pretože väčšie nádory majú tendenciu ku vzniku nekrotického centra. Ale pri pokusoch o zameranie väčších nádorov (300-600 mg) sa dosiahli v podstate rovnaké výsledky. Na každý čas boli použité tri zvieratá. Myši boli utrácané humánnym spôsobom a ich orgány boli zvážené a bola stanovená ich rádioaktivita. Výsledky pre reprezentatívne orgány sú vyjadrené ako percento injikovanej dávky protilátky na gram tkaniva (% ID/g). ScFv(L19) je rýchlo eliminovaný z krvi ľadvinami; oproti bežným protilátkam sa neakumuluje v pečeni ani iných orgánoch. 8 % injikovanej dávky na gram tkaniva sa lokalizuje v nádore už tri hodiny po injekcii; následné zníženie tejto hodnoty je spôsobené skutočnosťou, že nádor zdvojuje svoju veľkosť počas 24 - 48 hodín. Pomery nádor: krv v 3, 5 a 24 hodine po injekcii sú 1,9, 3,9 a 11,8, v príslušnom poradí, pre L19, ale vždy nižšie než 1,0 pre protilátku slúžiacu ako negatívna kontrola.

Rádioaktívne značený scFv(L19) sa prednostne lokalizuje v nádoroch už niekoľko hodín po injekcii, čo ukazuje na jeho použiteľnosť na imunoscintigrafickú detekciu angiogenézy u pacientov.

Príklad 4: Anti-ED-B protilátky selektívne farbia novovytvorené očné krvné cievy

Angiogenéza, tvorba nových krvných ciev z preexistujúcich ciev, je charakteristickým procesom, ktorý je príčinou mnohých ochorení, vrátane nádorov a väčšiny očných ochorení vedúcich ku strate zraku. Schopnosť selektívne rozpoznať a okludovať neovaskulatúru prinesie nové diagnostické a terapeutické možnosti.

Skúmali sme, či je B-FN špecifickým markerom očnej angiogenézy a či môžu protilátky rozpoznávajúce B-FN selektívne rozpoznávať očné neovaskuláme štruktúry in vivo po systémovom podaní. Na tento účel sme stimulovali angiogenézu v králičej rohovke, ktorá umožnila priame pozorovanie novovytvorených očných ciev, pomocou chirurgickej implantácie peliet obsahujúcich vaskulámy endotelový rastový faktor alebo ester forbolu (obr. 7). Sukralfátové (láskavý dar od Merck, Damistad, Germanyj/hydrónové pelety obsahujúce buď 800 ng vaskulámeho endotelového rastového faktora (Sigma), alebo 400 ng for-bol-12-myristát 13-acetátu („PMA“, Sigma) boli implantované do rohovky samíc králikov plemena New Zealand White, spôsobom opísaným v literatúre (D'Amato, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4082 - 4085, 1994). Angiogenéza bola indukovaná oboma faktormi. Králiky boli sledované denne. Pri použití oboch indukčných činidiel boli novovytvorené krvné cievy silne pozitívne na ED-B pri imunohistochemickom vyšetrení. Na všetky ďalšie pokusy boli použité PMA pelety. Imunohistochemické vyšetrenia ukázali, že L19 silno farbí neovaskulatúru indukovanú v králičej rohovke (obr. 8, 9a), ale nie pre existujúce krvné cievy oka (obr. 9b, c) a iné tkanivá (údaje nie sú uvedené). Imunohistochemické vyšetrenia boli uskutočnené spôsobom opísaným v literatúre (Camemolla, B. et al., Int. J. Cancer, 68: 397 - 405, 1996).

Príklad 5: Ľudský protilátkový fragment L19, ktorý sa viaže na ED-B so subnanomolámou afinitou, rozpoznáva očnú angiogenézu in vivo

