JPH0445788A - 癌胎児性抗原関連蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトの癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎ。

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　　ａｎｔｉｇｅｎ：以下ヒトＣＥ
Ａと略す）関連抗原に属する非特異的交差抗原（ｎｏｎ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ　
　ａｎｔｉｇｅｎ：以下ＮＣＡと略す）及び胆汁糖蛋白
質（ｂｉｌｉａｒｙ　　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ
　：以下ＢＧＰＩと略す）の蛋白質および該蛋白質をコ
ードする遺伝子に関する。

（従来の技術） 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は１９６５年、Ｇｏｌｄおよび
Ｆ　ｒ　ｅ　ｅ　ｄｍａ　ｎにより、ヒト結腸癌と２〜
６ケ月齢胎児消化管に共通に存在する抗原として発見さ
れ（Ｇｏｌｄ、Ｐ、およびＦｒｅｅｄｍａｎ、Ｓ、Ｏ，
：　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１２１．４３９．１９６５
およびＦｒｅｅｄｍａｎ。

Ｓ、　０．　　：　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　　
１２２．　４６７．１９６５）、現在、臨床検査で最も
広く用いられている臨床マーカーの一つである。

しかしながら、ＣＥＡを腫瘍マーカーとして用いる際の
重大な問題として、正常組織にも存在するＣＥＡ関連抗
原の存在がある。ＣＥＡ関連抗原とは、蛋白質化学的に
ＣＥＡにきわめて類似しており、免疫学的にも通常の抗
ＣＥＡ抗体ではＣＥ、Ａと区別できないような共通の抗
原決定基を有していると考えられる抗原の総称である。

代表的なＣＥＡ関連抗原としては、正常人の肺や牌臓中
に見出されている分子量約９万の糖蛋白質である非特異
的交差抗原（ＮＣＡ）が知られている（ＶＯｎ　　　　
Ｋｌｅｉｓｔ、　　　Ｓ、　　　ら　　　Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔ　　ＩＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９．２４
９２゜１９７２）。その他にも胎児の便中に見出された
ＮＣＡ−２（Ｂｕ　ｒ　ｔ　ｉ　ｎ、　　Ｐ、　　ら、
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１１ユ、　１９２６．１９
７３）、正常胆汁中に発見された胆汁糖蛋白質−１（ｂ
ｉｌｉａｒｙ　　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−１（−Ｂ
ＧＰ−１）（Ｓｖｅｎｂｅｒｇ、Ｔ、、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃ
ａｎｃｅｒ、１７，５８８−５９６．１９７６）および
正常成人糞便中に発見されたＮＦＡ　（ｎｏｒｍａｌ　
　ｆｅｃａｌ　　ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｍａｔｓｕｏｋａ
、Ｙ、　　ら、Ｇａｎｎ、旦ユ、２０３．１９７３）等
がある。ＮＦＡは３つの分子種からなり、それぞれＮＦ
Ａ−１，ＮＦＡ−２およびＮＦＣＡ　（ｎｏｒｍａｌ　
　ｆｅｃａｌ　　ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ　　ａ
ｎｔｉｇｅｎ）と名付けられているが、いずれもその構
造や物理化学的性質など、その実体はあきらかにされて
いなイ（Ｋｕ　ｒ　ｏ　ｋ　ｉ、　　Ｍ、　　ら、Ｃａ
ｎｃｅｒ　　ＲｅＳ、エエ、７１３．１９８１）。

ところで、現在市販されているＣＥＡ測定用ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）またエンザイムイムノアッセイ（
ＥＩＡ）キットで使用されている殆どのまたは大部分の
抗体は、ＣＥＡとＣＥＡ関連抗原の共通の抗原部分を認
識するものであるため、これらのＣＥＡ関連抗原とＣＥ
Ａを区別して測定できないという欠点がある。さらに、
従来のキットで同−ＣＥＡ検体を測定した場合、キット
間でその測定値が異なるという問題も提起されている（
Ｋｕｒｏｋｉ、Ｍ、　　　ら　　　Ｊ、　　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ　　　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、旦０，２２１．１９８
３）（発明が解決しようとする問題点） 上記の問題を解消し、ＣＥＡのみを特異的に測定する方
法を開発するためには、ＣＥＡおよびＣＥＡ関連抗原の
構造を解明し、特異性の高い抗体を製造することが要望
される。ＣＥＡに関してはすでに及用らによりその一次
構造が明らかにされている（Ｏｉｋａｗａ、Ｓ　　ら　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ
ｎ、　　　１工呈、５１１．１９８７および特開昭６２
−６８５１号公報）。

従って、次に問題になるのは、ＣＥＡ関連抗原の構造で
ある。前述のＣＥＡ関連抗原の中で、ＮＣＡは、肺や膵
臓中に多く含まれる（ｖｏｎ　　Ｋｌｅｉｓｔ、Ｓ、　
　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳ
Ａ、旦旦、２４９２．１９７２）とともに、白血球（お
もに、顆粒球と単球）で生産されており（Ｂｏｒｄｅｓ
、Ｍ、　　ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、１１，７８
３．１９７５）、また、血中濃度もかなり高いのでＣＥ
Ａの血中濃度を測定する場合や免疫組織化学的にＣＥＡ
を検出する際、もっとも注意すべき抗原である。

