ES2247802T3 - Anticuerpos para el dominio eb-d de fibronectina conjugados que los contienen y utilizacion de los mismos para el diagnostico y terapia de tumores y enfermedades asociadas con la angiogenesis. - Google Patents

Anticuerpos para el dominio eb-d de fibronectina conjugados que los contienen y utilizacion de los mismos para el diagnostico y terapia de tumores y enfermedades asociadas con la angiogenesis.

Info

Publication number
ES2247802T3
ES2247802T3 ES99923571T ES99923571T ES2247802T3 ES 2247802 T3 ES2247802 T3 ES 2247802T3 ES 99923571 T ES99923571 T ES 99923571T ES 99923571 T ES99923571 T ES 99923571T ES 2247802 T3 ES2247802 T3 ES 2247802T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
antibody
angiogenesis
domain
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES99923571T
Other languages
English (en)
Inventor
Dario Neri
Lorenzo Tarli
Francesca Viti
Manfred Birchler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Original Assignee
Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/300,425 external-priority patent/US20030045681A1/en
Application filed by Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ filed Critical Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Application granted granted Critical
Publication of ES2247802T3 publication Critical patent/ES2247802T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Anticuerpo aislado con afinidad específica por un epítopo característico del Dominio Extra B (ED-B) de lafibronectina, en donde el anticuerpo tiene una afinidad por dicho epítopo del ED-B en el rango subnanomolar y reconoce el ED-B(+) de la fibronectina.

Description

Anticuerpos para el dominio EB-D de fibronectina conjugados que los contienen y utilización de los mismos para el diagnóstico y terapia de tumores y enfermedades asociadas con la angiogénesis.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos con afinidad específica sub-nanomolar por un epítopo característico del dominio ED-B de la fibronectina, una marcado de la angiogénesis. Se refiere también al uso de anticuerpos anti-ED-B de elevada afinidad y marcados radiactivamente para detectar in vivo vasos sanguíneos de nueva formación, y a un equipo de diagnóstico que comprende dicho anticuerpo.
Además, la invención se refiere a conjugados que comprenden los anticuerpos antes mencionados y una molécula fotoactiva apropiada (por ejemplo, un fotosensibilizador) y a su uso en la detección y/o coagulación de nuevos vasos sanguíneos.
Antecedentes de la invención
Los tumores no pueden crecer más allá de una cierta masa sin la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), y se ha descrito una correlación entre la densidad de microvasos y la invasividad del tumor para un cierto número de de tumores (Folkman, Nature Med., 1:27-31 (1995)). Más aún, la angiogénesis subyace a la mayoría de los trastornos oculares que resultan en la pérdida de la visión (Lee et al., Surv. Ophthalmol., 43:245-269 (1998); Friedlander, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:9764-9769 (1996)). Las moléculas capaces de dirigir selectivamente los marcadores de la angiogénesis crearían oportunidades clínicas para la diagnosis y terapia de tumores y otras enfermedades caracterizadas por la proliferación vascular, tales como la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Los marcadores de la angiogénesis se expresan en la mayoría de los tumores sólidos agresivos, y deberían ser fácilmente accesibles a unidores específicos inyectados intravenosamente (Pasqualini et al., Nature Biotechnol., 15:542-546 (1997); Neri et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1275 (1997)). La oclusión dirigida de la neovasculatura podría resultar en el infarto y colapso del tumor (O'Reilly et al., Nature Med., 2:689-692 (1996); Huang et al., Science, 275:547-550 (1997)).
El dominio ED-B de la fibronectina, una secuencia de 91 aminoácidos idénticos en el ratón, la rata y los humanos, el cual se inserta mediante ayuste alternativo en la molécula de fibronectina, se acumula específicamente alrededor de las estructuras neo-vasculares (Castellani et al., Int. J. Cancer, 59:612-618 (1994)) y podría representar una diana para la intervención molecular. Es más, hemos mostrado recientemente con técnicas fluorescentes que los fragmentos de anticuerpo Fv de cadena simple (scFv) anti-ED-B se acumulan selectivamente en los vasos sanguíneos tumorales de ratones portadores de tumores, y que la afinidad del anticuerpo parece dictar las prestaciones del apuntamiento (Neri et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1275 (1997); Solicitud de Patente Internacional nº PCT/GB97/01412, basada en la GB96/
10967.3). El apuntamiento al tumor se evaluó 24 horas después de la inyección, o a intervalos de tiempo posteriores.
Se conocen varios intentos en el campo para generar anticuerpos contra el dominio ED-B con objeto de usarlos para apuntar a los tumores.
Peters et al. (Cell Adhesion and Communication, 3:67-89 (1995)) descubren anticuerpos policlonales generados contra antígenos que no contienen secuencia FN alguna distinta del dominio ED-B intacto, y muestran que se unen específica y directamente a este dominio.
Sin embargo, los reactivos de Peters et al. presentan una serie de inconvenientes: el antisuero de Peters et al. reconoce el ED-B(+)-FN sólo después de su tratamiento con N-glicanasa. Esto hace tales reactivos inapropiados para aplicaciones tales como el apuntamiento a, visualización y terapia de tumores, puesto que la desglicosilación no puede realizarse in vivo.
Los propios autores admiten que sus anticuerpos no reconocen el ED-B(+)-FN de longitud completa producido por las células de mamífero. También admiten que había sido imposible producir anticuerpos monoclonales específicos para el dominio ED-B de la fibronectina, aún cuando se habían producido anticuerpos contra otros dominios de la fibronectina (tales como el ED-A). Es bien conocido en la técnica que los antisueros policlonales no son aceptables para las aplicaciones mencionadas más arriba.
Incluso después de años de intensa investigación en este campo, sólo se pudieron producir anticuerpos monoclonales que reconocen el dominio ED-B de la fibronectina, sin tratamiento con N-glicanasa, usando técnicas de exhibición en fagos, tal como se aplicaron en la presente invención.
Zang et al. (Matrix Biology, 14:623-633 (1994)) descubren un antisuero policlonal generado contra el dominio ED-B canino. Los autores esperan una reactividad cruzada con el ED-B(+)-FN humanos, aunque ésta no se ensayó. Sin embargo, los autores admiten la dificultad para producir anticuerpos monoclonales que reconozcan directamente el dominio ED-B de la fibronectina (página 631). El antisuero reconoce el ED-B(+)-FN en una transferencia Western sólo después de su tratamiento con N-glicanasa. Tal como se ha mencionado más arriba, el tratamiento con la glicanasa hace que estos reactivos no sean apropiados para aplicaciones de acuerdo con la presente invención.
El reconocimiento del ED-B(+)-FN en ELISA se desarrolla sin necesidad de desglicosilación, pero sólo sobre cartílago extraído con un agente desnaturalizante (urea 4 M) y capturado sobre plástico usando gelatina. Los autores comentan que "la unión de la molécula de la FN a la gelatina unida sobre la superficie de plástico de la placa de ELISA podría de algún modo exponer suficientemente los epítopos para su reconocimiento por el antisuero". Puesto que en las aplicaciones in vivo la FN no puede desnaturalizarse y unirse a gelatina, los unidores monoclonales de la presente invención ofrecen ventajas evidentes.
Neri & Zardi (Advanced Drug Delivery Reviews, 31:43-52 (1998)) discuten el apuntamiento a tumor usando componentes de la matriz extracelular del estroma del tumor, tales como la fibronectina y la tenascina, y la posibilidad de usar anticuerpos recombinantes humanos en el apuntamiento a tumores.
Las patentes japonesas JP02076598 y JP04169195 se refieren a anticuerpos anti-ED-B. A partir de estos documentos, no está claro si se describen anticuerpos monoclonales anti-ED-B. Además, parece imposible que un único anticuerpo (tal como el anticuerpo descrito en la JP02076598) tenga "un determinante de antígeno" en la secuencia de aminoácidos con las fórmulas (1), (2) o (3):
- (1) EGIPIFEDFVDSSVGY
- (2) YTVTGLEPGIDYDIS
- (3) NGGESAPTTLTQQT
en base a la siguiente evidencia:
i)
un anticuerpo monoclonal debería reconocer un epítopo bien definido.
ii)
La estructura tridimensional del dominio ED-B de la fibronectina se ha determinado mediante espectroscopia de RMN. Los segmentos (1), (2) y (3) se hallan en caras opuestas de la estructura del ED-B, y no pueden ser unidos simultáneamente por un anticuerpo monoclonal.
Además, para probar la utilidad, debería demostrarse la localización mediante anticuerpos en tumores, así como la evidencia de tinción de estructuras del ED-B(+)-FN en muestras biológicas sin agentes alteradores de la estructura.
El anticuerpo BC1 descrito por Carnemolla et al., J. Biol. Chem., 267:24689-24692 (1992), reconoce un epítopo sobre el dominio 7 de la FN, pero no sobre el dominio EB-D, el cual es críptico en presencia del dominio ED-B de la fibronectina. Es estrictamente específico de humanos. Por tanto, el anticuerpo BC1 y los anticuerpos de la presente invención muestran una reactividad diferente. Más aún, el anticuerpo BC1 reconoce el dominio 7 solo, y el dominio 7-8 de la fibronectina en ausencia del dominio ED-B (Carnemolla et al., J. Biol. Chem., 267:24689-24692 (1992)). Tales epítopos podrían producirse in vivo mediante la degradación proteolítica de moléculas de FN. La ventaja de los reactivos de acuerdo con la presente invención es que pueden localizarse sobre moléculas o fragmentos de la FN sólo si contienen el dominio ED-B.
Para el diagnóstico del cáncer, y más específicamente para visualizar lesiones tumorales primarias y secundarias, la inmunocentelleografía es una de las técnicas de elección.
En esta metodología, los pacientes se visualizan con un dispositivo apropiado (por ejemplo, una gamma-cámara), después se haberles inyectado un compuesto marcado radiactivamente (por ejemplo, un radionúcleo unido a un vehículo apropiado). Para las aplicaciones centelleográficas se usan típicamente emisores de gamma de vida corta, tales como el tecnecio-99m, el yodo-123 o el indio-111, con objeto de minimizar la exposición de los pacientes a las radiaciones ionizantes.
