JPH0835964A - βタイプ血小板誘導成長因子レセプターによって仲介された活性をテストするためのバイオアッセイ - Google Patents
βタイプ血小板誘導成長因子レセプターによって仲介された活性をテストするためのバイオアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 βタイプ血小板誘導成長因子レセプターによ
って仲介された活性をテストするためのバイオアッセイ
を提供する。 【構成】 PDGFの潜在的類似体の、タイプβのPDGFレセ
プターによって仲介された活性をテストするバイオアッ
セイにおいて、i)PDGFの類似体であると想定される分子
をタイプβのPDGFレセプター蛋白質をエンコードするDN
A セグメントによって形質転換した細胞によって生成し
たタイプβのPDGFレセプターと接触させるステップであ
って、上記DNA セグメントによって形質転換される前の
上記細胞の生存率が通常インターロイキン３に依存する
ステップと、ii）上記細胞における上記タイプβのPDGF
レセプターによって仲介された生物学的活性の量を定量
するステップとからなるPDGFの潜在的類似体のタイプβ
のPDGFレセプターによって仲介された活性をテストする
ためのバイオアッセイ。
って仲介された活性をテストするためのバイオアッセイ
を提供する。 【構成】 PDGFの潜在的類似体の、タイプβのPDGFレセ
プターによって仲介された活性をテストするバイオアッ
セイにおいて、i)PDGFの類似体であると想定される分子
をタイプβのPDGFレセプター蛋白質をエンコードするDN
A セグメントによって形質転換した細胞によって生成し
たタイプβのPDGFレセプターと接触させるステップであ
って、上記DNA セグメントによって形質転換される前の
上記細胞の生存率が通常インターロイキン３に依存する
ステップと、ii）上記細胞における上記タイプβのPDGF
レセプターによって仲介された生物学的活性の量を定量
するステップとからなるPDGFの潜在的類似体のタイプβ
のPDGFレセプターによって仲介された活性をテストする
ためのバイオアッセイ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血小板誘導成長因子（Pl
atelet-Derived Growth Factor(PDGF)) のためにレセプ
ター蛋白質をコードし、特にヒトの血小板中に見出され
るPDGFの主要な型に好んで結合するレセプター蛋白質を
エンコードするヒト遺伝子に関する。また、本発明は組
換細胞によるこのようなPDGFレセプター遺伝子生成物の
合成及びこれらのレセプターをエンコードするDNA の同
定及びクローニングによって可能とされた他のいくつか
の新規生成物の製造及び使用にも関する。
atelet-Derived Growth Factor(PDGF)) のためにレセプ
ター蛋白質をコードし、特にヒトの血小板中に見出され
るPDGFの主要な型に好んで結合するレセプター蛋白質を
エンコードするヒト遺伝子に関する。また、本発明は組
換細胞によるこのようなPDGFレセプター遺伝子生成物の
合成及びこれらのレセプターをエンコードするDNA の同
定及びクローニングによって可能とされた他のいくつか
の新規生成物の製造及び使用にも関する。
【０００２】
【従来の技術】成長因子およびそのレセプターをエンコ
ードする遺伝子は正常な細胞増殖及び成長の調節に密接
な関係を有する。このような遺伝子の発現に影響する遺
伝的変化が悪性化を伴う細胞増殖の変化の一因となる可
能性を示す証拠も増加している。若干の腫瘍遺伝子の正
常な同族体がチロシンキナーゼ活性を有する膜伸張成長
因子をエンコードする(J. Downward et al., Science30
7,521(1984); A.Ullrichet al., Science 309, 418 (19
84); C.J.Sherr et al., Cell 41, 665(1985);L.Cousse
ns et al., Nature 320, 277(1986)) 。他の腫瘍遺伝子
は、成長因子により活性化された細胞増殖径路でも同じ
く作用しているように思われる(J.M. Bishop,Science 2
35,305(1985);R.A.Weinberg,Science230, 770(1985);
S.K.Hanks, A.M.Quinn, T.Hunter, Science 241, 42(19
88)) 。かくして、成長因子調節系一般の知識の増加
は、正常な成長調節および腫瘍形成の双方に決定的に関
与する遺伝子を更に理解するのに役立つことが期待され
る。
ードする遺伝子は正常な細胞増殖及び成長の調節に密接
な関係を有する。このような遺伝子の発現に影響する遺
伝的変化が悪性化を伴う細胞増殖の変化の一因となる可
能性を示す証拠も増加している。若干の腫瘍遺伝子の正
常な同族体がチロシンキナーゼ活性を有する膜伸張成長
因子をエンコードする(J. Downward et al., Science30
7,521(1984); A.Ullrichet al., Science 309, 418 (19
84); C.J.Sherr et al., Cell 41, 665(1985);L.Cousse
ns et al., Nature 320, 277(1986)) 。他の腫瘍遺伝子
は、成長因子により活性化された細胞増殖径路でも同じ
く作用しているように思われる(J.M. Bishop,Science 2
35,305(1985);R.A.Weinberg,Science230, 770(1985);
S.K.Hanks, A.M.Quinn, T.Hunter, Science 241, 42(19
88)) 。かくして、成長因子調節系一般の知識の増加
は、正常な成長調節および腫瘍形成の双方に決定的に関
与する遺伝子を更に理解するのに役立つことが期待され
る。
【０００３】血小板誘導成長因子（PDGF）は、それが正
常な創傷治癒において主要な役割を果すと考えられる結
合組織細胞の主要な分裂促進因子である故に、とりわけ
重要である。更にPDGFの異常な発現は癌ばかりでなく、
種々の組織病理学的症状、例えば動脈硬化症、関節炎、
および繊維症にも関係している(R.Ross, E.W.Raines,D.
F.Bowen-Pope, Cell 46, 155(1986)) 。
常な創傷治癒において主要な役割を果すと考えられる結
合組織細胞の主要な分裂促進因子である故に、とりわけ
重要である。更にPDGFの異常な発現は癌ばかりでなく、
種々の組織病理学的症状、例えば動脈硬化症、関節炎、
および繊維症にも関係している(R.Ross, E.W.Raines,D.
F.Bowen-Pope, Cell 46, 155(1986)) 。
【０００４】PDGFはＡ鎖およびＢ鎖と命名される２種の
ポリペプチド鎖のジスルフィド結合ダイマーから成る。
Ａ鎖またはＢ鎖または双方を含む３種の可能なダイマー
構造がすべて天然に生ずる証拠が存在する（R.F.Doolit
tle etal., Science 221, 275(1983); M.D.Waterfield
et al., Nature 304, 35(1983); K.C.Robbins et al.,
Nature 305, 605(1983);C.-H.Heldin et al.,Nature 31
9, 511(1986); P.Stroobant and M.D.Waterfield, EMBO
J. 3, 2963(1984)) 。成長因子の種々のダイマーの型は
“イソフォーム(isoform) ”と呼ばれる。種々の正常お
よび腫瘍細胞はＡ鎖またはＢ鎖を特異的に発現するよう
に思われる。それにもかかわらず生理学的な調節過程に
おいて最も大切なヒトのイソフォームはヒト血小板から
分離されたイソフォーム、即ち、ABヘテロダイマー（即
ち１個のＡおよびＢ鎖を含むダイマー;A.Johnsson,C.-
H.Heldin,B.Westermark,A.Wasteon,Biochem. Biophys.
Res. Commun. 104, 66(1982))であると信じられてい
る。
ポリペプチド鎖のジスルフィド結合ダイマーから成る。
Ａ鎖またはＢ鎖または双方を含む３種の可能なダイマー
構造がすべて天然に生ずる証拠が存在する（R.F.Doolit
tle etal., Science 221, 275(1983); M.D.Waterfield
et al., Nature 304, 35(1983); K.C.Robbins et al.,
Nature 305, 605(1983);C.-H.Heldin et al.,Nature 31
9, 511(1986); P.Stroobant and M.D.Waterfield, EMBO
J. 3, 2963(1984)) 。成長因子の種々のダイマーの型は
“イソフォーム(isoform) ”と呼ばれる。種々の正常お
よび腫瘍細胞はＡ鎖またはＢ鎖を特異的に発現するよう
に思われる。それにもかかわらず生理学的な調節過程に
おいて最も大切なヒトのイソフォームはヒト血小板から
分離されたイソフォーム、即ち、ABヘテロダイマー（即
ち１個のＡおよびＢ鎖を含むダイマー;A.Johnsson,C.-
H.Heldin,B.Westermark,A.Wasteon,Biochem. Biophys.
Res. Commun. 104, 66(1982))であると信じられてい
る。
【０００５】PDGF-A 鎖およびＢ鎖は、区別可能な特性
を有する（P.Beckman et al., Science 241, 1346(198
8))。Ａ鎖の方がＢ鎖よりもはるかに能率的に分泌さ
れ、かつより低い比分裂促進活性を発揮する。PDGFのＢ
鎖遺伝子は、サルの肉腫ウィルス誘導v-sis 腫瘍遺伝子
のヒトにおける正常同族体であることが示されている。
更にPDGFレセプターを有する細胞タイプにおいてＢ鎖が
発現することにより、これらの細胞が悪性化への道すじ
をたどる可能性の証拠が発見されてきている。Ｂ鎖に比
してＡ鎖は培養マウス（NIH/3T3)細胞の腫瘍性形質転換
の誘導性は低い。
を有する（P.Beckman et al., Science 241, 1346(198
8))。Ａ鎖の方がＢ鎖よりもはるかに能率的に分泌さ
れ、かつより低い比分裂促進活性を発揮する。PDGFのＢ
鎖遺伝子は、サルの肉腫ウィルス誘導v-sis 腫瘍遺伝子
のヒトにおける正常同族体であることが示されている。
更にPDGFレセプターを有する細胞タイプにおいてＢ鎖が
発現することにより、これらの細胞が悪性化への道すじ
をたどる可能性の証拠が発見されてきている。Ｂ鎖に比
してＡ鎖は培養マウス（NIH/3T3)細胞の腫瘍性形質転換
の誘導性は低い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】マウス、またはヒト繊
維芽細胞を使用してPDGFのイソフォームの結合および拮
抗力を基礎とする最近の研究では、PDGFレセプター（PD
GF-R）に２種のサブタイプの存在することが暗示されて
いる（C.-H.Heldin etal.,Nature 7, 1387(1988);C.E.H
art et al.,Science 240, 1529(1988))。これらの研究
は、Ｂ鎖ダイマーと選択的に結合する１個のレセプター
のサブタイプと、PDGF分子のすべてのイソフォームと能
率的に結合する今１つのレセプターのサブタイプが存在
するという仮説と符号している。しかし、これらの研究
の結果は、このようなレセプターに関連した病気の研究
と究極的治療についての異なった意味をもつ２つの別個
の可能性（即ちこれらのサブタイプは単一のPDGF-R遺伝
子が異なって処理されて生じた産物として現われたのか
またこれらは別個の遺伝子の生成物なのか）を識別する
ことができなかった。
維芽細胞を使用してPDGFのイソフォームの結合および拮
抗力を基礎とする最近の研究では、PDGFレセプター（PD
GF-R）に２種のサブタイプの存在することが暗示されて
いる（C.-H.Heldin etal.,Nature 7, 1387(1988);C.E.H
art et al.,Science 240, 1529(1988))。これらの研究
は、Ｂ鎖ダイマーと選択的に結合する１個のレセプター
のサブタイプと、PDGF分子のすべてのイソフォームと能
率的に結合する今１つのレセプターのサブタイプが存在
するという仮説と符号している。しかし、これらの研究
の結果は、このようなレセプターに関連した病気の研究
と究極的治療についての異なった意味をもつ２つの別個
の可能性（即ちこれらのサブタイプは単一のPDGF-R遺伝
子が異なって処理されて生じた産物として現われたのか
またこれらは別個の遺伝子の生成物なのか）を識別する
ことができなかった。
【０００７】更に、既に同定されているヒトPDGF-R遺伝
子によって生成されたレセプターの種々のPDGFイソフォ
ームの結合に関して、見解は統一されていない。発現ベ
クターによりPDGF遺伝子を種々のPDGFレセプターを欠除
するタイプの細胞に導入することによって、PDGF-BB の
選択的結合（R.G.K.Gronwald et al., Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA 88, 3435(1988); L.Claessan-Welsh et a
l., Mol. Cell. Biol. 8, 3476(1988)),または、その代
りに、３種のイソフォームのすべてによる効率のよい結
合（J.A.Escobedo et al., Science 240, 1532(1988))
に導く方法が報告されている。この結果のバラツキの根
拠は不明である。
子によって生成されたレセプターの種々のPDGFイソフォ
ームの結合に関して、見解は統一されていない。発現ベ
クターによりPDGF遺伝子を種々のPDGFレセプターを欠除
するタイプの細胞に導入することによって、PDGF-BB の
選択的結合（R.G.K.Gronwald et al., Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA 88, 3435(1988); L.Claessan-Welsh et a
l., Mol. Cell. Biol. 8, 3476(1988)),または、その代
りに、３種のイソフォームのすべてによる効率のよい結
合（J.A.Escobedo et al., Science 240, 1532(1988))
に導く方法が報告されている。この結果のバラツキの根
拠は不明である。
【０００８】このような訳で、既知のPDGFレセプターの
異ったPDGFのイソフォームに対して、また特にヒトPDGF
の主要なABヘテロダイマー型に対して反応する能力に関
して不確実性がある。報告された相異点に関しては、既
知のPDGF-R遺伝子生成物の翻訳後の処理が細胞特異的に
異なるか、または細胞の或るタイプにおいては附属蛋白
質が存在することによって説明されるであろう。その他
としては、種々の研究で報告されている結合特性がそれ
ぞれ異なる点は、異なったPDGFレセプターをエンコード
する２種の異った遺伝子の存在によって説明されるであ
ろう。
異ったPDGFのイソフォームに対して、また特にヒトPDGF
の主要なABヘテロダイマー型に対して反応する能力に関
して不確実性がある。報告された相異点に関しては、既
知のPDGF-R遺伝子生成物の翻訳後の処理が細胞特異的に
異なるか、または細胞の或るタイプにおいては附属蛋白
質が存在することによって説明されるであろう。その他
としては、種々の研究で報告されている結合特性がそれ
ぞれ異なる点は、異なったPDGFレセプターをエンコード
する２種の異った遺伝子の存在によって説明されるであ
ろう。
【０００９】上述のPDGFリガンドおよびレセプター活性
の複雑性、およびその際影響される正常な創傷治癒及び
結合組織の異常状態、例えば腫瘍の成長、動脈硬化症、
関節炎および繊維症からなる関連した過程を考えてみる
と、結合組織の成長の調節の機構に関する知識および解
析の改善を提供する方法と構成、およびバイオアッセイ
に対する必要性、また、究極的には内包されるPDGFレセ
プターにもとづく新規の診断および治療法に対する必要
性の存在することは明白である。
の複雑性、およびその際影響される正常な創傷治癒及び
結合組織の異常状態、例えば腫瘍の成長、動脈硬化症、
関節炎および繊維症からなる関連した過程を考えてみる
と、結合組織の成長の調節の機構に関する知識および解
析の改善を提供する方法と構成、およびバイオアッセイ
に対する必要性、また、究極的には内包されるPDGFレセ
プターにもとづく新規の診断および治療法に対する必要
性の存在することは明白である。
【００１０】上述の観察は特にPDGFレセプター成長の遺
伝学的基礎を徹底的に分析することがとりわけ必要であ
ることを示している。更に、チロシンキナーゼ活性を有
する膜伸張成長因子レセプターをエンコードする遺伝子
族、すなわち既知のPDGFレセプター遺伝子およびkit お
よびfms の腫瘍遺伝子からなる遺伝子族の新規の関連メ
ンバーを、保存されたチロシンキナーゼをエンコードす
る領域をプローブとして利用することによって同定し、
またクローニングできることは既に示されている(C.R.K
ing, M.H.Kraus, S.A.Aaronson, Science 229,974(198
5); G.D. Kruh et al., Science 234, 1545(1986)) 。
伝学的基礎を徹底的に分析することがとりわけ必要であ
ることを示している。更に、チロシンキナーゼ活性を有
する膜伸張成長因子レセプターをエンコードする遺伝子
族、すなわち既知のPDGFレセプター遺伝子およびkit お
よびfms の腫瘍遺伝子からなる遺伝子族の新規の関連メ
ンバーを、保存されたチロシンキナーゼをエンコードす
る領域をプローブとして利用することによって同定し、
またクローニングできることは既に示されている(C.R.K
ing, M.H.Kraus, S.A.Aaronson, Science 229,974(198
5); G.D. Kruh et al., Science 234, 1545(1986)) 。
【００１１】従って、本発明は主要なヒトPDGFの支配的
なエフェクターと思われるPDGFレセプター蛋白質の生成
法を発展させかつ上述のニーズを遂行するために組換え
DNA技術を応用することを企図している。本発明はま
た、治癒および病理学的過程に関連したこれらのレセプ
ターの分子メカニズムの応用も企図している。
なエフェクターと思われるPDGFレセプター蛋白質の生成
法を発展させかつ上述のニーズを遂行するために組換え
DNA技術を応用することを企図している。本発明はま
た、治癒および病理学的過程に関連したこれらのレセプ
ターの分子メカニズムの応用も企図している。
【００１２】特に、既知のPDGF-R遺伝子と関連するが、
異なっており並びにまた他のPDGF-R, kit およびfms 遺
伝子からなるチロシンキナーゼ遺伝子族のメンバーと関
連するが異なっている新しいヒト遺伝子のコード配列を
分離同定することが本発明の目的である。更に本発明の
目的は、PDGFを含む生理過程においてPDGFの既知および
新規の型の相対的役割を樹立するのに必要とされる分子
レベルの道具となるものを開発することである。
異なっており並びにまた他のPDGF-R, kit およびfms 遺
伝子からなるチロシンキナーゼ遺伝子族のメンバーと関
連するが異なっている新しいヒト遺伝子のコード配列を
分離同定することが本発明の目的である。更に本発明の
目的は、PDGFを含む生理過程においてPDGFの既知および
新規の型の相対的役割を樹立するのに必要とされる分子
レベルの道具となるものを開発することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は他のペプチド因
子を含有しない新規のPDGFレセプター（PDGF-R）蛋白質
の生成を含む組換DNA 技術の開発に関する。新しいDNA
セグメント、RNA 、およびバイオアッセイ法もまた包括
する。
子を含有しない新規のPDGFレセプター（PDGF-R）蛋白質
の生成を含む組換DNA 技術の開発に関する。新しいDNA
セグメント、RNA 、およびバイオアッセイ法もまた包括
する。
【００１４】特に本発明は、部分的には、 DNAセグメン
トに関し、以下の既知のレセプター遺伝子、即ち、PDGF
-R遺伝子と、コロニー形成促進因子-1レセプター（colo
nystimulating factor one receptor: CSF1-R)遺伝子
（fms 腫瘍遺伝子のある細胞型、c-fms としても知られ
る) と、kit 腫瘍遺伝子の細胞型（c-kit(C.J.Sherreta
l.,Cell 41, 665(1985); L.Coussens et al.,Nature 32
0, 277(1986); Y.Yarden et al., Nature 323, 226(198
6); P.Besmer et al., Nature 320, 415(1986);Y.Yarde
n et al., EMBO J. 6, 3341(1987))とからなる膜伸張チ
ロシンキナーゼレセプター遺伝子のサブファミリーの内
で新しいヒトレセプターの構造的および／または機能性
に特徴を有するメッセンジャーRNA(mRNA) および蛋白質
をエンコードする DNAセグメントに関する。
トに関し、以下の既知のレセプター遺伝子、即ち、PDGF
-R遺伝子と、コロニー形成促進因子-1レセプター（colo
nystimulating factor one receptor: CSF1-R)遺伝子
（fms 腫瘍遺伝子のある細胞型、c-fms としても知られ
る) と、kit 腫瘍遺伝子の細胞型（c-kit(C.J.Sherreta
l.,Cell 41, 665(1985); L.Coussens et al.,Nature 32
0, 277(1986); Y.Yarden et al., Nature 323, 226(198
6); P.Besmer et al., Nature 320, 415(1986);Y.Yarde
n et al., EMBO J. 6, 3341(1987))とからなる膜伸張チ
ロシンキナーゼレセプター遺伝子のサブファミリーの内
で新しいヒトレセプターの構造的および／または機能性
に特徴を有するメッセンジャーRNA(mRNA) および蛋白質
をエンコードする DNAセグメントに関する。
【００１５】より具体的には、本発明は、この成長因子
レセプターのサブファミリーに属する別のレセプターに