ＮＣＡの分子量は、組織によって異なっており、小さい
ものでは５０ｋＤａ、大きいものでは１３０ｋＤａとい
う報告がある。例えばＢｕｃｈｅｇｇｅｒらは、顆粒球
には５５ｋＤａと９５ｋＤａのＮＣＡが存在するが、上
皮細胞には、５５ｋＤａのものしか存在しないことを報
告しており（Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ、Ｆ、　　ら、Ｉｎｔ
、Ｊ、Ｃａｎｃｅ　ｒ、３３，６４３．１９８４）　、
また、Ｇｒｕｎｅｒｔらは、上記２種のＮＣＡ以外に結
腸癌から７５ｋＤａのＮＣＡを単離している（Ｇ　ｒ　
ｕｎｅｒｔ、ｌ”、　　ら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ
。

■旦、３５７．１９８５）。さらに顆粒球ＮＣＡについ
ては、Ａｕｄｅｔｔらは、分子量１６０ｋＤａと９０ｋ
Ｄａのものを報告しているが、Ｍａｔ　５ｕｏｋａらの
グループは（Ｋｕｒｏｋｆ、ＭＯｌら、Ｊａｐ、Ｊ、Ｃ
ａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、　　（Ｇａｎｎ）７９．８２，
１９８８．およびＫｕｒｏｋｉ、Ｍｏ、　　ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ　　
１６６．７０１゜１９９０）顆粒球をｓｓＳメチオニン
で標識する系で、１６０に、９５に、９０に、８０に、
５８ｋ及び２６ｋＤａのＮＣＡの発現を報告している。

このような分子量の相違は、ＮＣＡがＣＥＡ同様糖蛋白
質であり、重量にして２０〜５０％の糖を含むことから
考えて糖鎖構造の違いによる可能性が先ず考えられるが
、蛋白質として複数のＮＣＡが存在する可能性も否定は
できない。

最近肺癌に見出されるＮＣＡ（ｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡ）
のｃＤＮＡがクローン化され、当該抗原の蛋白質の一次
構造が明らかとなった（Ｔａｗａｒａｇｉ、Ｙ、、ら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ
ｎ、１５０，８９，１９８８、及びＮｅｕｍａ　ｉ　ｅ
　ｒ、Ｍ、　　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３，
３２０２．１９８−８゜及び特開平１−１２０２８９号
公報）。ざらにＣＥＡ関連抗原としては、ＢＧＰ−Ｉの
ｃＤＮＡがクローン化され、（Ｈｉｎｏｄａ、Ｙ、　　
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳ
Ａ、８−塁−，６９５９，１９８８）当該蛋白質の一次
構造が明らかになり、更に、ＢＧＰ−１遺伝子は選択ス
プライシングにより複数個のメツセンジャーＲＮＡ、複
数個の蛋白質をコードする事が判明した（Ｂａｒｎｅｔ
ｔ、Ｔ、Ｒ，、ら、Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．工立旦、２
６７．１９８９）。

しかしこのような進展にもかかわらず、まだＮＣＡの全
分子種の相互関係に関しては、現在のところ明らかにさ
れていない点が多い。そこで、本発明者はヒト顆粒球Ｎ
ＣＡ遺伝子をクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を決
定することにより、ヒト顆粒球ＮＣＡの全アミノ酸配列
を明らかにするため、鋭意研究を行った。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、ヒト顆粒球ＮＣＡ遺伝子をクローニングす
るため、ヒト末梢血より抽出したメツセンジャーＲＮＡ
を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。そこからＮ
ＣＡの遺伝子を単離・同定し、さらにその塩基配列を解
析・決定した。その解明された塩基配列をもとにヒト顆
粒球ＮＣＡの全構造を明らかにし、本発明を完成するに
いたった。

本発明のヒト顆粒球ＮＣＡ蛋白質をコードする遺伝子は
、次のようにして得ることができる。

先ず、１３０人分の血液より、デキストラン法を用いて
白血球画分を分離し、そのメツセンジャーＲＮＡを用い
て、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。ｃＤＮＡライブ
ラリーの調製は、公知の適当な方法で行うことができる
。

こうして調製されたｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）か
らの目的とするクローン（ヒト顆粒球ＮＣＡ蛋白質を発
現するクローン）のスクリーニングは、既にクローン化
されている、ｔｕｍｏｒＮＣＡのｃＤＮＡを適当な制限
酵素で切断して調製した断片をラベルし、これをプロー
ブとして用いて行うことが出来る。

次に、上記のようにしてスクリーニングされた陽性クロ
ーン（大腸菌）からファージＤＮＡを常法により分離し
、制限酵素解析により、目的とするｃＤＮＡ　（ヒト顆
粒球ＮＣＡのｃＤＮＡ）が該ファージＤＮＡ中に挿入さ
れていることを確認し、その挿入ｃＤＮＡの塩基配列を
常法により決定する。

次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡの塩基配列の
翻訳可能領域（オーブンリーディング領域）を、常法に
従って翻訳することによりヒト顆粒球ＮＣＡをコードす
る遺伝子ならびにヒト顆粒球ＮＣＡ蛋白質の構造（アミ
ノ酸配列）を知ることができる。こうして塩基配列が判
明したヒト顆粒球ＮＣＡの構造遺伝子は、化学的に合成
することによっても得ることができる。

