BR102021022687A2 - Método e reagentes para diagnosticar nefropatia membranosa - Google Patents
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Abstract
MÉTODO E REAGENTES PARA DIAGNOSTICAR NEFROPATIA MEMBRANOSA. A presente invenção refere-se a um veículo diagnosticamente útil revestido com um polipeptídeo recombinante compreendendo a SEQ ID NO1, um autoanticorpo isolado que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, um kit compreendendo o veículo, um método para o diagnóstico de uma nefropatia membranosa (MN) compreendendo a etapa de detecção da presença ou ausência de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 em uma amostra líquida compreendendo anticorpos a partir de um indivíduo, um uso de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1, e uma solução aquosa compreendendo um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um veículo revestido com um polipeptídeo recombinante compreendendo a SEQ ID NO1, um autoanticorpo isolado que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, um kit compreendendo o veículo, um método compreendendo a etapa que detecta a presença ou ausência de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 em uma amostra líquida compreendendo anticorpos de um indivíduo, um uso de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1, e uma solução aquosa compreendendo um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1.
[0002] A nefropatia membranosa é uma doença autoimune com uma prevalência de 1 a 2/100.000 indivíduos/ano e a causa mais comum de síndrome nefrótica em adultos caucasianos. Os sintomas clínicos iniciais são edema devido à perda de proteína renal aumentada, definida como proteinúria patológica, a qual é induzida pela lesão da barreira de filtração glomerular renal.
[0003] O curso clínico da doença é variável e varia da remissão espontânea da proteinúria até doença renal de estágio final (ESRD). Os pacientes com remissão espontânea (cerca de 20-25% dos pacientes) geralmente têm um resultado clínico excelente. Do outro lado do espectro da doença, cerca de 20% dos pacientes experimentam ESRD por um período de dez anos, frequentemente apesar da terapia imu-nossupressora. O terceiro grupo dos pacientes se apresenta com, na maioria dos casos níveis mais moderados de proteinúria e função renal estável.
[0004] É difícil ajustar uma terapia dependendo das necessidades individuais do paciente. Se um paciente pertence ao primeiro grupo (com remissão espontânea), qualquer medicação, em geral a administração de fármacos imunossupressores, vai encontrá-lo exposto a efeitos colaterais consideráveis do referido tratamento mesmo se o referido tratamento fosse necessário conforme poderia ser concluído posteriormente. Em contraste, um paciente que pertence ao grupo 3 pode se beneficiar da administração de fármacos imunossupressores fortes em um estágio inicial do tratamento.
[0005] Deste modo, sempre se aceitou como estratégia clínica simplesmente aguardar e observar como a atividade clínica da doença irá se desenvolver sob terapia de suporte e considerar, caso necessário, opções de terapia mais rigorosas durante o período de acompanhamento.
[0006] Em todo o caso, seria desejável reconhecer o quanto antes a doença em seus estágios precoces e como o curso da doença irá se desenvolver. Em particular, é importante distinguir tipos autoimunes de MN, especialmente relacionados a autoanticorpos que se ligam aos autoantígenos associados com podócitos, a partir de MN ligada a outras causas tais como malignidades, infecções e fármacos. Deste modo, o melhor tratamento possível pode ser selecionado. Por exemplo, pode ser possível submeter um paciente sem ou com sintomas leves ao tratamento com fármacos imunossupressores de baixa dose em um estágio precoce e observar se ele responde positivamente ao referido tratamento sem desenvolver atividade clínica da doença, assim potencialmente guardando o paciente da exposição ao tratamento imunos-supressor severo com efeitos colaterais graves.
[0007] A descoberta de autoanticorpos ao fosfolipase-A2-receptor (PLA2R) preparou o caminho para um diagnóstico da doença com base em sorologia (US2013/0280738; Beck, L, Bonegio, R. G., Lambe-au, G., Beck, D. M., Powell, D. W., Cummins, T. D., Klein J. B., Salant, D. J. (2009) N. Engl. J. Med. 361(1), 11-21). Esses autoanticorpos podem ser prontamente detectados no sangue de até 70% dos pacientes, significando que a cirurgia invasiva não é mais necessária para se obter uma amostra para o diagnóstico nesses casos.