構造的に類似している予測された蛋白質生成物ととも
に、ゲノムDNA 配列または該ゲノムDNA から転写された
mRNAに相補的な DNA配列を( すなわち、cDNA）含有する
DNA セグメントを含む。これらのレセプターの中でも、
予測された新しい遺伝子生成物は、既知のPDGFレセプタ
ーに対して最も近い配列相同性を示す。
レセプターのサブファミリーに属する別のレセプターに
構造的に類似している予測された蛋白質生成物ととも
に、ゲノムDNA 配列または該ゲノムDNA から転写された
mRNAに相補的な DNA配列を( すなわち、cDNA）含有する
DNA セグメントを含む。これらのレセプターの中でも、
予測された新しい遺伝子生成物は、既知のPDGFレセプタ
ーに対して最も近い配列相同性を示す。
【００１６】更に本発明のDNA によってコードされた新
規の生成物は、正常な種々のタイプの細胞において既知
のPDGFレセプター遺伝子生成物とともに発現される。該
蛋白質生成物はPDGFに結合でき、また機能性にPDGFによ
って活性化され得る。しかし、種々のPDGFのイソフォー
ム(isoform) の活性は、ここでタイプαヒトPDGFレセプ
ターと命名する新しい生成物を、既に同定されているPD
GFと結合できるレセプターをエンコードする遺伝子の生
成物（以前にPDGFレセプターと呼ばれ、かつここでタイ
プβ PDGF レセプターと命名された既知のレセプターを
含む）から機能的に区別する。更にここに開示する相当
な証拠から、この新しい遺伝子生成物のタイプα PDGF
レセプターは、人体における最も豊富な型のPDGFに対す
る活性の主要なエフェクターであることが示される。
規の生成物は、正常な種々のタイプの細胞において既知
のPDGFレセプター遺伝子生成物とともに発現される。該
蛋白質生成物はPDGFに結合でき、また機能性にPDGFによ
って活性化され得る。しかし、種々のPDGFのイソフォー
ム(isoform) の活性は、ここでタイプαヒトPDGFレセプ
ターと命名する新しい生成物を、既に同定されているPD
GFと結合できるレセプターをエンコードする遺伝子の生
成物（以前にPDGFレセプターと呼ばれ、かつここでタイ
プβ PDGF レセプターと命名された既知のレセプターを
含む）から機能的に区別する。更にここに開示する相当
な証拠から、この新しい遺伝子生成物のタイプα PDGF
レセプターは、人体における最も豊富な型のPDGFに対す
る活性の主要なエフェクターであることが示される。
【００１７】本発明の一実施例の実施に際して、 DNAセ
グメントは適当な宿主細胞中で発現され、その結果、新
規のPDGFレセプター蛋白質を生成できる。本発明はま
た、本発明の DNAセグメントのセンス鎖(sense strand)
の転写の結果として生成されたmRNAにも関する。更に本
発明は、本発明の DNAセグメントに関連した遺伝子から
生成されるヒト細胞におけるmRNAおよび蛋白質の発現の
レベルを決定するための新規のバイオアッセイ法を包含
する。
グメントは適当な宿主細胞中で発現され、その結果、新
規のPDGFレセプター蛋白質を生成できる。本発明はま
た、本発明の DNAセグメントのセンス鎖(sense strand)
の転写の結果として生成されたmRNAにも関する。更に本
発明は、本発明の DNAセグメントに関連した遺伝子から
生成されるヒト細胞におけるmRNAおよび蛋白質の発現の
レベルを決定するための新規のバイオアッセイ法を包含
する。
【００１８】主要な実施例において、本発明は以下に例
示される如き新しいPDGFレセプターをエンコードする D
NAセグメントを含む。すなわち本発明は、正常ヒト胸腺
DNAゲノムクローンであってここではTll ゲノムクロー
ンと命名されるものと、Tllに含まれ、HF1, HB6, EF17
およびTR4 と命名された配列を含む細胞mRNAのヒトcDNA
クローンと、上述のヒト DNAセグメントのいずれかに対
するハイブリッド形成によって検出され、既知のPDGF関
連レセプター遺伝子を含まないレセプター遺伝子をエン
コードする関連 DNAセグメントとを含む。
示される如き新しいPDGFレセプターをエンコードする D
NAセグメントを含む。すなわち本発明は、正常ヒト胸腺
DNAゲノムクローンであってここではTll ゲノムクロー
ンと命名されるものと、Tllに含まれ、HF1, HB6, EF17
およびTR4 と命名された配列を含む細胞mRNAのヒトcDNA
クローンと、上述のヒト DNAセグメントのいずれかに対
するハイブリッド形成によって検出され、既知のPDGF関
連レセプター遺伝子を含まないレセプター遺伝子をエン
コードする関連 DNAセグメントとを含む。
【００１９】Tll クローンに関連するヒト遺伝子を今後
Tll 遺伝子と呼び、また“T11"の言葉を形容詞として使
用する場合は、“Tll ゲノムクローン”に特別言及する
ことがなければ、上述の本発明の DNAセグメントのいづ
れかを含むことを意味する。
Tll 遺伝子と呼び、また“T11"の言葉を形容詞として使
用する場合は、“Tll ゲノムクローン”に特別言及する
ことがなければ、上述の本発明の DNAセグメントのいづ
れかを含むことを意味する。
【００２０】今一つの実施例において、本発明はベクタ
ーと本発明の DNAからなる組換 DNA分子に関する。これ
らの組換分子は、Tll 遺伝子関連のゲノムクローンまた
はcDNAクローン及び次のベクターDNA のいずれか、−即
ちλファージクローニングベクターまたは挿入されたDN
A を哺乳類細胞中に発現できる発現ベクター−からなる
分子によって例示される。
ーと本発明の DNAからなる組換 DNA分子に関する。これ
らの組換分子は、Tll 遺伝子関連のゲノムクローンまた
はcDNAクローン及び次のベクターDNA のいずれか、−即
ちλファージクローニングベクターまたは挿入されたDN
A を哺乳類細胞中に発現できる発現ベクター−からなる
分子によって例示される。
【００２１】なお、今一つ他の実施例において、本発明
は、細胞、好ましくは哺乳類細胞であって本発明の DNA
で形質転換した細胞を含む。更に本発明は、酵母細胞お
よび、バクテリア細胞を含む細胞、例えばE.coliまたは
B.subtilisの細胞で、本発明のDNA で形質転換した細胞
を含む。本発明の今一つの実施例によれば、形質転換DN
A はこの細胞中において発現され、それにより本DNA に
よってエンコードされたPDGF-R蛋白質の量をこの細胞内
において増加することができる。
は、細胞、好ましくは哺乳類細胞であって本発明の DNA
で形質転換した細胞を含む。更に本発明は、酵母細胞お
よび、バクテリア細胞を含む細胞、例えばE.coliまたは
B.subtilisの細胞で、本発明のDNA で形質転換した細胞
を含む。本発明の今一つの実施例によれば、形質転換DN
A はこの細胞中において発現され、それにより本DNA に
よってエンコードされたPDGF-R蛋白質の量をこの細胞内
において増加することができる。
【００２２】また更に、本発明は、本発明の DNAの発現
によりまたは本発明のRNA の翻訳によって作られた新規
のPDGF-R蛋白質を含む。これらのレセプターは機能の研
究に使用でき、更に生化学的および機能の分析、例えば
レセプター定性的および定量的な結合アッセイのために
精製することが可能である。
によりまたは本発明のRNA の翻訳によって作られた新規
のPDGF-R蛋白質を含む。これらのレセプターは機能の研
究に使用でき、更に生化学的および機能の分析、例えば
レセプター定性的および定量的な結合アッセイのために
精製することが可能である。
【００２３】特に、これらのαタイプのPDGFレセプター
は、ヒトPDGFの主要型を含む種々のPDGFのイソフォーム
の潜在的類似体（拮抗体(antagonist)またはアゴニス
ト）のレセプター結合および活性化活性をテストするこ
とによって、PDGFとそのレセプターが含まれる異常な過
程を含む症状の治療の開発に使用できるであろう。
は、ヒトPDGFの主要型を含む種々のPDGFのイソフォーム
の潜在的類似体（拮抗体(antagonist)またはアゴニス
ト）のレセプター結合および活性化活性をテストするこ
とによって、PDGFとそのレセプターが含まれる異常な過
程を含む症状の治療の開発に使用できるであろう。
【００２４】本発明のこの側面によれば、この新しいPD
GF-R蛋白質は本発明の“非変性(unmodified)”のDNA お
よびmRNAの蛋白質生成物であることが可能で、これらの
蛋白質は変性されまたは遺伝子工学的に操作された蛋白
質生成物であることも可能である。 DNA配列を工学的方
法で変異させた結果として、変性されたPDGF-R蛋白質
は、対応する天然の“野性型(wild-type) ”蛋白質と
は、アミノ酸配列中に１個またはそれ以上の相異点を有
している。これらの相異点は、変性された遺伝子生成物
に機能性な相異、例えばそれらの製造能力の改善または
バイオアッセイでの使用に対する好適性を付与しうる。
GF-R蛋白質は本発明の“非変性(unmodified)”のDNA お
よびmRNAの蛋白質生成物であることが可能で、これらの
蛋白質は変性されまたは遺伝子工学的に操作された蛋白
質生成物であることも可能である。 DNA配列を工学的方
法で変異させた結果として、変性されたPDGF-R蛋白質
は、対応する天然の“野性型(wild-type) ”蛋白質と
は、アミノ酸配列中に１個またはそれ以上の相異点を有
している。これらの相異点は、変性された遺伝子生成物
に機能性な相異、例えばそれらの製造能力の改善または
バイオアッセイでの使用に対する好適性を付与しうる。
【００２５】本発明はまた、本発明のDNA 関連遺伝子の
発現検出のための新規のバイオアッセイ法に関する。こ
のような一つの実施例によれば、本発明のDNA 、特に最
も好しいDNA は、既知のPDGFレセプター遺伝子のmRNAに
さまたげられることなく、タイプα PDGF レセプター関
連のmRNAの特定のレベルを決定するプローブとして使用
することができる。このようなバイオアッセイは、例え
ば、種々のクラスの腫瘍細胞または結合組織の成長およ
び／または治癒反応における遺伝的欠陥の同定に有用で
あろう。
発現検出のための新規のバイオアッセイ法に関する。こ
のような一つの実施例によれば、本発明のDNA 、特に最
も好しいDNA は、既知のPDGFレセプター遺伝子のmRNAに
さまたげられることなく、タイプα PDGF レセプター関
連のmRNAの特定のレベルを決定するプローブとして使用
することができる。このようなバイオアッセイは、例え
ば、種々のクラスの腫瘍細胞または結合組織の成長およ
び／または治癒反応における遺伝的欠陥の同定に有用で
あろう。
【００２６】本発明は更に、本発明の DNAセグメントま
たは関連DNA によってエンコードされたペプチドに対し
て作られた新しい抗体類を含む。本発明のこの実施例に
おいては、抗体類はモノクロナールまたはポリクロナー
ル起源であり、また天然、組換または合成化的方法によ
るPDGFレセプター関連ポリペプチドを使用して生成され
る。これらの抗体は、このようなポリペプチドの配列を
含むPDGF-R蛋白質に特異的に結合する。望ましくは、こ
れらの抗体は、αタイプのPDGFレセプター蛋白質に対し
てのみ、またはその他の場合としてβタイプのPDGFレセ
プター蛋白質にだけ結合する。また、本発明の望ましい
抗体類は、その蛋白質がそれの生来の（生物学的に活性
の) コンホメーションで存在する場合にPDGFレセプター
蛋白質に結合する。
たは関連DNA によってエンコードされたペプチドに対し
て作られた新しい抗体類を含む。本発明のこの実施例に
おいては、抗体類はモノクロナールまたはポリクロナー
ル起源であり、また天然、組換または合成化的方法によ
るPDGFレセプター関連ポリペプチドを使用して生成され
る。これらの抗体は、このようなポリペプチドの配列を
含むPDGF-R蛋白質に特異的に結合する。望ましくは、こ
れらの抗体は、αタイプのPDGFレセプター蛋白質に対し
てのみ、またはその他の場合としてβタイプのPDGFレセ
プター蛋白質にだけ結合する。また、本発明の望ましい
抗体類は、その蛋白質がそれの生来の（生物学的に活性
の) コンホメーションで存在する場合にPDGFレセプター
蛋白質に結合する。
【００２７】本発明の抗体類の断片、例えば抗原結合活
性を保持し、本技術分野において既知の方法によって調
製の可能なFab または F(ab)′断片もまた本発明の範囲
内に入る。更に本発明は、本発明の抗体類またはそれら
の活性断片の薬剤としての配合よりなるが、これらは本
技術分野において公知であるポリペプチドを投与するた
めの薬剤を調製する材料と方法を使用して調製でき、ま
た余計な実験を行うことなく本抗体類の投与に容易に適
応することが可能である。
性を保持し、本技術分野において既知の方法によって調
製の可能なFab または F(ab)′断片もまた本発明の範囲
内に入る。更に本発明は、本発明の抗体類またはそれら
の活性断片の薬剤としての配合よりなるが、これらは本
技術分野において公知であるポリペプチドを投与するた
めの薬剤を調製する材料と方法を使用して調製でき、ま
た余計な実験を行うことなく本抗体類の投与に容易に適
応することが可能である。
【００２８】これらの抗体類、およびこれらの活性断片
は、例えば、新しいαタイプのPDGFレセプターか、また
はその代りに既知のβタイプのPDGFレセプターのいづれ
かを特異的な方法で検出し、あるいは精製するのに使用
できる。また、かかる抗体類は、高レベルのPDGFレセプ
ターを有する組織に対して薬剤を集中させるための本技
術分野における既知の種々の方法において、例えば、こ
のような抗体と細胞を殺す薬剤との複合体を使用して適
当な腫瘍を治療する際に、使用することができる。
は、例えば、新しいαタイプのPDGFレセプターか、また
はその代りに既知のβタイプのPDGFレセプターのいづれ
かを特異的な方法で検出し、あるいは精製するのに使用
できる。また、かかる抗体類は、高レベルのPDGFレセプ
ターを有する組織に対して薬剤を集中させるための本技
術分野における既知の種々の方法において、例えば、こ
のような抗体と細胞を殺す薬剤との複合体を使用して適
当な腫瘍を治療する際に、使用することができる。
【００２９】
【実施例】本発明のDNA は、Tll ゲノムのクローン、お
よび、Tll ゲノムのクローンに含まれた配列を有する細
胞mRNAクローンのヒトcDNAクローンからなるHF1, HB6,
EF17およびTR4 クローンとここで呼ばれるDNA によって
例示される。Tll ゲノムのクローンおよびTR4 cDNAクロ
ーンは、本発明における好ましいDNA である。pT11-HP
(ゲノムクローンTll のHind III- Pst I 0.95-kbp断片)
と命名されたクローンおよびTll cDNAからの特定の制
限断片（エンコードする全域を含むTR4 の3.5-kbp Bam
HI断片）は、本発明の中で最も好ましいDNA である。HF
1, HB6, EF17およびTR4 のcDNAクローンの制限酵素によ
る消化地図、およびこれらのゲノムクローンTll に対す
るマッピングの関係を図２に表わす。Tll 遺伝子関連の
最大のcDNAクローンである、TR4 cDNAクローンについて
センス鎖(sense strand) DNAヌクレオチド配列および予
想され、エンコードされた主要蛋白質配列を図３から図
１２に示す。
よび、Tll ゲノムのクローンに含まれた配列を有する細
胞mRNAクローンのヒトcDNAクローンからなるHF1, HB6,
EF17およびTR4 クローンとここで呼ばれるDNA によって
例示される。Tll ゲノムのクローンおよびTR4 cDNAクロ
ーンは、本発明における好ましいDNA である。pT11-HP
(ゲノムクローンTll のHind III- Pst I 0.95-kbp断片)
と命名されたクローンおよびTll cDNAからの特定の制
限断片（エンコードする全域を含むTR4 の3.5-kbp Bam
HI断片）は、本発明の中で最も好ましいDNA である。HF
1, HB6, EF17およびTR4 のcDNAクローンの制限酵素によ
る消化地図、およびこれらのゲノムクローンTll に対す
るマッピングの関係を図２に表わす。Tll 遺伝子関連の
最大のcDNAクローンである、TR4 cDNAクローンについて
センス鎖(sense strand) DNAヌクレオチド配列および予
想され、エンコードされた主要蛋白質配列を図３から図
１２に示す。
【００３０】実験セクションで記載するように、Tll ゲ
ノムクローンは、制限酵素の Eco RI の認識部位によっ
て境界づけられた12-kbp配列を含む正常ヒト胸腺 DNAゲ
ノム断片のクローンを含むが、その断片はウィルス腫瘍
遺伝子v-/fmsおよびマウスの細胞PDGF-R遺伝子（図１を
参照) のチロシンキナーゼ領域に由来する DNAプローブ
と他の断片に比して、ブロット法ハイブリッド形成によ
る分析に際してはるかに強くハイブリッドした（図１参
照）。Tll ゲノムのクローンは、mRNAに見出されない介
在遺伝子配列（すなわちイントロン）に加えて、Tll 遺
伝子のmRNA生成物に見出される配列のブロック（すなわ
ちエキソン）のほとんどを含む。
ノムクローンは、制限酵素の Eco RI の認識部位によっ
て境界づけられた12-kbp配列を含む正常ヒト胸腺 DNAゲ
ノム断片のクローンを含むが、その断片はウィルス腫瘍
遺伝子v-/fmsおよびマウスの細胞PDGF-R遺伝子（図１を
参照) のチロシンキナーゼ領域に由来する DNAプローブ
と他の断片に比して、ブロット法ハイブリッド形成によ
る分析に際してはるかに強くハイブリッドした（図１参
照）。Tll ゲノムのクローンは、mRNAに見出されない介
在遺伝子配列（すなわちイントロン）に加えて、Tll 遺
伝子のmRNA生成物に見出される配列のブロック（すなわ
ちエキソン）のほとんどを含む。
【００３１】本発明の他のDNA は、本発明のTll 関連の
ゲノムまたはcDNAクローンおよび次のDNA ベクターのい
づれか：例えばλバクテリオファージクローニングベク
ター（例証としてλEMBL4 またはλgt11）、または〔挿
入されたDNA を哺乳類（例えば、cos-1)細胞において発
現できる〕哺乳類発現ベクター( 例えば、猿のsarcoma
ウィルスプロモーターを工学的に組入れたpSV2gpt ベク
ター）からなる組換分子を包含する。
ゲノムまたはcDNAクローンおよび次のDNA ベクターのい
づれか：例えばλバクテリオファージクローニングベク
ター（例証としてλEMBL4 またはλgt11）、または〔挿
入されたDNA を哺乳類（例えば、cos-1)細胞において発
現できる〕哺乳類発現ベクター( 例えば、猿のsarcoma
ウィルスプロモーターを工学的に組入れたpSV2gpt ベク
ター）からなる組換分子を包含する。
【００３２】ゲノムのクローンT11DNAは、当該技術分野
において公知の標準的な遺伝子クローニング法により、
すなわち Eco RI で消化された正常ヒト胸腺DNA(蔗糖密
度勾配法によっ大きさが選別され、EMBL-4ベクター系へ
とクローン化されたもの）より構成されたゲノムライブ
ラリーから分離された。λTll クローンは、v-fms およ
びマウスPDGF-Rプローブを用いるハイブリッド形成を基
礎にして同定され、緩和されてはいるが緊縮されていな
いハイブリッド形成の条件のもとでのみ行なわれた。更
なるクローニングの戦略およびプローブの詳細を、以下
およびそれにつづく実験セクションで提供する。
において公知の標準的な遺伝子クローニング法により、
すなわち Eco RI で消化された正常ヒト胸腺DNA(蔗糖密
度勾配法によっ大きさが選別され、EMBL-4ベクター系へ
とクローン化されたもの）より構成されたゲノムライブ
ラリーから分離された。λTll クローンは、v-fms およ
びマウスPDGF-Rプローブを用いるハイブリッド形成を基
礎にして同定され、緩和されてはいるが緊縮されていな
いハイブリッド形成の条件のもとでのみ行なわれた。更
なるクローニングの戦略およびプローブの詳細を、以下
およびそれにつづく実験セクションで提供する。
【００３３】pHF1と命名される、HF1 cDNAクローンを含
むプラスミドは公知の標準的方法により、本発明の中で
最も好ましいDNA のλTll の0.9-kbp Hind III-Pst I
断片を使用してOkayama-Berg発現ベクターの中で、正常
ヒト繊維芽細胞cDNAライブラリーから緊縮条件のもとで
分離された。これは正常ヒト繊維芽細胞(fibroblast)に
おける6.4-kbRNA 転写体にハイブリッドした3.9-kbp cD
NA挿入片を含み、その３′末端にpoly(A) 尾部が後続し
ているポリアデニル化シグナルを含む。これはまたλT1
1DNA内にコード配列およびCSF1-R関連の 170個のヌクレ
オチドおよびエキソン(a) 上流のPDGF-Rチロシンキナー
ゼ領域を含む。
むプラスミドは公知の標準的方法により、本発明の中で
最も好ましいDNA のλTll の0.9-kbp Hind III-Pst I
断片を使用してOkayama-Berg発現ベクターの中で、正常
ヒト繊維芽細胞cDNAライブラリーから緊縮条件のもとで
分離された。これは正常ヒト繊維芽細胞(fibroblast)に
おける6.4-kbRNA 転写体にハイブリッドした3.9-kbp cD
NA挿入片を含み、その３′末端にpoly(A) 尾部が後続し
ているポリアデニル化シグナルを含む。これはまたλT1
1DNA内にコード配列およびCSF1-R関連の 170個のヌクレ
オチドおよびエキソン(a) 上流のPDGF-Rチロシンキナー
ゼ領域を含む。
【００３４】cDNAクローンであるλHB6 は、ヒト小児脳
cDNAライブラリーをλgt11ベクター中でスクリーニング
するために、クローンHF1 の0.4-kbp ５′末端を使用す
る標準的方法によって分離された。
cDNAライブラリーをλgt11ベクター中でスクリーニング
するために、クローンHF1 の0.4-kbp ５′末端を使用す
る標準的方法によって分離された。
【００３５】今１つのcDNAクローンであるλEF17は、mR
NAの鋳型上で DNA合成のランダムなプライミングおよび
λgtllベクター中のクローニングによって調製されたヒ
ト胎児繊維芽細胞（M426細胞系）のcDNAライブラリーを
λHB6 の0.2-Kbp ５′断片をプローブとしてスクリーニ
ングすることによって分離された。可能なATG の開始コ
ドンはEF17内部で同定された。３種のオーバーラップし
たクローン（pHF1, λHB6 及びλEF17) は、翻訳されな