さらに上記のようにして得られるヒト顆粒球ＮＣＡ遺伝
子を用いて、大腸菌や酵母のような微生物あるいは動物
細胞でヒト顆粒球ＮＣＡ蛋白質を製造することが可能で
ある。即ち、上記で得られたヒト顆粒球ＮＣＡの構造遺
伝子の５゛側に適当なプロモーター領域を付加し、これ
を適当なプラスミドに挿入したのち、大腸菌や酵母のよ
うな微生物あるいは動物細胞に導入して、培養すればよ
い。このような操作は公知の技術を用いることにより行
うことができ、また不要なペプチド領域、例えばＣＥＡ
やｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡと共通するペプチド領域を除い
た、特異的な抗原ペプチドを微生物や動物細胞で製造す
ることも可能である。そして、これらのペプチドを抗原
として、ヒト顆粒球ＮＣＡにのみ特異的に反応するポリ
クローナルもしくはモノクローナル抗体を常法により作
ることができる。また、ＣＥＡやｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡ
をコードするｃＤＮＡとの塩基配列の比較から、ＣＥＡ
、ｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡと顆粒球ＮＣＡとを区別できる
ような特異的なりＮＡプローブの調製が可能となり、こ
のようなプローブを用いることによって、正常組織、癌
組織に含まれるＣＥＡｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡ、顆粒球Ｎ
ＣＡのｍＲＮＡ発現量を正確に知ることも可能である。

以下、−本発明を実施例をもってさらに詳しく説明する
。

（実施例） （１）ＲＮＡ抽出 正常成人末梢血（１３０人分、９リツトル）よりデキス
トラン法を用いて白血球分画を分離し、シャーゲインの
方法（Ｃｈｉ　ｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、１８．５２９４　１９７９）に従い、５Ｍ
グアニジウムイソチオシアネート存在下でホモジェナイ
ズし、ＣｓＣ１密度勾配遠心法により２．６ｍｇのＲＮ
Ａを調製した。次に全量のＲＮＡより０．５Ｍ　　Ｌｉ
Ｃｌ。

１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳを含む１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，２）を結合バッファーとして用
いオリゴｄＴセルロースに結合したメツセンジャーＲＮ
Ａ　（ｐｏｌ）’　（Ａ）”）　５７　Ａｌ　ｇを調製
した。

（２）　　ｃＤＮＡライブラリー作製 上記のｐｏｌｙ　（Ａ）″ＲＮＡ　５μｇをテンプレー
ト、４μｇのオリゴ（ｄＴ）　１２−１８をプライマー
とし、逆転写酵素を用いてファーストストランドＣＤ、
ＮＡを合成し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＲＮａｓｅ　
Ｈで鋳型のＲＮＡを消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩでセ
カンドストランドｃＤＮＡを合成した。さらにＴ４ポリ
メラーゼのエキソヌクレアーゼ活性で２本ｇｐ　ｃＤＮ
Ａを平滑末端化し、２重鎖ｃＤＮＡを合成した。以上ま
での操作は合成システム・プラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ、
　Ｕ、ＳＡ、　：　ｃｏｄｅ　ＲＰＮ、１２５６Ｙ／Ｚ
）を用い、その説明書に従った。

次に、このｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼでＥｃｏＲ
１部位を保護し、ＥｃｏＲｌ　　リンカ−（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ　　Ｕ、Ｓ、Ａ）をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。そして制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バイ
オゲル（Ｂｉｏ　ｇｅｌ）　Ａ５０　（ＢｉｏＲａｄ、
　Ｕ、Ｓ、Ａ、）に通し、ＥｃｏＲＩ末端を有するｃＤ
ＮＡを精製した。

続いて、λＺＡＰ　ＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ　Ｖ
ｅｃｔｏｒ　ＫＩＴ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌｌ、
Ｓ、Ａ、）を用いて、ｃＤＮＡをＴ４　ＤＮＡリガーゼ
テ２ＺＡＰ　ＩＩ　ＥＣ０ＲＩ７−Ａｌ：連結し、２−
ＤＮＡインビトロ・パッケージング・キット・ギガバッ
ク・プラス（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　
ｋｉｔ　Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ）（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）でｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケ
ージングを行い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。！
ＤＲＮＡ１μｇあたり、約８０万個の組み換えファージ
プラーク（ｃＤＮＡライブラリー）が得られた。

（３）スクリーニング 前記（２）で得られた約２００万個の組み換え体ファー
ジを宿主大腸菌ＢＢ４　（ストラタジーン（ＵＳ））に
感染させ、ブレーティングし、プレート上にプラークを
形成させた後、ニトロセルロースフィルターにファージ
を吸着させ、１．５ＭＮａＣ１を含む０．５Ｍ　　Ｎａ
ＯＨで３０秒処理することにより変性させ、３．０Ｍ　
　ＮａＣｌを含むＯ５５ＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ　　（ｐＨ７
，５）で１・５分処理することにより中和後、風乾し、
８０℃で２時間焼付けをした。