El radionúcleo más frecuentemente en los Departamentos de Medicina Nuclear es el tecnecio-99m (99mTc), un emisor de gamma con una vida media de seis horas. Los pacientes inyectados con radiofármacos basados en el 99mTc pueden visualizarse típicamente hasta 12-24 horas después de las inyecciones; sin embargo, es deseable la acumulación del núcleo en las lesiones de interés en los instantes iniciales.
Más aún, si hubiera disponibles anticuerpos capaces de una localización rápida y selectiva sobre vasos sanguíneos de nueva formación, los investigadores tendrían un estímulo para buscar moléculas apropiadas para conjugar a los anticuerpos, con objeto de conseguir un beneficio diagnóstico y/o terapéutico.
Resumen de la invención
Considerando la necesidad de la medicina nuclear de radiofármacos capaces de localizar las lesiones tumorales pocas horas después de la inyección, y la información de que la afinidad del anticuerpo parece influir sus prestaciones para apuntar hacia la angiogénesis, es un objeto de la presente invención producir anticuerpos específicos para el dominio ED-B de la fibronectina con constante de disociación subnanomolar (para una revisión de las definiciones y mediciones de la afinidad anticuerpo-antígeno, consultar Neri et al., Trends in Biotechnol., 14, 465-470 (1996)). Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar anticuerpos marcados radiactivamente en un formato apropiado, dirigidos contra el dominio ED-B de la fibronectina, que ya detectan lesiones tumorales pocas horas después de la inyección.
En una aspecto de la invención, estos objetos se consiguen mediante un anticuerpo con afinidad específica por un epítopo característico del dominio ED-B de la fibronectina, y con una afinidad mejorada por dicho epítopo del ED-B.
En un aspecto adicional de la presente invención, el anticuerpo descrito más arriba se usa para marcadores de la angiogénesis de apuntamiento rápido.
Otro aspecto de la presente invención es un equipo de diagnóstico que comprende dicho anticuerpo y uno o más reactivos para detectar la angiogénesis.
Aún un aspecto adicional de la presente invención es el uso de dicho anticuerpo para la diagnosis y terapia de tumores y enfermedades que se caracterizan por la proliferación vascular.
Finalmente, un aspecto importante de la invención está representado por conjugados que comprenden dichos anticuerpos y una molécula fotoactiva apropiada (por ejemplo, un fotosensibilizador escogido juiciosamente), y su uso para la oclusión selectiva y mediada por la luz de vasos sanguíneos nuevos.
Terminología
A lo largo de la solicitud, se usan varias expresiones técnicas a las cuales se aplican las siguientes definiciones.
Anticuerpos
Este término describe una inmunoglobulina, sea producida de forma natural o parcial o totalmente sintética. El término también abarca cualquier polipéptido o proteína que tienen un dominio unidor el cual es, o es homólogo a, un dominio unidor de anticuerpo. Estos pueden derivarse de fuentes naturales, o pueden producirse de forma parcial o totalmente sintética. Los ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulinas y sus subclases isotípicas; los fragmentos que comprenden un dominio unidor de antígeno tal como los Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y los diacuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros, y usar técnicas de la tecnología del ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas podrían implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de un anticuerpo en las regiones estructurales, o regiones constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, las EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400. Un hibridoma, u otra célula que produjera un anticuerpo, podría someterse a mutación genética u otros cambios, los cuales podrían o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos. Puesto que los anticuerpos pueden modificarse en un cierto número de formas, el término "anticuerpo" debería considerarse que abarca cualquier miembro de unión específica o sustancia que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. Por tanto, este término abarca fragmentos de anticuerpos, y derivados, equivalentes funcionales, y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio unidor de inmunoglobulina, sea natural o total o parcialmente sintético. Por tanto, se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un dominio unidor de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en la EP-A-0120694 y en la EP-A-0125023. Se ha mostrado que los fragmentos de anticuerpos enteros pueden realizar la función de unir antígenos. Los ejemplos de fragmentos unidores son (I) el fragmento Fab consistente en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd consistente en dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)) que consisten en un dominio VH; (v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) las moléculas Fv de cadena simple, en donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un eslabón polipeptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio unidor de antígeno (Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)); (viii) los dímeros de Fv de cadena simple biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) los "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante la fusión de genes (WO94/13804; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)). Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, comprendiendo cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina, y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando unidos los dos dominios (por ejemplo, mediante un eslabón peptídico) pero siendo incapaces de asociarse entre ellos para formar un sitio de unión de antígeno: los sitios de unión de antígeno se forman mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (WO94/13804). Cuando van a usarse anticuerpos biespecíficos, estos podrían ser anticuerpos biespecíficos convencionales, los cuales pueden fabricarse a partir de una variedad de formas, Holliger y Winter, Curr. Opin. Biotech., 4:446-449 (1993)), por ejemplo, prepararse químicamente o partir de hibridomas híbridos, o podrían ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mencionados más arriba. Podría ser preferible usar dímeros de scFv o diacuerpos en vez de anticuerpos enteros. Los diacuerpos y los scFv pueden construirse sin una región Fc, usando sólo dominios variable, reduciéndose potencialmente los efectos de la reacción anti-idiotípica. Otras formas de anticuerpos biespecíficos incluyen los CRAb de cadena simple descritos por Neri et al., J. Mol. Biol., 246:367-373 ((1995)).
Regiones determinantes de la complementariedad
Tradicionalmente, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los dominios variables de anticuerpo se han identificado como aquellas secuencias de anticuerpo hipervariables, que contienen residuos esenciales para el reconocimiento específico del antígeno. En este documento, nos referimos a la definición y numeración de las CDR de Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987).
Forma variante funcionalmente equivalente
Ésta se refiere a una molécula (la variante) que, aunque tiene diferencias estructurales con otra molécula (la progenitora) retiene cierta homología significativa, y también, al menos parte de la función biológica de la molécula progenitora, por ejemplo, la capacidad para unir un antígeno o epítopo determinado. Las variantes podrían estar en forma de fragmentos, derivados o mutantes. Una variante, derivado o mutante podría obtenerse mediante la modificación de la molécula progenitora, mediante la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos, o mediante la unión de otra molécula. Estos cambios podrían efectuarse a nivel de nucleótidos o de la proteína. Por ejemplo, el polipéptido codificado podría ser un fragmento Fab, el cual se une a continuación con una cola de Fc procedente de otra fuente. Alternativamente, podría unirse un marcador tal como un enzima, fluoresceína, etc. Por ejemplo, una forma variante funcionalmente equivalente de un anticuerpo "A" contra un epítopo característico del dominio ED-B de la fibronectina podría ser un anticuerpo "B" con una secuencia diferente de las regiones determinantes de la complementariedad, pero que reconoce el mismo epítopo que el anticuerpo "A".
Hemos aislado anticuerpos recombinantes en un formato scFv, a partir de una biblioteca de exhibición sobre fagos de anticuerpos, específicos para el dominio ED-B de la fibronectina, y que reconocen el ED-B(+)-fibronectina en secciones de tejidos. Unos de estos anticuerpos, el E1, se ha madurado según su afinidad para producir los anticuerpos H10 y L19, con una afinidad mejorada. El anticuerpo L19 tiene una constante de disociación para el dominio ED-B de la fibronectina en el rango de concentración nanomolar.
Los anticuerpos de elevada afinidad L19 y D1.3 (un anticuerpo específico para un antígeno irrelevante, el lisozima de huevo de gallina) se marcaron radiactivamente y se inyectaron en ratones portadores de tumor. A diferentes intervalos se obtuvieron las biodistribuciones del tumor, sangre y órganos, y se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g). Ya a las 3 horas después de la inyección, el %ID/g (tumor) era mejor que el %ID/g (sangre) para el L19, pero no para el control negativo D1.3. Las proporciones tumor:sangre incrementaron a intervalos mayores. Esto sugiere que el anticuerpo de elevada afinidad L19 podría ser un agente útil para apuntar a tumores, por ejemplo, para la detección inmunocentelleográfica de la angiogénesis.
Fotosensibilizador
Un fotosensibilizador podría definirse como una molécula que, a partir de su irradiación en presencia de agua y/o oxígeno, generará especies moleculares tóxicas (por ejemplo, oxígeno monoatómico) capaces de reaccionar con las biomoléculas, causando potencialmente de ese modo lesiones en las dianas biológicas, tales como células, tejidos y fluidos biológicos. Los fotosensibilizadores son particularmente útiles cuando absorben longitudes de onda por encima de los 600 nm. De hecho, la penetración en los tejidos y fluidos corporales se máxima en el rango de 600-900 nm (Wan et al., Photochem. Photobiol. 34:679-681 (1981)).
El suministro dirigido de fotosensibilizadores seguido por la irradiación es un vía atractiva para la terapia de las enfermedades relacionadas con la angiogénesis (Yarmush, M.L. et al., "Antibody targeted photolysis." Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 10:197-252 (1993); Rowe, P.M., Lancet 351:1496 (1998); Levy, J., Trends Biotechnol. 13:14-18 (1995)), particularmente para la ablación selectiva de la neovasculatura ocular. Las modalidades terapéuticas disponibles, tale como la fotocoagulación, bien directamente o después de la administración de agentes fotosensibilizadores, están limitadas por la ausencia de selectividad, y típicamente resultan en la lesión de tejidos y vasos sanos (Macular Photocoagulation Study Group, Arch. Ophthalm. 112:480-488 (1994); Haimovici, R. et al., Curr. Eye Res. 16:83-90 (1997); Schmidt-Erfurth, U. et al.; Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 236:365-374 (1998)).
En base a los argumentos presentados más arriba, puede verse que sería extremadamente importante descubrir formas para mejorar la selectividad y especificidad de los fotosensibilizadores, por ejemplo, conjugándolos con una molécula portadora apropiada. Es probable que el desarrollo de moléculas portadoras de buena calidad no sea una tarea trivial. Más aún, es probable que no todos los fotosensibilizadores se dejen "vehicular" in vivo al sitio de interés. Los factores tales como la estructura química, la solubilidad, la lipofilicidad, la pegajosidad y la potencia del fotosensibilizador es probable que influyan de forma crucial en la "apuntabilidad" y eficacia de los conjugados de fotosensibilizadores.