[0008] No entanto, o ensaio baseado em PLA2R não pode ser usado para diagnosticar o restante dos 30% dos pacientes. Os pesquisadores identificaram autoantígenos e autoanticorpos para fechar essa lacuna diagnóstica. Foi reportado que os autoanticorpos ao THSD7A também podem ser detectados (US10107810; Tomas NM, Beck LH Jr, Meyer-Schwesinger C, Seitz-Polski B, Ma H, Zahner G, Dolla G, Hoxha E, Helmchen U, Dabert-Gay AS, Debayle D, Merchant M, Klein J, Salant DJ, Stahl RAK, Lambeau G. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. N Engl J Med. 2014 Dec 11 ;371(24):2277-2287), porém a prevalência é de apenas aproximadamente 5%.
[0009] Os autoantígenos adicionais identificados recentemente incluem NELL-1 (Sethi S, Debiec H, Madden B, Charlesworth MC, Maislle J, Gross L, Ravindran A, Buob D, Jadoul M, Fervenza FC, Ronco P. Neural epidermal growth factor-like 1 protein (NELL-1) associated membranous nephropathy. Kidney Int. 2020 Jan;97(1): 163-174) e Semaphorin 3B (Sethi S, Debiec H, Madden B, Vivarelli M, Charles-worth MC, Ravindran A, Gross L, Ulinski T, Buob D, Tran CL, Emma F, Diomedi-Camassei F, Fervenza FC, Ronco P. Semaphorin SB-associated membranous nephropathy is a distinct type of disease predominantly present in pediatric patients. Kidney Int. 2020 Jun 10:S0085-2538(20)30640-2).
[0010] Exostosina (EXT) (W020037135; Sethi S, Madden BJ, Debiec H, Charlesworth MC, Gross L, Ravindran A, Hummel AM, Specks U, Fervenza FC, Ronco P. Exostosin 1/Exostosin 2-Associated Mem-branous Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2019 Jun;30(6):1123-1136) é um outro autoantígeno. Exostosinas são glicosiltransferases que são responsáveis pela síntese da estrutura principal de heparan sulfato que adicionam resíduos de glicosaminoglicana à proteína alvo resultando na geração de polissacarídeos complexos. Existem cinco genes que codificam as proteínas EXT - EXT1, EXT2, EXTL1, EXTL2 e EXTL3. Os polipeptídeos de EXT1 e EXT2 mostram similaridades estruturais, e EXT1 e EXT2 podem existir como heterodímeros e agir como copolimerases no alongamento da cadeia do sulfato de hepari-na. O heterodímero de EXT1/EXT2 também aumentou a estabilidade e a atividade. Esta é a razão provável de que EXT1/EXT2 (na forma de heterodímero) são encontrados nos nossos estudos. As proteínas EXTL mostram a homologia da sequência de aminoácido com EXT1 e EXT2, e estão provavelmente envolvidas na síntese de heparan sulfato embora a sua função seja bem menos conhecida. As proteínas EXT são bem conservadas, especialmente nas suas regiões C-terminais. Exceto pela EXTL1, as proteínas EXT são ubiquamente expressadas em vários tecidos mamíferos. As proteínas EXT também são expressadas em podócitos, e um knockout homozigótico de EXT1 especificamente em podócitos não levou a defeitos significativos na filtração glomerular, embora mudanças na arquitetura dos podócitos e espessura focal de GBM fossem notados. As proteínas EXT são proteínas transmembrana no retículo endoplasmático, e se a EXT1 e EXT2 detectadas na MN associada a EXT1/EXT2 são proteínas de comprimento total ou representam proteínas parciais cortadas ou truncadas ou são proteínas com modificações pós-transcricionais necessitam ser mais bem estudadas. Por fim, as mutações em EXT1 e EXT2 estão associadas com um distúrbio dominante autossômico, múltiplas exostoses hereditárias, que são um dos mais comuns distúrbios esqueléticos herdados. Os distúrbios associados com o acúmulo de EXT1 e EXT2 diferente de MN são desconhecidos (BERTELLI et al. Molecular and Cellular Mechanisms for Proteinuria in Minimal Change Disease. Front. Med., 11 June 2018, Vol 5, Article 170, pp 1-13. Especially abstract, pg 2, col 2, para 2; US 2006/0040293 A1 (SALONEN et al.) 23 February 2006 (23.02.2006) abstract, [0021] ).
[0011] Enquanto autoanticorpos para cada urn desses autoantige-nos possam não estar presentes na maioria dos pacientes, eles raramente emergem juntos com os autoanticorpos ao PLA2R, significando que esses ensaios ajudam a concluir o diagnóstico nos pacientes PLA2R-negativos em particular e assim complementam o ensaio existente.