続イテ先に取得したｔｕｍｏｒ　ＮＣＡ　（Ｔａｗａｒ
ａｇｉ　Ｙ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＋ｍｕｎ、、１５（１８９−９６
、１９８８、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　ＳＢＭ２９４と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第９６８７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−
９６８７）として寄託されている）のＮ−ドメイン（ｄ
ｏｍａｉｎ）のＮｃｏＩ−Ｂｇｌ　ｌｌ８８１ｂｐ断片
を、ヘキサヌクレオチド、フレノウ断片、〔α”ｐ、１
ａｃｔｐ　　等を用いるマルチプライム法で８２ｐ　ｔ
ｌＡ識してプローブを作製した。これにはＤＮＡラベリ
ングキット（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｋｉｔ）　（＝　ッ
ポンジーン）を使用し、その使用法に従った。このプロ
ーブと、上記のフィルターに固定化されたＤＮＡ分子と
のハイブリダイゼーションを、以下のように行った。

先ずフィルターを３％スキムミルクと１００　μｇ／ｍ
ｌニシン精子ＤＮＡを含むＧ　Ｘ　ＳＳＣ中で６５℃、
３時間保温し、プレハイブリダイゼーションを行った。

続いてプレハイブリダイゼーション溶液に８２ｐ標識プ
ローブを加え、更に６５℃、１６時間保温し、ハイブリ
ダイゼーションを行った。続いてフィルターを０．１％
ＳＤＳを含む２　ｘ　ＳＳＣ，６５℃で４回洗浄し、風
乾したのちオートラジオグラフィーにかけた。この操作
で得られた約２００個の陽性プラークから、１００個の
プラークを選択した。陽性プラークからのファージを新
たに宿主大腸菌ＢＢ４に感染させ９９個の陽性プラーク
を得、それらを単離した。

（４）　自動切り離し制限酵素地図 陽性クローンファージは、Ｍ１３ヘルパーファージＲ−
４０８（ストラタジーン）と宿主菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（
ストラタジーン）を用いλＺＡＰ　ｎ　（ストラタジー
ン）の自動切り離しによりＤＮＡインサートをｐＢｌｕ
ｅ−ｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）に組み込ませた。

プラスミドＤＮＡはアルカリ−５ＤＳ法（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版）、　Ｊ、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ　ら、　ｐｉ−２５，Ｃ５ＨＬブレス、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）で調製した。

このプラスミドＤＮＡを用いて制限酵素地図を作製した
。使用した制限酵素はいずれもニラポンジーンのもので
以下に示す。

・ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）　　ポリリンカ
ー酵素５ａｃｌ　　ＸｂａＩ、ＢａｍＨｌ、Ｓｍａｌ、
Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲＩ。

ＥｃｏＲＶ、　ＨｉｎｄＩ［［、ＨｉｎｃＩＩ、　　５
ａｉ１．　Ｘｈｏｌ。

Ａｐａｌ、　！ｌ：ｐｎｌ ・ノンポリリンカー酵素 ５ｐｈｌ、　Ｂａ１ｌ、　ＮｃｏＩ、　Ｎ５ｉｌ、　５
ｔｕｌ、　ＢｇｌＩＩ自動切り自動側限酵素地図（第１
Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ及び６Ａ図）に於いて、Ｄ
ＮＡ部分は白抜き箱型で示し、その上部に制限酵素切断
部位と当該酵素名を、下に数字でヌレオチド残基数を示
した。横の矢印は配列解析の方向と範囲を示している。

（５）　サブクローニング ＤＮＡインサートをＥｃｏＲ１部位で切り出し、ｐＵＣ
１１８（宝酒造）に組み込み、制限酵素地図をもとに適
当な制限酵素部位でサブクローニングを行った。制限酵
素によりプラスミドを切断し、５′末端突出のものに対
してはフレノウフラグメント、３′末端突出のものに対
してはＴＪ　ＤＮＡポリメラーゼエを使用し、平滑末端
化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで両末端を連結した。この
ＤＮＡをコンピテント細胞ＤＨ５α（クロンチック（Ｃ
１ｏｎｔｅｃｈ）　（ＵＳ））にトランスフォーメンジ
ョンし、アルカリ−５ＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製
した。

（６）　デレージョン プラスミドＤＮＡをインサートＤＮＡ側を５゛末端突出
もしくは平滑末端になる制限酵素で、シーフェンス時の
ブライマーアニーリング側を３′末端突出になる制限酵
素でそれぞれ切断し、エクソヌクレアーゼ■で３°側か
ら５′側へ分解し、これを時間毎にサンプリングし、ヤ
エナリ（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで一本鎖Ｄ
ＮＡ部分を切断、さらにフレノウフラグメントで完全に
平滑末端にし、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで両末端を連結し
た。コンピテント細胞ＤＨ５αにトランスフォーメンジ
ョンし、アルカリ−３ＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製
し、インサートＤＮＡのサイズをＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
　　で切断して調べた。デレージョンにはキロシーフェ
ンス用デレージョンキット（宝酒造）を使用した。

（７）　塩基配列の決定 上記のプラスミドＤＮＡ　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　
５Ｋ（−）、　ＰＵＣｌｌｇ、サブクローニング、デレ
ージョンで得たプラスミドＤＮＡ）をコンピテント細胞
ＭＶ１１８４　　（宝酒造）とへルバーファージＭ１３
　ＫＯ７（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　（ＵＳ）　）
を使用して一本鎖ＤＮＡを調製した。