En ésta mostramos que el anticuerpo de elevada afinidad L19, específico para el dominio ED-B de la fibronectina, se localiza selectivamente en vasos sanguíneos de nueva formación, en un modelo en conejo de angiogénesis ocular, a partir de su administración sistémica. El anticuerpo L19, acoplado químicamente al agente fotosensibilizador estaño (IV) clorina e_{6}, e irradiado con luz roja, medió la oclusión selectiva de la neovasculatura ocular y promovió la apoptosis de las correspondientes células endoteliales. Estos resultados demuestran que los vasos sanguíneos nuevos pueden distinguirse in vivo inmunoquímicamente de los preexistentes, y sugiere con fuerza que el suministro apuntado de fotosensibilizadores seguido por irradiación podría ser efectivo para tratar las enfermedades que ciegan el ojo, y posiblemente otras patologías asociadas con la angiogénesis.
Breve descripción de las figuras
Las realizaciones de la presente invención se ilustran mediante las figuras siguientes, en donde
la Figura 1 muestra una biblioteca en fagos de anticuerpo diseñado;
la Figura 2 muestra geles 2D y la transferencia Western de un lisado de células COLO-38 de melanoma humano;
la Figura 3 muestra experimentos de inmunohistoquímica de glioblastoma multiforme.
La Figura 4 muestra un análisis de la estabilidad de los complejos anticuerpo-(ED-B).
La Figura 5 muestra la biodistribución de ratones portadores del tumor con fragmentos de anticuerpo marcado radiactivamente.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos del L19;
Las Figura 7A y 7B muestran ojos de conejo con precipitados implantados;
la Figura 8 muestra la inmunohistoquímica de secciones de córnea de conejos.
La Figura 9 muestra la inmunohistoquímica de secciones de estructuras oculares de conejos (córnea, iris y conjuntiva) usando un sustrato rojo de fosfatasa alcalina y hematoxilina.
La Figura 10 muestra la localización de los anticuerpos marcados fluorescentemente en la neovasculatura ocular.
La Figura 11 muestra el aspecto macroscópico de los ojos de conejos inyectados con proteínas acopladas a fotosensibilizadores, antes y después de la irradiación.
La Figura 12 muestra el análisis microscópico de secciones de estructuras oculares de conejos inyectados con proteínas acopladas a fotosensibilizadores e irradiadas con luz roja.
Descripción detallada de las figuras
La Figura 1 muestra: Biblioteca en fagos de anticuerpos diseñados. (a) Los fragmentos de anticuerpo se exhiben sobre fagos como fusión con pIII, tal como se ilustra esquemáticamente. En el sitio de unión del anticuerpo (punto de vista del antígeno), el esqueleto de los CDR de Vk está en amarillo, el esqueleto de los CDR de la VH está en azul. Los residuos sometidos a mutación aleatoria son las posiciones 91, 93, 94 y 96 del CDR3 de Vk (amarillo), y las posiciones 95, 96, 97 y 98 del CDR3 de VH (azul). Los átomos Cb de estas cadenas laterales se muestran en colores más oscuros. También se muestran (en gris) los residuos del CDR1 y CDR2, los cuales pueden mutarse para mejorar la afinidad del anticuerpo. Usando el programa RasMol (http://www.chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html) se modeló la estructura del scFv a partir del fichero PBD 1igm (Brookhaven Protein Data Bank; (http://www2.ebi.ac.uk./pcserv/
pdbdb.htm). (b) Estrategia de amplificación y clonación de la biblioteca mediante PCR. Se modificaron las plantillas DP47 and DPK22 de líneas germinales (ver el texto) para generar mutaciones en las regiones CDR3. Los genes se indican como rectángulos, y las CDR como cajas numeradas dentro del rectángulo. Los segmentos de VH y VL se ensamblaron y clonaron a continuación en el vector fagómido pDN332. Los cebadores usados en la amplificación y ensamblado se listan en la parte inferior.
La Figura 2 muestra: Geles 2D y transferencia Western. (a) Tinción con plata del 2D-PAGE de un lisado de células COLO-38 de melanoma humano, a las cuales se les había añadido el 7B89 conteniendo el ED-B recombinante. Las dos manchas de 7B89 (círculos) se deben a la proteolisis parcial de la marca His usada en la purificación de la proteína. (b) Inmunotransferencia de un gel, idéntico al de la Figura 2a, usando los anticuerpos E1 anti-ED-B (Tabla 1) y M2 anti-FLAG como reactivos de detección. Sólo se detectaron las manchas del 7B89, confirmando la especificidad del anticuerpo recombinante aislado a partir de una mancha en el gel.
La Figura 3 muestra: Experimentos inmunohistoquímicos, con secciones en serie de un glioblastoma multiforme, que muestran las típicas estructuras vasculares parecidas a glomérulos teñidas usando los scFv E1 (A), A2 (B) y G4 (C). Barra de escala: 20 \mum.
La Figura 4 muestra: Estabilidad de los complejos anticuerpo-(ED-B). Análisis de la unión de los scFv E1, H10 y L19 al dominio ED-B de la fibronectina. (a) Sensogramas de Biacore que muestran los perfiles de disociación mejorados obtenidos a partir de la maduración por afinidad del anticuerpo. (b) Análisis electroforético en gel nativo de los complejos de scFv-(ED-B). Sólo el anticuerpo de elevada afinidad L19 puede formar un complejo estable con el antígeno marcado fluorescentemente. La detección de la fluorescencia se realizó como se ha descrito (Neri et al., BioTechniques, 20:708-712 (1996)). (c) Competición del complejo scFv-(ED-B-biotina) con un exceso molar de 100 veces de ED-B sin biotinilar, monitorizado mediante electro-quimioluminiscencia usando un aparato Origen. Puede observarse una vida larga para el complejo L19-(ED-B). Cuadrados negros: L19; triángulos vacíos: H10.
La Figura 5 muestra: Biodistribución de los ratones portadores de tumores inyectados con fragmentos de anticuerpo marcados radiactivamente. Las biodistribuciones en los tumores y sangre, expresadas como porcentaje de la dosis inyectada por gramo, se representan respecto el tiempo. También se informa de las biodistribuciones en órganos importantes.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos del anticuerpo L19, comprendiendo la cadena pesada (VH), el eslabón, y la cadena ligera (VL).
La Figura 7 muestra ojos de conejos con precipitados de polímero implantados empapados con sustancias angiogénicas.
La Figura 8 muestra la inmunohistoquímica de secciones de córnea de conejos con vasos sanguíneos de nueva formación, teñidos con el anticuerpo L19.
La Figura 9 muestra estudios inmunohistoquímicos de estructuras oculares usando el anticuerpo L19. Se observa una tinción en rojo específica alrededor de las estructuras neovasculares en la córnea (a), pero no alrededor de los vasos sanguíneos en el iris (b) y en la conjuntiva (c). Flechas pequeñas: epitelio corneal. Los vasos sanguíneos relevantes se indican con flechas grandes. Barras de escala: 50 \mum.
La Figura 10 muestra la inmunofotodetección de anticuerpos marcados fluorescentemente que apuntan a la angiogénesis ocular. Se observa una fuerte neovascularización fluorescente (indicada por una flecha) en los conejos inyectados con el conjugado anticuerpo L19-Cy5 (a), específico para el dominio ED-B de FN, pero no con el anticuerpo HyHEL-10-Cy5 (b). La microscopia de inmunofluorescencia de secciones de córnea confirmó que el L19-Cy5 (c), pero no el HyHEL-10-Cy5 (d) se localizan alrededor de estructuras neovasculares en la córnea. La imágenes (a,b) se adquirieron 8 horas después de la inyección del anticuerpo; (c, d) se obtuvieron usando secciones de córnea aisladas a partir de conejos 24 horas después de la inyección del anticuerpo. P, precipitado.
La Figura 11 muestra imágenes macroscópicas de ojos de conejos tratados con conjugados de fotosensibilizador. Ojo de conejo infectado con L19-PS antes (a) y 16 horas después de la irradiación con luz roja (b). La flecha indica la coagulación de la neovasculatura, la cual se confirma como un área hipofluorescente en el fluoroangiograma con Cy5 del panel (c) 16 horas después de la irradiación. Hay que destacar que no se observa coagulación en otras estructuras vasculares, por ejemplo, en los vasos conjuntivos dilatados. Por comparación, en (d) y (h) se muestran un fluoroangiograma con Cy5 con hiperfluorescencia de vasos resquebrajados, y la correspondiente fotografía en color, de ojos de conejos no tratados. Las imágenes (e, f, g) son análogas a (a, b, c), pero corresponden a una conejo inyectado con ovoalbúmina-PS e irradiado con luz roja. No puede observarse coagulación, y el angiograma revela hiperfluorescencia de vasos resquebrajados. Los ojos de los conejos con angiogénesis en estado primario e inyectado con L19-PS se muestran en (i-l). Las imágenes antes (i) y 16 horas después de la irradiación con luz roja (j) revelan una coagulación intravascular extensa y selectiva inducida por la luz (flecha). La oclusión de vasos (flecha) es particularmente evidente en el ojo irradiado (l) de un conejo inmediatamente después de la eutanasia, pero no puede detectarse en el ojo no irradiado (k) del mismo conejo. P, precipitado. Las puntas de flecha indican la unión corneoescleral (limbus). En todas las figuras, son visibles los vasos preexistentes dilatados de la conjuntiva por encima del limbus, mientras que el crecimiento de la neovascularización corneal puede observarse desde el limbus hacia el precipitado (P).
La Figura 12 muestra el análisis microscópico de la oclusión selectiva de vasos sanguíneos. Secciones con H/E de córneas (a,e,b,f: sin fijar; i,j: fijadas con paraformaldehído) de conejos inyectados con ovoalbúmina-PS (a, e, i) o L19-PS (b, f, j) e irradiados. Las flechas grandes indican vasos sanguíneos representativos no dañados (e, i) o completamente ocluidos (f, j). En contraste con la oclusión selectiva de la neovasculatura corneal y la lesión perivascular restringida (eosinofilia) mediada por el L19-PS después de la irradiación (b, f, j), los vasos en la conjuntiva (k) e iris (l) no muestran señales de lesión en el mismo conejo. El ensayo fluorescente TUNEL indica el diferente número de células apoptóticas en secciones de conejos irradiados inyectados con L19-PS (c, g) o con ovoalbúmina-PS (d, h). Las flechas grandes indican algunas estructuras vasculares relevantes. Las flechas pequeñas indican el epitelio corneal. Barras de escala: 100 \mum (a-d) y 25 \mum (e-l).