い配列の138-bp５′および３′の3-kbp に加えて、全コ
ード領域を含む（図２) 。
NAの鋳型上で DNA合成のランダムなプライミングおよび
λgtllベクター中のクローニングによって調製されたヒ
ト胎児繊維芽細胞（M426細胞系）のcDNAライブラリーを
λHB6 の0.2-Kbp ５′断片をプローブとしてスクリーニ
ングすることによって分離された。可能なATG の開始コ
ドンはEF17内部で同定された。３種のオーバーラップし
たクローン（pHF1, λHB6 及びλEF17) は、翻訳されな
い配列の138-bp５′および３′の3-kbp に加えて、全コ
ード領域を含む（図２) 。
【００３６】cDNAクローンのTR4 は、“phagemid”（フ
ァージとプラスミドのハイブリッド）ベクター中でM426
ヒト胎児繊維芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニング
するためにλEF17の５′0.2-kbp のサブフラグメントを
使用して得られた（米国特許出願の内容、No. 07/386,0
53、標題“効率的指向性クローニング系 (EfficientDir
ectional Cloning System) ”1989年７月28日出願) 。
6.4-kbp TR4 cDNAクローンは、ヌクレオチド部位139 に
おいて可能なAT開始コドンで始まり、3406部位のTAA 終
止コドンまで伸びる開いた読みとり枠を含む（図３から
図１２参照）。更に最初の23個のアミノ酸は、切断可能
な疎水性のシグナルペプチド特性を発揮した（図３から
図１２および図１３）。この開いた読みとり枠には、翻
訳されない配列の-3-kbpおよびcDNAの３′末端のpoly
(A) 配列からヌクレオチド25個分上流に位置するポリア
デニル化シグナル（AATAAA）が続いた。
ァージとプラスミドのハイブリッド）ベクター中でM426
ヒト胎児繊維芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニング
するためにλEF17の５′0.2-kbp のサブフラグメントを
使用して得られた（米国特許出願の内容、No. 07/386,0
53、標題“効率的指向性クローニング系 (EfficientDir
ectional Cloning System) ”1989年７月28日出願) 。
6.4-kbp TR4 cDNAクローンは、ヌクレオチド部位139 に
おいて可能なAT開始コドンで始まり、3406部位のTAA 終
止コドンまで伸びる開いた読みとり枠を含む（図３から
図１２参照）。更に最初の23個のアミノ酸は、切断可能
な疎水性のシグナルペプチド特性を発揮した（図３から
図１２および図１３）。この開いた読みとり枠には、翻
訳されない配列の-3-kbpおよびcDNAの３′末端のpoly
(A) 配列からヌクレオチド25個分上流に位置するポリア
デニル化シグナル（AATAAA）が続いた。
【００３７】cDNA発現プラスミドは、ヌクレオチドの１
から3454迄（図３から図１２）を包含するTll 関連cDNA
をpSV2gpt ベクター中に導入することにより当該技術分
野において公知の標準的クローニング法を使用して組立
てられたが、pSV2gpt ベクター中にはサルのsarcoma ウ
ィルスの長い反覆末端（LTR)が、以前に詳細に記載した
ようにしてプロモーターとして工学的に組入れられた
(C.R.Kig,N.A.Giese,K.C.Robbins, S.A.Aaronson, Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA 82, 5295(1985)) 。
から3454迄（図３から図１２）を包含するTll 関連cDNA
をpSV2gpt ベクター中に導入することにより当該技術分
野において公知の標準的クローニング法を使用して組立
てられたが、pSV2gpt ベクター中にはサルのsarcoma ウ
ィルスの長い反覆末端（LTR)が、以前に詳細に記載した
ようにしてプロモーターとして工学的に組入れられた
(C.R.Kig,N.A.Giese,K.C.Robbins, S.A.Aaronson, Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA 82, 5295(1985)) 。
【００３８】本発明のDNA およびセンス鎖のRNA は、当
該技術分野において既知の蛋白質生成方法と組合わせ
て、他のPDGFレセプターの不在の下で、新しい遺伝子か
ら機能性タイプα PDGF-R 蛋白質を発現する細胞を作る
ために使用できる。これらの新規のレセプターは、細胞
における機能の研究、例えば定性および定量のレセプタ
ー結合アッセイに使用できる。従って、本発明のこの側
面における実施例の１つは、好ましくは哺乳類の細胞で
あって、本発明の DNAにより形質転換され、そこにおい
て形質転換DNA を発現できる細胞を含む。Tll 関連cDNA
を保持するpSV2gpt ベクターで形質転換した哺乳類細胞
（cos-1)は、公知の方法に従って調製され、185kd およ
び160kd 種(species) （図１６の（Ｂ））としてTll 遺
伝子生成物を発現することが示された。これらの生成物
は、以下の実験セクション図１７参照）に示される如
く、血小板から分離されたヒトPDGFと結合することがで
きた。
該技術分野において既知の蛋白質生成方法と組合わせ
て、他のPDGFレセプターの不在の下で、新しい遺伝子か
ら機能性タイプα PDGF-R 蛋白質を発現する細胞を作る
ために使用できる。これらの新規のレセプターは、細胞
における機能の研究、例えば定性および定量のレセプタ
ー結合アッセイに使用できる。従って、本発明のこの側
面における実施例の１つは、好ましくは哺乳類の細胞で
あって、本発明の DNAにより形質転換され、そこにおい
て形質転換DNA を発現できる細胞を含む。Tll 関連cDNA
を保持するpSV2gpt ベクターで形質転換した哺乳類細胞
（cos-1)は、公知の方法に従って調製され、185kd およ
び160kd 種(species) （図１６の（Ｂ））としてTll 遺
伝子生成物を発現することが示された。これらの生成物
は、以下の実験セクション図１７参照）に示される如
く、血小板から分離されたヒトPDGFと結合することがで
きた。
【００３９】実験セクションの他の研究によれば、本発
明のDNA は、PDGFレセプターの存在しない他の細胞中に
タイプαPDGFレセプター遺伝子機能を再構成するのに使
用可能で、また各々のαまたはβタイプのレセプター
は、細胞分裂シグナルの形質導入、走化性およびホスホ
イノシチドのターンオーバーの刺激を含む既知のPDGFの
主要な活性を有効に仲介することが更に示されている。
更にこれらの研究によって、タイプαのPDGFレセプター
が血小板由来のヒトPDGFの主要な型に対する主なレセプ
ターであることが明らかになっている。
明のDNA は、PDGFレセプターの存在しない他の細胞中に
タイプαPDGFレセプター遺伝子機能を再構成するのに使
用可能で、また各々のαまたはβタイプのレセプター
は、細胞分裂シグナルの形質導入、走化性およびホスホ
イノシチドのターンオーバーの刺激を含む既知のPDGFの
主要な活性を有効に仲介することが更に示されている。
更にこれらの研究によって、タイプαのPDGFレセプター
が血小板由来のヒトPDGFの主要な型に対する主なレセプ
ターであることが明らかになっている。
【００４０】かくして、遺伝子発現方法における本発明
のDNA 、特にここであげられた有利なTR4 cDNAクローン
をこのように使用することによって、当該分野に習熟し
た人々は、PDGFの調節過程のメカニズムを決定し、新規
なPDGFレセプター蛋白質を大量に成長するために、不要
な実験をくりかえすことなく、本発明の範囲内の細胞系
を構築することができる。
のDNA 、特にここであげられた有利なTR4 cDNAクローン
をこのように使用することによって、当該分野に習熟し
た人々は、PDGFの調節過程のメカニズムを決定し、新規
なPDGFレセプター蛋白質を大量に成長するために、不要
な実験をくりかえすことなく、本発明の範囲内の細胞系
を構築することができる。
【００４１】本発明は更に、本発明のDNA に関連したの
遺伝子の発現を検出するための新規のバイオアッセイ法
を含む。このような実施例によれば、本発明のDNA は関
連mRNAのレベルを決定するプローブとして使用されう
る。この実施例は、Tll のmRNA種と正常および腫瘍細胞
における既知のPDGF-R遺伝子の比較によって例証される
（図１５）。全体またはポリアデニル化されたRNA は、
ホルムアルデヒド中での変性ゲル電気泳動によって分離
し(H.D.Lehrach,D.Diamond, J.M.Wozney,H.Boedker,Bio
chemistry 16, 4743(1977)) 、ニトロセルローズに移行
し、緊縮条件のもとで32P でラベルしたプローブでハイ
ブリッドさせた。該プローブは、以下の本発明のDNA の
いづれか、例えばクローンpT11-HP(ゲノムのクローンTl
l の0.95-kbp Hind III-Pst I 断片）から；またはTll
cDNA（コード領域全体を含むTR4 の3.5-kbp Bam HI断
片）から調製した。
遺伝子の発現を検出するための新規のバイオアッセイ法
を含む。このような実施例によれば、本発明のDNA は関
連mRNAのレベルを決定するプローブとして使用されう
る。この実施例は、Tll のmRNA種と正常および腫瘍細胞
における既知のPDGF-R遺伝子の比較によって例証される
（図１５）。全体またはポリアデニル化されたRNA は、
ホルムアルデヒド中での変性ゲル電気泳動によって分離
し(H.D.Lehrach,D.Diamond, J.M.Wozney,H.Boedker,Bio
chemistry 16, 4743(1977)) 、ニトロセルローズに移行
し、緊縮条件のもとで32P でラベルしたプローブでハイ
ブリッドさせた。該プローブは、以下の本発明のDNA の
いづれか、例えばクローンpT11-HP(ゲノムのクローンTl
l の0.95-kbp Hind III-Pst I 断片）から；またはTll
cDNA（コード領域全体を含むTR4 の3.5-kbp Bam HI断
片）から調製した。
【００４２】従って、本発明のDNA およびRNA 〔特にこ
こであげられた最も好ましいDNA 〕を既知のハイブリッ
ド形成法を使用することによりいわゆる当業者は、無駄
な実験をくりかえすことなく、タイプαのPDGF-R遺伝子
の発現レベルを、タイプβのPDGF-R遺伝子または他の関
連腫瘍遺伝子のmRNAから妨害されることなく測定でき
る。
こであげられた最も好ましいDNA 〕を既知のハイブリッ
ド形成法を使用することによりいわゆる当業者は、無駄
な実験をくりかえすことなく、タイプαのPDGF-R遺伝子
の発現レベルを、タイプβのPDGF-R遺伝子または他の関
連腫瘍遺伝子のmRNAから妨害されることなく測定でき
る。
【００４３】本発明はまた、本発明の DNAセグメントま
たは他の関連DNA によってエンコードされたペプチドに
対する新規の抗体類を含む。本発明によるこの実施例
は、タイプαのPDGF-R蛋白質またはその代りとして、こ
こではタイプβと命名された既知のPDGF-R蛋白質に特異
的に結合する抗体類を含むウサギ抗血清によって例証さ
れる。
たは他の関連DNA によってエンコードされたペプチドに
対する新規の抗体類を含む。本発明によるこの実施例
は、タイプαのPDGF-R蛋白質またはその代りとして、こ
こではタイプβと命名された既知のPDGF-R蛋白質に特異
的に結合する抗体類を含むウサギ抗血清によって例証さ
れる。
【００４４】かかるタイプ特異的な抗血清(type specif
ic anti-sera) は、それぞれのPDGF-R蛋白質（図３から
１２に示されたタイプα配列の959-973 残基およびそれ
ぞれのcDNA配列によって予測される、既知の対応するタ
イプβ配列の967-981 残基）のカルボキシル末端領域か
ら15のアミノ酸配列を示す合成ペプチドに対して作られ
た。これらのペプチドは、次の基準に合致するように選
択された。即ち２種のPDGF-Rタイプ間の配列関連性の欠
除（50％以下の配列の相同性);相対親水性、およびもと
の蛋白質と反応性の抗体を成長する比較的高い可能性と
関連することが知られているカルボキシル末端の配置で
ある。
ic anti-sera) は、それぞれのPDGF-R蛋白質（図３から
１２に示されたタイプα配列の959-973 残基およびそれ
ぞれのcDNA配列によって予測される、既知の対応するタ
イプβ配列の967-981 残基）のカルボキシル末端領域か
ら15のアミノ酸配列を示す合成ペプチドに対して作られ
た。これらのペプチドは、次の基準に合致するように選
択された。即ち２種のPDGF-Rタイプ間の配列関連性の欠
除（50％以下の配列の相同性);相対親水性、およびもと
の蛋白質と反応性の抗体を成長する比較的高い可能性と
関連することが知られているカルボキシル末端の配置で
ある。
【００４５】ペプチドに対する抗血清は、ペプチドを化
学的に合成し、それらを担体（thyroglobulin)に結合さ
せ、かつペプチド免疫の標準の方法に従って、完全なFr
eundのアジュバントとともに、ペプチド結合体をウサギ
に注射することによって調製された。
学的に合成し、それらを担体（thyroglobulin)に結合さ
せ、かつペプチド免疫の標準の方法に従って、完全なFr
eundのアジュバントとともに、ペプチド結合体をウサギ
に注射することによって調製された。
【００４６】これらの抗体は、蛋白質生成物の検出また
は精製に使用できる。かくして図１６は、対応するタイ
プ特異的ペプチドに対して作られた２種の異ったウサギ
抗体〔抗Tll （タイプαのPDGF-R）および抗-HPR（タイ
プβのPDGF-R）〕のWesternブロット実験における使い
方を示す。図から明らかなように、特定のPDGF-Rタイプ
は、合成ペプチドで免疫したウサギ抗血清によって種々
の細胞中に特異的に検出される。
は精製に使用できる。かくして図１６は、対応するタイ
プ特異的ペプチドに対して作られた２種の異ったウサギ
抗体〔抗Tll （タイプαのPDGF-R）および抗-HPR（タイ
プβのPDGF-R）〕のWesternブロット実験における使い
方を示す。図から明らかなように、特定のPDGF-Rタイプ
は、合成ペプチドで免疫したウサギ抗血清によって種々
の細胞中に特異的に検出される。
【００４７】実験セクション 本セクションは、PDGFレセプター／CSF-1 レセプターの
サブファミリーのレセプターに類似した新規な遺伝子の
ゲノム配列およびcDNAの同定およびクローニングのため
の実験的研究について記載する。本遺伝子によって正常
ヒト組織中に既知の5.3-kb PDGF レセプターmRNAととも
に発現する6.4-kb RNA転写体を生ずる。この新規のPDGF
レセプター遺伝子は、先祖関係のある染色体４および５
の上に存在するこのレセプターサブファミリーのその他
の遺伝子のクラスタと両立し、染色体４の4q11-12 の位
置の染色体４に局在した。
サブファミリーのレセプターに類似した新規な遺伝子の
ゲノム配列およびcDNAの同定およびクローニングのため
の実験的研究について記載する。本遺伝子によって正常
ヒト組織中に既知の5.3-kb PDGF レセプターmRNAととも
に発現する6.4-kb RNA転写体を生ずる。この新規のPDGF
レセプター遺伝子は、先祖関係のある染色体４および５
の上に存在するこのレセプターサブファミリーのその他
の遺伝子のクラスタと両立し、染色体４の4q11-12 の位
置の染色体４に局在した。
【００４８】クローンされたcDNAに機能性のあること
は、COS-1 細胞に新規な遺伝子のcDNAを導入することに
よって（ウィルスのベクターを使用するトランスフェク
ションによる）、蛋白質の発現が、予測されたペプチド
に対する抗血清により特異的に検出されるという観察結
果によって示される。トランスフェクトされたが、対照
区ではないCOS-1 細胞は、 125Ｉ−ヒトPDGFと特異的結
合を示すが、このPDGFはヒト血小板で見出された主要な
AB型を含む３種のPDGFイソフォームのすべてによって有
効に競合される。対照的に、COS-1 細胞における既知の
PDGFレセプターcDNAの発現は、PDGFのBB型に対する顕著
な選好性を特徴とする、同一のPDGFイソフォームによる
異なった競合パターンを有するPDGF結合を引きおこす。
は、COS-1 細胞に新規な遺伝子のcDNAを導入することに
よって（ウィルスのベクターを使用するトランスフェク
ションによる）、蛋白質の発現が、予測されたペプチド
に対する抗血清により特異的に検出されるという観察結
果によって示される。トランスフェクトされたが、対照
区ではないCOS-1 細胞は、 125Ｉ−ヒトPDGFと特異的結
合を示すが、このPDGFはヒト血小板で見出された主要な
AB型を含む３種のPDGFイソフォームのすべてによって有
効に競合される。対照的に、COS-1 細胞における既知の
PDGFレセプターcDNAの発現は、PDGFのBB型に対する顕著
な選好性を特徴とする、同一のPDGFイソフォームによる
異なった競合パターンを有するPDGF結合を引きおこす。
【００４９】新しいレセプター遺伝子が独特のPDGFレセ
プターをエンコードするという更なる証拠は、元来PDGF
レセプターのないヒトの細胞の調査に由来しているが、
その場合PDGFレセプターの活性は、それぞれのcDNAをに
なうベクターを使用し、トランスフェクトすることによ
って導入されたタイプαまたはタイプβのレセプターに
よって再構成される。タイプαのレセプターを有する細
胞は、以下のPDGFにより仲介される細胞活性のすべて、
すなわちレセプター遺伝子生成物のチロシンの燐酸化、
DNA合成およびその結果としての細胞増殖の刺激、走化
性、ホスホイノシチド(phosphoinositide)の分解、およ
びサイトゾルのカルシウムの起動（〔Ca+ 〕i)におい
て、PDGF-AB に対して相当により高い反応性を有する。
プターをエンコードするという更なる証拠は、元来PDGF
レセプターのないヒトの細胞の調査に由来しているが、
その場合PDGFレセプターの活性は、それぞれのcDNAをに
なうベクターを使用し、トランスフェクトすることによ
って導入されたタイプαまたはタイプβのレセプターに
よって再構成される。タイプαのレセプターを有する細
胞は、以下のPDGFにより仲介される細胞活性のすべて、
すなわちレセプター遺伝子生成物のチロシンの燐酸化、
DNA合成およびその結果としての細胞増殖の刺激、走化
性、ホスホイノシチド(phosphoinositide)の分解、およ
びサイトゾルのカルシウムの起動（〔Ca+ 〕i)におい
て、PDGF-AB に対して相当により高い反応性を有する。
【００５０】かくして、再構成されたPDGF-R遺伝子生成
物の各々のタイプは、PDGF-BB に対して独自に同様な生
化学的並びに生物学的反応を誘発するが、タイプαのPD
GF-Rは、血小板に見出されるヒトPDGFの主要なイソフォ
ームであるPDGF-AB についてより好ましいレセプターで
ある。従って、タイプαのPDGFレセプターの構造または
発現の異常性は、深刻な病理学的影響を有するであろう
し、それに対して本発明は、診断および治療の手段を提
供する。
物の各々のタイプは、PDGF-BB に対して独自に同様な生
化学的並びに生物学的反応を誘発するが、タイプαのPD
GF-Rは、血小板に見出されるヒトPDGFの主要なイソフォ
ームであるPDGF-AB についてより好ましいレセプターで
ある。従って、タイプαのPDGFレセプターの構造または
発現の異常性は、深刻な病理学的影響を有するであろう
し、それに対して本発明は、診断および治療の手段を提
供する。
【００５１】材料および方法ヒト胎盤および胸腺DNA におけるv-fms およびPDGFレセ
プター関連遺伝子の検出 。ゲノムDNA 20μg をEco RIで
消化し、0.8 ％のアガロースゲル中での電気泳動により
分離して、ニトロセルローズ紙に移行させた(E.M.South
ern,J.Med. Biol. 98, 503(1975)) 。32P でラベルした
プローブに対するハイブリッド形成は（P.W.J.Rigby,M.
Dieckerman, C.Rhodes, P.Berg, J.Med. Biol. 113, 23
7(1977))、50％または30％のホルムアミド、0.75M NaC
l、および0.075Mクエン酸ナトリウムの溶液中で42℃で
行われた(G.M.Wahl, M.Stern, G.R.Stark, Proc.Natl.
Adad. Sci. USA 76, 3683 (1979)) 。ハイブリッド形成
後、ブロットを室温で２倍のSSC(0.3M NaCl;0.03M クエ
ン酸ナトリウム）で洗ってから、50℃で 0.1倍または0.
6倍のSSC(それぞれ緊縮または緩和条件）で洗った。v-f
ms のプローブは、v-fms 腫瘍遺伝子(A.Hampe, M.Gobe
t, C.J.Sherr, F.Galibert, Proc. Soc. Natl.Acad. Sc
i. USA 81, 85(1984)) の3891から4419のヌクレオチド
を包含する0.44-kbp Xho I- Bgl II断片であった。マウ
スPDGFレセプターのプローブは、そのcDNAのヌクレオチ
ド2490から2995を包含する0.5-kbp Sin I-Pvu I 断片で
あった(Y. Yarden et al., Nature 323, 226 (1986))。
プター関連遺伝子の検出 。ゲノムDNA 20μg をEco RIで
消化し、0.8 ％のアガロースゲル中での電気泳動により
分離して、ニトロセルローズ紙に移行させた(E.M.South
ern,J.Med. Biol. 98, 503(1975)) 。32P でラベルした
プローブに対するハイブリッド形成は（P.W.J.Rigby,M.
Dieckerman, C.Rhodes, P.Berg, J.Med. Biol. 113, 23
7(1977))、50％または30％のホルムアミド、0.75M NaC
l、および0.075Mクエン酸ナトリウムの溶液中で42℃で
行われた(G.M.Wahl, M.Stern, G.R.Stark, Proc.Natl.
Adad. Sci. USA 76, 3683 (1979)) 。ハイブリッド形成
後、ブロットを室温で２倍のSSC(0.3M NaCl;0.03M クエ
ン酸ナトリウム）で洗ってから、50℃で 0.1倍または0.