[0012] Sethi et al. tentou detectar autoanticorpos circulantes para EXT1/EXT2 no soro de pacientes com MN usando análise western e native blotting sob condições não redutoras, mas falhou para detectar um autoanticorpo circulante. Deve ser mencionado que o western blotting foi considerado um método particularmente sensível para detectar autoanticorpos para autoantígenos relevantes para MN. Isto sugere que os autoanticorpos circulantes para a Exostosina, que poderiam ser detectados em amostras de sangue, não existem.
[0013] O problema subjacente à presente invenção é prover um ensaio sorológico e reagentes relacionados que podem ser usados para diagnosticar MN em pacientes que não têm um autoanticorpo de-tectável para PLA2R ou um outro autoantígeno relacionado a MN tal como THSD7A ou para detectar um autoanticorpo tal como um anticorpo humano para a SEQ ID NO1.
[0014] Um outro problema subjacente à presente invenção é aumentar a sensibilidade de diagnóstico para o diagnóstico de MN, preferencialmente para distinguir tipos autoimunes de MN, especialmente relacionados a autoanticorpos que se ligam aos autoantígenos associados com podócitos, a partir de MN ligado a outras causas tais como doenças autoimunes, malignidades, infecções e fármacos.
[0015] Em um 1o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um veículo diagnosticamente útil revestido com um polipeptídeo recombinante compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, em que o veículo é selecionado a partir do grupo compreendendo uma esfera, preferencialmente uma esfera paramag-nética, uma tira de teste, uma placa de microtitulação, uma membrana, preferencialmente a partir do grupo compreendendo western blot, line blot e dot blot, um dispositivo de fluxo lateral, uma superfície de vidro, uma lâmina para microscópio, um microarranjo e um biochip e é preferencialmente uma lâmina para microscópio.
[0016] Em uma modalidade preferida, o veículo ainda compreende um ou mais polipeptídeos recombinantes preferencialmente todos os polipeptídeos a partir do grupo compreendendo um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO4, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO5 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO6 ou uma variante da mesma.
[0017] Em uma modalidade preferida, qualquer polipeptídeo imobilizado é expressado por uma célula imobilizada no veículo, preferencialmente uma célula fixada ou é um polipeptídeo recombinante ou isolado imobilizado no veículo.
[0018] Em uma modalidade preferida, qualquer polipeptídeo imobilizado é expressado por uma célula imobilizada no veículo e o veículo ainda compreende uma célula mock-transfectada.
[0019] Em uma modalidade preferida, um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 é ligado ao polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e opcionalmente um anticorpo secundário compreendendo um marcador.
[0020] Em um 2o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, preferencialmente a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, opcionalmente ligada ao veículo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5. O autoanticorpo pode ser seco ou liofilizado.
[0021] Em um 3o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um kit compreendendo o veículo de acordo com a presente invenção e um ou mais a partir do grupo compreendendo um meio para detectar um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, a qual é preferencialmente um anticorpo secundário, mais preferencialmente um anticorpo secundário que se liga especificamente a anticorpos da classe IgG, ou é um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1, em que o meio preferencialmente compreende um marcador, um meio para capturar um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, um tampão de lavagem, um meio de montagem, um tampão de diluição, um controle positivo, um controle negativo, um calibrador, preferencialmente um conjunto compreendendo três ou mais calibradores e um polipeptídeo recombinante compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma.
[0022] Em um 4o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um método para o diagnóstico de MN compreendendo a etapa de detecção da presença ou ausência de um autoan-ticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1, preferencialmente a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, em uma amostra líquida compreendendo anticorpos a partir de um indivíduo.
[0023] Em uma modalidade preferida, o autoanticorpo é um anticorpo de classe IgG.
[0024] Em uma modalidade preferida, a amostra é selecionada a partir do grupo compreendendo sangue total, soro e plasma. Preferencialmente, a amostra é de um mamífero, mais preferencialmente paciente humano.
[0025] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é detectado usando um método a partir do grupo compreendendo imunodifusão, imunoeletroforese, imunoensaios de varredura da luz, aglutinação, imunoensaios marcados tais como aqueles a partir do grupo compreendendo imunoensaios radiomarcados, imunoensaios enzimáticos tais como ensaios colorimétricos, imunoensaios de quimioluminescência e imunofluorescência, mais preferencialmente imunofluorescência.
[0026] Em uma modalidade preferida, o método ainda compreende detectar a presença ou ausência de um anticorpo a partir do grupo, preferencialmente todos os autoanticorpos a partir do grupo compreendendo um autoanticorpo que se liga especificamente ao complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2, um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO2, um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO3, um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO4, um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO5 e um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO6.