La invención se describe más precisamente mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplo 1 Aislamiento de fragmentos scFv de anticuerpo, específicos para el dominio ED-B de la fibronectina, procedentes de una biblioteca de exhibición sobre fagos
Se clonó una biblioteca de anticuerpos humano usando los genes de la línea germinal de VH (DP47; Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992)) y Vk (DPK22; Cox et al., Eur. J. Immunol., 24:827-836 (1994)) (ver Figura 1 para la estrategia de clonación y amplificación). El componente VH de la biblioteca se creó usando cebadores parcialmente degenerados (Figura 1) (desde la SEC. Nº ID.: 11 hasta la SEC. Nº ID.: 18) en un procedimiento basado en la PCR para introducir mutaciones aleatorias en las posiciones 95-98 en el CDR3. El componente VL de la biblioteca se generó de la misma manera, mediante la introducción de mutaciones aleatorias en las posiciones 91, 93, 94 y 96 del CDR3. Las reacciones de la PCR se realizaron tal como se ha descrito (Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). Los fragmentos scFv de VH-VL se construyeron mediante ensamblado por PCR (Figura 1; Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)), a partir de segmentos de VH y VL purificados en gel. Se digirieron doblemente 30 \mug de fragmentos scFv de VH-VL purificado con 300 unidades de cada uno de NcoI y NotI. A continuación se ligaron en 15 \mug de vector fagómido pDN332 digerido con NotI/NcoI. El pDN332 es un derivado del fagómido pHEN1 (Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19:4133-4137 (1991)), en el que la secuencia entre el sitio NotI y el codón ámbar que precede al gen III ha sido remplazada con la secuencia siguiente, que codifica la marca D3SD3-FLAG-His6 (Neri et al., Nature Biotechnology, 14:485-490 (1996)):
21
Las transformaciones en la cepa TG1 de E. coli se realizaron de acuerdo con Marks et al. (J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)) y los fagos se prepararon de acuerdo con protocolos estándares (Nissim et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). Se seleccionaron cinco clones aleatoriamente y se secuenciaron para comprobar la ausencia de contaminación contaminándolo todo.
Los fragmentos recombinantes ED-B y 7B89 de la fibronectina, que contenían respectivamente una y cuatro repeticiones de la homología del tipo III, se expresaron a partir de vectores de expresiones pQE12-based (Qiagen, Chatsworth, Californi, EE.UU.) tal como se ha descrito (Carnemolla et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996)).
Las selecciones respecto el dominio ED-B recombinante de la fibronectina (Carnemolla et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996); Zardi et al., EMBO J., 6:2337-2342) se realizaron a una concentración 10 nM usando el antígeno biotinilado con éster de biotina disulfuro N-hidroxisuccinimida (reactivo B-4531; Sigma, Buchs, Suiza; 10) y se eluyeron a partir de un gel 2D, y se capturaron con Dynabead recubiertas con estreptoavidina (Dynal, Oslo, Noruega). Se usaron 1013 fagos en cada ronda de criba, en una reacción de 1 ml. Los fagos se incubaron con antígeno en 2% de leche/PBS (MPBS) durante 10 minutos. A esta solución, se le añadió 1,0 \mul de Dynabead (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Noruega), bloqueadas previamente con MPBS. Después de 5 minutos de mezclado, se separaron las cuentas magnéticamente de la solución y se lavaron siete veces con PBS-0,1% de Tween-20 (PBST) y tres veces con PBS. La elución se llevó a cabo mediante incubación durante 2 minutos con 5,0 \mul de ditiotreitol (DTT) 50 mM, para reducir el enlace disulfuro entre el antígeno y la biotina. Se capturaron de nuevo las cuentas, y la solución resultante se usó para infectar célula TG1 de E. coli creciendo exponencialmente. Después de tres rondas de cribado, el fago eluido se usó para infectar células HB2151 de E. coli creciendo exponencialmente, y se sembraron en placas de agar al 1,5% (2 \times TY + 1% de glucosa + 1,0 \mug/ml de ampicilina). Se cultivaron colonias individuales en 2 \times TY + 0,1% de glucosa + 1,0 \mug/ml de ampicilina, y se indujeron durante la noche a 30ºC con IPTG 1 mM hasta conseguir la expresión del anticuerpo. Los sobrenadantes resultantes se examinaron mediante ELISA usando placas de microvaloración recubiertas con estreptoavidina y tratadas con ED-B biotinilado 10 mM, y anticuerpo anti-FLAG M2 (IBI Kodak, New Haven, Conn.) como reactivo de detección. El 32% de los clones examinados eran positivos en este ensayo, y los tres que dieron la señal de ELISA más intensa (E1, A2 y G4) se secuenciaron y caracterizaron adicionalmente.
Los ensayos de ELISA se realizaron usando ED-B biotinilado recuperado de una mancha en el gel, ED-B biotinilado que no se había desnaturalizado, EB-D unido a dominios de la fibronectina adyacentes (proteína recombinante que contiene los dominios 7B89), y un cierto número de antígenos irrelevantes. Los anticuerpos E1, A2 y G4 reaccionaron intensa y específicamente con las tres proteínas que contenían el ED-B. Esto, junto con el hecho de que los tres anticuerpos recombinantes pudieron purificarse a partir de sobrenadantes bacterianos usando una columna de afinidad de ED-B, sugiere con fuerza que reconocen un epítopo presente en la conformación nativa del ED-B. No se detectó reacción con los fragmentos de fibronectina que no contenían el dominio ED-B (no se muestran los datos).
Con objeto de ensayar si los anticuerpos aislados contra una mancha del gel tenían un buena afinidad hacia el antígeno nativo, se realizó un análisis de interacción en tiempo real, usando la resonancia plasmón superficial en un instrumento Biacore tal como se ha descrito (Neri et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1285 (1997)). Las fracciones monoméricas de los fragmentos scFv de E1, E2 y G4 se unieron al ED-B con una afinidad en el rango 10^{7}-10^{8} M^{-1} (Tabla 1).
Como un ensayo adicional de la especificidad y utilidad del anticuerpo, se realizó una inmunotransferencia de 2D-PAGE, corriendo en un gel un lisado de la línea celular COLO-38 de melanoma humano, a la cual se le habían añadido pequeñas cantidades del ED-B conteniendo la proteína 7B89 recombinante (Figura 2). El scFv(E1) sólo tiñó intensa y específicamente la mancha del 7B89.
Los anticuerpos E1, A2 y G4 se usaron para inmunolocalizar la fibronectina conteniendo el ED-B (B-FN) en secciones de criostato de tumor cerebral humano glioblastoma multiforme con prominentes procesos angiogénicos. La Figura 3 muestra secciones en serie del glioblastoma multiforme, con las típicas estructuras vasculares parecidas a glomérulos teñidas en rojo por los tres anticuerpos. La inmunotinción de secciones de muestras de glioblastoma multiforme congeladas en nitrógeno líquido inmediatamente después de su extracción mediante procedimientos quirúrgicos, se realizó según se ha descrito (Carnemolla et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996); Castellani et al., Int. J. Cancer, 59:612-618 (1994)). De forma breve, la inmunotinción se realizó usando el anticuerpo M2-anti-FLAG (IBI Kodak), anticuerpos policlonales anti-ratón biotinilados (Sigma), un equipo de tinción con complejo estreptoavidina-biotina fosfatasa alcalina (BioSpa, Milan, Italy) y naftol-AS-MX-fosfato y "fast-red" TR (Sigma). Como tinción de contraste se usó la hematoxilina de Gill, seguida por el montaje en glicerol (Dako, Carpenteria, Calif.) tal como se ha descrito previamente (Castellani et al., Int. J. Cancer, 59:612-618 (1994)).
Usando técnicas similares y el anticuerpo L19 (ver el ejemplo siguiente) también pudimos teñir específicamente los vasos sanguíneos de nueva formación inducidos por el implante, en la córnea de conejo, de precipitados de polímero empapados con sustancias angiogénicas, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular o los ésteres de forbol.
Ejemplo 2 Aislamiento de un fragmento scFv de anticuerpo humano que une el ED-B con afinidad subnanomolar
Se seleccionó el scFv(E1) para ensayar la posibilidad de mejorar su afinidad con un número limitado de mutaciones de residuos de las CDR ubicados en la periferia del sitio de unión al antígeno (Figura 1A). Mutamos de forma combinatoria los residuos 31, 33, 50, 52 y 54 de la VH del anticuerpo, y exhibimos el repertorio correspondiente sobre fagos filamentosos. Se ha hallado que estos residuos frecuentemente están en contacto con el antígeno en las estructuras 3D conocidas de los complejos anticuerpo-antígeno. El repertorio resultante de 4 \times 10^{8} clones se seleccionó en función de la unión al dominio ED-B de la fibronectina. Después de dos rondas de cribado, y del examen de 96 clones individuales, se aisló un anticuerpo con una afinidad mejorada 27 veces (H10; Tablas 1 y 2). De forma similar a lo observado por otros con anticuerpos de afinidad madurada, la afinidad mejorada era debida a una disociación más lenta del antígeno, en vez de a valores de k_{on} mejorados (Schier et al., Gene, 169:147-155 (1996); Ito, J. Mol. Biol., 248:729-732 (1995)). A menudo se cree que la cadena ligera del anticuerpo contribuye menos a la afinidad de unión del antígeno, tal como está apoyado por el hecho de que ambos, los anticuerpos naturales y artificiales carentes de cadena ligera, todavía pueden unir el antígeno (Ward et al., Nature, 341, 544-546 (1989); Hamers-Casterman et al., Nature, 363, 446-448 (1993)). Por esta razón, escogimos cambiar aleatoriamente sólo dos residuos (32 y 50) del dominio VL, los cuales están ubicados de forma central en el sitio de unión del antígeno (Figura 1A), y que a menudo se hallan en las estructuras 3D en contacto con el antígeno. La biblioteca resultante, que contenía 400 clones, se exhibió sobre fagos y se seleccionó en función de la unión del antígeno. A partir del análisis de los perfiles de disociación usando el análisis de interacción en tiempo real con un instrument Biacore (Jonsson et al., BioTechniques, 11:620-627 (1991)) y de las mediciones de k_{off} mediante experimentos de competición con detección electroquimioluminiscente, se identificó un clon (L19) que se unía al dominio ED-B de la fibronectina con una K_{d} = 54 pM (Tablas 1 y 2).