6倍のSSC(それぞれ緊縮または緩和条件）で洗った。v-f
ms のプローブは、v-fms 腫瘍遺伝子(A.Hampe, M.Gobe
t, C.J.Sherr, F.Galibert, Proc. Soc. Natl.Acad. Sc
i. USA 81, 85(1984)) の3891から4419のヌクレオチド
を包含する0.44-kbp Xho I- Bgl II断片であった。マウ
スPDGFレセプターのプローブは、そのcDNAのヌクレオチ
ド2490から2995を包含する0.5-kbp Sin I-Pvu I 断片で
あった(Y. Yarden et al., Nature 323, 226 (1986))。
【００５２】λTll ゲノム断片並びにTll のcDNAおよび
PDGF-R遺伝子の分子クローニング。特定のcDNAクローン
（カッコ中）が分離されたライブラリーは、例えばOkay
ma-Berg ベクター(pHF) 中のヒト繊維芽細胞mRNAλgtll
中のヒト幼児脳mRNA（λHB）、λgtll中のヒト胎児繊維
芽細胞のランダムにプライムされたmRNA (λEF) 、およ
び指向性クローニングphagemid（TR4 またはHPR)中のヒ
ト胎児繊維芽細胞mRNAを包含した。制限部位は、一重お
よび二重の消化による生成物を電気泳動で分析すること
によって決定した。v-fms またはマウスのPDGFレセプタ
ープローブに対して相同のλTll 領域は、図１に記載し
たように、ハイブリッド形成によって同定された。v-/f
msおよびマウスPDGFレセプタープローブに相同な領域を
含む３個の制限断片(0.95-kbp Hind III-Pst I,0.5kbp
Ava I-Sac I 、および0.35-kbpKpn I-Xba I)は、プラ
スミド中にサブクローンされたdideoxy 鎖終止方法(F.S
anger,S.Nicklen,A.R.Coulson,Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 74, 5463(1977)) によって配列が決定された。
PDGF-R遺伝子の分子クローニング。特定のcDNAクローン
（カッコ中）が分離されたライブラリーは、例えばOkay
ma-Berg ベクター(pHF) 中のヒト繊維芽細胞mRNAλgtll
中のヒト幼児脳mRNA（λHB）、λgtll中のヒト胎児繊維
芽細胞のランダムにプライムされたmRNA (λEF) 、およ
び指向性クローニングphagemid（TR4 またはHPR)中のヒ
ト胎児繊維芽細胞mRNAを包含した。制限部位は、一重お
よび二重の消化による生成物を電気泳動で分析すること
によって決定した。v-fms またはマウスのPDGFレセプタ
ープローブに対して相同のλTll 領域は、図１に記載し
たように、ハイブリッド形成によって同定された。v-/f
msおよびマウスPDGFレセプタープローブに相同な領域を
含む３個の制限断片(0.95-kbp Hind III-Pst I,0.5kbp
Ava I-Sac I 、および0.35-kbpKpn I-Xba I)は、プラ
スミド中にサブクローンされたdideoxy 鎖終止方法(F.S
anger,S.Nicklen,A.R.Coulson,Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 74, 5463(1977)) によって配列が決定された。
【００５３】Tll 遺伝子の染色体マッピング。プローブ
を、変形ニック翻訳キット(Amersham, ArlingtonHeight
s, IL)を使用して、４種の 3Ｈヌクレオチド（New Engl
andNuclear, Boston, MA)すべてにより、比活性が2.5
×107 cpm/ngDNA になるように、ラベルした。methotre
-xate でシンクロナイズされたヒト周辺部淋巴球培養体
からのヒトのメタファーゼおよびプロメタファーゼとの
切片上ハイブリッド形成を、以前記載されたようにして
行った(M.E.Harper and G.F.Saunders, Chromosoma(Ber
l.)83,431(1981);N.C.Popescu et al.,Cytogenet. Cell
Genet 39, 73(1985))。
を、変形ニック翻訳キット(Amersham, ArlingtonHeight
s, IL)を使用して、４種の 3Ｈヌクレオチド（New Engl
andNuclear, Boston, MA)すべてにより、比活性が2.5
×107 cpm/ngDNA になるように、ラベルした。methotre
-xate でシンクロナイズされたヒト周辺部淋巴球培養体
からのヒトのメタファーゼおよびプロメタファーゼとの
切片上ハイブリッド形成を、以前記載されたようにして
行った(M.E.Harper and G.F.Saunders, Chromosoma(Ber
l.)83,431(1981);N.C.Popescu et al.,Cytogenet. Cell
Genet 39, 73(1985))。
【００５４】Northernブロットハイブリッド形成法によ
るmRNA種の比較。全部またはポリアデニル化されたRNA
をホルムアルデヒド中で変性ゲル電気泳動の実施によっ
て分離し(H.D. Lehrach, D.Diamond, J.M.Wozney, H.Bo
edtker, Biochemistry 16, 4743(1977))、ニトロセルロ
ーズ膜に移して、32P でラベルしたプローブを用いて緊
縮の条件で(50 ％ホルムアミド、0.075M NaCl 、0.75M
クエン酸ナトリウム、42℃）でハイブリッドさせた。
るmRNA種の比較。全部またはポリアデニル化されたRNA
をホルムアルデヒド中で変性ゲル電気泳動の実施によっ
て分離し(H.D. Lehrach, D.Diamond, J.M.Wozney, H.Bo
edtker, Biochemistry 16, 4743(1977))、ニトロセルロ
ーズ膜に移して、32P でラベルしたプローブを用いて緊
縮の条件で(50 ％ホルムアミド、0.075M NaCl 、0.75M
クエン酸ナトリウム、42℃）でハイブリッドさせた。
【００５５】抗ペプチド血清によるTll およびPDGF-R蛋
白質の検出。抗Tll(anti-Tll) および抗PDGF-R血清(ant
i-PDGF-R sera)を、予想レセプターの対応するカルボキ
シル末端領域から15個のアミノ酸ペプチドによりウサギ
を免疫することによって得た。これらのペプチド配列の
相同性は、50％以下であった。cDNA発現プラスミドをヌ
クレオチドの１〜3454を包含するTll cDNA（図３から１
２) またはヌクレオチドの１〜3939を包含するPDGF-R c
DNA を、サルのSarcoma ウィルスLTR がプロモーターと
して工学的に組入れられたpSV2gpt ベクター中に導入す
ることによって組立てた(C.R.King, N.A. Giese,K.C.Ro
bbins, S.A.Aaronson, Proc. Natl.Acad.Sci.USA82, 52
95(1985)) 。10cmのペトリ皿に約106 のCOS-1 細胞を、
10％の牛胎児血清を添加したDulbeccoの変法によるEagl
e の培地(DMEM)中で、トランスフェクションの24時間前
にインキュベートした。DNA のトランスフェクション
は、燐酸カルシウム沈澱法によって分析の48時間前に実
施された(M.Wigler et al.,Cell 11,223(1977))。培養
体をstaph-A バッファー（10mM燐酸ナトリウムpH7.5,10
0mM NaCl,１％TritonX-100, 0.1％SDS, 0.5％ deoxycho
late, 0.1％ apro-tinin, 1mMPMSF、および1mM sodium
orthovanadate) で溶解し、10,000 x g、30分間の遠心
分離により透明にした。蛋白質類(100μg/レーン）を７
％のSDS ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で溶解
させ、ニトロセルローズフィルターに移して、 125Ｉ-p
rotein A(H.Towbin,T.Staehelin, J.Gordon, Proc. Nat
l. Acad.Sci. USA 76, 4350(1979)) を使用して免疫ブ
ロット分析（ペプチドブロッキングを使用または不使
用）によって調べた。
白質の検出。抗Tll(anti-Tll) および抗PDGF-R血清(ant
i-PDGF-R sera)を、予想レセプターの対応するカルボキ
シル末端領域から15個のアミノ酸ペプチドによりウサギ
を免疫することによって得た。これらのペプチド配列の
相同性は、50％以下であった。cDNA発現プラスミドをヌ
クレオチドの１〜3454を包含するTll cDNA（図３から１
２) またはヌクレオチドの１〜3939を包含するPDGF-R c
DNA を、サルのSarcoma ウィルスLTR がプロモーターと
して工学的に組入れられたpSV2gpt ベクター中に導入す
ることによって組立てた(C.R.King, N.A. Giese,K.C.Ro
bbins, S.A.Aaronson, Proc. Natl.Acad.Sci.USA82, 52
95(1985)) 。10cmのペトリ皿に約106 のCOS-1 細胞を、
10％の牛胎児血清を添加したDulbeccoの変法によるEagl
e の培地(DMEM)中で、トランスフェクションの24時間前
にインキュベートした。DNA のトランスフェクション
は、燐酸カルシウム沈澱法によって分析の48時間前に実
施された(M.Wigler et al.,Cell 11,223(1977))。培養
体をstaph-A バッファー（10mM燐酸ナトリウムpH7.5,10
0mM NaCl,１％TritonX-100, 0.1％SDS, 0.5％ deoxycho
late, 0.1％ apro-tinin, 1mMPMSF、および1mM sodium
orthovanadate) で溶解し、10,000 x g、30分間の遠心
分離により透明にした。蛋白質類(100μg/レーン）を７
％のSDS ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で溶解
させ、ニトロセルローズフィルターに移して、 125Ｉ-p
rotein A(H.Towbin,T.Staehelin, J.Gordon, Proc. Nat
l. Acad.Sci. USA 76, 4350(1979)) を使用して免疫ブ
ロット分析（ペプチドブロッキングを使用または不使
用）によって調べた。
【００５６】 125ＩでラベルしたヒトPDGFの細胞上のレ
セプターに対する結合。COS-1 細胞を12ウエルのプレー
トにうえつけて、図１６に記載されているようにアッセ
イ前の48時間にトランスフェクトした。 ヒトPDGFをchlo
ramine-T法で 125Ｉでラベルし、比活性を3.7 ×104 cp
m/ngとした（W. M.Hunter and F.C.Greenwood, Nature
194,495(1962))。ヒト血小板から分離され 125Ｉでラベ
ルされたPDGFの、50〜100 倍過剰の未ラベルのヒトPDGF
(AB)(Collaborative Research)または組換ヒトPDGF-BB
(AmGen)または組換PDGF-AA(P.Beckman et al.,Science
241, 1346(1988)) の不在または存在のもとにおける結
合を(E.W.Raines and R.Ross.J.Biol,Chem257, 5154(19
82)）、４℃で２時間行った。結合しない 125ＩＰＤＧ
Ｆを、結合に用いた緩衝液で４回継続して洗うことによ
って除去した（牛血清アルブミンをmlあたり１mg含有す
るDMEM) 。続いて細胞を可溶化緩衝液で（１％TritonX-
100、20mM Hepes pH7.4、10％[v/v] グリセロール) で
溶解し、γカウンターを使用して放射能を測定した。
セプターに対する結合。COS-1 細胞を12ウエルのプレー
トにうえつけて、図１６に記載されているようにアッセ
イ前の48時間にトランスフェクトした。 ヒトPDGFをchlo
ramine-T法で 125Ｉでラベルし、比活性を3.7 ×104 cp
m/ngとした（W. M.Hunter and F.C.Greenwood, Nature
194,495(1962))。ヒト血小板から分離され 125Ｉでラベ
ルされたPDGFの、50〜100 倍過剰の未ラベルのヒトPDGF
(AB)(Collaborative Research)または組換ヒトPDGF-BB
(AmGen)または組換PDGF-AA(P.Beckman et al.,Science
241, 1346(1988)) の不在または存在のもとにおける結
合を(E.W.Raines and R.Ross.J.Biol,Chem257, 5154(19
82)）、４℃で２時間行った。結合しない 125ＩＰＤＧ
Ｆを、結合に用いた緩衝液で４回継続して洗うことによ
って除去した（牛血清アルブミンをmlあたり１mg含有す
るDMEM) 。続いて細胞を可溶化緩衝液で（１％TritonX-
100、20mM Hepes pH7.4、10％[v/v] グリセロール) で
溶解し、γカウンターを使用して放射能を測定した。
【００５７】タイプαおよびβPDGF-R遺伝子生成物のチ
ロシン自動燐酸化。PDGFを加えて５分間37℃でインキュ
ベート後、細胞溶解物を抗ペプチド抗血清によって免疫
沈澱させた。全細胞溶解物または免疫沈澱物を、レセプ
ターまたはphosphotyrosine(抗-P-Tyr)(J.J.Wang,Mol.
Cell. Biol.5, 3640(1985)) に対する抗体を使用して、
免疫ブロット(immunoblot)法によって分析した。抗phos
photyrosine 抗体を遮断用の10mMのphosphotyrosine と
ともに、予めインキュベートした。
ロシン自動燐酸化。PDGFを加えて５分間37℃でインキュ
ベート後、細胞溶解物を抗ペプチド抗血清によって免疫
沈澱させた。全細胞溶解物または免疫沈澱物を、レセプ
ターまたはphosphotyrosine(抗-P-Tyr)(J.J.Wang,Mol.
Cell. Biol.5, 3640(1985)) に対する抗体を使用して、
免疫ブロット(immunoblot)法によって分析した。抗phos
photyrosine 抗体を遮断用の10mMのphosphotyrosine と
ともに、予めインキュベートした。
【００５８】結 果新しいヒトPDGF-R/CSF1-R 関連遺伝子の検出 。PDGF-R/C
SF1-R 族の既知の成長因子レセプター遺伝子に関連した
新規な配列を探究するために、ヒト胎盤および胸腺から
調製された高分子量DNA をEco RIで消化しv-fms の チ
ロシンキナーゼ領域由来の DNAプローブおよびマウスPD
GF-R遺伝子（図１）由来の DNAプローブを使用して、ブ
ロットハイブリッド形成法によって分析した。緊縮条件
下では、v-fms プローブは、以前報告されたこの部位
(D.Q.Xu, S.Guilhot, F.Galibert,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 82, 2862(1985))における制限多形性(restrict
ionpolymorphism)にもとづいて、27-kbpおよび／または
20-kbpのEco RI制限断片を検出した。低い緊縮条件のも
とでは、いくつかのv-fms のプローブにハイブリッドし
た12-, 6.8-, 5-, 2.7-,2.2-kbp の断片が更に観察され
た。対応したマウスのPDGF-R cDNA の領域は、緊縮条件
のもとでは単一の21-kbp断片とハイブリッドした（図
１) 。
SF1-R 族の既知の成長因子レセプター遺伝子に関連した
新規な配列を探究するために、ヒト胎盤および胸腺から
調製された高分子量DNA をEco RIで消化しv-fms の チ
ロシンキナーゼ領域由来の DNAプローブおよびマウスPD
GF-R遺伝子（図１）由来の DNAプローブを使用して、ブ
ロットハイブリッド形成法によって分析した。緊縮条件
下では、v-fms プローブは、以前報告されたこの部位
(D.Q.Xu, S.Guilhot, F.Galibert,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 82, 2862(1985))における制限多形性(restrict
ionpolymorphism)にもとづいて、27-kbpおよび／または
20-kbpのEco RI制限断片を検出した。低い緊縮条件のも
とでは、いくつかのv-fms のプローブにハイブリッドし
た12-, 6.8-, 5-, 2.7-,2.2-kbp の断片が更に観察され
た。対応したマウスのPDGF-R cDNA の領域は、緊縮条件
のもとでは単一の21-kbp断片とハイブリッドした（図
１) 。
【００５９】より低い緊縮度では、同じプローブは更に
いくつかの断片を検出し、その内の若干は、上述の v-/
fms 関連の断片の大きさに類似のサイズを有していた。
これらの中で、12-kbp Eco RI 断片は、他の断片より以
上につよく双方のプローブとハイブリッドした。更に、
比較的小さい若干のバンドは、ヒトc-kit に対して報告
された制限断片に対応した(P.Besmer al.,Nature 320,
415(1986);Y.Yarden et al.,EMBOJ. 6, 3341(1987)) 。
かくして、12-kbp Eco RI DNA 断片をクローンし、また
その性質を一層十分に検討することが決定された。
いくつかの断片を検出し、その内の若干は、上述の v-/
fms 関連の断片の大きさに類似のサイズを有していた。
これらの中で、12-kbp Eco RI 断片は、他の断片より以
上につよく双方のプローブとハイブリッドした。更に、
比較的小さい若干のバンドは、ヒトc-kit に対して報告
された制限断片に対応した(P.Besmer al.,Nature 320,
415(1986);Y.Yarden et al.,EMBOJ. 6, 3341(1987)) 。
かくして、12-kbp Eco RI DNA 断片をクローンし、また
その性質を一層十分に検討することが決定された。
【００６０】λEMBL-4ベクター系を使用して、蔗糖勾配
によって大きさの選択されたゲノムライブラリーを Eco
RI 消化正常ヒト胸腺DNA から組立てた。図２は12-kbp
EcoRI 挿入片を含むλTll の制限地図を示すが、これ
はv-fms およびマウスのPDGF-Rのプローブでもっぱら緩
和されているが緊縮でないハイブリッド形成条件下での
みハイブリッドさせたものを表わす。v-fms /PDGF-R チ
ロシンキナーゼ領域に相同の領域は、λT11DNAの制限エ
ンドヌクレアーゼ消化物に対するハイブリッド形成によ
って配置が決定された。
によって大きさの選択されたゲノムライブラリーを Eco
RI 消化正常ヒト胸腺DNA から組立てた。図２は12-kbp
EcoRI 挿入片を含むλTll の制限地図を示すが、これ
はv-fms およびマウスのPDGF-Rのプローブでもっぱら緩
和されているが緊縮でないハイブリッド形成条件下での
みハイブリッドさせたものを表わす。v-fms /PDGF-R チ
ロシンキナーゼ領域に相同の領域は、λT11DNAの制限エ
ンドヌクレアーゼ消化物に対するハイブリッド形成によ
って配置が決定された。
【００６１】λT11 の0.95-kbp Hind III- Pst I, 0.5-
kbp Ava I-Sac I 、および0.35-kbpKpm I- Xba I 断片
にハイブリッドする配列を含む３個のプラスミドサブク
ローンをヌクレオチド配列分析で調べた。これらの別個
の開いた読みとり枠（図３から１２）は、ヒトc-fms 並
びにマウスPDGF-R遺伝子に対する関連性を示したが、こ
れらの遺伝子の各々からは容易に区別され(C.J.Sherr e
t al.,Cell 41, 665 (1985); L.Coussens et al., Natu
re 320, 277(1986); Y.Yarden et al., Nature323, 226
(1986))、さらに、c-kit(P.Besmer et al., Nature 32
0, 415(1986);Y.Yarden et al., EMBOJ. 6, 3341 (198
7)) からも区別された。この３個の推定のコード領域
は、真核生物の遺伝子のエキソン (R.Breathnad and P.
Chambon, Annu. Rev. Biochem.50, 349(1981))に面する
AGおよびGTジヌクレオチドによってそれぞれ境界を接し
た。
kbp Ava I-Sac I 、および0.35-kbpKpm I- Xba I 断片
にハイブリッドする配列を含む３個のプラスミドサブク
ローンをヌクレオチド配列分析で調べた。これらの別個
の開いた読みとり枠（図３から１２）は、ヒトc-fms 並
びにマウスPDGF-R遺伝子に対する関連性を示したが、こ
れらの遺伝子の各々からは容易に区別され(C.J.Sherr e
t al.,Cell 41, 665 (1985); L.Coussens et al., Natu
re 320, 277(1986); Y.Yarden et al., Nature323, 226
(1986))、さらに、c-kit(P.Besmer et al., Nature 32
0, 415(1986);Y.Yarden et al., EMBOJ. 6, 3341 (198
7)) からも区別された。この３個の推定のコード領域
は、真核生物の遺伝子のエキソン (R.Breathnad and P.
Chambon, Annu. Rev. Biochem.50, 349(1981))に面する
AGおよびGTジヌクレオチドによってそれぞれ境界を接し
た。
【００６２】Tll 配列が転写されたか否かを査定するた
めに種々の細胞のNorthernブロット分析が、エキソン
(a)(図２) を含み、かつヒトの反復配列を欠如する0.95
-kbpHind III-Pst I 断片(pT11-HP) のクローンを使用
して実施された。緊縮な条件のもとで、単一の6.4-kbp
RNA 転写体が正常ヒト繊維芽細胞から調製されたpoly
(A) ＋RNA の中に検出された（データ省略）。この転写
体は、以前に報告されているPDGF-R(Y.Yarden et al.,
Nature 323, 226(1986)), c-fms (3) またはc-kit遺伝
子(P.Besmer et al.,Nature 320,415(1986);Y.Yardenet
al., EMBOJ. 6, 3341(1987)) に対する転写体とは大き
さにおいて異っていた。これらの発見のすべてにより、
Tll 配列が既知のチロシンキナーゼレセプターのサブフ
ァミリーの既知メンバーとは異なる遺伝子を表わしてい
ることが示された。
めに種々の細胞のNorthernブロット分析が、エキソン
(a)(図２) を含み、かつヒトの反復配列を欠如する0.95
-kbpHind III-Pst I 断片(pT11-HP) のクローンを使用
して実施された。緊縮な条件のもとで、単一の6.4-kbp
RNA 転写体が正常ヒト繊維芽細胞から調製されたpoly
(A) ＋RNA の中に検出された（データ省略）。この転写
体は、以前に報告されているPDGF-R(Y.Yarden et al.,
Nature 323, 226(1986)), c-fms (3) またはc-kit遺伝
子(P.Besmer et al.,Nature 320,415(1986);Y.Yardenet
al., EMBOJ. 6, 3341(1987)) に対する転写体とは大き
さにおいて異っていた。これらの発見のすべてにより、
Tll 配列が既知のチロシンキナーゼレセプターのサブフ
ァミリーの既知メンバーとは異なる遺伝子を表わしてい
ることが示された。
【００６３】新規な遺伝子のcDNAクローニング。Okayam
a-Berg発現ベクターにおける正常ヒト繊維芽細胞のcDNA
ライブラリーを、最初にλTll の0.9-kbp Hind III-Ps
t I断片のpT11-HP クローンを使用して緊縮条件のもと
でスクリーニングした。3.9-kbp cDNA挿入片を含む１個
の強く対合するクローンを分離した（図２）。PHF1と命
名された該クローンは、正常なヒト繊維芽細胞における
6.4-kb転写体とハイブリッドし、またその３′末端にpo
ly(A) の尾部がつづくポリアデニル化のシグナルを含ん
でいた。これはまた、λT11DNA内にエンコードする配
列、およびエキソン(a) の上流に、CSF1-R-PDGF-R チロ
シンキナーゼ領域に関連した170 個のヌクレオチドも含
んでいた。
a-Berg発現ベクターにおける正常ヒト繊維芽細胞のcDNA
ライブラリーを、最初にλTll の0.9-kbp Hind III-Ps
t I断片のpT11-HP クローンを使用して緊縮条件のもと
でスクリーニングした。3.9-kbp cDNA挿入片を含む１個
の強く対合するクローンを分離した（図２）。PHF1と命
名された該クローンは、正常なヒト繊維芽細胞における
6.4-kb転写体とハイブリッドし、またその３′末端にpo
ly(A) の尾部がつづくポリアデニル化のシグナルを含ん
でいた。これはまた、λT11DNA内にエンコードする配
列、およびエキソン(a) の上流に、CSF1-R-PDGF-R チロ
シンキナーゼ領域に関連した170 個のヌクレオチドも含
んでいた。
【００６４】pHF1の0.4-kbp ５′末端をヒト幼児脳ライ
ブラリーのオーバーラップしたcDNAクローンを探すため
に使用した。緊縮条件のもとで、類似した制限地図を有
する多くの正(positive)のクローンを分離した（データ
は図示せず）。最長のλHB6(図２）を配列分析にかけ
た。可能なATG 開始コドンは、別のクローン、すなわち
λEF17内部で、同定された。このλEF17は、λHB6 の0.
2-kbp ５′断片をプローブとして使用し、λgt11ベクタ
ーの中で、M426ヒト胎児繊維芽細胞のcDNAライブラリー
をスクリーニングすることによって分離されたものであ
る。この３種のオーバーラップしたクローン（pHF1, λ
HB6 およびλEF17) は、３′の翻訳されない配列（図
２）の138-bp５′および-3-kbpに加えて、全コード領域
(coding region) を包含していた。
ブラリーのオーバーラップしたcDNAクローンを探すため
に使用した。緊縮条件のもとで、類似した制限地図を有
する多くの正(positive)のクローンを分離した（データ
は図示せず）。最長のλHB6(図２）を配列分析にかけ
た。可能なATG 開始コドンは、別のクローン、すなわち
λEF17内部で、同定された。このλEF17は、λHB6 の0.