S použitím modelu angiogenézy na králičej rohovke, ktorý bol opísaný v predošlom príklade, a imunofotodetekčnej techniky (Neri, D. et al., Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275, 1997), sme preukázali, že L19, chemicky naviazaný na červený fluórofór Cy5, ale nie protilátkový fragment (HyHEL-10)-Cy5, namierený proti irelevantnému antigénu (obr. 10a, b), selektívne rozpoznáva očnú angiogenézu po intravenóznej injekcii. Fluorescenčné farbenie rastúcich očných ciev bolo jasne detegovateľné pri použití L19 ihneď po injekcii a pretrvávalo počas aspoň dvoch dní, analogicky s predošlými pozorovaniami pre nádorovú angiogenézu. Následná imunofluorescenčná mikroskopická analýza rezov z rohovky uskutočnená ex vivo potvrdila lokalizáciu L19, ale nie Hy-HEL-10, okolo vaskulámych štruktúr (obr. 10c, d). Dôkaz rozpoznávania očnej neo vaskularizácie protilátkou, spoločne s reaktivitou anti-B-FN protilátok pri rôznych druhoch, nabáda k ďalším klinickým výskumom. Imunofluorescenčné zobrazenie môže byť vhodné na včasnú detekciu očnej angiogenézy u rizikových pacientov, skôr než sa lézie stanú zreteľnými pri fluóroangiografii.

Niektoré metodologické podrobnosti:

Na vyšetrenie imunofluorescencic ex vivo a na niektoré H/E farbenia boli rohovky fixované v 4 % paraformaldehyde v PBS pred ponorením. Pokusy fluorescenčnej fotodetekcie boli uskutočnené na králikoch upokkojených Acepromazínom v dávke 5 mg/kg. Na pokusy cieleného rozpoznávania bolo 3,5 mg scFv(L19)_rCy5o,66 a 2,8 mg scFv(HyHEL-10)i-Cy5₀,83 injikovaných intravenózne každému králikovi (čas injekcie =15 minút). Silná fluorescencia v rohovkovej neovaskulatúre bola pozorovaná ihneď po injekci LI9, ale nie Hy-HEL-10, a pretrvávala niekoľko hodín. V ďalšom teste na špecificitu bol králikom injekčné podaný deň vopred scFv(HyHEL-10)-Cy5 a králikom negatívnym pri fotodetekcii bol ďalší deň injikovaný scFv(L19)-Cy5 a bolo pozorované silné fluorescenčné farbenie rohovkových novovytvorených ciev.

Na fluorescenčnú detekciu boli oči ožiarené wolfrámovou halogénovou lampou (model Schott KL1500; Zeiss, Jena, Germany) vybavenou Cy5 excitačným filtrom (Chromá, Brattleboro, VT, USA) a dvoma svetelnými kanálmi, ktorých konce boli umiestnené približne 2 cm od oka. Fluorescencia bola detegovaná chladenou C-5985 monochromatickou CCD-kamerou (Hamatsu, Hamatsu-City, Japan), vybavenou C-upevnenou Canon Zoom šošovkou (V6xl6; 16-100 mm, 1: 1,9) a Cy5 emisným filtrom s priemerom 50 mm (Chromá), umiestneným vo vzdialenosti 3-4 cm od ožarovaného oka. Akvizičné časy boli 0,4 s.

Cy5 fluóroangiografické pokusy boli uskutočnené s rovnakým vybavením, ale s intravenóznou injekciou 0,25 mg Cy5-Tris (produkt reakcie medzi Cy5-NHS a tris(hydroxymetyl)-aminometánom; čas injekcie = 5 minút). Akvizičné časy boli 0,2 s.

Protilátkové fragmenty boli vo forme scFv. Prečistenie scFv(L19) a scFv(HyHEL-lO) a ich značenie N-hydroxysukcínimidovými estermi (NHS) indokyanínu bolo opísané v literatúre (Neri, D. et al., Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275, 1997; Fattorusso, R. et al., 1999, Structure 7: 381 - 390). Pomery protilátka:Cy5 pri značení boli pre tieto dve protilátky 1,5 : 1 a 1,2 : 1, v príslušnom poradí. Cy5-NHS bolo zakúpené od Amersham Pharmacia Biotech (Zurich, Switzerland) a ovalbumín od Sugma (Buchs, Switzerland).

Po značení boli protilátkové konjugáty separované od neinkorporovaného fluórofóru alebo fotosenzibilizátora s použitím PD-10 kolón (Amersham Pharmacia Biotech) uvedených do rovnováhy v 50 mM fosfátu, pH 7,4, 100 mM, NaCl, (PBS). Imunoreaktivita protilátkových konjugátov bola meraná afmitnou chromatografiou na antigénnych kolónach (Neri, D. et al., Náture Biotechnol. 15: 1271 - 1275, 1997) a vo všetkých prípadoch bola > 78 %. Imunokonjugáty boli analyzované elektroforézou na dodecylsíran sodný-polyakrylamidových géloch a migrovali ako prúžok o MW = 30 000 Daltonov (čistota³ 90 %).