Los experimentos de maduración de la afinidad se realizaron como sigue. El gen del scFv(E1) se amplificó mediante la PCR con los cebadores LMB1bis (5'-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEC. Nº ID.: 1) y DP47CDR1for (5'-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNG CTA AAG GTG MT CCA GAG GCT G-3') (SEC. Nº ID.: 2) para introducir mutaciones aleatorias en las posiciones 31, 33 en el CDR1 del VH (para la numeración: 28), y con los cebadores DP47CDR1back (5'-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3') (SEC. Nº ID.: 3) y DP47CDR2for (5'-GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3') (SEC. Nº ID.: 4) para mutar aleatoriamente las posiciones 50, 52, 54 en el CDR2 del VH. El fragmento restante del gen del scFv, abarcando la porción 3' del gen del VH, el eslabón peptídico, y el gen del VL, se amplificó con los cebadores DP47CDR2back (5'-ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEC. Nº ID.: 5) y JforNot (5'-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3') (SEC. Nº ID.: 6) (94ºC, 1 min; 60ºC, 1 min; 72ºC, 1 min). Los tres productos resultantes de la PCR se purificaron en gel y se ensamblaron mediante PCR (21) con los cebadores LMB1bis y JforNot (94ºC, 1 min; 60ºC, 1 min; 72ºC, 1 min). El producto único resultante de la PCR se purificó de la mezcla de la PCR, se digirió doblemente con NotI/NcoI, y se ligó en el vector pDN332 digerido con NotI/NcoI. Aproximadamente 9 \mug de vector y 3 \mug de inserto se usaron en la mezcla de ligación, la cual se purificó mediante fenolización y precipitación con etanol, se resuspendió en 50 \mul de agua estéril, y se electroporó en células TG1 de E. coli electrocompetentes. La biblioteca de maduración de la afinidad resultante contenía 4 \times 10^{8} clones. Las partículas de anticuerpo, producidas según se ha descrito (Nissim et al., EMBO J., 13:692-698 (1994)) se usaron para una primera ronda de selecciona sobre inmunotubo recubierto con 7B89 (Carnemolla et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996)). Los fagos seleccionados se usaron para una segunda ronda de cribado, realizada con ED-B biotinilado, seguida por la captura con cuentas magnéticas recubiertas con estreptoavidina (Dynal, Oslo, Noruega; ver parágrafo previo). Después de la selección, aproximadamente el 25% de los clones eran positivos en ELISA soluble (consultar el protocolo experimental en el capítulo previo). De entre los candidatos positivos en ELISA, identificamos además el que tenía la k_{off} más baja (H10; Tabla 1) mediante análisis con Biacore (Jonsson et al., BioTechniques, 11:620-627 (1991)).
El gen del scFv(H10) se amplificó mediante la PCR con los cebadores LMB1bis y DPKCDR1for (5'-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G) (SEC. Nº ID.: 7) para introducir una mutación aleatoria en la posición 32 del CDR1 del VL (para la numeración: Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-907 (1987)), y con los cebadores DPKCDR1back (5'-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-5') (SEC. Nº ID.: 8) y DPKCDR2for (5'-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (SEC. Nº ID.: 9) para introducir una mutación aleatoria en la posición 50 en el CDR2 del VL. La porción restante del gen del scFv se amplificó con los oligos DPKCDR2back (5'-GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3') (SEC. Nº ID.: 10) y JforNot (94ºC, 1 min; 60ºC, 1 min; 72ºC, 1 min). Los tres productos resultantes se ensamblaron, digirieron y clonaron en el pDN332 tal como se ha descrito más arriba para la mutagénesis de la cadena pesada. La biblioteca resultante se incubó con ED-B biotinilado en BSA al 3% durante 30 minutos, seguidos por una captura sobre placa de microvaloración recubierta con estreptoavidina (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) durante 10 minutos. Los fagos se eluyeron con una solución de DTT 20 mM (1,4-Ditio-DL-treitol, Fluka) y se usaron para infectar células TG1 creciendo exponencialmente.
El análisis de los sobrenadantes de unión al ED-B de las 96 colonias mediante ELISA y Biacore permitió la identificación del clon L19. Los fragmentos de anticuerpo scFv anti-ED-B E1, G4, A2, H10 y L19 tiñen selectivamente los vasos sanguíneos de nueva formación en secciones de tumores agresivos (Figura 3).
Los fragmentos de anticuerpo anti-ED-B mencionados más arriba se produjeron a continuación inoculando una única colonia reciente en 1 litro de medio 2 \times TY, tal como se ha descrito previamente en Pini et al. (J. Immunol. Meth., 206:171-182 (1997)), y se purificaron por afinidad sobre una columna de Sepharose activada con CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suecia), la cual se había acoplado con 10 mg de ED-B que contenía la proteína recombinante 7B98 (Carnemolla et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996)). Después de cargarla, se lavó la columna con 50 ml de tampón de equilibrado (PBS, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M).
A continuación se eluyeron los fragmentos anticuerpo con trietilamina 1,0 mM, se neutralizaron inmediatamente con HEPES 1 M, pH 7, y se dializaron respecto PBS. Las mediciones de la afinidad mediante el Biacore se realizaron con anticuerpos purificado tal como se ha descrito (Neri et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1275 (1997)) (Figura 4). El análisis de desplazamiento de banda se realizó tal como se ha descrito (Neri et al., Nature Biotechnology, 14:385-390 (1996)), usando el ED-B recombinante marcado fluorescentemente en el extremo N-terminal (Carnemolla et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996); Neri et al..
Nature Biotechnol., 15:1271-1275 (1997)) con el fluoróforo infrarrojo Cy5 (Amersham) (Figura 4). El análisis con el Biacore no permite siempre la determinación precisa de los parámetros cinéticos para las reacciones de disociación lenta debido a los posibles efectos de unión de nuevo, la inestabilidad de la línea base, y los largos tiempos de medición necesarios para comprobar que la fase de disociación sigue un perfil exponencial simple. Por tanto, realizamos las mediciones de la constante de disociación, k_{off}, cinética mediante experimentos de competición (Neri et al., Trends in Biotechnol., 14:465-470 (1996)) (Figura 4). De forma resumida, se incubaron anticuerpos anti-ED-B (30 nM) con ED-B biotinilado (10 nM) durante 10 minutos, en presencia del anticuerpo M2 anti-FLAG (0,5 \mug/ml) e IgG policlonal anti-ratón (Sigma), los cuales se habían marcado previamente con un complejo de rutenio, tal como se ha descrito (Deaver, D.R., Nature, 377:758-760 (1995)). A esta solución, en reacciones paralelas, se le añadió ED-B sin biotinilar (1 \muM) a intervalos diferentes. Las Dynabeads recubiertas con estreptoavidina, diluidas en tampón de ensayo Origen (Deaver, D.R., Nature, 377:758-760 (1995)), se añadieron entonces (20 \mul, 1 mg/ml), y las mezclas resultantes se analizaron con un analizador ORIGEN (IGEN Inc., Gaithersburg, Md., EE.UU.). Este instrumento detecta una señal electroquimioluminiscente (ECL) que se correlaciona con la cantidad de fragmentos scFv que todavía están unidos al ED-B biotinilado al final de la reacción de competición. La representación de la señal del ECL respecto el tiempo de competición proporciona un perfil, el cual puede ajustarse a una exponencial simple con la constante característica k_{off} (Figura 4; Tabla 2).
Ejemplo 3 Apuntando a tumores con un scFv específico, marcado radiactivamente, con elevada afinidad por el dominio ED-B de la fibronectina
El scFv(L19) radioyodado o el scFv(D1.3) (un anticuerpo irrelevante específico para la lisozima de huevo de gallina) se inyectaron intravenosamente en ratones con teratocarcinomas F9 de ratón, un tumor agresivo que crece rápidamente, implantados subcutáneamente. Las biodistribuciones de los anticuerpos se obtuvieron a diferentes intervalos (Figura 4). El scFv(L19) y el scFv(D1.3) se purificaron por afinidad en una columna de antígeno (Neri et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1273 (1997)) y se marcaron radiactivamente con yodo-125 usando el procedimiento del "yodogen" (Pierce, Rockford, Ill., EE.UU.). Los fragmentos de anticuerpo marcados radiactivamente retenían > 80% de la inmunoreactividad, tal como se evaluó cargando el anticuerpo marcado radiactivamente sobre una columna de antígeno, seguida por el recuento radiactivo de las fracciones del flujo a través y del eluato. Los ratones lampiños (lampiños Swiss, de 12 semanas de edad, machos), con teratocarcinoma de ratón F9 implantado subcutáneamente (Neri et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1273 (1997)) se inyectaron con 3 \mug (3-4 \muCi) de scFv en 100 \mul de solución
salina.
El tamaño el tumor era de 50-250 mg, puesto que tumores mayores tiende a tener un centro necrótico. Sin embargo, los experimentos de apuntamiento realizados con tumores mayores (300-600 mg) proporcionaron esencialmente los mismos resultados. Se usaron tres animales para cada instante de tiempo. Los ratones se mataron con procedimientos humanos, y los órganos se pesaron y contaron radiactivamente. Los resultados de apuntamiento de órganos representativos se expresan como porcentaje de dosis inyectada de anticuerpo por gramo de tejido (% ID/g). El scFv(L19) se elimina rápidamente de la sangre a través de los riñones; a diferencia de los anticuerpos convencionales, no se acumula en el hígado u otros órganos. El ocho por ciento de la dosis inyectada por gramo de tejido ya se localiza en el tumor tres horas después de la inyección; la subsiguiente disminución de este valor se debe al hecho de que el tumor duplica su tamaño en 24-48 horas. Las proporciones tumor:sangre a las 3, 5 y 24 horas después de la inyección eran respectivamente del 1,9, 3,9 y 11,8 para el L19, pero siempre por debajo de 1,0 para el anticuerpo control
negativo.
El scFv(L19) marcado radiactivamente se localiza preferentemente en tumores ya a las pocas horas después de la inyección, sugiriendo su utilidad para la detección inmunocentelleográfica de la angiogénesis en pacientes.
Ejemplo 4 Los anticuerpos anti-ED-B tiñen selectivamente los vasos sanguíneos oculares de nueva formación
La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneo a partir de los preexistentes, es una proceso característico que subyace tras muchas enfermedades, incluyendo el cáncer y la mayoría de los trastornos oculares que resultan en una pérdida de visión. La capacidad de apuntar y ocluir selectivamente la neovasculatura abrirá oportunidades diagnósticas y terapéuticas.