2-kbp ５′断片をプローブとして使用し、λgt11ベクタ
ーの中で、M426ヒト胎児繊維芽細胞のcDNAライブラリー
をスクリーニングすることによって分離されたものであ
る。この３種のオーバーラップしたクローン（pHF1, λ
HB6 およびλEF17) は、３′の翻訳されない配列（図
２）の138-bp５′および-3-kbpに加えて、全コード領域
(coding region) を包含していた。
【００６５】ヒト小児脳のライブラリーをスクリーニン
グする際にプラークハイブリッド形成(plaque hybridiz
ation)において比較弱いシグナルを与えた２つのクロー
ンのλHB3 とλHB4 の配列も決定した。これらは、マウ
スPDGF-R cDNA(Y.Yarden etal.,Nature 323,226(1986))
の配列に近い類似性を示した。更に、λHB4 の2.0-kbp
挿入片を正常のヒト繊維芽細胞RNA にハイブリッドさ
せた際に、PDGF-Rの動写体に符号する5.3-kbの転写体を
検出した(Y.Yarden et al.,Nature 323, 226(1986)) 。
λHB4 の５′末端からさらに上流の配列を含むクローン
はいずれも、λgt11中でヒト小児脳cDNAライブラリーを
スクリーンニングすることによって得ることはできなか
った。これは別に記載（標題“効率的指向性クローニン
グ系 (Efficient Directional Cloning System) ”の米
国特許明細書のテーマ、1989年２月出願）されたように
して組立てられた新しいphagemidベクター中でM426ヒト
胎児繊維芽細胞cDNAライブラリーを利用することによっ
て完成した。このライブラリーをλHB3 の0.3-kbp ５′
サブフラグメントでスクリーニングすることによって、
２個のオーバラップしたクローン、HPR2およびHPR5を得
た。これらには、既知のヒトのPDGF-Rのエンコード配列
の全部、その完全な３′非翻訳領域(untranslatedregio
n) 、およびその５′非翻訳領域の 360個のヌクレオチ
ドを含んでいた（図２) 。新しい関連遺伝子の6.4-kbp
cDNAクローン(TR4) はまた、同じライブラリーから、λ
EF17の５′0.2-kbp サブフラグメントによりスクリーニ
ングすることによって得られた。
グする際にプラークハイブリッド形成(plaque hybridiz
ation)において比較弱いシグナルを与えた２つのクロー
ンのλHB3 とλHB4 の配列も決定した。これらは、マウ
スPDGF-R cDNA(Y.Yarden etal.,Nature 323,226(1986))
の配列に近い類似性を示した。更に、λHB4 の2.0-kbp
挿入片を正常のヒト繊維芽細胞RNA にハイブリッドさ
せた際に、PDGF-Rの動写体に符号する5.3-kbの転写体を
検出した(Y.Yarden et al.,Nature 323, 226(1986)) 。
λHB4 の５′末端からさらに上流の配列を含むクローン
はいずれも、λgt11中でヒト小児脳cDNAライブラリーを
スクリーンニングすることによって得ることはできなか
った。これは別に記載（標題“効率的指向性クローニン
グ系 (Efficient Directional Cloning System) ”の米
国特許明細書のテーマ、1989年２月出願）されたように
して組立てられた新しいphagemidベクター中でM426ヒト
胎児繊維芽細胞cDNAライブラリーを利用することによっ
て完成した。このライブラリーをλHB3 の0.3-kbp ５′
サブフラグメントでスクリーニングすることによって、
２個のオーバラップしたクローン、HPR2およびHPR5を得
た。これらには、既知のヒトのPDGF-Rのエンコード配列
の全部、その完全な３′非翻訳領域(untranslatedregio
n) 、およびその５′非翻訳領域の 360個のヌクレオチ
ドを含んでいた（図２) 。新しい関連遺伝子の6.4-kbp
cDNAクローン(TR4) はまた、同じライブラリーから、λ
EF17の５′0.2-kbp サブフラグメントによりスクリーニ
ングすることによって得られた。
【００６６】推論されたアミノ酸配列は、Tll 遺伝子を
PDGF-R/CSF1-R サブファミリーの１員として確定する。
Tll 遺伝子の6.4-kbp cDNAの完全なヌクレオチド配列を
図３から１２に示す。ヌクレオチドの位置139 におい
て、可能なATG 開始コドンで始まる開いた読みとり枠
は、部位3406におけるTAA 終止コドン迄伸張した。この
開いた読みとり枠は、更に上流に伸びたが、推定される
開始ATG コドンは、真正開始コドンのKozak の規準(M.K
ozak, Cell 44, 283(1986)) をみたす配列に隣接してい
た。更に最初の23のアミノ酸の伸びは、切断可能な疎水
性のシグナルペプチドの特性を発揮した（図３から１２
および１３）。３′末端で、開いた読みとり枠には、非
翻訳配列の３′-kbpが後続した。ポリアデニル化シグナ
ル(AATAAA)はcDNAの３′端のpoly(A) 配列から25ヌクレ
オチド上流に位置していた。
PDGF-R/CSF1-R サブファミリーの１員として確定する。
Tll 遺伝子の6.4-kbp cDNAの完全なヌクレオチド配列を
図３から１２に示す。ヌクレオチドの位置139 におい
て、可能なATG 開始コドンで始まる開いた読みとり枠
は、部位3406におけるTAA 終止コドン迄伸張した。この
開いた読みとり枠は、更に上流に伸びたが、推定される
開始ATG コドンは、真正開始コドンのKozak の規準(M.K
ozak, Cell 44, 283(1986)) をみたす配列に隣接してい
た。更に最初の23のアミノ酸の伸びは、切断可能な疎水
性のシグナルペプチドの特性を発揮した（図３から１２
および１３）。３′末端で、開いた読みとり枠には、非
翻訳配列の３′-kbpが後続した。ポリアデニル化シグナ
ル(AATAAA)はcDNAの３′端のpoly(A) 配列から25ヌクレ
オチド上流に位置していた。
【００６７】このシグナルペプチドに対する指定切断部
位に従って(G.von Heijne, NucleicAcids Res. 14, 468
3(1986)) 、成熟成長物のアミノ末端は、1066個のアミ
ノ酸が後続する24番目のアミノ酸におけるグルタミンと
予測された。この略 120kd（キロダルトン）の計算分子
量値を有するポリペプチド配列は、膜伸張チロシンキナ
ーゼレセプターのすべての特徴を含んでいた。24個のア
ミノ酸(525〜548 残基）からなる疎水性のセグメント
は、レセプターの膜透過領域の特徴を発揮した（（図３
から１２および１３）。このシグナルペプチドと膜透過
領域の間に、PDGF-R/CSF1-R のサブファミリー領域を結
合する細胞外リガンドとの構造上の相同性が存在した。
10個のシステイン残基がこのサブファミリーの他のレセ
プターと同一の部位の配置を有し、また８個の潜在的な
Ｎ連鎖(N-linked)グリコシル化部位がその推定細胞外領
域に分布していた（図３から１２) 。
位に従って(G.von Heijne, NucleicAcids Res. 14, 468
3(1986)) 、成熟成長物のアミノ末端は、1066個のアミ
ノ酸が後続する24番目のアミノ酸におけるグルタミンと
予測された。この略 120kd（キロダルトン）の計算分子
量値を有するポリペプチド配列は、膜伸張チロシンキナ
ーゼレセプターのすべての特徴を含んでいた。24個のア
ミノ酸(525〜548 残基）からなる疎水性のセグメント
は、レセプターの膜透過領域の特徴を発揮した（（図３
から１２および１３）。このシグナルペプチドと膜透過
領域の間に、PDGF-R/CSF1-R のサブファミリー領域を結
合する細胞外リガンドとの構造上の相同性が存在した。
10個のシステイン残基がこのサブファミリーの他のレセ
プターと同一の部位の配置を有し、また８個の潜在的な
Ｎ連鎖(N-linked)グリコシル化部位がその推定細胞外領
域に分布していた（図３から１２) 。
【００６８】細胞質領域は、保存されたチロシンキナー
ゼ領域および親水性カルボキシル末端の尾部から成って
いた（図３から１２および１３）。チロシンキナーゼ領
域は、共通(consensus)ATP結合配列(Gly-X-Gly-X-X-Gl
y....Lys 残基）および、416部位にあるpp60v-src の主
要な自動燐酸化部位に相同な 849部位のチロシン残基を
含んでいた(J.E.Smart et al.,Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA 78, 6013(1981)) 。更に、チロシンキナーゼ
を、以前にc-fms /CSF1-R, PDGF-R およびc-kit に対し
て示したように、親水性インターキナーゼ配列によって
２つの領域に分けた（図１３) 。
ゼ領域および親水性カルボキシル末端の尾部から成って
いた（図３から１２および１３）。チロシンキナーゼ領
域は、共通(consensus)ATP結合配列(Gly-X-Gly-X-X-Gl
y....Lys 残基）および、416部位にあるpp60v-src の主
要な自動燐酸化部位に相同な 849部位のチロシン残基を
含んでいた(J.E.Smart et al.,Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA 78, 6013(1981)) 。更に、チロシンキナーゼ
を、以前にc-fms /CSF1-R, PDGF-R およびc-kit に対し
て示したように、親水性インターキナーゼ配列によって
２つの領域に分けた（図１３) 。
【００６９】PDGF-R 、CSF1-R、およびc-kit のアミノ
酸と細胞外領域のアミノ酸の相同性は、それぞれ31％、
18％および19％であった。Tll 遺伝子の２個のキナーゼ
の領域は、c-fms およびc-kit に対する67〜70％に比較
して、ヒトPDGFレセプターのキナーゼの領域に対して最
も相同であった( それぞれ85％および75％)(図１３)。
インターキナーゼの領域においてさえも、このアミノ酸
の配列は、c-fms またはc-kit の10および19％の相同性
と比較して、27％の相同性でPDGF-Rにより接近して並列
するものであった。これらの観察によって、Tll 生成物
は、PDGF-R/CSF1-R のサブファミリー中にあり、またPD
GF-Rに最も深く関連しているという結論に導かれる。
酸と細胞外領域のアミノ酸の相同性は、それぞれ31％、
18％および19％であった。Tll 遺伝子の２個のキナーゼ
の領域は、c-fms およびc-kit に対する67〜70％に比較
して、ヒトPDGFレセプターのキナーゼの領域に対して最
も相同であった( それぞれ85％および75％)(図１３)。
インターキナーゼの領域においてさえも、このアミノ酸
の配列は、c-fms またはc-kit の10および19％の相同性
と比較して、27％の相同性でPDGF-Rにより接近して並列
するものであった。これらの観察によって、Tll 生成物
は、PDGF-R/CSF1-R のサブファミリー中にあり、またPD
GF-Rに最も深く関連しているという結論に導かれる。
【００７０】今一つのcDNAクローンの推定されるアミノ
酸配列は（TR4 cDNAクローンを製造したのと同じ実験に
より得られた) 、その成長物を既知のヒトPDGFレセプタ
ーとして確定した。その配列は、最近発表された既知の
ヒトPDGFレセプターの配列と殆ど完全に一致した(P.G.
K.Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,3
435(1988); L.Claesson-Welsh et al.,Mol. Cell. Bio
l. 8, 3476(1988))。１個のヌクレオチドの相異は、残
基240 をアスパラギン(Asn) からセリン(Ser) に変え
た。また、マウスPDGFレセプターcDNAアミノ酸配列との
比較により、リガンド結合領域（79％）、膜透過領域(t
ransmembrane domain)（96％）、近接膜領域(juxtamemb
rane domain)（97％) 、分裂チロシンキナーゼ(split t
yrosine kinase) 領域（TK1,99％およびTK2, 97 ％) 、
インターキナーゼ領域（86％) およびカルボキシル末端
（85％）を含むすべての機能領域を通じて、高い類似性
のあることが判明した。
酸配列は（TR4 cDNAクローンを製造したのと同じ実験に
より得られた) 、その成長物を既知のヒトPDGFレセプタ
ーとして確定した。その配列は、最近発表された既知の
ヒトPDGFレセプターの配列と殆ど完全に一致した(P.G.
K.Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,3
435(1988); L.Claesson-Welsh et al.,Mol. Cell. Bio
l. 8, 3476(1988))。１個のヌクレオチドの相異は、残
基240 をアスパラギン(Asn) からセリン(Ser) に変え
た。また、マウスPDGFレセプターcDNAアミノ酸配列との
比較により、リガンド結合領域（79％）、膜透過領域(t
ransmembrane domain)（96％）、近接膜領域(juxtamemb
rane domain)（97％) 、分裂チロシンキナーゼ(split t
yrosine kinase) 領域（TK1,99％およびTK2, 97 ％) 、
インターキナーゼ領域（86％) およびカルボキシル末端
（85％）を含むすべての機能領域を通じて、高い類似性
のあることが判明した。
【００７１】Tll 遺伝子の染色体マッピング。染色体の
位置に関して新しい遺伝子特定するために、104 個の染
色体の展開をpT11-pのプローブを使用して切片上ハイブ
リッド形成によって検討した。全部で 136個の小粒(gra
in) を 400バンドの核型図式(ideogram)の上に分布させ
た（図１４) 。全小粒のうち、50個（37％）がq11-12の
バンドの長腕のアセントロメア領域 (acentromeric re
gion) 近くに密集する45個の大多数の小粒と共に染色体
４の上に存在した。７個の小粒からなる染色体5q 11.1-
11.2上の２番目のハイブリッド形成の部位は、全小粒の
５％に達した（図１４) 。
位置に関して新しい遺伝子特定するために、104 個の染
色体の展開をpT11-pのプローブを使用して切片上ハイブ
リッド形成によって検討した。全部で 136個の小粒(gra
in) を 400バンドの核型図式(ideogram)の上に分布させ
た（図１４) 。全小粒のうち、50個（37％）がq11-12の
バンドの長腕のアセントロメア領域 (acentromeric re
gion) 近くに密集する45個の大多数の小粒と共に染色体
４の上に存在した。７個の小粒からなる染色体5q 11.1-
11.2上の２番目のハイブリッド形成の部位は、全小粒の
５％に達した（図１４) 。
【００７２】Tll 遺伝子プローブはまた、転座(translo
cation) t1;5(p22, q23)転座より生ずる大型の異常なマ
ーカー染色体を有するBurkitt lymphoma細胞系の由来の
染色体ともハイブリッドした。染色体５における小粒の
存在を検討した 300以上の染色体の展開の中で、この再
配列された染色体５のラベル化は検出されなかった。か
くして切片上のハイブリッド形成によりTll 遺伝子は、
染色体４のq11-12部位に割当てられた。この位置測定に
よりこの新規な遺伝子は、c-kit 癌原遺伝子と同じ領域
内にあることがわかった(L. d'Auroiol etal., Hum.Gen
et 78, 374(1988)) 。血小板因子４(C.A.Griffinet a
l., Cytogenetic Cell Genet 45, 67 (1987)) 、インタ
ーフェロンγ誘導因子；γIP-10(A.D.Luster et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2868(1987)) およびメ
ラノーマ成長刺激活性(MGSA)(A. Richmond etal., EMBO
J. 7, 2025(1988)) に対する構造的に関連した遺伝子群
並びにα−フエト(feto)蛋白質、アルブミン(M.E.Harpe
r and G.Dugaiczyk, J.Hum. Genet. 35, 565(1983)) 、
HPAFP (M.A.Furgnson-Smith et al., Cytogenet Cell G
enet 40, 628(1985)に対する遺伝子群および遺伝子デン
チン形成不全症(dentino-genesis imperfecta)の遺伝子
が4q11-13 にマッピングされている (S.P.Ball, P.J.L.
Cook, M.Mars, K.E.Buckton,Aun Hum. Genet 46, 35(19
82))。
cation) t1;5(p22, q23)転座より生ずる大型の異常なマ
ーカー染色体を有するBurkitt lymphoma細胞系の由来の
染色体ともハイブリッドした。染色体５における小粒の
存在を検討した 300以上の染色体の展開の中で、この再
配列された染色体５のラベル化は検出されなかった。か
くして切片上のハイブリッド形成によりTll 遺伝子は、
染色体４のq11-12部位に割当てられた。この位置測定に
よりこの新規な遺伝子は、c-kit 癌原遺伝子と同じ領域
内にあることがわかった(L. d'Auroiol etal., Hum.Gen
et 78, 374(1988)) 。血小板因子４(C.A.Griffinet a
l., Cytogenetic Cell Genet 45, 67 (1987)) 、インタ
ーフェロンγ誘導因子；γIP-10(A.D.Luster et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2868(1987)) およびメ
ラノーマ成長刺激活性(MGSA)(A. Richmond etal., EMBO
J. 7, 2025(1988)) に対する構造的に関連した遺伝子群
並びにα−フエト(feto)蛋白質、アルブミン(M.E.Harpe
r and G.Dugaiczyk, J.Hum. Genet. 35, 565(1983)) 、
HPAFP (M.A.Furgnson-Smith et al., Cytogenet Cell G
enet 40, 628(1985)に対する遺伝子群および遺伝子デン
チン形成不全症(dentino-genesis imperfecta)の遺伝子
が4q11-13 にマッピングされている (S.P.Ball, P.J.L.
Cook, M.Mars, K.E.Buckton,Aun Hum. Genet 46, 35(19
82))。
【００７３】正常および腫瘍細胞における内因性(endog
enous)のTll 遺伝子の転写体および蛋白質生成物の発
現。新しいレセプター様遺伝子の組織特異的発現を調べ
るために、本発明の中で最も好ましいDNA のうちのいづ
れか、すなわちTll ゲノムのクローンのHind III- Pst
I 0.95- kbp 断片、またはTR4 のcDNA挿入片を、Nort
hernブロットハイブリッド形成実験に使用した。単一の
6.4-kb転写体が種々のヒト組織および細胞系のRNA を含
有するpoly(A) 内で検出された。図１５に示すように、
比較的高レベルの転写体を平滑筋、心臓、およびヒト胎
児に見出したが、ヒト肝臓および脾臓では、これらの条
件のもとでは、検出されないか、またはやっと検出でき
る程度の転写体を示した。既知のヒトPDGFレセプター遺
伝子に対するプローブを使用して、Tll および5.3-kb P
DGF-R 転写体が、それぞれ類似したレベルで、これらの
同一の各組織において同時に発現することがわかった。
ヒト骨格筋、胎児脳、胎盤並びに培養繊維芽細胞および
グリア細胞(glial cell)もまた、高レベルの双方の転写
体を発現した（データ省略) 。
enous)のTll 遺伝子の転写体および蛋白質生成物の発
現。新しいレセプター様遺伝子の組織特異的発現を調べ
るために、本発明の中で最も好ましいDNA のうちのいづ
れか、すなわちTll ゲノムのクローンのHind III- Pst
I 0.95- kbp 断片、またはTR4 のcDNA挿入片を、Nort
hernブロットハイブリッド形成実験に使用した。単一の
6.4-kb転写体が種々のヒト組織および細胞系のRNA を含
有するpoly(A) 内で検出された。図１５に示すように、
比較的高レベルの転写体を平滑筋、心臓、およびヒト胎
児に見出したが、ヒト肝臓および脾臓では、これらの条
件のもとでは、検出されないか、またはやっと検出でき
る程度の転写体を示した。既知のヒトPDGFレセプター遺
伝子に対するプローブを使用して、Tll および5.3-kb P
DGF-R 転写体が、それぞれ類似したレベルで、これらの
同一の各組織において同時に発現することがわかった。
ヒト骨格筋、胎児脳、胎盤並びに培養繊維芽細胞および
グリア細胞(glial cell)もまた、高レベルの双方の転写
体を発現した（データ省略) 。
【００７４】かくして、この新しい遺伝子および既知の
PDGF-R遺伝子は、協調して調査された正常組織に発現す
るように思われ、c-fms /CSF1-R またはc-kit に関して
報告されたデータとは非常に異ったパターンを示した
(D.J.Sherret al., Cell 41,665(1985); L.Coussens et
al.,Nature 320, 277(1986);P.Besmer et al.,Nature32
0, 415(1986); Y.Yarden et al., EMBOJ 6, 3341(198
7)) 。また、Tll およびPDGF-R遺伝子の発現を、ヒト腫
瘍細胞において比較した。ここでは、これらの表現のパ
ターンを容易に区別することが可能であった。いくつか
の腫瘍細胞系は、Tll またはPDGF-R遺伝子転写体のいず
れかを含むが、双方は含まないことが見出された( 図１
５（Ｃ）および（Ｄ）) 。
PDGF-R遺伝子は、協調して調査された正常組織に発現す
るように思われ、c-fms /CSF1-R またはc-kit に関して
報告されたデータとは非常に異ったパターンを示した
(D.J.Sherret al., Cell 41,665(1985); L.Coussens et
al.,Nature 320, 277(1986);P.Besmer et al.,Nature32
0, 415(1986); Y.Yarden et al., EMBOJ 6, 3341(198
7)) 。また、Tll およびPDGF-R遺伝子の発現を、ヒト腫
瘍細胞において比較した。ここでは、これらの表現のパ
ターンを容易に区別することが可能であった。いくつか
の腫瘍細胞系は、Tll またはPDGF-R遺伝子転写体のいず
れかを含むが、双方は含まないことが見出された( 図１
５（Ｃ）および（Ｄ）) 。
【００７５】新規なまたは既知のPDGFレセプター蛋白質
に対して特異的な抗体。この新しい遺伝子による蛋白質
生成物を同定するために、ペプチド類に対する抗血清
を、予測されたその配列にもとづいて調製した。既知の
PDGF-Rの予測された配列の類似領域を利用して抗血清を
も成長した。最初にTll 遺伝子生成物の特異的発現を検
出するために、双方のレセプターのcDNAが分離されてい
るM426胎児繊維芽細胞を利用した。PDGF-RまたはTll 遺
伝子転写体を特異的に発現した8387およびA204細胞系を
それぞれ同様に分析した（図１６（Ａ）) 。Tll 遺伝子
生成物に対する抗血清（抗T11)を使用したM426細胞のWe
stern ブロット分析法によって、180kd および160kd の
蛋白質種が免疫ペプチドと特異的に競合することが判明
した。抗PDGF-R(anti-PDGF-R) ペプチド血清（抗HPR と
命名）により、同じ細胞中に180 および165kd の蛋白質
が検出された。8387細胞のWestern ブロット分析によ
り、抗-HPRによって認知されたが、抗Tll 血清によって
は認知されない180 および165 kdの種(species) が判明
した。これとは反対に、A204細胞は、抗Tll によって特
異的に検出されたが抗HPR 血清によっては認知されなか
った180 および160kd の種を含んでいた。これらの発見
すべてによって、本発明のこれらの抗体は、同族のレセ
プター遺伝子生成物の検出に関しては特異的であり、か
つTll 遺伝子生成物は、その転写体を含む細胞において
発現されることが示された。
に対して特異的な抗体。この新しい遺伝子による蛋白質
生成物を同定するために、ペプチド類に対する抗血清
を、予測されたその配列にもとづいて調製した。既知の
PDGF-Rの予測された配列の類似領域を利用して抗血清を
も成長した。最初にTll 遺伝子生成物の特異的発現を検
出するために、双方のレセプターのcDNAが分離されてい
るM426胎児繊維芽細胞を利用した。PDGF-RまたはTll 遺
伝子転写体を特異的に発現した8387およびA204細胞系を
それぞれ同様に分析した（図１６（Ａ）) 。Tll 遺伝子
生成物に対する抗血清（抗T11)を使用したM426細胞のWe
stern ブロット分析法によって、180kd および160kd の
蛋白質種が免疫ペプチドと特異的に競合することが判明
した。抗PDGF-R(anti-PDGF-R) ペプチド血清（抗HPR と
命名）により、同じ細胞中に180 および165kd の蛋白質
が検出された。8387細胞のWestern ブロット分析によ
り、抗-HPRによって認知されたが、抗Tll 血清によって
は認知されない180 および165 kdの種(species) が判明
した。これとは反対に、A204細胞は、抗Tll によって特
異的に検出されたが抗HPR 血清によっては認知されなか
った180 および160kd の種を含んでいた。これらの発見
すべてによって、本発明のこれらの抗体は、同族のレセ
プター遺伝子生成物の検出に関しては特異的であり、か
つTll 遺伝子生成物は、その転写体を含む細胞において
発現されることが示された。
【００７６】哺乳類ベクター系におけるTll cDNAの発
現。更にTll 遺伝子生成物を免疫学的に検出する能力の
テスト並びにそのcDNAの機能の発現調査として、LTR を
基礎とした発現ベクター(LTR-based expression vecto
r) をヌクレオチド１から3454（図３から１２) を包含
するTll cDNAおよび対応する既知のPDGF-R cDNA に対し
て同様に組立てた。cos-1 細胞における過渡的発現によ
り、PDGF-Rは185kd および165kd 蛋白質として出現した
が、Tll 遺伝子生成物は185kd および160kd 種として特
異的に検出された（図１６（Ｂ）) 。各レセプターのそ
れぞれの低分子量のものは、分析された細胞の間では、
大きさに変化はなかった。しかし、比較的に分子量が大
きい種の中には、若干の大きさの異ったものが観察され
たが、これはグリコシル化(glycosylation) の細胞特異
的な相異にもとづくようである。
現。更にTll 遺伝子生成物を免疫学的に検出する能力の
テスト並びにそのcDNAの機能の発現調査として、LTR を
基礎とした発現ベクター(LTR-based expression vecto
r) をヌクレオチド１から3454（図３から１２) を包含
するTll cDNAおよび対応する既知のPDGF-R cDNA に対し
て同様に組立てた。cos-1 細胞における過渡的発現によ
り、PDGF-Rは185kd および165kd 蛋白質として出現した
が、Tll 遺伝子生成物は185kd および160kd 種として特
異的に検出された（図１６（Ｂ）) 。各レセプターのそ
れぞれの低分子量のものは、分析された細胞の間では、
大きさに変化はなかった。しかし、比較的に分子量が大
きい種の中には、若干の大きさの異ったものが観察され
たが、これはグリコシル化(glycosylation) の細胞特異
的な相異にもとづくようである。
【００７７】PDGFのTll 成長物との結合による新しいPD
GF-R遺伝子の確定。その構造的および推定アミノ酸配列
の類似性並びにPDGFに反応することの知られる正常な細
胞タイプによるその共通の発現性を理由として、Tll 遺
伝子生成物が既知のPDGF-R生成物に何等かの機能性関連
性を示したか否かを決定する研究が行われた。かくし
て、 125ＩでラベルされたヒトPDGFを、対照区(contro
l) およびトランスフェクトされたcos-1 細胞ととも
に、未ラベルのPDGFイソフォームの存在または不在のも