[0027] Em um 5° aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um uso de um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um po-lipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO2 ou o veículo de acordo coma presente invenção para o diagnóstico sorológico de MN.
[0028] Em um 6o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um de um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou de um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma e um anticorpo secundário para a fabricação de um kit diagnóstico.
[0029] Em um T aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um uso de um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou um anticorpo recombinante que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 como um controle positivo para a detecção de um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 em uma amostra, preferencialmente para o diagnóstico de MN.
[0030] Em um 8o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por uma solução aquosa compreendendo um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2. Em uma modalidade preferida, a solução aquosa compreende uma amostra a partir de um paciente humano tendo MN. Em uma outra modalidade preferida, a solução compreende um tampão não fisiológico ou um tampão fisiológico em concentrações acima dos níveis fisiológicos e mais preferencialmente tem um pH entre 5 e 9, preferencialmente 6 a 8.
[0031] Em um 9o aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um dispositivo para remover um autoanticorpo da SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e a SEQ ID NO2, a partir do sangue, preferencialmente soro de um paciente com MN, em que o dispositivo compreende um veículo revestido com a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma.
[0032] Em um 10° aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um método ex vivo para remover um anticorpo da SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e SEQ ID NO2, a partir do sangue, preferencialmente soro de um paciente com MN.
[0033] A presente invenção é baseada na verificação surpreendente dos inventores que os autoanticorpos a EXT2 e EXT1/2 são presentes e detectáveis em amostras de sangue a partir de pacientes com MN, mas não em amostras de pacientes saudáveis. Eles podem ser detectados usando imunoensaios e podem ser usados para configurar os imunoensaios sorológicos para o diagnóstico de MN. Um veículo compreendendo EXT2 ou EXT1/2 imobilizado pode ser usado para detectar os referidos anticorpos.
[0034] Além disso, a presente invenção é baseada na verificação surpreendente de que é possível distinguir entre MN autoimune e não autoimune usando um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma ou um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma.
[0035] De acordo com a presente invenção, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma é usada para detectar um autoanticorpo à SEQ ID NO1, por exemplo ao se revestir o veículo diagnosticamente útil por exemplo ao se revestir o veículo diagnosticamente útil de acordo com a presente invenção com um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma ou ao se usar um polipeptídeo solúvel compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma a qual pode ser detectada caso esteja ligada ao anticorpo. Opcionalmente, o veículo pode compreender um outro autoantígeno relacionado a MN, preferencialmente espacialmente separado a partir do polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1. Opcionalmente, o veículo pode compreender um controle indicando que foi colocado em contato com uma amostra de soro. Opcionalmente, o veículo pode compreender um controle indicando que foi colocado em contato com um anticorpo secundário, preferencialmente um anticorpo secundário que se liga a anticorpos humanos, mais preferencialmente a anticorpos de IgG humana. Opcionalmente, o veículo pode compreender pelo menos um calibrador, preferencialmente um conjunto compreendendo pelo menos três calibradores. Os calibradores são descritos na técnica, por exemplo, The Immunoassay Handbook, 3rd edition, edited by David Wild, Elsevier, 2005. Em uma modalidade preferida, deve-se compreender que qualquer sequência referida seja apresentada como parte de um polipeptídeo ou uma forma similar a partir da qual pode ser usada para detectar o autoanticorpo de interesse. Em particular, isto se aplica às sequências de outro autoantíge-no relacionado a MN. Em uma modalidade preferida, o termo “outro autoantígeno relacionado a MN”, conforme usado no presente documento, se refere a um ou mais, preferencialmente todos a partir do grupo compreendendo um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e SEQ ID NO2, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5 e SEQ ID NO6. Quaisquer sequências da base de dados uniprot referidas no presente documento se referem às sequências disponíveis em 20 de outubro de 2021.
[0036] Preferencialmente um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma é imobilizado em uma fase sólida do veículo. Ele pode ser diretamente imobilizado na fase sólida quando colocado em contato com a amostra, por um ensaio competitivo, um ensaio de ponte de captura, um ensaio imunométrico, um segundo anticorpo específico de classe na fase sólida, um ensaio de captura de classe, direto ou indireto também pode ser usado. O princípio de cada desses formatos é detalhado no The Immunoassay Handbook, 3rd edition, edited by David Wild, Elsevier, 2005. Mais preferencialmente, a fase sólida é uma tira de teste ou um poço de uma placa de microtitu-lação para ELISA, preferencialmente um poço de uma placa de micro-titulação para ELISA.