Nosotros investigamos si la B-FN es un marcador específico de la angiogénesis ocular y si los anticuerpos que reconocen la B-FN podían apuntar selectivamente a las estructuras neovasculares oculares in vivo a partir de su administración sistémica. Con este objeto, estimulamos la angiogénesis en la córnea de conejo, lo que permite la observación directa de los nuevos vasos sanguíneos, mediante el implante quirúrgico de precipitados que contenían el factor de crecimiento endotelial vascular o un éster de forbol (Figura 7). Se implantaron pellas de Sucralfate (amable obsequio de Merck, Darmstadt, Alemania)/hydron que contenían, bien 8,0 ng de factor del crecimiento endotelial vascular (Sigma) o 4,0 ng de forbol 12-miristato 13-acetato ("PMA"; Sigma), en la córnea de conejos hembra New Zealand White tal como se ha descrito (D'Amato, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4082-4085 (1994)). La angiogénesis fue inducida por ambos factores. Los conejos se monitorizaron diariamente. Con ambos inductores, los vasos sanguíneos de nueva formación eran intensamente ED-B-positivos en la inmunohistoquímica. Para todos los experimentos adicionales se usaron pellas de PMA.
Los estudios inmunohistoquímicos mostraron que el L19 tiñe intensamente la neovasculatura inducida en las córneas de conejo (Figura 8; 9a), pero no los vasos sanguíneo preexistentes del ojo (Figura 9b, c) y de otros tejidos (no se muestran los datos). La inmunohistoquímica se realizó tal como se ha descrito (Carnemolla, B. et al., Int. J. Cancer, 68:397-405 (1996)).
Ejemplo 5 El fragmento L19 de anticuerpo humano, que se une al ED-B con afinidad subnanomolar, apunta a la angiogénesis ocular in vivo
Usando el modelo de angiogénesis de la córnea del conejo descrito en el ejemplo previo, y una metodología de inmunofotodetección (Neri, D. et al., Nature Biotechnol. 15:1271-1275 (1997)), demostramos que el L19, acoplado químicamente al fluoróforo rojo Cy5, pero no el fragmento de anticuerpo (HyHEL-10)-Cy5 dirigido contra un antígeno irrelevante (Figura 10a, b), apuntan selectivamente a la angiogénesis ocular a partir de su inyección intravenosa. La tinción fluorescente de los vasos oculares en crecimiento fue claramente detectable con el L19 inmediatamente después de la inyección, y persistió durante al menos dos días, de forma análoga a la observación previa con la angiogénesis del tumor. El subsiguiente análisis inmunofluorescente ex vivo de secciones de córnea confirmó la localización del L19, pero no del HyHEL-10, alrededor de estructuras vasculares (Figura 10c, d).
La demostración del apuntamiento selectivo, basado en anticuerpo, de la neovascularización ocular, junto con la reactividad de los anticuerpos anti-B-FN en diferentes especies, garantiza futuras investigaciones clínicas. La visualización mediante inmunofluorescencia podría ser útil para la detección temprana de la angiogénesis ocular en pacientes de riesgo, antes de que las lesiones se manifiesten en la fluoroangiografía.
Algunos detalles metodológicos:
Para la inmunofluorescencia ex vivo y para ciertas tinciones con H/E, se fijaron las córneas en paraformaldehído al 4% en PBS, antes del montaje. Los experimentos de fotodetección de la fluorescencia se realizaron con conejos sedados usando 5 mg/kg de Acepromazina.
Para los experimentos de apuntamiento, se inyectaron intravenosamente 3,5 mg de scFv(L19)_{1}-Cy5_{0,66} y 2,8 mg de scFv(HyHEL-10)_{1}-Cy5_{0,83} en cada conejo (tiempo de la inyección = 15 minutos). Se observó una intensa fluorescencia en la neovasculatura corneal ya inmediatamente después de la inyección del L19, pero no del HyHEL-10, y persistió durante varias horas. Como un ensayo adicional de la especificidad, los ratones inyectados el día antes con scFv(HyHEL-10)-Cy5 y negativos en la fotodetección de la fluorescencia, se inyectaron al día siguiente con scFv(L19)-Cy5, y mostraron una intensa tinción fluorescente de la angiogénesis corneal.
Para la detección fluorescente, se iluminó el ojo con una lámpara de halógeno de volframio (modelo Schoft KL1,00; Zeiss, Jena, Alemania) equipada con un filtro de excitación Cy5 (Chroma, Brattleboro, Vt., EE.UU.) y con dos guías de luces, cuyos extremos se colocaron a aproximadamente 2 cm de distancia del ojo. La fluorescencia se detectó con una cámara de CCD monocroma C-5985 enfriada (Hamamatsu, Hamamatsu-City, Japón), equipada con un lente Canon montada en C (V6 \times 16; 16-100 mm; 1:1,9) y un filtro de emisión de Cy5 de 50 mm de diámetro (Chroma) colocado a 3,4 cm de distancia del ojo irradiado. El tiempo de adquisición fue de 0,4 s.
Los experimentos de fluoroangiografía se realizaron con el mismo diseño experimental, pero inyectando intravenosamente 0,25 mg de Cy5-Tris (el producto de reacción entre el Cy5-NHS y el tris(hidroximetil)aminometano; tiempo de inyección = 5 s). El tiempo de adquisición fue de 0,2 s.
Los fragmentos de anticuerpo estaban en un formato scFv. La purificación del scFv(L19) y del scFv(HyHEL-10), y su marcado con los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) de colorantes de indocianina, se han descrito en otras partes (Neri, D. et al., Nature Biotechnol. 15:1271-1275 (1997); Fattorusso, R., et al. Structure, 7:381-390 (1999)). Las proporciones de marcaje anticuerpo:Cy5 para los dos anticuerpos fueron respectivamente de 1,5:1 y 1,2:1. El Cy5-NHS se compró a Amersham Pharmacia Biotech (Zurich, Suiza), la ovoalbúmina a Sigma (Buchs,
Suiza).
Después de la reacción de marcado, los conjugados de anticuerpo se separaron del fluoróforo no incorporado o del fotosensibilizador usando columnas PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibradas en fosfato 50 mM, pH 7,4, NaCl 1,0 mM (PBS). La inmunoreactividad de los conjugados de anticuerpos se midió también mediante cromatografía de afinidad en columnas de antígeno (Neri, D. et al., Nature Biotechnol., 15:1271-1275 (1997)) y en todos los casos fue >78%. Los inmunoconjugados se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con sulfato de sodio dodecil, y migraron como una banda de P.M. = 30.000 Daltones (pureza^{3} 90%).
Ejemplo 6 El fragmento L19 de anticuerpo humano, conjugado químicamente con el fotosensibilizador Sn(IV) clorina e6, apunta selectivamente a la angiogénesis ocular y media su oclusión a partir de la irradiación con luz roja
Para ensayar si podía conseguirse la ablación selectiva de vasos gracias al apuntamiento mediado por anticuerpo, inyectamos conejos con el fragmento de anticuerpo L19, o una proteína irrelevante que no se ubica en vasos sanguíneos de nueva formación (ovoalbúmina), acoplados al fotosensibilizador estaño (IV) clorina e6 (a partir de ahora denominado "PS"). Los ojos de los animales inyectados se irradiaron con luz roja (dosis de luz = 78 J/cm^{2}). En la Figura 11 se ilustran resultados representativos. Se observó una sorprendente diferencia macroscópica 16 horas después de la irradiación en conejos tratados con L19-PS (Figura 11a, b), con la coagulación de la neovasculatura corneal pero no de los vasos en la conjuntiva o en otras estructuras oculares. La fluoroangiografía con el fluoróforo de indocianina Cy5 (Figura 11c) confirmó la oclusión de los vasos como un área hipofluorescente característica. Por contra, se observaron áreas hiperfluorescentes en las vasculatura resquebrajada de los ojos no irradiados (Figura 11d, h). No se detectó ninguna alteración macroscópica en los vasos irradiados de los conejos tratados con ovoalbúmina-PS (Figura 11 e-g), bien oftalmológicamente o mediante fluoroangiografía con Cy5. El efecto de la irradiación del conjugado L19-PS dirigido en las etapas tempranas de la angiogénesis corneal se muestra en la Figura 11i-l. Los vasos sanguíneos coagulados eran visibles macroscópicamente en animales vivos (Figura 11i, j) e incluso más evidentes en los animales inmediatamente después de su eutanasia (Figura
11k, l).
La lesión fotodinámica se investigó aún más usando técnicas microscópicas. Después de la irradiación, pudo detectarse la oclusión de los vasos mediante técnicas de tinción estándares con hematoxilina/eosina (H/E), en ambas, córneas no fijadas y fijadas con paraformaldehído, de animales tratados con L19-PS (Figura 11b, f, j), pero no en aquéllos tratados con ovoalbúmina-PS (Figura 11a, e, i). La apoptosis en la porción de la córnea apuntada por el conjugado de fotosensibilizador era claramente visible en el ensayo fluorescente TUNEL (Figura 11c, g), pero difícilmente detectable en los controles negativos (Figura 11d, h). Una vista con mayor ampliación mostró la apoptosis de células endoteliales en estructuras vasculares (Figura 11g). No se pudo observar lesión de los vasos sanguíneos del iris, esclerótica, y conjuntiva de animales tratados, ni por el ensayo TUNEL (no se muestra) ni mediante tinción con H/E (Figura 11k, l).
La ablación fotodinámica selectiva de neovasculatura promete ser beneficiosa para el tratamiento de los trastornos oculares y de otras patología relacionadas con la angiogénesis que son accesible a la irradiación usando difusores de luz o técnicas de fibra óptica. Los resultados de este estudio demuestran claramente que la neovasculatura ocular puede ocluirse selectivamente sin lesionar los vasos sanguíneos preexistentes y los tejidos normales.