Príklad 6: Ľudský protilátkový fragment L19, chemicky konjugovaný na fotosenzibilizačné činidlo, ktorým bol chlorín štvormocného cínu e₆, selektívne rozpoznáva angiogenézu a spôsobuje oklúziu novovytvorených ciev pri ožiarení červeným svetlom

Na testovanie toho, či môže byť pomocou selektívneho rozpoznávania protilátkou dosiahnutá selektívna ablácia ciev, sme injikovali králikom L19 protilátkový fragment alebo irelevantný proteín, ktorý sa nevychytáva v novovytvorených cievach (ovalbumín), naviazaných na fotosenzibilizačné činidlo, ktorým bol chlorín štvormocného cínu e6, (ktoré je tu označované ako „PS“). Oči zvierat, ktorým bola podaná injekcia, boli ožiarené červeným svetlom (dávka = 78 J/cm²). Reprezentatívne hodnoty sú uvedené na obr. 11. Nápadný makroskopický odlišný nález bol pozorovaný 16 hodín po ožiarení pri králikoch ošetrených L19-PS (obr. 11a, b), s koaguláciou rohovkovej neovaskulatúry, ale nie ciev v spojivke či iných očných štruktúrach. Fluóroangiografia s indokyaninovým fluórofórom Cy5 (obr. 11c) potvrdila uzáver ciev, ktorý sa prejavil ako charakteristické hypofluorescenčné oblasti. Naopak, hyperfluorescenčné oblasti boli pozorované v prepúšťajúcej neovaskulatúre v neožiarených očiach (obr. 11 d, h). Žiadne makroskopické alterácie neboli pozorované v ožiarených cievach králikov ošetrených ovalbuminom-PS (obr. Íle - g), ani oftalmoskopicky, ani pri Cy5 fluóroangiografii. Efekt ožiarenia cielene podaného L19-PS konjugátu pri včasných štádiách rohovkovej angiogenézy je uvedený na obr. 11i- 1. Selektívne koagulované krvné cievy boli makroskopický viditeľné pri živých zvieratách (obr. 1 li, j) a boli ešte zreteľnejšie pri zvieratách bezprostredne po utratení (obr. 11 k, 1).

Fotodynamické poškodenie bolo ďalej skúmané pomocou mikroskopických techník. Po ožiarení mohla byť oklúzia ciev detegovaná štandardnými technikami farbenia hematoxylinom/eozínom (H/E) tak v nefixovaných, ako v paraformaldehydom fixovaných rezoch z rohovky zvierat liečených L19-PS (obr. 1 lb, j, f), ale nie zvierat liečených ovalbumínom-PS (obr. 11a, e, i). Apoptóza v časti rohovky cielene rozpoznanej konjugátom obsahujúcim fotosenzibilizačné činidlo bola jasne viditeľná vo fluorescenčnom TUNEL teste (obr. 11c, g), ale bola zle detegovateľná pri negatívnych kontrolách (obr. 11 d, h). Vyššie zväčšenie ukázalo apoptózu endotelových buniek v cievnych štruktúrach (obr. 1 lg). Ani v TUNEL teste (nie je ukázané), ani H/E farbením (obr. 1 lk, 1) nebolo detegované žiadne poškodenie krvných ciev v dúhovke, sklére či spojivke liečených zvierat.

Selektívna fotodynamická ablácia neovaskulatúry bude prínosom pre liečbu očných ochorení a iných patologických stavov súvisiacich s angiogenézou, ktoré sú prístupné na ožiarenie pomocou svetelných difuzérov alebo optických vlákien. Výsledky tejto štúdie jasne ukazujú, že očná neovaskulatúra môže byť selektívne okludovaná bez poškodenia preexistujúcich krvných ciev a normálnych tkanív.