[0037] Em uma modalidade preferida, qualquer polipeptídeo imobilizado em uma fase sólida, preferencialmente de um veículo, pode ser configurado para imobilização na referida fase. Por exemplo, o polipeptídeo pode não ser realmente imobilizado, mas pode estar associado com um ligante que se liga ao parceiro de ligação associado com a fase sólida. O ligante pode ser biotina e o parceiro de ligação estrep-tavidina ou vice-versa. Mediante a mistura do polipeptídeo e da fase sólida em uma solução líquida, o polipeptídeo irá imediatamente se ligar à fase sólida. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser configurado para imobilização em um poço da placa de microtitulação.
[0038] Em uma modalidade preferida, um veículo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma pode ser usado para detectar um autoanticorpo para a SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e a SEQ ID NO2 em uma amostra líquida, preferencialmente amostra de sangue, mais preferencialmente amostra soro ou amostra de plasma.
[0039] Os ensinamentos da presente invenção podem não ser apenas realizados usando os polipeptídeos, em particular um polipeptídeo compreendendo a sequência nativa de um polipeptídeo referido tal como Exostosina 2 (SEQ ID NO1) ou ácidos nucleicos tendo as sequências exatas referidas neste pedido de forma explícita, por exemplo através da função, nome, sequência ou número de acesso, ou de forma implícita, mas também usando variantes dos referidos polipeptídeos ou ácidos nucleicos. As variantes exemplificadoras incluem SEQ ID NO9, SEQ ID NO10, bovinas (Uniprot O7783), chimpanzé (A0A6D2WAN1), cão (A0A6D2WAN1), cavalo (A0A5F5Q0R9), leão (A0A6P6IAG1), porco (A0A480SE83), peru (A0A7L0W6P6) e ovelha (A0A6P7EVF0) Exostosina 2.
[0040] Em uma modalidade preferida, o termo “variante”, conforme usado no presente documento, pode se referir a pelo menos um fragmento da sequência de comprimento total referida a, mais especificamente um ou mais sequências de aminoácido ou ácido nucleico a qual é, relativa à sequência de comprimento total, truncada em um ou ambos os terminais por um ou mais aminoácidos. Um referido fragmento compreende ou codifica um peptídeo tendo pelo menos 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 620, 640, 660, 680 ou 700 aminoácidos sucessivos da sequência original ou uma variante da mesma. O comprimento total da variante pode ser de pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 640, 660, 680, 700 ou 718 ou mais aminoáci-dos.
[0041] O termo "variante" refere-se não apenas a pelo menos um fragmento, mas também a um polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreendendo sequências de aminoácido que são pelo menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 ou 99,9, preferencialmente pelo menos 99,3 % idênticas à sequência de aminoácido de referência referida a ou o fragmento do mesmo, em que os aminoácidos diferentes daqueles essenciais para a atividade biológica, por exemplo a capacidade de um antígeno em se ligar a um (auto)anticorpo, ou a dobra ou estrutura do são deletadas ou substituídas e/ou um ou mais dos referidos aminoácidos essenciais são substituídos de uma forma conservadora e/ou aminoácidos são adicionados de forma que a atividade biológica do polipeptídeo seja preservada. O estado da técnica compreende vários métodos que podem ser usados para alinhar duas dadas sequências de ácido nucleico ou aminoácido e para calcular o grau de identidade, vide por exemplo Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3rd edition. Em uma modalidade preferida, o software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) é usado usando a configuração padrão. A literatura do estado da técnica será usada pelo versado na técnica para designar variantes, por exemplo Behnert, A., Fritzler, M. J., Teng, B., Zhang, M., Bol-lig, F., Haller, H., Skoberne, A., Mahler, M., and Schiffer, M. (2013) (PLOS, 8 (4) e61669), e os seus resultados, em particular os epítopos na tabela 1 e Fig. 2, podem ser usados para orientar o design de variantes. A orientação adicional pode ser encontrada em US2019183969 AA
[0042] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo e variantes dos mesmos podem, além disso, compreender modificações químicas, por exemplo, marcadores isotópicos ou modificações covalentes tais como glicosilação, fosforilação, acetilação, descarboxilação, citrulina-ção, metilação, hidroxilação e similares. O versado na técnica é familiar com métodos para modificar polipeptídeos. Qualquer modificação é designada de forma que ela não anule a atividade biológica da variante.