とで、インキュベートした。図１７に示すように、新し
いレセプター遺伝子でトランスフェクトされたcos-1 細
胞には、NIH/3T3 細胞に対するように、それだけ多くの
125Ｉ- ＰＤＧＦが特異的に結合した。過剰のヒトPDGF
（ABが支配的）、PDGF-BB 、またはPDGF-AAとの競合に
よって、結合はトランスフェクトされていないcos-1 細
胞のレベル迄減少した。また、 125Ｉ- ＰＤＧＦのPDGF
-R cDNA によりトランスフェクトされたcos-1 細胞に対
する特異的結合も観察された。しかしこの場合には、結
合はヒトPDGF（すなわち、PDGF-AB)およびPDGF-BB によ
り競合されたが、PDGF-AA によっては競合されなかった
（図１７) 。かくして、Tll 遺伝子とPDGF-R遺伝子の生
成物の双方は、ヒトPDGFと結合したが、PDGFの異なるイ
ソフォームによる競合のパターンによって、２種のレセ
プターが区別された。これらの結果は、Tll 遺伝子がPD
GFの３種のダイマー型に対して異なった親和性を有する
新しいPDGFレセプターをエンコードすることを意味し
た。従って、Tll レセプター遺伝子生成物は、PDGF結合
がAA並びにBBイソフォームと競合したので、仮にタイプ
αPDGF-Rと命名せられ、また以前にクローンされたPDGF
レセプター遺伝子の生成物は、タイプβと命名された。
GF-R遺伝子の確定。その構造的および推定アミノ酸配列
の類似性並びにPDGFに反応することの知られる正常な細
胞タイプによるその共通の発現性を理由として、Tll 遺
伝子生成物が既知のPDGF-R生成物に何等かの機能性関連
性を示したか否かを決定する研究が行われた。かくし
て、 125ＩでラベルされたヒトPDGFを、対照区(contro
l) およびトランスフェクトされたcos-1 細胞ととも
に、未ラベルのPDGFイソフォームの存在または不在のも
とで、インキュベートした。図１７に示すように、新し
いレセプター遺伝子でトランスフェクトされたcos-1 細
胞には、NIH/3T3 細胞に対するように、それだけ多くの
125Ｉ- ＰＤＧＦが特異的に結合した。過剰のヒトPDGF
（ABが支配的）、PDGF-BB 、またはPDGF-AAとの競合に
よって、結合はトランスフェクトされていないcos-1 細
胞のレベル迄減少した。また、 125Ｉ- ＰＤＧＦのPDGF
-R cDNA によりトランスフェクトされたcos-1 細胞に対
する特異的結合も観察された。しかしこの場合には、結
合はヒトPDGF（すなわち、PDGF-AB)およびPDGF-BB によ
り競合されたが、PDGF-AA によっては競合されなかった
（図１７) 。かくして、Tll 遺伝子とPDGF-R遺伝子の生
成物の双方は、ヒトPDGFと結合したが、PDGFの異なるイ
ソフォームによる競合のパターンによって、２種のレセ
プターが区別された。これらの結果は、Tll 遺伝子がPD
GFの３種のダイマー型に対して異なった親和性を有する
新しいPDGFレセプターをエンコードすることを意味し
た。従って、Tll レセプター遺伝子生成物は、PDGF結合
がAA並びにBBイソフォームと競合したので、仮にタイプ
αPDGF-Rと命名せられ、また以前にクローンされたPDGF
レセプター遺伝子の生成物は、タイプβと命名された。
【００７８】PDGFのイソフォームは新規および既知のPD
GFレセプターの異なるパターンの自動燐酸化を誘導す
る。レセプターにPDGFが結合した後、レセプター蛋白質
のチロシン残基の燐酸化(phosphorylation) を含む分子
間の多数の変化が生体内において(in vivo) で迅速に触
発される(A.R.Frackelton, P.M.Tremble Jr., L.T.Will
iams, J.Biol. Chem. 259, 7909 (1984); T.O.Daniel e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2684(1985))
。各PDGFのイソフォームによる２種のPDGF-R遺伝子生
成物の相対的自動燐酸化を比較するために、タイプαお
よびタイプβのPDGF-R遺伝子を発現するA204および8387
細胞の反応をそれぞれ分析した。図１８の（Ａ）に示す
ように、リガンド処理に続いて５分間溶解(lyse)された
A204細胞のイムノブロットにより、容易に検出可能でか
つ非常に類似したレベルの180kd 種(species) の自動燐
酸化が３種のPDGFのイソフォームの各々に応じて行われ
ることが判明した。誘導された自動燐酸化がタイプαの
レセプター遺伝子生成物に特異的であるという更なる証
拠として、リガンドで刺激されたA204細胞の溶解物(lyn
sate) を最初に抗タイプαPDGF-R血清（抗-T11）で免疫
沈澱させ、つづいて抗phosphotyrosine 血清を用いて免
疫ブロット法を行った。この試みによって、180kd のタ
イプαPDGFレセプターは、各々３種のリガンドに反応し
て同様の強度でチロシンが燐酸化されることが確認され
た。タイプβのPDGF遺伝子生成物のみを発現した8387細
胞を各々同量のPDGFイソフォームで処理すると、非常に
異ったパターンのレセプターの自動燐酸化がみられた。
ここでPDGF-BB は、抗タイプβPDGF-R血清（抗HPR)によ
って特異的に認識される180kd 種の最高レベルの自動燐
酸化を誘導し、またヒトPDGFは、検出可能な自動燐酸化
を同じく誘導した（図１８の（Ｂ））。これとは対照的
に、PDGF-AAは、検出可能な燐酸化を誘導しなかった。
GFレセプターの異なるパターンの自動燐酸化を誘導す
る。レセプターにPDGFが結合した後、レセプター蛋白質
のチロシン残基の燐酸化(phosphorylation) を含む分子
間の多数の変化が生体内において(in vivo) で迅速に触
発される(A.R.Frackelton, P.M.Tremble Jr., L.T.Will
iams, J.Biol. Chem. 259, 7909 (1984); T.O.Daniel e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2684(1985))
。各PDGFのイソフォームによる２種のPDGF-R遺伝子生
成物の相対的自動燐酸化を比較するために、タイプαお
よびタイプβのPDGF-R遺伝子を発現するA204および8387
細胞の反応をそれぞれ分析した。図１８の（Ａ）に示す
ように、リガンド処理に続いて５分間溶解(lyse)された
A204細胞のイムノブロットにより、容易に検出可能でか
つ非常に類似したレベルの180kd 種(species) の自動燐
酸化が３種のPDGFのイソフォームの各々に応じて行われ
ることが判明した。誘導された自動燐酸化がタイプαの
レセプター遺伝子生成物に特異的であるという更なる証
拠として、リガンドで刺激されたA204細胞の溶解物(lyn
sate) を最初に抗タイプαPDGF-R血清（抗-T11）で免疫
沈澱させ、つづいて抗phosphotyrosine 血清を用いて免
疫ブロット法を行った。この試みによって、180kd のタ
イプαPDGFレセプターは、各々３種のリガンドに反応し
て同様の強度でチロシンが燐酸化されることが確認され
た。タイプβのPDGF遺伝子生成物のみを発現した8387細
胞を各々同量のPDGFイソフォームで処理すると、非常に
異ったパターンのレセプターの自動燐酸化がみられた。
ここでPDGF-BB は、抗タイプβPDGF-R血清（抗HPR)によ
って特異的に認識される180kd 種の最高レベルの自動燐
酸化を誘導し、またヒトPDGFは、検出可能な自動燐酸化
を同じく誘導した（図１８の（Ｂ））。これとは対照的
に、PDGF-AAは、検出可能な燐酸化を誘導しなかった。
【００７９】かくして、PDGF-AB とPDGF-BB は双方のレ
セプターを触発したが、BBホモダイマーに対するβタイ
プレセプターのはるかに強力な反応並びにAAホモダイマ
ーに対する検出可能な反応の欠如は、容易にレセプター
を機能性に区別した。異ったPDGFイソフォームによる２
種のレセプターの自動燐酸化のパターンを同じ細胞で検
討するために、最初にNIH/3T3 細胞を異なるリガンドに
よって触発し、つづいて抗タイプαまたはβのPDGF-R血
清により免疫沈澱(immunoprecipitation) せしめた。続
いて免疫沈澱したレセプター蛋白質を抗phosphotyrosin
e 血清を使用して免疫ブロット法によって解析した。図
１９の（Ｃ）に示すように、タイプαPDGF-R抗血清によ
って免疫沈澱した180kd の蛋白質は、PDGFのすべての３
種のダイマー形式によって燐酸化された。対照的に、抗
タイプβレセプター血清によって免疫沈澱した180kd の
燐蛋白質は、ヒトPDGF-AB またはPDGF-BB 刺激後にのみ
検出された。このようにして、異なったPDGFリガンドに
対する反応のパターンは、自然に双方のPDGF-R遺伝子を
発現する形質未転換細胞の一例においてレセプター特異
的なままであった。
セプターを触発したが、BBホモダイマーに対するβタイ
プレセプターのはるかに強力な反応並びにAAホモダイマ
ーに対する検出可能な反応の欠如は、容易にレセプター
を機能性に区別した。異ったPDGFイソフォームによる２
種のレセプターの自動燐酸化のパターンを同じ細胞で検
討するために、最初にNIH/3T3 細胞を異なるリガンドに
よって触発し、つづいて抗タイプαまたはβのPDGF-R血
清により免疫沈澱(immunoprecipitation) せしめた。続
いて免疫沈澱したレセプター蛋白質を抗phosphotyrosin
e 血清を使用して免疫ブロット法によって解析した。図
１９の（Ｃ）に示すように、タイプαPDGF-R抗血清によ
って免疫沈澱した180kd の蛋白質は、PDGFのすべての３
種のダイマー形式によって燐酸化された。対照的に、抗
タイプβレセプター血清によって免疫沈澱した180kd の
燐蛋白質は、ヒトPDGF-AB またはPDGF-BB 刺激後にのみ
検出された。このようにして、異なったPDGFリガンドに
対する反応のパターンは、自然に双方のPDGF-R遺伝子を
発現する形質未転換細胞の一例においてレセプター特異
的なままであった。
【００８０】タイプαのPDGFレセプターはPDGFイソフォ
ームABに反応して DNA合成を刺激する際により効率的で
ある。他の繊維芽細胞系における２種のレセプターの発
現を次に分析した。Western ブロット分析（データ省
略) によって分析された系(line)の中で、２種のレセプ
ターの比率に相当の変化の存在することが判明した。マ
ウス繊維芽細胞は、類似したレベルのタイプαおよびβ
のレセプターを発現したが、ヒト繊維芽細胞、例えばAG
1532またはM413は、マウス繊維芽細胞またはM426ヒト繊
維芽細胞に比べて、比較的低いレベルのタイプαのレセ
プターを発現した。飽和量のPDGF-AB またはPDGF-BB
は、各々の細胞系において同じ様に DNA合成の増加を示
した（データ省略）。しかし、最高に次ぐ用量のPDGF-A
B およびPDGF-BB は、観察された分裂促進活性レベルの
相当な相異を示した（図２０）。NIH/3T3, BALB/3T3 お
よびM426細胞は、同等な効率でPDGF-BB およびPDGF-AB
に反応したが、PDGF-AB は、AG1523またはM413細胞に対
して相当に低い活性を示した。PDGF-AB に対する比較的
低い分裂促進性の反応性は、これらの細胞における免疫
学的に検出されたαレセプターに比してβレセプターの
高い比率と相関関係があるように思われた。異なったPD
GFイソフォームによるNIH/3T3 細胞中の２種のレセプタ
ーの燐酸化について見られる用量反応曲線とまとめて考
えると、これらの結果は、タイプβレセプターの存在に
おける、PDGF-AB 並びにPDGF-AA によるタイプαレセプ
ターの選択的な誘発を強く示唆した。
ームABに反応して DNA合成を刺激する際により効率的で
ある。他の繊維芽細胞系における２種のレセプターの発
現を次に分析した。Western ブロット分析（データ省
略) によって分析された系(line)の中で、２種のレセプ
ターの比率に相当の変化の存在することが判明した。マ
ウス繊維芽細胞は、類似したレベルのタイプαおよびβ
のレセプターを発現したが、ヒト繊維芽細胞、例えばAG
1532またはM413は、マウス繊維芽細胞またはM426ヒト繊
維芽細胞に比べて、比較的低いレベルのタイプαのレセ
プターを発現した。飽和量のPDGF-AB またはPDGF-BB
は、各々の細胞系において同じ様に DNA合成の増加を示
した（データ省略）。しかし、最高に次ぐ用量のPDGF-A
B およびPDGF-BB は、観察された分裂促進活性レベルの
相当な相異を示した（図２０）。NIH/3T3, BALB/3T3 お
よびM426細胞は、同等な効率でPDGF-BB およびPDGF-AB
に反応したが、PDGF-AB は、AG1523またはM413細胞に対
して相当に低い活性を示した。PDGF-AB に対する比較的
低い分裂促進性の反応性は、これらの細胞における免疫
学的に検出されたαレセプターに比してβレセプターの
高い比率と相関関係があるように思われた。異なったPD
GFイソフォームによるNIH/3T3 細胞中の２種のレセプタ
ーの燐酸化について見られる用量反応曲線とまとめて考
えると、これらの結果は、タイプβレセプターの存在に
おける、PDGF-AB 並びにPDGF-AA によるタイプαレセプ
ターの選択的な誘発を強く示唆した。
【００８１】PDGFレセプターのない造血細胞中へcDNAを
導入後の２種のPDGF遺伝子タイプの独立した発現。各PD
GF-R遺伝子生成物に対する特異的な生物学的および生化
学的反応を調査するために、各々のタイプが独立して導
入され発現される可能性のある細胞において該レセプタ
ーを調べるためのシステムを開発した。これらのシステ
ムは、32D 細胞系である、生存および増殖のため通常I1
-3に依存するマウス造血細胞系を基礎とした。最近の研
究は、EGF-R に対する発現ベクターをこれらの細胞中に
導入することにより、EGF の分裂促進シグナルの導入経
路との効果的カップリングに結びつくことを確認した。
gpt 選択可能なマーカーを保持する上述の哺乳類の発現
ベクターが、32D 細胞をタイプαまたはタイプβのPDGF
-RcDNAを使用するエレクトロポレーション法(electropo
ration) によってトランスフェクトするために、使用さ
れた。形質転換体(transformant)をmycophenolic acid
を加えた培地を用いて選択した。選択培地中で２週間
後、成育培養体を得た。
導入後の２種のPDGF遺伝子タイプの独立した発現。各PD
GF-R遺伝子生成物に対する特異的な生物学的および生化
学的反応を調査するために、各々のタイプが独立して導
入され発現される可能性のある細胞において該レセプタ
ーを調べるためのシステムを開発した。これらのシステ
ムは、32D 細胞系である、生存および増殖のため通常I1
-3に依存するマウス造血細胞系を基礎とした。最近の研
究は、EGF-R に対する発現ベクターをこれらの細胞中に
導入することにより、EGF の分裂促進シグナルの導入経
路との効果的カップリングに結びつくことを確認した。
gpt 選択可能なマーカーを保持する上述の哺乳類の発現
ベクターが、32D 細胞をタイプαまたはタイプβのPDGF
-RcDNAを使用するエレクトロポレーション法(electropo
ration) によってトランスフェクトするために、使用さ
れた。形質転換体(transformant)をmycophenolic acid
を加えた培地を用いて選択した。選択培地中で２週間
後、成育培養体を得た。
【００８２】32D-αR および32D-βR と命名された培養
体を、上述したようにそれぞれNorthernブロット分析に
かけた。NIH/3T3 繊維芽細胞においてマウスの各PDGF-R
遺伝子転写体の検出を可能ならしめる緩和されたハイブ
リッド形成条件のもとでさえも、いずれのタイプのPDGF
-R mRNA も32D の親細胞中には検出されなかった。対照
的に、32D-αR および32D-βR のトランスフェクト体(t
ransfectant)は、ヒトのタイプαおよびタイプβの各PD
GF-R遺伝子にそれぞれ特異的な転写体を豊富に発現し
た。これらのトランフェクト体の膜溶解物を免疫ブロッ
ト分析にかけると、抗タイプαPDGF-Rペプチド血清は、
180kd および160kd 蛋白質種を32D-αR 中に検出した
が、32D-β細胞中には検出しなかった。更にこれらの蛋
白質は、免疫ペプチドと特異的に競合した。32D-βR 細
胞は、これとは反対に、抗タイプβPDGF-R血清によって
特異的に検出される180-200kd および165kd 種を含有し
た。これらの蛋白質種のいずれも、対照(control) であ
る32D 細胞中には検出されなかった。
体を、上述したようにそれぞれNorthernブロット分析に
かけた。NIH/3T3 繊維芽細胞においてマウスの各PDGF-R
遺伝子転写体の検出を可能ならしめる緩和されたハイブ
リッド形成条件のもとでさえも、いずれのタイプのPDGF
-R mRNA も32D の親細胞中には検出されなかった。対照
的に、32D-αR および32D-βR のトランスフェクト体(t
ransfectant)は、ヒトのタイプαおよびタイプβの各PD
GF-R遺伝子にそれぞれ特異的な転写体を豊富に発現し
た。これらのトランフェクト体の膜溶解物を免疫ブロッ
ト分析にかけると、抗タイプαPDGF-Rペプチド血清は、
180kd および160kd 蛋白質種を32D-αR 中に検出した
が、32D-β細胞中には検出しなかった。更にこれらの蛋
白質は、免疫ペプチドと特異的に競合した。32D-βR 細
胞は、これとは反対に、抗タイプβPDGF-R血清によって
特異的に検出される180-200kd および165kd 種を含有し
た。これらの蛋白質種のいずれも、対照(control) であ
る32D 細胞中には検出されなかった。
【００８３】タイプαのレセプターはPDGF-AB イソフォ
ームに対してより高い結合親和性を有する。PDGF-BB 結
合を32D-αR または32D-βR トランスフェクト体におい
て比較したが、両者は高い親和性結合を示した。スキャ
ッチャード分析によって、単一親和性クラスの結合部位
を有する１細胞当り約2000のレセプターの存在が明らか
となった。 Kα値は、32D-αR および32D-βR 細胞に対
してそれぞれ0.4nM および0.5nM であった（図２２）。
また、32D-αR 細胞は、 125Ｉ-PDGF-ABに対して高い結
合親和性（ｋd ＝0.4nM)を示し、PDGF-BB に対するもの
と同数の結合部位を現わした。対照的に、32D-βR 細胞
はしかしながら、32D-αR 細胞にくらべて、 125Ｉ-PDG
F-AB に対して10倍も低い結合能を示した。かくして、
これらの類似したPDGF-BB の結合をもとに標準化する
と、タイプβのレセプターは、PDGF-AB に対して極端に
低い親和性を示した。
ームに対してより高い結合親和性を有する。PDGF-BB 結
合を32D-αR または32D-βR トランスフェクト体におい
て比較したが、両者は高い親和性結合を示した。スキャ
ッチャード分析によって、単一親和性クラスの結合部位
を有する１細胞当り約2000のレセプターの存在が明らか
となった。 Kα値は、32D-αR および32D-βR 細胞に対
してそれぞれ0.4nM および0.5nM であった（図２２）。
また、32D-αR 細胞は、 125Ｉ-PDGF-ABに対して高い結
合親和性（ｋd ＝0.4nM)を示し、PDGF-BB に対するもの
と同数の結合部位を現わした。対照的に、32D-βR 細胞
はしかしながら、32D-αR 細胞にくらべて、 125Ｉ-PDG
F-AB に対して10倍も低い結合能を示した。かくして、
これらの類似したPDGF-BB の結合をもとに標準化する
と、タイプβのレセプターは、PDGF-AB に対して極端に
低い親和性を示した。
【００８４】タイプαおよびβのPDGF遺伝子生成物によ
って独自に誘発された共通の生物学的機能。有線分裂促
進性(mitogenesis) および走化性は、PDGFに対する繊維
芽細胞の反応の中でも最もよく性質が調べられている。
従って、32D-αR またはβR細胞系がこれらの生物学的
反応のどちらを仲介するかが調べられた。32D 細胞の増
殖は、通常インターロイキン３( 以後、IL-3）に厳密に
依存し、IL3 を培地から除去することは、トランスフェ
クト体および対照の32D 細胞の双方の生存能力を迅速に
失わせた。図２３に示すごとく、PDGF-BB は、分裂促進
のシグナル形質導入経路と効率的にカップルし、また双
方のトランスフェクト体においてIL-3依存性を類似した
用量依存を示しながら排除することができたが、対照の
32D細胞においては効果がなかった。こうして、αまた
はβタイプのいずれかの存在がPDGF-BB に対する分裂促
進反応(mitogenicresponse) にとって必要かつ十分であ
った。しかしながら、 32D細胞を含むタイプαのレセプ
ターがPDGF-BB に対するのと同じようにPDGF-AB に対し
ても反応性があったのに対して、32D-βR 細胞において
PDGF-AB は相当に低いDNA 合成反応を誘発した（図２
３) 。これらの発見を寒天を含む半固形の培地中のコロ
ニー形成分析によって確認した。両方のトランスフェク
ト体がPDGF-BB 添加培地で容易にコロニーを形成した
が、32D-αR 細胞のみがPDGF-AB 添加培地でコロニーを
形成した（データ省略）。かくして、32D-αR およびβ
R トランスフェクト体により観察された分裂促進反応
は、各々の細胞系によってそれぞれ発現されたαおよび
βのレセプターに対する同一のPDGFイソフォームの結合
特性とよく相関した。走化性がタイプαまたはβのいず
れかのPDGFレセプターによって特異的に仲介されたか否
かを調べるために、当該分野で公知の変形Boydenチェン
バー技術を使用して走化性のアッセイを行った。PDGFレ
セプターが欠如している32D 細胞は、PDGF-AB またはPD
GF-BB に反応しなかったが、PDGF-BB は、αおよびβレ
セプター発現トランスフェクト体の双方に対して走化性
を示した。PDGF-AB は32D-αR細胞に対して比較的によ
り活性であった（図２４) 。かくして、各PDGFレセプタ
ーは、それぞれ独自に32D 細胞に遺伝的に内在する分裂
促進および走化性のシグナル経路とカップルした。更
に、これらの生物的機能は、いずれかのレセプターに対
するPDGFのイソフォームの相対的結合能に応じて誘発さ
れた。
って独自に誘発された共通の生物学的機能。有線分裂促
進性(mitogenesis) および走化性は、PDGFに対する繊維
芽細胞の反応の中でも最もよく性質が調べられている。
従って、32D-αR またはβR細胞系がこれらの生物学的
反応のどちらを仲介するかが調べられた。32D 細胞の増
殖は、通常インターロイキン３( 以後、IL-3）に厳密に
依存し、IL3 を培地から除去することは、トランスフェ
クト体および対照の32D 細胞の双方の生存能力を迅速に
失わせた。図２３に示すごとく、PDGF-BB は、分裂促進
のシグナル形質導入経路と効率的にカップルし、また双
方のトランスフェクト体においてIL-3依存性を類似した
用量依存を示しながら排除することができたが、対照の
32D細胞においては効果がなかった。こうして、αまた
はβタイプのいずれかの存在がPDGF-BB に対する分裂促
進反応(mitogenicresponse) にとって必要かつ十分であ
った。しかしながら、 32D細胞を含むタイプαのレセプ
ターがPDGF-BB に対するのと同じようにPDGF-AB に対し
ても反応性があったのに対して、32D-βR 細胞において
PDGF-AB は相当に低いDNA 合成反応を誘発した（図２
３) 。これらの発見を寒天を含む半固形の培地中のコロ
ニー形成分析によって確認した。両方のトランスフェク
ト体がPDGF-BB 添加培地で容易にコロニーを形成した
が、32D-αR 細胞のみがPDGF-AB 添加培地でコロニーを
形成した（データ省略）。かくして、32D-αR およびβ
R トランスフェクト体により観察された分裂促進反応
は、各々の細胞系によってそれぞれ発現されたαおよび
βのレセプターに対する同一のPDGFイソフォームの結合
特性とよく相関した。走化性がタイプαまたはβのいず
れかのPDGFレセプターによって特異的に仲介されたか否
かを調べるために、当該分野で公知の変形Boydenチェン
バー技術を使用して走化性のアッセイを行った。PDGFレ
セプターが欠如している32D 細胞は、PDGF-AB またはPD
GF-BB に反応しなかったが、PDGF-BB は、αおよびβレ
セプター発現トランスフェクト体の双方に対して走化性
を示した。PDGF-AB は32D-αR細胞に対して比較的によ
り活性であった（図２４) 。かくして、各PDGFレセプタ
ーは、それぞれ独自に32D 細胞に遺伝的に内在する分裂
促進および走化性のシグナル経路とカップルした。更
に、これらの生物的機能は、いずれかのレセプターに対
するPDGFのイソフォームの相対的結合能に応じて誘発さ
れた。
【００８５】独自に再構成されたレセプターと共役する
イノシトール脂質代謝およびサイトゾルのCa2+起動。最
近の研究によれば、PDGFで誘導された分裂促進のシグナ
ルの導入に際して、細胞内の遊離カルシウムおよびジア
シルグリセロールといった第２メッセンジャーの増加を
おこすイノシトール脂質のレセプター仲介による代謝回
転(turnover)の重要な役割が示唆されている。かくして
イノシトール脂質代謝および細胞内遊離Ca2+（〔Ca2+〕
i)に対するPDGF-AB およびPDGF-BB の効果を、 32D細胞
を含むタイプαおよびタイプβのPDGF-Rにおいて研究し
た。放射性燐酸イノシトールの蓄積を、 3Ｈミオイノシ
トール（ 3Ｈ-myoinositol) で培養体をラベルし、当該
分野で公知の方法に従ってPDGFのイソフォームを37℃で
LiClの存在で誘発し測定した。〔Ca2+〕i を、懸濁液中
の 32D細胞において螢光〔Ca2+〕i インジケーターfura
２で負荷し、また完全なインキュベーション培地中でPD
GFで処理して、測定した。
イノシトール脂質代謝およびサイトゾルのCa2+起動。最
近の研究によれば、PDGFで誘導された分裂促進のシグナ
ルの導入に際して、細胞内の遊離カルシウムおよびジア
シルグリセロールといった第２メッセンジャーの増加を
おこすイノシトール脂質のレセプター仲介による代謝回
転(turnover)の重要な役割が示唆されている。かくして
イノシトール脂質代謝および細胞内遊離Ca2+（〔Ca2+〕
i)に対するPDGF-AB およびPDGF-BB の効果を、 32D細胞
を含むタイプαおよびタイプβのPDGF-Rにおいて研究し
た。放射性燐酸イノシトールの蓄積を、 3Ｈミオイノシ
トール（ 3Ｈ-myoinositol) で培養体をラベルし、当該
分野で公知の方法に従ってPDGFのイソフォームを37℃で
LiClの存在で誘発し測定した。〔Ca2+〕i を、懸濁液中
の 32D細胞において螢光〔Ca2+〕i インジケーターfura
２で負荷し、また完全なインキュベーション培地中でPD
GFで処理して、測定した。
【００８６】図２５に燐酸イノシトール(inositol phos
phate)に対するPDGF-AB およびPDGF-BB の効果と、タイ
プαおよびタイプβのPDGF-R 32D細胞における〔Ca2+〕
i とを示す。図２５（パネルＡ）に示すように、PDGF-B
B およびPDGF-AB は、燐酸イノシトールの用量依存性の
蓄積を同様な相対的効力で誘発することが可能であっ
た。同じイソフォームは、タイプαのPDGF-R 32D細胞に
おいても〔Ca2+〕i を殆ど同様に増加させた（図２５の
パネルＡ、挿入図）。PDGF-BB もまた、タイプβのPDGF
-R 32D細胞におけるイノシトール脂質の代謝および細胞
内のCa2+起動を顕著に刺激し、PDGF-BB に反応して酷似
した生化学的反応がこれらの異なったPDGF-R遺伝子生成
物によって 32D細胞中に誘発されることが確認された。
図２５（パネルＢ）は、タイプβのPDGF-R 32D細胞にお
ける燐酸イノシトール蓄積を促進する際に、PDGF-AB が
PDGF-BB よりも相当に効果が低かったことを示す。検出
可能な燐酸イノシトールの放出は、PDGF-AB の濃度が高
い場合のみ起った。同様にPDGF-AB は、殆どまたは全く
〔Ca2+〕i 反応を誘発しなかった。
phate)に対するPDGF-AB およびPDGF-BB の効果と、タイ