Niektoré technické podrobnosti:

Zlúčenina štvormocného cínu a chlóru e₆ bola vybraná z rôznych fotosenzibilizačných činidiel pre svoju účinnosť, rozpustnosť a špecificitu po naviazaní na králičiu anti-myšiu polyklonálnu protilátku (Sigma). Tieto imunokonjugáty boli testované na cielenú fotolýzu červených krviniek potiahnutých monoklonálnou protilátkou špecifickou pre ľudský CD47 (č. 313441 A; Phar-mingen, San Diego, CA, USA). Zlúčenina štvormocného cínu a chlóru e₆ bola pripravená spôsobom opísaným v literatúre (Lu, X.M. et al., J. Immunol. Methods, 156: 85 - 99, 1992). Pre väzbu na proteíny bola zlúčenina štvormocného cínu a chlóru e₆ (2 mg/ml) miešaná počas 30 minút pri teplote okolia v dimetylformamide s 10-násobným molámym nadbytkom EDC (N'-3-dimetylaminopropyl-N-etylkarbodiimid, hydrochlorid, Sigma) a NHS (N-hydroxysukcínimid, Sigma). Vzniknutá aktivovaná zmes sa potom pridala do 8-násobného objemu proteínového roztoku (1 mg/ml) a uskutočnila sa inkubácia pri teplote okolia počas 1 hodiny.

Po značení boli protilátkové konjugáty separované od neinkorporovaného fluórofóru alebo fotosenzibilizátora s použitím PD-10 kolón (Amersham Pharmacia Biotech) uvedených do rovnováhy v 50 mM fosfátu, pH 7,4, 100 mM NaCl, (PBS). Imunoreaktivita protilátkových konjugátov bola meraná spôsobom opísaným v predchádzajúcom príklade.

V pokusoch týkajúcich sa fotodeštrukcie bolo králikom podaných intravenózne 12 mg scFv(L19)_rzlúčeniny štvormocného cínu a chlóru e₆ (_0;8) alebo 38 mg ovalbumínuí - zlúčeniny štvormocného cínu a chlóru e₆ (o,36) ^a králiky boli držané v tme počas trvania pokusu. 8 hodín po injekcii boli králiky uvedené do anestézie ketamínom (35 mg/kg/ xylazínom (5 mg/kg)/ acepromazínom (1 mg/kg)) a jedno z dvoch očí bolo ožarované počas 13 minút Schott KL 1500 wolframovou halogénovou lampou vybavenou Cy5 excitačným filtrom (Chromá) a dvoma svetelnými kanálmi, ktorých konce boli umiestnené približne 1 cm od oka. Ožiarená plocha mala približne veľkosť 1 cm² a ožiarenie bolo uskutočnené dávkou 100 mW/cm*. ako bola zmeraná SL818 fotodetektorom (Newport Corp. Irvine, CA, USA). Neboli pozorované žiadne známky diskomfortu po ožiarení. Preventívne králiky dostali po ožiarení analgetiká (buprenorfín 0,03 mg/kg). Na sledovanie fotodeštrukcie boli oči vyšetrované oftalmoskopom a boli fotografované s použitím „fundus“ kamery KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausanne, Switzerland). Päť králikov bolo ošetrených konjugátom obsahujúcim zlúčeninu štvormocného cínu a chlóru c_ŕ, a ožiarených len na jedno oko, zatiaľ čo druhé oko slúžilo ako vnútorná negatívna kontrola. Ako ďalšia kontrola boli použité dva králiky, ktoré boli len ožiarené, ale nebol im podaný žiadny konjugát s fotosenzibilizátorom.

Ihneď po utratení králikov nadmernou dávkou anestetika boli bulby enukleované, rohovky boli odstránené, boli ponorené do Tissue Tek (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan) a zmrazené. Na ímunofluorescenčné vyšetrenia ex vivo a na niektoré H/E farbenia boli rohovky fixované v 4 % paraformaldehyde v PBS pred tým, než boli ponorené do Tissue Tek. Kryostatové rezy s priemerom 5 pm boli použité na ďalšiu mikroskopickú analýzu. Fluorescenčné TUNEL testy boli uskutočnené podľa návodu výrobcu (Roche Diagnostic, Rotkreutz, Switzerland).