また−重鎮ＤＮＡ　　を鋳型とし、相補的なオリゴヌク
レオチドをブライマーとしＤＮＡを５′側から３′側方
同へ伸長させるジデオキシ法を使用した。この操作には
５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ）を
使用したシーフェンシングキット（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ　Ｋｉｔ）（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）を用いた。ブライマーはｐＵＣ系プラ
スミドに対してはシーフェンシングブライ？−（Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒ１Ｉｌｌｅｒ）、　Ｍ１３　（ス
トラタジーン）を、またｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ
（−）系ブラぶミドには、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅ
ｒもしくは５Ｋ（−）　Ｐｒｉｍｅｒ　　（ストラタジ
ーン）を使用した。また標識ヌクレオチドには〔α−”
ｓ　）チオ罰ＡＴＰを使用し両側から塩基配列を決定し
た。

以下に塩基配列を決定するのに用いたプラスミドを示す
。尚、制限酵素断片の左側の制限酵素部位は、ポリリン
カー中の、右側は挿入ＤＮＡ中の部位を示す。

ＢＣ２３６ ・サブクローニング ・デレージョン プラスミド　Ｂｌｕａｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）（イン
サートＤＮＡ順向） プラスミド　ｐＵｃｌｌｇ （インサート逆向） プラスミド　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）（イン
サートＤＮＡ順向） ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨｌ、　Ｘｂａｌ−ＮｃｏＩ　　Ｓ
ｍａｌ−ＳｍａＩプラスミド　ｐＵｃｌｌｇ （インサートＤＮＡ　逆向） 使用制限部位　５ｐｈｌ、Ｘｂａｌ ＢＣ２６４ プラスミド　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）（イン
サートＤＮＡ順向） プラスミド　ｐＵｃｌｌｇ ・サック叶ニング ・デレージョン （インサート逆向） プラスミド　ｐＵｃｌｌｇ （インサートＤＮＡ順向） Ｘｂａｌ−Ｂｇｌ　ＩＩ　、　Ｈｉｎｃ　ＩＩ　−５ｔ
ｕｌプラスミド　ｐｌＪｃ１１８ （インサートＤＮＡ逆向） 使用制限部位　　　Ｐｓｔｌ、　ＸｂａｌｌＦＢｃ２８
２ ・号ブクＤ−二ング ・　ブレーンラン プラスミド　ｐｔｌｃ１１８ （インサートＤＮＡ　　順、逆向） プラスミド　ｐＵＣ１１８ （インサートＤＮＡ順向） Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔｌ　　Ｓｍａｌ−Ｂａｌｌプラスミド
　ｐＵｃｌｌｇ （インサートＤＮＡ逆向） 使用制限部位　　　５ｐｈｌ、　ＸｂａｌＷＢＣ２１１ プラスミド　ｐＬｌｃ　１１８ （インサートＤＮＡ 順、逆向） ・サブクローニング ブラスミ ド Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（−） （インサートＤＮＡ順向） ＰｓｔＩ−Ｐｓｔｌ、　ＢａｍＨｌ−ＢａｍＨＩ、　　
５ａｃｌ−８ａｃＩＸｂａｉ−ＮｓｉＩ ＢＣ２３３ ・サブクローニング プラスミド　ｐＵｃ１１８ （インサーｈ　ＤＮＡ　　順、逆向） プラスミド　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）（イン
サートＤＮＡ順向） Ｐｓｔｌ−ＰｓｔＩ　　ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩプラス
ミド　ｐＵｃ１１８ （インサートＤＮＡ逆向） ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ、　Ｐｓｔｌ−ＰｓｔｌＢＣ２
３９ ・　サブクローニング プラスミド　ｐＵｃ１１８ （インサートＤＮＡ　　順、逆向） プラスミド　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）（イン
サートＤＮＡ順向） Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔｌ　　ＢａｍＨＩ−Ｂａｍ）ＩＩ　　
５ａｃｌ−８ａｃｌプラスミド　ｐＵｃ１１８ （インサートＤＮＡ逆向） ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ 各クローンの塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ第１
Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ及び６Ｂ図に示した。上段
に塩基配列、下段にはその塩基配列のコードするアミノ
酸を三文字標記で示した。

右端の数字はそれぞれのクローンのｃＤＮＡの５゛−末
端を１としたヌクレオチド残基数を、中程の数字はＣＥ
Ａ、ＮＣＡ　（Ｏｉ　ｋａｗａ　　Ｓ、　　ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ。

ｍｍｕｎ、１土又、５１１−５１８　（１９８７）＆Ｏ
ｉｋａｗａ　　Ｓ、　　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１４旦、４６４−４６
９　（１９８７））を参考に推定した成熟蛋白質のＮ−
末端を１として数えたアミノ酸残基数をしめす。−数字
はシグナル配列に付けた。

尚、塩基配列はｃＤＮＡのセンスストランドのものでＳ
ＢＭ３１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＳＢ
Ｍ３１３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＳＢＭ
）１４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＳＢＭ３
１５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＳＢＭ３１
６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｓ８Ｍ３１７
　　　　　”　　　　　　　と命名され、工業技術院微
生物工業技術研究所に各々、微工研菌寄第１１５１０号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５１０）、微工研菌寄第１１５１
１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５１１）、微工研菌寄第１１
５１２号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５１２）、微工研菌寄第
１１５１３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５１３）、微工研菌
寄第１１５１４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５１４）、微工
研菌寄第１１５１５号（ＦＥＢＭ　Ｐ−１１５１５）と
して寄託されている。