プαおよびタイプβのPDGF-R 32D細胞における〔Ca2+〕
i とを示す。図２５（パネルＡ）に示すように、PDGF-B
B およびPDGF-AB は、燐酸イノシトールの用量依存性の
蓄積を同様な相対的効力で誘発することが可能であっ
た。同じイソフォームは、タイプαのPDGF-R 32D細胞に
おいても〔Ca2+〕i を殆ど同様に増加させた（図２５の
パネルＡ、挿入図）。PDGF-BB もまた、タイプβのPDGF
-R 32D細胞におけるイノシトール脂質の代謝および細胞
内のCa2+起動を顕著に刺激し、PDGF-BB に反応して酷似
した生化学的反応がこれらの異なったPDGF-R遺伝子生成
物によって 32D細胞中に誘発されることが確認された。
図２５（パネルＢ）は、タイプβのPDGF-R 32D細胞にお
ける燐酸イノシトール蓄積を促進する際に、PDGF-AB が
PDGF-BB よりも相当に効果が低かったことを示す。検出
可能な燐酸イノシトールの放出は、PDGF-AB の濃度が高
い場合のみ起った。同様にPDGF-AB は、殆どまたは全く
〔Ca2+〕i 反応を誘発しなかった。
【００８７】
論 考 本研究は、２種の異ったヒトPDGFレセプター遺伝子の存
在を示す。更に、本研究は、本発明の２つの主要な具体
例PDGF-R/CSF1-R サブファミリー内における新規遺伝子
のゲノムおよびcDNAクローンの検出および分離を例証す
る。この遺伝子は、既知のPDGF-R遺伝子とは異なるが、
最も深く関連している。自然な発現の条件のもと、並び
にこの新規のcDNAを発現ベクターを使用して適当なター
ゲットの細胞内に導入に次いて、その成長物のPDGFに対
する機能性反応は、既に同定されているPDGFレセプター
のチロシン燐酸化を結合し触発した濃度において示され
た。
在を示す。更に、本研究は、本発明の２つの主要な具体
例PDGF-R/CSF1-R サブファミリー内における新規遺伝子
のゲノムおよびcDNAクローンの検出および分離を例証す
る。この遺伝子は、既知のPDGF-R遺伝子とは異なるが、
最も深く関連している。自然な発現の条件のもと、並び
にこの新規のcDNAを発現ベクターを使用して適当なター
ゲットの細胞内に導入に次いて、その成長物のPDGFに対
する機能性反応は、既に同定されているPDGFレセプター
のチロシン燐酸化を結合し触発した濃度において示され
た。
【００８８】一定量のPDGFによって誘導されたPDGF-R遺
伝子生成物のチロシン燐酸化（および幾つかのその他の
活性）の類似したレベルをもとにして標準化すると、新
規のレセプターは、AAのホモダイマー(homodimer) に対
して既知のPDGF-Rよりもよく反応することが示された。
反対に、既知のレセプターは、BBのホモダイマーに選択
的に反応した。今回の発見をもとにして、この新規の遺
伝子生成物をタイプαPDGF-Rと命名し、また以前に同定
されているPDGF-R遺伝子生成物をタイプβのレセプター
として命名した。AAホモダイマーは、NIH/3T3 細胞にお
ける検出可能のβタイプレセプターのチロシン燐酸化を
刺激できなかったが、該細胞系においてDNA 合成を誘導
できる(P. Beckman et al, Science 241, 1346(1988))
。これは、αタイプのレセプターが繊維芽細胞におけ
る分裂促進シグナルの経路とカップルできることを示し
た。タイプβのレセプターもまた、PDGFを分裂促進経路
とカップルさせることが報告されている (J.A.Escobedo
et al., Science 240, 1532(1988)) 。これらの結果
は、両方の遺伝子生成物が増殖反応を誘導できることを
示唆した。
伝子生成物のチロシン燐酸化（および幾つかのその他の
活性）の類似したレベルをもとにして標準化すると、新
規のレセプターは、AAのホモダイマー(homodimer) に対
して既知のPDGF-Rよりもよく反応することが示された。
反対に、既知のレセプターは、BBのホモダイマーに選択
的に反応した。今回の発見をもとにして、この新規の遺
伝子生成物をタイプαPDGF-Rと命名し、また以前に同定
されているPDGF-R遺伝子生成物をタイプβのレセプター
として命名した。AAホモダイマーは、NIH/3T3 細胞にお
ける検出可能のβタイプレセプターのチロシン燐酸化を
刺激できなかったが、該細胞系においてDNA 合成を誘導
できる(P. Beckman et al, Science 241, 1346(1988))
。これは、αタイプのレセプターが繊維芽細胞におけ
る分裂促進シグナルの経路とカップルできることを示し
た。タイプβのレセプターもまた、PDGFを分裂促進経路
とカップルさせることが報告されている (J.A.Escobedo
et al., Science 240, 1532(1988)) 。これらの結果
は、両方の遺伝子生成物が増殖反応を誘導できることを
示唆した。
【００８９】本発明の構成と方法に従って、ヌル細胞中
にこれらの異ったレセプター遺伝子に対する発現ベクタ
ーを安定して導入できることは、このような示唆をヒト
細胞において確認することを可能とした。このような細
胞における研究は、走化性(H.Seppa et al, J.Cell Bio
l.92, 584(1982); G.R.Grotendorst et al., J.CellPhy
siol. 113, 261(1982); T.F.Deuel, R.M.Senior, J.S.H
uang, G.L.Griffin,J.Clin. Invest. 69, 1046(1982))
、膜の波うち(ruffling)(K.Mellstrom et al.,J.Cell
Motility and Muscle Res. 4, 589(1983)) 、並びに非
相同(heterologous)レセプターの転移調整(transmodula
tion)(E.Rozengurt, M.Rodriquez-Pnena, K.A.Smith, P
roc. Natl. Acad. Sci.USA 80, 7244 (1983); R.J.Davi
s and M.P.Czech, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82, 408
0(1985))を含む既知のその他のPDGFの機能は、タイプα
またはβのPDGF-R遺伝子生成物によって特異的には仲介
されないことを更に示した。
にこれらの異ったレセプター遺伝子に対する発現ベクタ
ーを安定して導入できることは、このような示唆をヒト
細胞において確認することを可能とした。このような細
胞における研究は、走化性(H.Seppa et al, J.Cell Bio
l.92, 584(1982); G.R.Grotendorst et al., J.CellPhy
siol. 113, 261(1982); T.F.Deuel, R.M.Senior, J.S.H
uang, G.L.Griffin,J.Clin. Invest. 69, 1046(1982))
、膜の波うち(ruffling)(K.Mellstrom et al.,J.Cell
Motility and Muscle Res. 4, 589(1983)) 、並びに非
相同(heterologous)レセプターの転移調整(transmodula
tion)(E.Rozengurt, M.Rodriquez-Pnena, K.A.Smith, P
roc. Natl. Acad. Sci.USA 80, 7244 (1983); R.J.Davi
s and M.P.Czech, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82, 408
0(1985))を含む既知のその他のPDGFの機能は、タイプα
またはβのPDGF-R遺伝子生成物によって特異的には仲介
されないことを更に示した。
【００９０】このような知識は、これらのPDGF機能に影
響を与える病態の理解と診断への必要な前奏となるもの
であり、本発明を更に実施することによって推進するこ
とができる。本発明の方法を使用して解析されたヒト腫
瘍細胞系のうちで、２種のPDGF-R遺伝子の発現が不調和
のいくつかの例が観察された。更に、いずれかの遺伝子
からのmRNAを発現する代表的腫瘍細胞系は、細胞に結合
しかつPDGFに反応してチロシンが燐酸化される代表的蛋
白質生成物をそれぞれ含有することが示された。本発明
のタイプαあるいはタイプβのPDGF-R遺伝子生成物に対
して特異的な免疫学的並びに分子生物学的プローブが利
用できることは、PDGF-A鎖または B鎖の発現が、いづれ
かのレセプター遺伝子との組合せにおいて、腫瘍の発生
に因果的に関連しているヒトの腫瘍の同定を可能とす
る。同時に、各タイプの成分を特異的に検出する試薬を
利用できることは、他の慢性病態、例えば動脈硬化症、
関節炎、および繊維症における該成長因子とレセプター
の複雑なネットワークの異常な発現の関与を発見しよう
とする努力に対して、決定的な援助となる(R.Ross, E.
W.Raines, D. F.Bowen-Pope, Cell 46, 155(1986)) 。
更に、科学的に重要な観察は、ここに記載されたように
本発明の実施によって既に与えられている。例えば、新
しい遺伝子の染色体上の配置は、本発明のDNA を使用し
て確定せられ、該レセプター遺伝子族の進化の可能性に
対する見通しを与える。かくして、この染色体の配置の
特定は、タイプαのPDGFレセプター遺伝子が染色体４上
の関連レセプター様遺伝子、c-kit (L. d'Auriol et a
l.,Hum. Genet78, 374(1988))と同一領域の4q11-12 に
あることを示す。その他のこのサブファミリーの遺伝子
は、染色体５の上にあることがわかった。これらは、5q
23-31 に位置することがわかったタイプβのPDGF-R(Y.Y
arden et al., Nature 323, 226(1986))および5q33.2-3
3.3 上のCSF1-R遺伝子(M. M.LeBeau et al., Science 2
31, 984(1986) を含む。ヒト染色体の４および５が共通
の祖先に由来する証拠が存する(D.E.Comings, Nature 2
38, 455(1972))。これらの関連レセプター遺伝子は、4q
上のセントロメア(centromere)近くまたは5qの末端半分
に集まる。かくして、これらの遺伝子の先祖が単一の祖
先の染色体に限定されたならば、リンケージの切断は長
腕(long arm)内の逆位によって説明されるであろう。
響を与える病態の理解と診断への必要な前奏となるもの
であり、本発明を更に実施することによって推進するこ
とができる。本発明の方法を使用して解析されたヒト腫
瘍細胞系のうちで、２種のPDGF-R遺伝子の発現が不調和
のいくつかの例が観察された。更に、いずれかの遺伝子
からのmRNAを発現する代表的腫瘍細胞系は、細胞に結合
しかつPDGFに反応してチロシンが燐酸化される代表的蛋
白質生成物をそれぞれ含有することが示された。本発明
のタイプαあるいはタイプβのPDGF-R遺伝子生成物に対
して特異的な免疫学的並びに分子生物学的プローブが利
用できることは、PDGF-A鎖または B鎖の発現が、いづれ
かのレセプター遺伝子との組合せにおいて、腫瘍の発生
に因果的に関連しているヒトの腫瘍の同定を可能とす
る。同時に、各タイプの成分を特異的に検出する試薬を
利用できることは、他の慢性病態、例えば動脈硬化症、
関節炎、および繊維症における該成長因子とレセプター
の複雑なネットワークの異常な発現の関与を発見しよう
とする努力に対して、決定的な援助となる(R.Ross, E.
W.Raines, D. F.Bowen-Pope, Cell 46, 155(1986)) 。
更に、科学的に重要な観察は、ここに記載されたように
本発明の実施によって既に与えられている。例えば、新
しい遺伝子の染色体上の配置は、本発明のDNA を使用し
て確定せられ、該レセプター遺伝子族の進化の可能性に
対する見通しを与える。かくして、この染色体の配置の
特定は、タイプαのPDGFレセプター遺伝子が染色体４上
の関連レセプター様遺伝子、c-kit (L. d'Auriol et a
l.,Hum. Genet78, 374(1988))と同一領域の4q11-12 に
あることを示す。その他のこのサブファミリーの遺伝子
は、染色体５の上にあることがわかった。これらは、5q
23-31 に位置することがわかったタイプβのPDGF-R(Y.Y
arden et al., Nature 323, 226(1986))および5q33.2-3
3.3 上のCSF1-R遺伝子(M. M.LeBeau et al., Science 2
31, 984(1986) を含む。ヒト染色体の４および５が共通
の祖先に由来する証拠が存する(D.E.Comings, Nature 2
38, 455(1972))。これらの関連レセプター遺伝子は、4q
上のセントロメア(centromere)近くまたは5qの末端半分
に集まる。かくして、これらの遺伝子の先祖が単一の祖
先の染色体に限定されたならば、リンケージの切断は長
腕(long arm)内の逆位によって説明されるであろう。
【００９１】また本研究は、異なったPDGF-R遺伝子が、
それぞれが発現される細胞とは明らかに独立した結合特
性を有する２種のレセプタータイプをエンコードするこ
とを明らかにしている。この観察の示唆するところは、
他のレセプターに関する知識を考慮すれば一層よく評価
することができる。より複雑な生物が進化するにつれ
て、細胞間伝達機構の複雑性も同じく増大している証拠
が浮上してきている。関連したEGF および TFGα分子が
類似した親和性をもって共通のレセプターである EGFレ
セプターと作用する (J.Massague, J.Biol. Chem. 258,
13614 (1983))。これらの成長因子の発生および組織発
現の色々のパターンは(R.Derynck et al., Cancer Res.
47, 707(1987); D.C.Lee et al, Mol. Cell. Biol. 5,
3644 (1985); D.R.Twardzik, Cancer Res. 45, 5413(1
985); R.J.Coffey et al., Nature 328, 817(1987)) 、
これらの現在存在する意味を説明するものと考えられ
る。
それぞれが発現される細胞とは明らかに独立した結合特
性を有する２種のレセプタータイプをエンコードするこ
とを明らかにしている。この観察の示唆するところは、
他のレセプターに関する知識を考慮すれば一層よく評価
することができる。より複雑な生物が進化するにつれ
て、細胞間伝達機構の複雑性も同じく増大している証拠
が浮上してきている。関連したEGF および TFGα分子が
類似した親和性をもって共通のレセプターである EGFレ
セプターと作用する (J.Massague, J.Biol. Chem. 258,
13614 (1983))。これらの成長因子の発生および組織発
現の色々のパターンは(R.Derynck et al., Cancer Res.
47, 707(1987); D.C.Lee et al, Mol. Cell. Biol. 5,
3644 (1985); D.R.Twardzik, Cancer Res. 45, 5413(1
985); R.J.Coffey et al., Nature 328, 817(1987)) 、
これらの現在存在する意味を説明するものと考えられ
る。
【００９２】進化論的に多岐にわたるレセプター遺伝子
の例も増加している。このような遺伝子の生成物は、PD
GFやCSF-1 レセプターの例のように、全く異ったリガン
ドに対応可能であるか(E.S.Kawasaki et al, Science23
0 291(1985); C.Betsholtz et al., Nature 320,695(19
86))、またはその代りに、IGF-I およびインシュリンレ
セプターにおける如く関連リガンドに反応できる(A.Ull
richet al., Nature 313(1985); Y.Ebina et al., Cell
40, 747(1985); A.Ullrich et al., EMBO J.5, 2503(1
986))。ここで、レセプター並びにそれらのリガンドの
発生および組織の特異的発現、さらに触発された生化学
的反応は、生体の複雑性とともに進化してきている。本
研究で示されたように、PDGFによって仲介された反応
は、２種の遺伝子によってエンコードされた異なったダ
イマー型の関連リガンドを含むだけでなく、異なったPD
GFレセプターを同じくエンコードする２種の関連遺伝子
をも含む。それらの組織特異的発現 (C.Betsholtz et a
l.,Nature 320,695(1986);R.A.Seifert,S.M.Schwartz,
D.F.Bowen-Pope Nature 34,669(1984); M.Jaye et al.,
Science228, 882(1985); J.Nilssonet al., Proc. Nat
l. Acad.Sci.USA 82, 4418(1985);T.Collins et al., N
ature 316, 748(1985))における相異に加えて、この２
種のPDGF遺伝子生成物は、彼等の相対的な分泌能におい
て異なることが知られている。PDGF-A鎖は B鎖よりもは
るかに効果的に遊離され (P.Beckman et. al., Science
241, 1346(1988)、このことがPDGF-A鎖に比較的大きく
離れても作用する可能性を与える。
の例も増加している。このような遺伝子の生成物は、PD
GFやCSF-1 レセプターの例のように、全く異ったリガン
ドに対応可能であるか(E.S.Kawasaki et al, Science23
0 291(1985); C.Betsholtz et al., Nature 320,695(19
86))、またはその代りに、IGF-I およびインシュリンレ
セプターにおける如く関連リガンドに反応できる(A.Ull
richet al., Nature 313(1985); Y.Ebina et al., Cell
40, 747(1985); A.Ullrich et al., EMBO J.5, 2503(1
986))。ここで、レセプター並びにそれらのリガンドの
発生および組織の特異的発現、さらに触発された生化学
的反応は、生体の複雑性とともに進化してきている。本
研究で示されたように、PDGFによって仲介された反応
は、２種の遺伝子によってエンコードされた異なったダ
イマー型の関連リガンドを含むだけでなく、異なったPD
GFレセプターを同じくエンコードする２種の関連遺伝子
をも含む。それらの組織特異的発現 (C.Betsholtz et a
l.,Nature 320,695(1986);R.A.Seifert,S.M.Schwartz,
D.F.Bowen-Pope Nature 34,669(1984); M.Jaye et al.,
Science228, 882(1985); J.Nilssonet al., Proc. Nat
l. Acad.Sci.USA 82, 4418(1985);T.Collins et al., N
ature 316, 748(1985))における相異に加えて、この２
種のPDGF遺伝子生成物は、彼等の相対的な分泌能におい
て異なることが知られている。PDGF-A鎖は B鎖よりもは
るかに効果的に遊離され (P.Beckman et. al., Science
241, 1346(1988)、このことがPDGF-A鎖に比較的大きく
離れても作用する可能性を与える。
【００９３】今迄調査されたすべての正常な組織中に２
種のPDGFレセプター遺伝子が同時に発現する今回の証拠
を考えると、これらの組織特異的発現は、これらの機能
の主要な決定因子ではないのであろう。しかしながら、
本発明の方法を胎児発生期間および正常な同質の細胞集
団における各レセプタータイプ発現の包括的な調査に適
用することによって、示差調節 (differentialregulati
on) の証拠が明らかにされ得る。記載の背景および今回
の発表を完成するため各発表論文、特許および今迄本文
中で同定された特許明細書をここで参考文献として明細
書中に引用する。上述のように本発明が明瞭に理解でき
るよう若干詳細に記載した。本発明の範囲から逸脱する
ことなく形式や詳細を色々と組合わせることができるこ
ともまた明らかであろう。
種のPDGFレセプター遺伝子が同時に発現する今回の証拠
を考えると、これらの組織特異的発現は、これらの機能
の主要な決定因子ではないのであろう。しかしながら、
本発明の方法を胎児発生期間および正常な同質の細胞集
団における各レセプタータイプ発現の包括的な調査に適
用することによって、示差調節 (differentialregulati
on) の証拠が明らかにされ得る。記載の背景および今回
の発表を完成するため各発表論文、特許および今迄本文
中で同定された特許明細書をここで参考文献として明細
書中に引用する。上述のように本発明が明瞭に理解でき
るよう若干詳細に記載した。本発明の範囲から逸脱する
ことなく形式や詳細を色々と組合わせることができるこ
ともまた明らかであろう。
【図１】ヒト胎盤および胸腺DNA におけるv-fms PDGFレ
セプター関連遺伝子断片の検出結果を示すクロマトグラ
フ図である。v-fms プローブ〔図中の(A) 〕またはマウ
スPDGFレセプタープローブ〔図中の(B) 〕をヒト胎盤
（レーン１および３）または胸腺（レーン２および４)
DNA に対して緊縮（50％ホルムアミド；レーン１および
２）または緩和（30％ホルムアミド；レーン３および
４）ハイブリッド形成条件下のハイブリッド形成を示
す。矢印は、v-fms およびマウスPDGF-Rプローブの双方
による、緩和条件のもとで検出された12-kbp Eco RI 断
片を示す。
セプター関連遺伝子断片の検出結果を示すクロマトグラ
フ図である。v-fms プローブ〔図中の(A) 〕またはマウ
スPDGFレセプタープローブ〔図中の(B) 〕をヒト胎盤
（レーン１および３）または胸腺（レーン２および４)
DNA に対して緊縮（50％ホルムアミド；レーン１および
２）または緩和（30％ホルムアミド；レーン３および
４）ハイブリッド形成条件下のハイブリッド形成を示
す。矢印は、v-fms およびマウスPDGF-Rプローブの双方
による、緩和条件のもとで検出された12-kbp Eco RI 断
片を示す。
【図２】λTll ゲノム断片並びにTll のcDNAおよびPDGF
-R遺伝子の分子クローニングを説明する遺伝子地図であ
る。 制限地図：すなわちλTll ゲノムクローン（実線）；Tl
l cDNAクローン（中実の棒) ；およびPDGF-R cDNA クロ
ーン（中空の棒) 。ヌクレオチド配列解析によって決定
された如く、３個の断片内のコード領域をａ，ｂおよび
ｃとラベルされた黒い四辺形で示す。
-R遺伝子の分子クローニングを説明する遺伝子地図であ
る。 制限地図：すなわちλTll ゲノムクローン（実線）；Tl
l cDNAクローン（中実の棒) ；およびPDGF-R cDNA クロ
ーン（中空の棒) 。ヌクレオチド配列解析によって決定
された如く、３個の断片内のコード領域をａ，ｂおよび
ｃとラベルされた黒い四辺形で示す。
【図３】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。これらは、本来一続きであるが、表現上１０枚
に亘っている。。ヌクレオチドは左側に番号で示す。予
測アミノ酸配列の長く開いた読みとり枠をヌクレオチド
配列の上部に示す。アミノ酸は、推定される開始コドン
から始めてアミノ酸上部に番号を付す。潜在的Ｎ末端シ
グナルの配列には下線を付す。Ｎ結合したグリコシル化
の潜在的部位には上部に線を付し、システイン残基は箱
でかこむ。推定の単一膜透過領域は斜線をつけた棒で示
す。キナーゼ領域の潜在的ATP 結合部位はグリシンの60
0, 602および605 残基上とリジンの627 残基上にサーク
ルで示す。チロシンの849 残基の推定自動燐酸化部位は
＊によって示す。ａ，ｂおよびｃのエキソンによって明
示されたTll のゲノム配列の領域にはアンダーラインを
付す。ポリアデニル化されたcDNAの３′末端に近接した
AATAAAボックスも同様にアンダーラインを付す。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。これらは、本来一続きであるが、表現上１０枚
に亘っている。。ヌクレオチドは左側に番号で示す。予
測アミノ酸配列の長く開いた読みとり枠をヌクレオチド
配列の上部に示す。アミノ酸は、推定される開始コドン
から始めてアミノ酸上部に番号を付す。潜在的Ｎ末端シ
グナルの配列には下線を付す。Ｎ結合したグリコシル化
の潜在的部位には上部に線を付し、システイン残基は箱
でかこむ。推定の単一膜透過領域は斜線をつけた棒で示
す。キナーゼ領域の潜在的ATP 結合部位はグリシンの60
0, 602および605 残基上とリジンの627 残基上にサーク
ルで示す。チロシンの849 残基の推定自動燐酸化部位は
＊によって示す。ａ，ｂおよびｃのエキソンによって明
示されたTll のゲノム配列の領域にはアンダーラインを
付す。ポリアデニル化されたcDNAの３′末端に近接した
AATAAAボックスも同様にアンダーラインを付す。
【図４】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
【図５】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
【図６】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
【図７】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
【図８】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
【図９】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNAヌ
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
クレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列図
である。図３に関する説明は全て援用される。
【図１０】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNA
ヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列
図である。図３に関する説明は全て援用される。
ヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列
図である。図３に関する説明は全て援用される。
【図１１】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNA
ヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列
図である。図３に関する説明は全て援用される。
ヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列
図である。図３に関する説明は全て援用される。
【図１２】本図を含む図３から図１２までは、Tll cDNA
ヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列
図である。図３に関する説明は全て援用される。
ヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を示す配列
図である。図３に関する説明は全て援用される。
【図１３】ヒドロパシシティー(hydropathicity)プロフ
ァイルおよび他のTll レセプター様遺伝子生成物のチロ
シンキナーゼとの相似性(homology)を示すグラフであ
る。予測された蛋白質領域の略図は、シグナル配列
（Ｓ；黒色のボックス）、リガンド結合(ligand bindin
g)領域（LB）、膜透過(transmembrane) 領域（TM；２番
目の黒色のボックス）、隣接膜(juxtamembrane) 領域(J
M)、チロシンキナーゼ(tyrosine kinase) 領域（TK1, T
K2；点を打ったボックス）、インターキナーゼ(inter-k
inase)領域(IK)およびカルボキシル末端(carboxyl term
inus) (C) を示す。ヒドロパシシティーのプロファイル
はKyteおよびDoolittle(J.Kyte and R.F.Doolittle, J.