Algunos detalles metodológicos:
Se seleccionó el estaño (IV) clorina e_{6} de entre un grupo de fotosensibilizadores en base a su potencia, solubilidad y especificidad, después de acoplarlo a un anticuerpo policlonal anti-ratón de conejo (Sigma). Estos inmunoconjugados se examinaron mediante fotolisis dirigida de glóbulos rojos humanos recubiertos con un anticuerpo monoclonal específico para el CD47 humano (#313441A; Pharmingen, San Diego, California, EE.UU.). El estaño (IV) clorina e_{6} se preparó según se describió (Lu, X.M., et al., J. Immunol. Methods, 156:85-99 (1992)). Para acoplar proteínas, el estaño (IV) clorina e_{6} (2 mg/ml) se mezcló durante 30 minutos a temperatura ambiente, en dimetilformamida, con un exceso molar de diez veces de EDC (N'-3-dimetilaminopropil-N-etilcarbodiimida hidrocloruro, Sigma) y NHS (N-hidroxisuccinimida, Sigma). La mezcla activada resultante se añadió a continuación a un volumen ocho veces mayor de solución de proteína (1 mg/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.
Después de la reacción de marcado, se separaron los conjugados de anticuerpo del fluoróforo no incorporado o del fotosensibilizador usando columnas POD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibradas en fosfato 50 mM, pH 7,4, NaCl 1,0 mM (PBS). La inmunoreactividad de los conjugados de anticuerpo se midió tal como se ha descrito en el ejemplo previo.
Para los experimentos de "fotokilling", se inyectaron los conejos intravenosamente con 12 mg de scFv(L19)_{1}-tin(IV) clorina e_{6}, 0,8 ó 38 mg de ovoalbúmina_{1}-tin(IV) clorina e_{6}, y se mantuvieron a oscuras durante la duración del experimento. Ocho horas después de la inyección, se anestesiaron los conejos con ketamina (35 mg/kg)/xilazina (5 mg/kg)/acepromazina (1 mg/kg), y uno de los dos ojos de irradió durante 13 minutos con una lámpara halógeno de volframio Schott KL1500 equipada con un filtro Cy5 (Chroma) y con dos guías de luz cuyas extremidades se colocan a 1 cm de distancia del ojo. El área iluminada era aproximadamente de 1 cm^{2}, con una densidad de potencia de irradiación de 1,0 mW/cm^{2}, medida con un fotodetector SL818 (Newport Corp., Irvine, California, EE.UU.). No se observó ningún signo de malestar en el animal después de la irradiación. Como medida preventiva, los conejos recibieron analgésicos después de la irradiación (buprenorfina 0,03 mg/Kg). Para seguir la muerte por causa de la luz, se investigaron los ojos con un oftalmoscopio y se fotografiaron usando una cámara de fundus KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausana, Suiza). Se trataron cinco conejos con cada uno de los conjugados con tin(IV) clorina e_{6} y se irradiaron sólo en un ojo, sirviendo el otro ojo como control negativo interno. Como control adicional, se irradiaron dos conejos, pero no recibieron ningún conjugado de fotosensibilizador.
Inmediatamente después de la eutanasia de los conejos con una sobredosis de anestésico, se enuclearon los ojos, se retiraron las córneas, y a continuación se impregnaron en Tissue Tek (Sakura Finetechnical, Tokio, Japón) y se congelaron. Para la inmunofluorescencia ex vivo y para algunas tinciones con H/E, las córneas se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS antes de impregnarlas. Las secciones de criostato de 5 \mum se usaron para análisis microscópico adicional.
Los ensayos TUNEL fluorescentes se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostic, Rotkreuz, Suiza).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
Secuencias de clones de anticuerpos anti-ED-B seleccionados
cadena del VH cadena del VL
Clon 31-33* 50-54* 95-98* 32* 50* 91-96*
A2 SYA AISGSG GLSI Y G NGWYPW
G4 SYA AISGSG SFSF Y G GGWLPY
E1 SYA AISGSG FPFY Y G TGRIPP
H10 SFS SIRGSS FPFY Y G TGRIPP
L19 SFS SIRGSS FPFY Y Y TGRIPP
\begin{minipage}[t]{150mm}Posiciones de aminoácidos relevantes (*: numeración de acuerdo con Tomlinson et al. EMBO J., 14:4628-4638 (1995)) de clones de anticuerpos aislados a partir de bibliotecas sintéticas.\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{150mm}Los códigos simples de aminoácidos se usan de acuerdo con la nomenclatura estándar de la IUPAC.\end{minipage}
TABLA 2
Afinidades de los fragmentos scFv anti-ED-B
Clon kon (s^{-1}M^{-1}) koff (s^{-1})^{B} koff (s^{-1})^{C} K_{d} (M)*
A2 1,5 \times 10^{5} 2,8 \times 10^{-3} - - 1,9 \times 10^{-8}
G4 4,0 \times 10^{4} 3,5 \times 10^{-3} - - 8,7 \times 10^{-8}
E1 1,6 \times 10^{5} 6,5 \times 10^{-3} - - 4,1 \times 10^{-8}
H10 6,7 \times 10^{4} 5,6 \times 10^{-4} 9,9 \times 10^{-5} 1,5 \times 10^{-9}
L19 1,1 \times 10^{5} 9,6 \times 10^{-5} 6,0 \times 10^{-6} 5,4 \times 10^{-11}
\begin{minipage}[t]{150mm}*K_{d} = k_{off}/k_{on}. Para los unidores de elevada afinidad H10 y L19, los valores de k_{off} de los experimentos de Biacore no eran suficientemente fiables debido a los efectos de la matriz de dextrano sólido carboxilado; los valores de Kd se calcularon por tanto a partir de las mediciones de k_{off} obtenidas mediante experimentos de competición (Procedimientos Experimentales).\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{150mm} k_{off}, constante cinética de disociación; k_{on}, constante cinética de asociación; K_{d}, constante de disociación. B = medido/a en el Biacore; C = medido mediante competición con la detección electroquimioluminiscente. Los valores son precisos hasta \pm 50%, en base a la precisión de las determinaciones de concentración.\end{minipage}
<110> EIDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas de unión específica para centelleografía, conjugados que las contienen y procedimiento terapéutico para el tratamiento de la angiogenésis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1900PTEP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/075338
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1998-05-11
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-04-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: LBM1bis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcccagc cggccatggc cgag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DP47CDR1for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DP47CDR1back
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgagctggg tccgccaggc tcc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DP47CDR2for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnmaatmnnt gagacccact ccagcccctt 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DP47CDR2back
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acatactacg cagactccgt gaag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: JforNot
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc cctthhccga acg 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DPKCDR1for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DPKCDR1back
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttagcctggt accagcagaa acc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DPKCDR2for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DPKCDR2back
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcatccagca gggccactgg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DP47baNco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: CDR3for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttccctgg cccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: VHpullth
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcccagc atgccatggc cgag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: Jassm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc cctggcccca 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtagtc 
\hfill
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DPK22assm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgggtcca gtggcggtag tcgactggcg aaattgtgtt gacgcagtct 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cc 
\hfill
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: DPK3for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgc 
\hfill
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: Jfornot
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtcccttggc cgaacg 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de la PCR: VLpullth
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgggtcca gtggcggtag cggg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH del anticuerpo específico para el dominio ED-B de la fibronectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Eslabón del anticuerpo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VL del anticuerpo específico para el dominio ED-B de fibronectina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
3

Claims (22)

1. Anticuerpo aislado con afinidad específica por un epítopo característico del Dominio Extra B (ED-B) de la fibronectina, en donde el anticuerpo tiene una afinidad por dicho epítopo del ED-B en el rango subnanomolar y reconoce el ED-B(+) de la fibronectina.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo une el dominio ED-B de la fibronectina con una Kd de 54 pM.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, con la siguiente secuencia de aminoácidos:
4
4. Anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es una forma variante funcionalmente equivalente del L19, en donde el L19 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 19, 20 y 21.
5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo está en el formato scFv.
6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo completo.
7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo está marcado radiactivamente.
8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo está marcado con yodo radiactivo.
9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un procedimiento de marcadores de apuntamiento rápido de la angiogénesis.
10. Anticuerpo según se reivindica en la reivindicación 9 para la detección inmunocentelleográfica de la angiogénesis.
11. Anticuerpo según se reivindica en la reivindicación 10, para detectar enfermedades caracterizadas por la proliferación vascular, tales como la retinopatía diabética, la degeneración macular relacionada con la edad, o los tumores.
12. Equipo de diagnóstico que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y uno o más reactivos necesarios para detectar la angiogénesis.
13. Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de un agente de diagnóstico para la diagnosis de tumores o de una enfermedad caracterizada por la proliferación vascular.
14. Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de un medicamento para la terapia de tumores o de una enfermedad caracterizada por la proliferación vascular.
15. Conjugado que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y una molécula capaz de inducir la coagulación de la sangre y la oclusión del vaso sanguíneo.
16. Conjugado según la reivindicación 15, en donde la molécula capaz de inducir la coagulación de la sangre y la oclusión del vaso sanguíneo es una molécula fotoactiva.
17. Conjugado según la reivindicación 16, en donde la molécula fotoactiva es un fotosensibilizador.
18. Conjugado según la reivindicación 17, en donde el fotosensibilizador absorbe a una longitud de onda superior a los 600 nm.
19. Conjugado según la reivindicación 18, en donde el fotosensibilizador es un derivado de estaño (IV) cloro e6.
20. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, para su uso en el tratamiento terapéutico de un tumor o enfermedad caracterizada por la proliferación vascular en el cuerpo humano o animal.
21. Utilización de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 para la preparación de una composición inyectable para el tratamiento de una patología relacionada con la angiogénesis.
22. Utilización según la reivindicación 21, en donde la patología relacionada con la angiogénesis está causada por, o asociada con la angiogénesis ocular.
ES99923571T 1998-05-11 1999-05-11 Anticuerpos para el dominio eb-d de fibronectina conjugados que los contienen y utilizacion de los mismos para el diagnostico y terapia de tumores y enfermedades asociadas con la angiogenesis. Expired - Lifetime ES2247802T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7533898A 1998-05-11 1998-05-11
US75338 1998-05-11
US300425 1999-04-28
US09/300,425 US20030045681A1 (en) 1998-05-11 1999-04-28 Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2247802T3 true ES2247802T3 (es) 2006-03-01

Family

ID=26756726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES99923571T Expired - Lifetime ES2247802T3 (es) 1998-05-11 1999-05-11 Anticuerpos para el dominio eb-d de fibronectina conjugados que los contienen y utilizacion de los mismos para el diagnostico y terapia de tumores y enfermedades asociadas con la angiogenesis.