以下にｃＤＮＡＤＮＡ−ン及び、それら各クローンによ
ってコードされる蛋白質の性質を記述する。

（ｉ）　Ｗ２３６　（第１Ａ及び１８図）当クローンは
３°−末端の１８Ａ残基を含めて１２０８残基よりなり
、３゛−非翻訳領域ＵＴＲはポリへの１８Ａ残基を含む
全ての領域、５’−ＵＴＲも９７ヌレオチドを有する、
下に説明するような蛋白質をコードするメツセンジャー
ＲＮＡの殆ど全域を代表するものである。ヌクレオチド
１１２４−１１２９に所謂ポリＡシグナルＡＡＴＡＡＡ
配列をもつ。ヌクレオチド９８−８２９の翻訳枠（オー
ブンリーディングフレーム、０ＲＦ）は３４アミノ酸よ
りなるシグナル配列及びそれに続く２１０アミノ酸より
なる総アミノ酸数２４４の新規な蛋白質プレープローＷ
２３６をコードする。プローＷ２３６は既知のＣＥＡフ
ァミリーメンバーとの比較により、Ｎ−末より順に、１
ｏ８アミノ酸よりなるＮ−ドメイン、１０２アミノ酸よ
りなる細胞膜貫通領域−細胞内ドメインとよりなる。Ｎ
−グリコジル化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ドメイン
には４個あり、細胞膜貫通領域−細胞内ドメイン及びシ
グナル配列には無い。

（ｉｉ）　　Ｗ２６４　（第２Ａ及び２Ｂ図）当クロー
ンは３゛−末端のｌｌ０Ａ残基を含めて１２５９残基よ
りなり、３’−ＵＴＲはポリＡの１１０Ａ残基を含む全
ての領域、５’−ＵＴＲ末端も７４ヌレオチドを有する
、下に説明するような蛋白質をコードするメツセンジャ
ーＲＮＡの殆ど全域を代表するものである。ヌクレオチ
ド１１２８−１１３３に所謂ポリＡシグナルＡＡＴＡＡ
Ａ配列をもつ。ヌクレオチド７５−８３０のＯＲＦ　Ｊ
ｔ３４アミノ酸よりなるシグナル配列及びそれに続く２
１８アミノ酸よりなる総アミノ酸数２５２の新規な蛋白
質プレープローＷ２６４をコードする。プローＷ２６４
は既知のＣＥＡファミリーメンバーとの比較により、Ｎ
−末より順に、１０８アミノ酸よりなるＮ−ドメイン、
１１０アミノ酸よりなる細胞膜貫通領域−細胞内ドメイ
ンとよりなる。Ｎ−グリコジル化可能アスパラギン残基
は、Ｎ−ドメインには４個あり、細胞膜貫通領域−細胞
内ドメイン及びシグナル配列には無い。

（ｉｉｉ）　Ｗ２８２　（第３Ａ及び３Ｂ図）当クロー
ンは３′−末端の６８Ａ残基を含めて１５８７残基より
なり、３’−ＵＴＲはポリＡの６８Ａ残基を含む全ての
領域、５’−ＵＴＲも６１ヌレオチドを有する、下に説
明するような蛋白質をコードすメツセンジャーＲＮＡの
゛殆ど全域を代表するものである。ヌクレオチド１４９
８−１５０３に所謂ポリＡシグナルＡＡＴＡＡＡ配列を
もつ。

ヌクレオチド６２−５９２のＯＲＦは３４アミノ酸より
なるシグナル配列及びそれに続く１４３アミノ酸よりな
る総アミノ酸数１７７の新規な蛋白質プレープローＷ２
８２をコードする。ブローＷ２８２は既知のＣＥＡファ
ミリーメンバーとの比較により、Ｎ−末より順に、１０
８アミノ酸よりなるＮ−ドメイン、ｔｕｍｏｒ　　ＮＣ
Ａのドメイン−ＩのＮ未配列と極めて類似した３５アミ
ノ酸よりなるＣ−末ドメインとよりなる。Ｎ−グリコジ
ル化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ドメインには２個、
Ｃ−末様ドメインに１個あり、シグナル配列には無い。

（ｉｖ）　　Ｗ２１１　（第４Ａ及び４Ｂ図）当クロー
ンは３′−末端の１７Ａ残基を含めて１７５９残基より
なり、３°−ＵＴＲはポリＡの１７Ａ残基を含む全ての
領域、５°−ＵＴＲも６４ヌレオチドを有する、下に説
明するような蛋白質をコードするメツセンジャーＲＮＡ
の殆ど全域を代表するものである。３’−ＵＴＲには所
謂ポリＡシグナルＡＡＴＡＡＡ配列をもたない。ヌクレ
オチド６５−１３１５のＯＲＦは３４アミノ酸よ切なる
シグナル配列及びそれに続く３８３アミノ酸よりなる総
アミノ酸数４１７のプレープローＷ２１１をコードする
。ブローＷ２１１は既知のＣＥＡファミリーメンバーと
の比較により、Ｎ−末より順に、１０８アミノ酸よりな
るＮ−ドメイン、９２アミノ酸よりなるＡｌ、８６アミ
ノ酸よりなるＢ１．９２アミノ酸よりなるＡ２ドメイン
とよりなる。Ｎ−グリコジル化可能アスパラギン残基は
、Ｎ−ドメインより順に、３．５．５．７個あり、シグ
ナル配列には無い。