Tabuľka 1: Sekvencie vybraných anti-ED-B protilátkových klonov

VH reťazec VL reťazec

Kloň	31-33*	50-55*	99-102*	33*	50*	92-97*
A2	SYA	AISGSC-	GLSI	Y	G	NGWYPW
G4	SYA	AISGSG	SFSF	Y	G	GGWLPY
Et	SYA	AISGSG	FPFY	Y	G	TGRIPP
H10	SFS	SIRGSS	FPFY	Y	G	TGRIPR
L19	SFS	SISGSS	PFPY	Y	Y	TFRIPP

Relevantné aminokyselinové pozície (*: číslovanie podľa Tomlinson et al., 1995, EMBO J., 14: 4628 - 4638) protilátkových klonov izolovaných z navrhnutých syntetických knižníc. Jednopísmenové aminokyselinové kódy sú použité podľa štandardného IUPAC názvoslovia.

Tabuľka 2: Afinity anti-ED-B scFv fragmentov

Kloň	kon (s'’M·')		koff (s’’)^c	W
A2	1.5 x 10’	2.8 x 10·’	-	1.9 x 10·'
G4	4.0 x 10⁴	3.5 x 10’	-	8.7 x ΙΟ·
EJ	1.6 x 10‘	6.5 x 10’	-	4.1 x 10'
H10	6.7 x 10*	5.6 x 10-*	9.9x10’’	1.5x10·*
L19	1.1 x 10’	9.6 x 10·’	6.0 x ÍO“	5.4x10

*) Kd = koff/kon. Pre vysokoafmitné ligandy Hl0 a L19 nie sú hodnoty k_cfr z BIAcore analýzy dostatočne presné z dôvodu vplyvu negatívne nabitej karboxylovanej pevnej dextránovej matrice; Kd hodnoty sú preto vypočítané z meraní K_off získaných v kompetičných pokusoch (pozri príklady), koo, kinetická disociačná konštanta; k_on, kinetická asociačná konštanta; kj, disociačná konštanta. B = meranie na BIAcore; C = meranie pomocou kompetície s elektrochemiluminiscenčnou detekciou. Hodnoty sú presné pre +/- 50 %, podľa presného stanovenia koncentrácie.

Zoznam sekvencií <110> EUDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH <120> Špecifické väzbové molekuly pre scintigrafiu, konjugáty obsahujúce tieto molekuly a spôsoby liečby angiogenézy <130> 1900PTEP <140>

<141>

<150> US 09/075338 <151> 1998-05-11 <150>US <151> 1999-04-28 <160> 21 < 170> Patentin Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: LMBlbis <400> 1 gcggcccagc cggccatggc egag <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DP47CDRlfor <400> 2 gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag getg <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DP47CDRľback atgagctggg tccgccaggc tcc 23 <210> 4 <21l>60 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DP47CDR2for <400> 4 gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc nrnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt 60 <210> 5 <211> 24 <212>DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DP47CDR2back <400> 5 acatactacg cagactccgt gaag 24 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: JforNot <400> 6 tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPKCDRlfor <400> 7 gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 47 <210>8 <211> 23 <212>DNA <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DPKCDRlback <400>8 ttagcctggt accagcagaa acc 23 <210> 9 <211> 46 <212>DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPKCDR2for <400>9 gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 4 <210>10 <211>21 <212>DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DPKCDR2back gcatccagca gggccactgg c <210>ll <211>45 <212>DNA <213>Arteficiálne sekvencie <220>

<223>Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: DP47baNco <400> 11 gcggcccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45 <210>12 <211> 55 <212>DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCRprimér: CDR3for <400> 12 ggttccctgg ccccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg <210> 13 <211 >24 <212>DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: VHpullth <400> 13 gcggcccagc atgccatggc cgag <210> 14 <211> 66 <212>DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<210> 15 <211> 62 <223> Opis arteficiálnej sekvencie. PCR primér: Jassm <400> 14 cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc cctggcccca 60 gtagtc ~ <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPK22assm <400> 15 gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt gacgcagtct 60 cc ⁶² <210>16 <211> 63 <212> DNA <213> Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: DPK3for <400> 16 caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg nuinmnnaccm nnctgctgac agtaatacac 60 ^fc9^c 63 <220>17 <2U>56 <212>DNA <213>Arteficiálne sekvencie <220>

<223> Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: Jfomot <400> 17 gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtccctťggc cgaacg 56 <210>18 <211>24 <212>DNA <213>Arteficiálne sekvencie <220>