Mol. Biol.157,105(1982))の方法によって計算した。相
同性の百分率(homology percentage) は各自の領域内の
同じアミノ酸類に関して示される。 用語の省略形：IRはインシュリンレセプター；EGF-R は
表皮成長因子レセプター；NDは未確定である。
ァイルおよび他のTll レセプター様遺伝子生成物のチロ
シンキナーゼとの相似性(homology)を示すグラフであ
る。予測された蛋白質領域の略図は、シグナル配列
（Ｓ；黒色のボックス）、リガンド結合(ligand bindin
g)領域（LB）、膜透過(transmembrane) 領域（TM；２番
目の黒色のボックス）、隣接膜(juxtamembrane) 領域(J
M)、チロシンキナーゼ(tyrosine kinase) 領域（TK1, T
K2；点を打ったボックス）、インターキナーゼ(inter-k
inase)領域(IK)およびカルボキシル末端(carboxyl term
inus) (C) を示す。ヒドロパシシティーのプロファイル
はKyteおよびDoolittle(J.Kyte and R.F.Doolittle, J.
Mol. Biol.157,105(1982))の方法によって計算した。相
同性の百分率(homology percentage) は各自の領域内の
同じアミノ酸類に関して示される。 用語の省略形：IRはインシュリンレセプター；EGF-R は
表皮成長因子レセプター；NDは未確定である。
【図１４】Tll 遺伝子の染色体マッピング図である。
(A) はpT11-Pプローブとの切片上ハイブリッド形成によ
る正常ヒト染色体上の銀顆粒の分布(3.6-kbp Pst Iゲノ
ム断片のクローン)(図１参照) である。(B) は第４染色
体上の顆粒の分布である。
(A) はpT11-Pプローブとの切片上ハイブリッド形成によ
る正常ヒト染色体上の銀顆粒の分布(3.6-kbp Pst Iゲノ
ム断片のクローン)(図１参照) である。(B) は第４染色
体上の顆粒の分布である。
【図１５】Tll および既知のPDGF-R遺伝子のmRNA種の正
常および腫瘍細胞における比較結果を示すクロマト図で
ある。最初に同一のフィルターをpT11-HP(0.95-kbp Hin
d III-Pst I ゲノム断片) (A) からのプローブとハイブ
リッドさせそれからPDGF-R cDNA プローブ(B) で再びハ
イブリッドさせた。別のフィルターを最初Tll cDNA（エ
ンコード領域全体を含むTR4 の3.5-kbp Bam HI断片) で
ハイブリッドさせ(C) それからPDGF-R cDNA(HPR2の3.8-
kbp Nde I 断片) (D) で再びハイブリッドさせた。Ａお
よびＢは、ヒト平滑筋（レーン１) 、心臓（レーン２)
、肝臓（レーン３) 、脾臓（レーン４）または胎児
（レーン５および６）から抽出したRNA （レーン当り５
μg)とpoly(A) を含有していた。ＣおよびＤは、G402 l
eiomyoblastoma細胞（レーン１）、SK-LMS-1 leiomyosa
rcoma 細胞（レーン２）、A1186 またはA204 rhabdomyo
sarcoma 細胞（レーン３および４）、8387 fibrosarcom
a 細胞（レーン５）、astrocytoma 組織（レーン６およ
び７）、A1690 astrocytoma 細胞（レーン８）、A1207
またはA172 glioblastoma 細胞（レーン９および10）ま
たはA875 melanoma 細胞（レーン11）から抽出した全RN
A(レーン当り20μg)を含有した。28S および18Sリボゾ
ームRNA(マーカー）の游走は示す通りである。
常および腫瘍細胞における比較結果を示すクロマト図で
ある。最初に同一のフィルターをpT11-HP(0.95-kbp Hin
d III-Pst I ゲノム断片) (A) からのプローブとハイブ
リッドさせそれからPDGF-R cDNA プローブ(B) で再びハ
イブリッドさせた。別のフィルターを最初Tll cDNA（エ
ンコード領域全体を含むTR4 の3.5-kbp Bam HI断片) で
ハイブリッドさせ(C) それからPDGF-R cDNA(HPR2の3.8-
kbp Nde I 断片) (D) で再びハイブリッドさせた。Ａお
よびＢは、ヒト平滑筋（レーン１) 、心臓（レーン２)
、肝臓（レーン３) 、脾臓（レーン４）または胎児
（レーン５および６）から抽出したRNA （レーン当り５
μg)とpoly(A) を含有していた。ＣおよびＤは、G402 l
eiomyoblastoma細胞（レーン１）、SK-LMS-1 leiomyosa
rcoma 細胞（レーン２）、A1186 またはA204 rhabdomyo
sarcoma 細胞（レーン３および４）、8387 fibrosarcom
a 細胞（レーン５）、astrocytoma 組織（レーン６およ
び７）、A1690 astrocytoma 細胞（レーン８）、A1207
またはA172 glioblastoma 細胞（レーン９および10）ま
たはA875 melanoma 細胞（レーン11）から抽出した全RN
A(レーン当り20μg)を含有した。28S および18Sリボゾ
ームRNA(マーカー）の游走は示す通りである。
【図１６】ヒト細胞系(A) およびCOS-1 細胞トランスフ
ェクタント(B) における、ペプチドの抗血清によるTll
およびPDGF-R蛋白質の検出結果を示すウェスタンブロッ
ト図である。 (A)M426 ヒト胎児繊維芽細胞(fibroblast)（レーン１，
４，７および10) 、8387 fibrosarcoma 細胞（レーン
２，５，８および11) 、A204 rhabdomyosarcoma細胞
（レーン３，６，９および12）、(B) COS-1 細胞（レー
ン１および４）、Tll cDNA（レーン２および３）または
PDGF-R cDNA(レーン５および６）を運ぶベクターにより
移入されたCOS-1 細胞。
ェクタント(B) における、ペプチドの抗血清によるTll
およびPDGF-R蛋白質の検出結果を示すウェスタンブロッ
ト図である。 (A)M426 ヒト胎児繊維芽細胞(fibroblast)（レーン１，
４，７および10) 、8387 fibrosarcoma 細胞（レーン
２，５，８および11) 、A204 rhabdomyosarcoma細胞
（レーン３，６，９および12）、(B) COS-1 細胞（レー
ン１および４）、Tll cDNA（レーン２および３）または
PDGF-R cDNA(レーン５および６）を運ぶベクターにより
移入されたCOS-1 細胞。
【図１７】マウス対照区(control) NIH/3T3 と、対照区
COS-1 と、Tll または既知のPDGF-R cDNA 発現ベクター
により移入されたCOS-1 細胞とへの 125Ｉでラベルされ
たヒトPDGFの結合。結果は３つの試料による平均値（±
SD）を表わすグラフである。
COS-1 と、Tll または既知のPDGF-R cDNA 発現ベクター
により移入されたCOS-1 細胞とへの 125Ｉでラベルされ
たヒトPDGFの結合。結果は３つの試料による平均値（±
SD）を表わすグラフである。
【図１８】本図１８と図１９とは、異ったPDGFイソフォ
ームによって誘導されたタイプαおよびタイプβのPDGF
-R遺伝子生成物のチロシンの自動燐酸化(autophosphory
lation) を示すクロマトグラフ図である。A204(A) 、83
87(B) 、またはNIH/3T3(C)細胞を、PDGF-BB (30ng/ml)
(レーン２）、ヒトPDGF（30ng/ml)（レーン３）、PDGF-
AA(300ng/ml)(レーン４）または３mM酢酸（媒体対照区
(vehicle control) ：レーン１）でインキュベートし
た。細胞溶解物(cell lysate) を予想されたタイプαま
たはタイプβのPDGFレセプター（それぞれ抗T11(anti-T
ll) および抗HPR(anti-HPR))に対するペプチド抗血清に
よって免疫沈澱させた。免疫ブロット解析(immunoblot
analysis) をレセプターまたはphosphotyrosine(anti-P
-Tys)(J.J.Wang, Mol. Cell.Biol. 5, 3640(1985))に対
する抗体を用いてブロットの上に示すように行った。矢
印は免疫ペプチドの存在のもとでブロックされた特定の
バンドを示す。
ームによって誘導されたタイプαおよびタイプβのPDGF
-R遺伝子生成物のチロシンの自動燐酸化(autophosphory
lation) を示すクロマトグラフ図である。A204(A) 、83
87(B) 、またはNIH/3T3(C)細胞を、PDGF-BB (30ng/ml)
(レーン２）、ヒトPDGF（30ng/ml)（レーン３）、PDGF-
AA(300ng/ml)(レーン４）または３mM酢酸（媒体対照区
(vehicle control) ：レーン１）でインキュベートし
た。細胞溶解物(cell lysate) を予想されたタイプαま
たはタイプβのPDGFレセプター（それぞれ抗T11(anti-T
ll) および抗HPR(anti-HPR))に対するペプチド抗血清に
よって免疫沈澱させた。免疫ブロット解析(immunoblot
analysis) をレセプターまたはphosphotyrosine(anti-P
-Tys)(J.J.Wang, Mol. Cell.Biol. 5, 3640(1985))に対
する抗体を用いてブロットの上に示すように行った。矢
印は免疫ペプチドの存在のもとでブロックされた特定の
バンドを示す。
【図１９】本図１８と図１９とは、異ったPDGFイソフォ
ームによって誘導されたタイプαおよびタイプβのPDGF
-R遺伝子生成物のチロシンの自動燐酸化(autophosphory
lation) を示すクロマトグラフ図である。図１８に関す
る説明は、図１９についても援用される。
ームによって誘導されたタイプαおよびタイプβのPDGF
-R遺伝子生成物のチロシンの自動燐酸化(autophosphory
lation) を示すクロマトグラフ図である。図１８に関す
る説明は、図１９についても援用される。
【図２０】本図２０と図２１は、種々の細胞、例えば
〔図２０の(A) 〕マウスNIH/3T3;〔図２０の(B) 〕ヒト
M426; 〔図２０の(C) 〕ヒトAG1523; 〔図２０の(D) 〕
ヒトM413における、PDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に
よる DNA合成の刺激の結果を示すグラフである。
〔図２０の(A) 〕マウスNIH/3T3;〔図２０の(B) 〕ヒト
M426; 〔図２０の(C) 〕ヒトAG1523; 〔図２０の(D) 〕
ヒトM413における、PDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に
よる DNA合成の刺激の結果を示すグラフである。
【図２１】本図２０と図２１は、種々の細胞、例えば
〔図２０の(A) 〕マウスNIH/3T3;〔図２０の(B) 〕ヒト
M426; 〔図２０の(C) 〕ヒトAG1523; 〔図２０の(D) 〕
ヒトM413における、PDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に
よる DNA合成の刺激の結果を示すグラフである。
〔図２０の(A) 〕マウスNIH/3T3;〔図２０の(B) 〕ヒト
M426; 〔図２０の(C) 〕ヒトAG1523; 〔図２０の(D) 〕
ヒトM413における、PDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に
よる DNA合成の刺激の結果を示すグラフである。
【図２２】それぞれcDNAをになうベクターを使用するト
ランスフェクションによりタイプα（開いた印）または
タイプβ（閉じた印）のPDGFレセプターで再構成された
ヒト D32細胞のレセプターとPDGF-AB(△）またはPDGF-B
B(○) との結合を示すグラフである。挿入図は、標準
（セミログの) スキャッチャード)(Scatchard)形式によ
り再プロットされた同一のデータを表わす。
ランスフェクションによりタイプα（開いた印）または
タイプβ（閉じた印）のPDGFレセプターで再構成された
ヒト D32細胞のレセプターとPDGF-AB(△）またはPDGF-B
B(○) との結合を示すグラフである。挿入図は、標準
（セミログの) スキャッチャード)(Scatchard)形式によ
り再プロットされた同一のデータを表わす。
【図２３】タイプα（上部パネル）またはタイプβ（下
部パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32 細胞
によるPDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に対するDNA 合
成刺激反応を示すグラフである。
部パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32 細胞
によるPDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に対するDNA 合
成刺激反応を示すグラフである。
【図２４】タイプα（上部パネル）またはタイプβ（下
方パネル）PDGFレセプターにより再構成されたヒトD32
細胞によるPDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に対する走
化性反応を示すグラフである。
方パネル）PDGFレセプターにより再構成されたヒトD32
細胞によるPDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に対する走
化性反応を示すグラフである。
【図２５】タイプα（上方パネル）またはタイプβ（下
方パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32 細胞
によるPDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に対する燐酸イ
ノシトール(inositol phosphate)形成およびサイトゾル
のカルシウムイオン起動(すなわち〔Ca2+〕i;データー
は挿入図中）の反応を示すグラフである。
方パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32 細胞
によるPDGF-AB(△）またはPDGF-BB(○）に対する燐酸イ
ノシトール(inositol phosphate)形成およびサイトゾル
のカルシウムイオン起動(すなわち〔Ca2+〕i;データー
は挿入図中）の反応を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年７月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２０】 図２０は、種々の細胞における、Ｐ
ＤＧＦ−ＡＢ（△）またはＰＤＧＦ−ＢＢ（○）による
ＤＮＡ合成の刺激の結果を示すグラフである。図中
（Ａ）はマウスＮＩＨ／３Ｔ３におけるもの、（Ｂ）は
ヒトＭ４２６におけるものを示す。
ＤＧＦ−ＡＢ（△）またはＰＤＧＦ−ＢＢ（○）による
ＤＮＡ合成の刺激の結果を示すグラフである。図中
（Ａ）はマウスＮＩＨ／３Ｔ３におけるもの、（Ｂ）は
ヒトＭ４２６におけるものを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２１】 図２１は、種々の細胞における、Ｐ
ＤＧＦ−ＡＢ（△）またはＰＤＧＦ−ＢＢ（○）による
ＤＮＡ合成の刺激の結果を示すグラフである。図中
（Ｃ）はヒトＡＧ１５２３におけるもの、（Ｄ）はヒト
Ｍ４１３におけるものを示す。
ＤＧＦ−ＡＢ（△）またはＰＤＧＦ−ＢＢ（○）による
ＤＮＡ合成の刺激の結果を示すグラフである。図中
（Ｃ）はヒトＡＧ１５２３におけるもの、（Ｄ）はヒト
Ｍ４１３におけるものを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ピアース，ジャカリン・エイチ アメリカ合衆国、20816 メリーランド、 ベセスダ、オーガスタ・ストリート 5306
Claims (1)
- 【請求項１】 PDGFの潜在的類似体の、タイプβのPDGF
レセプターによって仲介された活性をテストするバイオ
アッセイにおいて、i)PDGFの類似体であると想定される
分子をタイプβのPDGFレセプター蛋白質をエンコードす
るDNA セグメントによって形質転換した細胞によって生
成したタイプβのPDGFレセプターと接触させるステップ
であって、上記DNA セグメントによって形質転換される
前の上記細胞の生存率が通常インターロイキン３に依存
するステップと、ii）上記細胞における上記タイプβの
PDGFレセプターによって仲介された生物学的活性の量を
定量するステップとからなるPDGFの潜在的類似体のタイ
プβのPDGFレセプターによって仲介された活性をテスト
するためのバイオアッセイ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30828289A | 1989-02-09 | 1989-02-09 | |
| US308,282 | 1989-02-09 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504784A Division JP2640568B2 (ja) | 1989-02-09 | 1990-02-08 | タイプα血小板由来増殖因子レセプター遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0835964A true JPH0835964A (ja) | 1996-02-06 |
| JP2826708B2 JP2826708B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=23193333
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504784A Expired - Lifetime JP2640568B2 (ja) | 1989-02-09 | 1990-02-08 | タイプα血小板由来増殖因子レセプター遺伝子 |
| JP6279838A Expired - Lifetime JP2826708B2 (ja) | 1989-02-09 | 1994-10-19 | タイプβ血小板由来増殖因子レセプターによって仲介された活性をテストするためのバイオアッセイ |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504784A Expired - Lifetime JP2640568B2 (ja) | 1989-02-09 | 1990-02-08 | タイプα血小板由来増殖因子レセプター遺伝子 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7427671B1 (ja) |
| EP (2) | EP0869177B1 (ja) |
| JP (2) | JP2640568B2 (ja) |
| AT (2) | ATE397659T1 (ja) |
| AU (1) | AU629920B2 (ja) |
| CA (1) | CA2044626C (ja) |
| DE (2) | DE69034254D1 (ja) |
| DK (1) | DK0456766T3 (ja) |
| ES (1) | ES2133269T3 (ja) |
| IL (3) | IL93331A (ja) |
| WO (1) | WO1990010013A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6110737A (en) | 1988-02-02 | 2000-08-29 | The Regents Of The University Of California | Human platelet-derived growth factor receptor, type A |
| US6642022B1 (en) | 1988-02-02 | 2003-11-04 | The Regents Of The University Of California | Platelet-derived growth factor receptors |
| US6228600B1 (en) | 1992-07-20 | 2001-05-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunoassays for the alpha platelet-derived growth factor receptor |
| US7252929B2 (en) | 1989-02-09 | 2007-08-07 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept Of Health & Human Services | Methods for identifying alpha PDGFR agonists and antagonists |
| US5468468A (en) * | 1989-02-09 | 1995-11-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Method for making a monoclonal antibody, monoclonal antibodies to α PD |
| AU1411092A (en) * | 1991-01-31 | 1992-09-07 | Cor Therapeutics, Inc. | Domains of extracellular region of human platelet derived growth factor receptor polypeptides |
| NZ246242A (en) * | 1991-12-02 | 1996-01-26 | Cor Therapeutics Inc | Inhibiting immunoglobulins acting on beta-platelet derived growth factor (pdgf) |
| US5817310A (en) | 1991-12-02 | 1998-10-06 | Cor Therapeutics, Inc. | Inhibitory immunoglobulin polypeptides to human PDGF beta receptor |
| EP0548867A2 (en) * | 1991-12-23 | 1993-06-30 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Soluble stem cell factor (SFC)-receptor |
| EP1909819A4 (en) | 2005-06-17 | 2010-02-17 | Imclone Llc | RECEPTOR ANTAGONISTS FOR THE TREATMENT OF METASTATIC BONE CANCER |
| ATE493652T1 (de) * | 2005-08-11 | 2011-01-15 | Siemens Healthcare Diagnostics | Quantitative assays für pdgfr-beta- in körperflüssigkeiten |
| CL2007002225A1 (es) | 2006-08-03 | 2008-04-18 | Astrazeneca Ab | Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un |
| EP2588141A4 (en) | 2010-07-02 | 2014-12-03 | Medimmune Llc | ANTIBODY FORMULATIONS |
| ES2604110T3 (es) * | 2011-07-01 | 2017-03-03 | Shiseido Company, Ltd. | Activador de la producción del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB, y activador de la producción de células madre mesenquimatosas, estabilizador de células madre y regenerador de la dermis comprendiendo cada uno el mismo |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766073A (en) * | 1985-02-25 | 1988-08-23 | Zymogenetics Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| US5094941A (en) | 1987-12-31 | 1992-03-10 | Zymogenetics, Inc. | Monoclonal antibodies to PDGF |
| US5567584A (en) * | 1988-01-22 | 1996-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF |
| US6642022B1 (en) * | 1988-02-02 | 2003-11-04 | The Regents Of The University Of California | Platelet-derived growth factor receptors |
| CA1339356C (en) * | 1988-02-02 | 1997-08-26 | Lewis T. Williams | Human platelet-derived growth factor receptor |
| US6110737A (en) | 1988-02-02 | 2000-08-29 | The Regents Of The University Of California | Human platelet-derived growth factor receptor, type A |
| US5100774A (en) | 1988-04-22 | 1992-03-31 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Methods for detecting growth factor receptor expression |
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-
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- 1990-02-08 CA CA002044626A patent/CA2044626C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-08 EP EP90905022A patent/EP0456766B1/en not_active Expired - Lifetime
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