（ｖ）　Ｗ２３３　（第５Ａ及び５Ｂ図）当クローンは
３′−末端の１４Ａ残基を含めて１７９７残基よりなり
、３’−ｔＪＴＲはポリＡの１４Ａ残基を含む全ての領
域、５’−ＵＴＲも１０３ヌレオチドを有する、下に説
明するような蛋白質をコードするメツセンジャーＲＮＡ
の殆ど全域を代表するものである。３　’−Ｕ　Ｔ　Ｒ
には所謂ポリＡシグナルＡＡＴＡＡＡ配列をもたない。

ヌクレオチド１０４−１０６６のＯＲＦは３４アミノ酸
よりなるシグナル配列及びそれに続く２８７アミノ酸よ
りなる総アミノ酸数３２１のプレープローＷ２３３をコ
ードする。プローＷ２３３は既知のＣＥＡファミリーメ
ンバーとの比較により、Ｎ−末より順に、１０８アミノ
酸よりなるＮ−ドメイン、９２アミノ酸よりなるＡｌ、
８６アミノ酸よりなるＢ１ドメインとよりなる。Ｎ−グ
リコジル化可能アスパラギン残基は、Ｎ−ドメインより
順に、３．６．５個あり、シグナル配列には無い。

（ｖｉ）　　Ｗ２３９　（第６Ａ及び６Ｂ図）当クロー
ンは３−末端の１２Ａ残基゛を含めて１６３１残基より
なり、３　’−Ｕ　Ｔ　Ｒはポリへの１２Ａ残基を含む
全ての領域、５’−ＵＴＲも７５ヌレオチドを有する、
下に説明するような蛋白質をコ−ドするメツセンジャー
ＲＮＡの殆ど全域を代表するものである。３’−ＵＴＲ
には所謂ポリＡシグナルＡＡＴＡＡＡ配列をもたない。

ヌクレオチド７６−１１２８のＯＲＦは３４アミノ酸よ
りなるシグナル配列及びそれに続く３１７アミノ酸より
なる総アミノ酸数３５１のプレープローＷ２３９をコー
ドする。プローＷ２３９は既知のＣＥＡファミリーメン
バーとの比較により、Ｎ−末より順に、１０８アミノ酸
よりなるＮ−ドメイン、９２アミノ酸よりなるＡ１．８
６アミノ酸よりなるＢ１．３１アミノ酸よりなる不完全
なＡ２ドメインとよりなる。Ｎ−グリコジル化可能アス
パラギン残基は、Ｎ−ドメインより順に、３．６．５個
あり、シグナル配列には無い。

尚、（ｉｖ）　、　（ｖ）　、　（ｖｉ）に記載したク
ローンは（ｉｖ）　、（ｖ）　、　（ｖｉ）に記載した
蛋白質をコードするメツセンジャーＲＮＡのｃＤＮＡク
ローンであり、これらの遺伝子配列は、第７図に示した
様にＢＧＰ−■の染色体遺伝子の選択スプライシングに
より新しいドメインの組み合わせによる新しい蛋白質が
生合成されたものであり、顆粒球ＮＣＡグループに属す
ると思われる。

（発明の効果） （１）　本発明の遺伝子を使用して６種のヒト顆粒球Ｎ
ＣＡまたは種々のヒト顆粒球ＮＣＡフラグメントを細胞
（大腸菌、酵母、動物細胞等）で発現させ大量に調製す
ることが可能になった。その結果得られるヒト顆粒球Ｎ
ＣＡあるいはヒト顆粒球ＮＣＡフラグメントを用いて抗
ＣＥＡ抗体を吸収することにより、ＣＥＡ特異抗体を得
ることができる。

（２）　本発明によりＣＥＡＳｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡと
顆粒球ＮＣＡの構造上の違いが明確になった。例えば、
顆粒球ＮＣＡのアミノ酸７−１０の配列は、ＣＥＡ及び
ｔｕｍｏｒ　　ＮＣＡのどのドメインのそれに対応する
アミノ酸配列とも異なっている。従って、この部分を含
むペプチドフラグメントを遺伝子工学的手法あるいは合
成法を用いて作製し抗原として用いれば、ＣＥＡＳ　ｔ
　ｕｍｏ　ｒＮＣＡと顆粒球ＮＣＡを区別する抗体を得
ることが可能である。さらに詳細に比較することにより
、各抗原を区別する特異抗体を得ることが可能である。

（３）　前言己のとおり、本発明者によりヒトＣＥＡお
よびそれぞれのＮＣＡに特異的な抗体の作製が可能とな
るため、癌の診断、例えば癌のスクリニング、確定診断
、癌の進行度判定、治療のモニタリング、標識抗ＣＥＡ
抗体による癌の局在診断が可能となり、加えてミサイル
療法などの治療にも利用することが期待される。