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20070189963A1 (es)
EP (1) EP1084145B1 (es)
JP (1) JP2002514405A (es)
CN (1) CN1250571C (es)
AT (1) ATE301676T1 (es)
AU (1) AU759207B2 (es)
BR (1) BRPI9910394B8 (es)
CA (1) CA2333833C (es)
CZ (1) CZ300495B6 (es)
DE (1) DE69926630T2 (es)
DK (1) DK1084145T3 (es)
EA (1) EA005685B1 (es)
EE (1) EE05435B1 (es)
ES (1) ES2247802T3 (es)
HU (1) HU225675B1 (es)
IL (1) IL139452A0 (es)
IS (1) IS2522B (es)
NO (1) NO327732B1 (es)
NZ (1) NZ508600A (es)
PL (1) PL199353B1 (es)
SK (1) SK286822B6 (es)
TR (1) TR200003317T2 (es)
TW (1) TWI259837B (es)
WO (1) WO1999058570A2 (es)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
DK1140170T3 (da) 1999-01-05 2006-10-23 Univ Southern Australia Antistoffragmenter til topisk behandling af öjensygdomme
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
DE19947559A1 (de) * 1999-09-24 2001-04-19 Schering Ag Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung
US6319273B1 (en) * 1999-12-16 2001-11-20 Light Sciences Corporation Illuminating device for treating eye disease
CA2400622A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
PT1719528E (pt) * 2000-02-24 2012-01-06 Philogen Spa Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas
DE10045803A1 (de) * 2000-09-07 2002-04-11 Schering Ag Rezeptor der EDb Fibronektin-Domäne
EP1381629B1 (de) * 2000-09-07 2008-09-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft REZEPTOR DER EDb-FIBRONEKTIN-DOMÄNE (II)
US20030100010A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-29 George Jackowski Fibrinogen biopolymer Marker predictive of type II diabetes
JP2005538033A (ja) * 2001-12-04 2005-12-15 ナノスペクトラ バイオサイエンセズ，インク． 過剰なあるいは不適切な新脈管形成によって特徴付けられる病状の治療
ATE478095T1 (de) * 2002-01-03 2010-09-15 Bayer Schering Pharma Ag Konjugate mit einem für die ed-b-domäne von fibronectin spezifischen antikörper, und deren verwendung zum nachweis und zur behandlung von tumoren
EP2239274A1 (en) * 2002-01-03 2010-10-13 Bayer Schering Pharma AG New methods for diagnosis and treatment of tumours
US8491906B2 (en) 2002-03-11 2013-07-23 Philogen S.P.A. Selective targeting of tumor vasculature using antibody molecules
DK1537146T3 (da) 2002-07-15 2011-04-04 Univ Texas Antistoffer, der binder til anioniske phospholipider og aminophospholipider, og deres anvendelse til behandling af virusinfektioner
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
DE10348319A1 (de) * 2003-10-17 2005-05-19 Schering Ag Bindemoleküle für die Extra-Domäne B von Fibronectin zur Detektion von atherosklerotischen Plaques
US7785591B2 (en) 2004-10-14 2010-08-31 Morphosys Ag Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies
EP1957531B1 (en) * 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
JP2009514540A (ja) * 2005-11-09 2009-04-09 バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 機能−阻止抗−ｅｄ−ｂ−フィブロネクチン抗体（ｐｒｉｖａｔｅ）の同定及び特徴化
EP1842553A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule
EP1925664A1 (en) 2006-11-15 2008-05-28 Scil proteins GmbH Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin
ATE548052T1 (de) 2008-01-17 2012-03-15 Philogen Spa Kombination aus einem anti-edb-fibronectin- antikörper-il-2-fusionsprotein und einem b-zellen bindenden molekül, b-zellen-vorläufern und/oder deren krebserregendem gegenspieler
EP2100621A1 (en) 2008-03-10 2009-09-16 mivenion GmbH Polyether polyol dendron conjugates with effector molecules for biological targeting
JP2009244154A (ja) 2008-03-31 2009-10-22 Nationa Hospital Organization 老化、および血管障害を伴う疾患の検定のための組成物、キットおよび方法
EP2116555A1 (en) 2008-05-08 2009-11-11 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma
WO2010056889A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of an antibody and a rare-earth based crystal
JP5749733B2 (ja) 2009-12-14 2015-07-15 シル プロテインズ ゲーエムベーハーＳｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ フィブロネクチンのエキストラドメインｂに対する特異的結合活性を有する修飾ユビキチンタンパク質
WO2011110490A1 (en) 2010-03-09 2011-09-15 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Process for the production of radioactively labelled scfv antibody fragments, kits and compositions
AU2012268970B2 (en) 2011-06-15 2016-01-28 Navigo Proteins Gmbh Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins
WO2012171541A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
EP2734232B1 (en) 2011-07-19 2017-11-01 Philogen S.p.A. Sequential anti-ctla4 and targeted il-2 therapy
RU2481839C2 (ru) * 2011-08-16 2013-05-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития" Способ лечения ишемической болезни сердца с дистальным или диффузным поражением коронарных артерий
EP2861616A1 (en) 2012-06-13 2015-04-22 Scil Proteins GmbH Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains
WO2014094799A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Scil-Proteins-Gmbh Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life
US10611830B2 (en) * 2013-06-06 2020-04-07 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Human antibody against ED-B domain of fibronectin and uses thereof
CA2975362A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Navigo Proteins Gmbh Egfr binding proteins comprising ubiquitin muteins
CN107922483B (zh) 2015-07-16 2021-07-30 纳维格蛋白质有限公司 新型免疫球蛋白结合蛋白及其在亲和纯化中的用途
JP2018520675A (ja) 2015-07-20 2018-08-02 ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法
EP3378947B1 (en) * 2015-11-16 2024-01-24 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia
CN109310780A (zh) 2016-05-04 2019-02-05 纳维格蛋白质有限公司 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物
GB201612317D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Philogen Spa Antibody compositions
EP3497118B1 (en) 2016-08-11 2022-09-14 Repligen Corporation Alkaline stable fc binding proteins for affinity chromatography
IL266112B2 (en) 2016-10-17 2024-07-01 Pfizer Antibodies against EDB and antibody-drug conjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
WO2019062877A1 (zh) 2017-09-30 2019-04-04 合肥立方制药股份有限公司 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白
EP3706804B1 (en) 2017-11-07 2022-02-23 Navigo Proteins GmbH Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
IL309522A (en) 2021-06-23 2024-02-01 Cytune Pharma Interleukin 15 variants
US20240294594A1 (en) 2021-06-23 2024-09-05 Cytune Pharma Interleukin-15 based immunocytokines
AU2023206004A1 (en) 2022-01-04 2024-08-22 Philogen S.P.A. Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor
WO2024028258A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Philochem Ag Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents
WO2024047237A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Philogen S.P.A. Tnf alpha and interleukin-2 combination therapy for non-melanoma skin cancer
WO2024052333A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Philochem Ag Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9610967D0 (en) * 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods

Also Published As

Publication number Publication date
CN1250571C (zh) 2006-04-12
AU759207B2 (en) 2003-04-10
PL345845A1 (en) 2002-01-14
IS2522B (is) 2009-07-15
EE200000802A (et) 2002-06-17
HU225675B1 (en) 2007-06-28
NO20005694L (no) 2001-01-10
CA2333833A1 (en) 1999-11-18
DK1084145T3 (da) 2005-12-19
CZ20004216A3 (en) 2001-05-16
DE69926630D1 (de) 2005-09-15
TWI259837B (en) 2006-08-11
CA2333833C (en) 2011-01-25
ATE301676T1 (de) 2005-08-15
AU4039899A (en) 1999-11-29
NO327732B1 (no) 2009-09-14
US20070189963A1 (en) 2007-08-16
HUP0102992A2 (hu) 2001-11-28
EP1084145A2 (en) 2001-03-21
NO20005694D0 (no) 2000-11-10
WO1999058570A2 (en) 1999-11-18
JP2002514405A (ja) 2002-05-21
EA200001169A1 (ru) 2001-04-23
NZ508600A (en) 2003-03-28
IS5708A (is) 2000-11-10
CZ300495B6 (cs) 2009-06-03
EP1084145B1 (en) 2005-08-10
SK286822B6 (sk) 2009-06-05
BRPI9910394B1 (pt) 2013-07-02
EE05435B1 (et) 2011-06-15
BRPI9910394A (pt) 2001-01-09
DE69926630T2 (de) 2006-05-24
IL139452A0 (en) 2001-11-25
TR200003317T2 (tr) 2001-07-23
WO1999058570A3 (en) 2000-03-16
SK16792000A3 (sk) 2001-05-10
HUP0102992A3 (en) 2003-09-29
BRPI9910394B8 (pt) 2021-07-06
CN1303393A (zh) 2001-07-11
EA005685B1 (ru) 2005-04-28
PL199353B1 (pl) 2008-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2247802T3 (es) Anticuerpos para el dominio eb-d de fibronectina conjugados que los contienen y utilizacion de los mismos para el diagnostico y terapia de tumores y enfermedades asociadas con la angiogenesis.
US8097254B2 (en) Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
KR100744370B1 (ko) 신티그래피용 특이 결합 분자,이를 함유하는 접합체 및맥관형성의 치료방법
AU2001242432A1 (en) Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
JP5221641B2 (ja) 腫瘍転移の血管新生と関連するフィブロネクチンのｅｄ−ａ抗原
AU2005304031B2 (en) Antibodies against tenascin-C
ES2549362T3 (es) Antígenos asociados a endometriosis
ES2807753T3 (es) Un antígeno asociado con artritis reumatoide
ES2534726T3 (es) Antígeno ED-A del fibrinógeno que está asociado con linfomas
ES2361743T3 (es) Reconocimiento de la vasculatura tumoral como diana mediante el anticuerpo l19 radiomarcado dirigido contra el dominio ed-b de fibronectina.
US20030176663A1 (en) Specific binding molecules for scintigraphy
MXPA00011017A (es) Anticuerpos para el dominio ed-b de la fibronectina, conjugados que los contienen y uso de los mismos para diagnosis y terapia de tumores y enfermedades asociadas con angiogenesis
BG65163B1 (bg) Антитела за ed-b домен на фибронектин, съдържащи ги конюгации и използването им за диагноза и лечение на тумори и болестни състояния, свързани с ангиогенезата