<223>Opis arteficiálnej sekvencie: PCR primér: VLpullth <400>18 gatgggtcca gtggcggtag cggg <210>19 <211>116 <212>PRT <213> VH protilátky špecifické pre ED-B doménu fibronektínu <400>19

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

Ser

Leu

Arg Leu 20

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Sex Ser Phe

25

30

Ser

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

íle

Ser

Gly

Ser

Sér

Gly

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Pro

Phe

Pro

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

11S <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> protilátková spojovacia skupina <400> 20

Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly <210>21 <21l>108 <212> PRT <213> VL protilátky špecifické pre ED-B doménu fibroncktínu <400>21

Glu íle Val Leu Thr Gin Ser

Pro Gly Thr Leu 10

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

1

5

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

20

25

30

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

35

40

45

íle

Tyr

Ala

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

SO

55

60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

Thr

Gly

Arg

íle

Pro

85

90

95

Pro

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

íle

Lys

100 105

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná protilátka so špecifickou afinitou pre charakteristický epitop domény fibronektínu Extra Domain-B (ED-B), kde uvedená protilátka má afinitu k uvedenému ED-B epitopu v subnanomolámych koncentráciách.
2. Protilátka podľa nároku 1, kde uvedená protilátka rozpoznáva ED-B(+) fibronektín.
3. Protilátka podľa nároku 1, kde uvedená protilátka je v scFv formáte.
4. Protilátka podľa nároku 3, kde uvedenou protilátkou je rekombinantná protilátka.
5. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde uvedenou protilátkou je celá protilátka.
6. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde uvedená protilátka sa viaže na ED-B doménu fibronektínu s K_d 54 pM.
7. Protilátka podľa nároku 1, majúca nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:

evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS GOGSSGGSGGASTG

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYOQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRF8GSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK
8. Protilátka podľa nároku 1, kde uvedená protilátka je funkčne ekvivalentný variant L19, pričom L19 má aminokyselinové sekvencie SEQ ID NO: 19, SEQID NO:20 a SEQID NO:21.
9. Protilátka podľa nároku 8, kde uvedená protilátka je rádioaktívne značená.
10. Protilátka podľa nároku 9, kde uvedená protilátka je značená rádioaktívnym jódom.
11. Protilátka podľa nároku 1, kde uvedená protilátka zahrnuje VH doménu zo SEQ ID NO: 19.
12. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 na použitie pri rýchlom cielenom zameraní markerov angiogenézy.
13. Protilátka podľa nároku 12 na použitie na imunoscintigrafickú detekciu angiogenézy.
14. Protilátka podľa nároku 13 na použitie na detekciu ochorení charakterizovaných vaskulámou proliferáciou, ako je diabetická retinopatia, starecká makuláma degenerácia alebo nádory.
15. Diagnostický kit obsahujúci protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 a jedno alebo viac činidiel potrebných na detekciu angiogenézy.
16. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 na použitie pri diagnostike alebo terapii nádorov alebo ochorení charakterizovaných vaskulámou proliferáciou.
17. Konjugáty, vyznačujúce sa tým, že obsahujú protilátku podľa nároku 1 a molekulu schopnú indukovať koaguláciu krvi a uzatvorenie krvnej cievy.
18. Konjugáty podľa nároku 17, vyznačujúce sa tým, že molekulou schopnou indukovať koaguláciu krvi a uzatvorenie krvnej cievy je fotoaktívna molekula.
19. Konjugáty podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že fotoaktívnou molekulou je fotosenzibilizačné činidlo.
20. Konjugáty podľa nároku 19, vyznačujúce sa tým, že fotosenzibilizačné činidlo absorbuje svetlo vlnovej dĺžky väčšej než 600 nm.
21. Konjugáty podľa nároku 20, vyznačujúce sa tým, že fotosenzibilizačné činidlo je derivát zlúčeniny štvormocného cínu s chlórom e₆.
22. Použitie konjugátu podľa nároku 17 na prípravu injekčného prostriedku na liečbu patologických stavov súvisiacich s angiogenézou.
23. Použitie podľa nároku 22, v ktorom je patologický stav súvisiaci s angiogenézou spôsobený alebo spojený s očnou angiogenézou.