（４）　本発明により、ＣＥＡおよびそれぞれのＮＣＡ
に特異的なりＮＡプローブの調製が可能となる。このよ
うなプローブを用いれば、従来抗体を用いた免疫組織化
学的手段に代えて、ヒトＣＥＡを産生ずる腫瘍等の組織
を、インスイトウー（ｉｎ　　５ｉｔｕ）ハイブリダイ
ゼーションによって、より特異的に検出することも可能
と考えられる。

以上のように本発明の使用分野は多岐にわたり、その利
用価値は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、本発明によるクローンＷ２３６の自動切り
離し制限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示して
いる。 第１Ｂ図は、本発明によるクローンＷ２３６のｃＤＮＡ
配列のアミノ酸および塩基配列を示す図である。 第２Ａ図は、本発明によるクローンＷ２６４の自動切り
離し制限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示して
いる。 第２Ｂ図は、本発明によるクローンＷ２６４のｃ　ＤＮ
Ａ配列のアミノ酸および塩基配列を示す図である。 第３Ａ図は、本発明によるクローンＷ２８２の自動切り
離し制限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示して
いる。 第３Ｂ図は、本発明によるクローンＷ２８２のｃＤＮＡ
配列のアミノ酸および塩基配列を示す図である。 第４Ａ図は、本発明によるクローンＷ２１１の自動切り
層し制限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示して
いる。 第４Ｂ−１図および第４Ｂ−２図は、−緒になって本発
明によるクローンＷ２１１のｅＤＮＡ配列のアミノ酸お
よび塩基配列を示す一連の図である。 第５Ａ図は、本発明によるクローンＷ２３３の自動切り
離し制限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示して
いる。 第５Ｂ−１図および第５Ｂ−２図は、−緒になって本発
明によるクローンＷ２３３のｃＤＮＡ配列のアミノ酸お
よび塩基配列を示す一連の図である。 第６Ａ図は、本発明によるクローンＷ２３９の自動切り
離し制限酵素地図であり、塩基配列解析戦略をも示して
いる。 第６Ｂ−１図および第６Ｂ−２図は、−緒になって本発
明によるクローンＷ２３９のｃＤＮＡ配列のアミノ酸お
よび塩基配列を示す一連の図である。 第７図は、本発明によるクローンＷ２１１．Ｗ２３３、
Ｗ２３９のメツセンジャーＲＮＡが如何にＢＧＰ−１の
染色体遺伝子から選択スプライシングにより、生成する
かを示した模式図であり、白抜き及び斜線長方形はそれ
ぞれＢＧＰ遺伝子及び、Ｗ２１１，２３３，２３９のｍ
ＲＮＡ中のエクソン部分を示し、横線はイントロンの一
部を示し、各エクソン部分をつなぐｖ字状の線はスプラ
イシングを示し、そして打点長方形は３゛−υＴＲを示
す。 特許出願人　サントリー株式会社 第１Ａ凹 第２Ａ図 第１Ｂ図 第２Ｂ図 ＶｚＥＡ図 第４Ａ図 し□−−−□□□□□□−−Ｓ 第３Ｂ図 第４Ｂ−１図 第４Ｂ−２図 第５八凹 第６八凹 Ｌ　ｙ　Ｂ　＊　＊　＊ 第５Ｂ−１図 第５Ｂ−２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト顆粒球由来の癌胎児性抗原関連抗原をコードす
   るｃＤＮＡ。 ２、微工研菌寄第９６８７号（ＦＥＲＭＰ−９６８７）
   として寄託されている大腸菌内に保存されている癌非特
   異的交差抗原（ＮＣＡという）遺伝子のＮ−ドメインの
   Ｎｃｏ I −ＢｇｌII３８１ｂｐ断片をプローブとして
   、ヒト白血球から調製されたｃＤＮＡライブラリーをス
   クリーニングして得られる、請求項１記載のｃＤＮＡ。 ３、第１Ｂ図の第９８番目の塩基Ａから第８２９番目の
   塩基Ｔまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 ４、第１Ｂ図の第２００番目の塩基Ｃから第８２９番目
   の塩基Ｔまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 ５、第２Ｂ図の第７５番目のＡから第８３０番目の塩基
   Ｔまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 ６、第２Ｂ図の第１７７番目のＡから第８３０番目の塩
   基Ｔまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 ７、第３Ｂ図の第６２番目の塩基Ａから第５９２番目の
   塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 ８、第３Ｂ図の第１６４番目の塩基Ａから第５９２番目
   の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 ９、第４Ｂ図の第６５番目の塩基Ａから第１３１５番目
   の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 １０、第４Ｂ図の第１６７番目の塩基Ｃから第１３１５
   番目の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 １１、第５Ｂ図の第１０４番目の塩基Ａから第１０６６
   番目の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 １２、第５Ｂ図の第２０６番目の塩基Ｃから第１０６６
   番目の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 １３、第６Ｂ図の第７６番目の塩基Ａから第１１２８番
   目の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 １４、第６Ｂ図の第１７８番目の塩基Ｃから第１１２８
   番目の塩基Ｇまでの塩基配列を有するｃＤＮＡ。 １５、ヒト顆粒球由来の癌胎児性抗原関連抗原。 １６、請求項３〜１５のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ
   によりコードされるアミノ酸配列を有するヒト顆粒球由
   来の癌胎児性抗原関連抗原。