[0043] Além do mais, as variantes também podem ser geradas pela fusão de polipeptídeos N- ou/e C-terminais, fragmentos ou variantes dos mesmos com outros polipeptídeos conhecidos ou variantes dos mesmos, preferencialmente a partir do grupo compreendendo ligantes e marcadores de afinidade, opcionalmente com os sítios de clivagem da protease e compreendem porções ativas ou domínios, preferencialmente tendo uma identidade de sequência de pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % quando alinhadas com a porção ativa da sequência de referência, em que o termo "porção ativa", conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência de aminoácido, que é menor do que a sequência de aminoácido de comprimento total ou, no caso de uma sequência de ácido nucleico codifica menos do que a sequência de aminoácido de comprimento total, respectivamente, e/ou é uma variante da sequência natural, mas retém pelo menos alguma atividade biológica. Preferencialmente a porção ativa é uma porção ativa da SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma. Um ligante pode ser um filamento flexível de aminoácidos, por exemplo ricos em resíduos de glicina e serina, preferencialmente compreendendo 1 a 50, 3 a 30 ou 4 a 20 aminoácidos. Os exemplos dos sítios de clivagem da protease compreendem trombina e sítios de clivagem da protease Prescission.
[0044] A variante do polipeptídeo tem atividade biológica. Em uma modalidade preferida, a referida atividade biológica é a capacidade de se ligar especificamente a um autoanticorpo que se liga especificamente ao autoantígeno de interesse, preferencialmente a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5 e SEQ ID NO6, mais preferencialmente a SEQ ID NO1, conforme verificado em um paciente que sofre de uma doença autoimune associada com o referido autoanticorpo, preferencialmente MN. Por exemplo, se ou não uma variante do polipeptídeo tem tal atividade biológica pode ser verificada determinando se ela se liga especificamente a um autoanticorpo a partir de uma amostra de um paciente com MN compreendendo um autoanticorpo que se liga especificamente ao autoantígeno do tipo selvagem, preferencialmente conforme determinado pela imunofluorescência indireta conforme descrito na seção experimental deste pedido.
[0045] De acordo com a presente invenção, um polipeptídeo, preferencialmente o polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, pode ser uma proteína recombinante. Em uma modalidade preferida, o termo “recombinante”, conforme usado no presente documento, se refere a um polipeptídeo produzido usando abordagens de engenharia genética em qualquer estágio do processo de produção, por exemplo ao fundir um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo a um promotor forte para superexpressão em células ou tecidos ou através da engenharia da sequência do próprio polipeptídeo. O versado na técnica é familiar com os métodos para a engenharia de ácidos nucleicos e polipeptídeos codificados (por exemplo, descritos em Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) e para produzir e purificar polipeptídeos nativos ou recombinantes (por exemplo Handbooks ..Strategies for Protein Purification", ..Antibody Purification", published by GE Healthcare Life Sciences, e em Burgess, R. R., Deutscher, Μ. P. (2009): Guide to Protein Purification). Em uma outra modalidade preferida, um polipeptídeo provido ou usado de acordo com a presente invenção tal como um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um complexo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma ou um anticorpo é um polipeptídeo isolado, em que o termo “isolado” significa que o polipeptídeo foi enriquecido comparado a seu estado mediante a produção usando uma abordagem biotecnológica ou sintética e é preferencialmente puro, isto é, pelo menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 porcento do polipeptídeo no respectivo líquido consiste do referido polipeptídeo conforme julgado pela eletroforese em gel SDS poliacrilamida seguido por marcação com azul de Coomassie e inspeção visual. Preferencialmente qualquer polipeptídeo em um veículo usado como um meio para capturar um anticorpo é puro.
[0046] De acordo com a presente invenção, um dispositivo médico ou diagnóstico tal como o veículo diagnosticamente útil pode ser preparado através da expressão de uma variante recombinante da SEQ ID NO1 compreendendo um marcador de afinidade, opcionalmente com um ligante artificial que pode incluir um sítio de divagem da protease, em uma célula tal como uma célula eucariótica ou procariótica, colocando a variante expressada em contato com um ligante que se liga especificamente ao marcador de afinidade, cujo ligante é imobilizado em uma fase sólida, lavando a fase sólida de forma que o material não especificamente ligado a partir da célula seja removido e se elua a variante expressada a partir da fase sólida, preferencialmente através da adição de um excesso de ligante não imobilizado. A variante pode ser então imobilizada no dispositivo. Opcionalmente, o marcador de afinidade pode ser removido ao se colocar a variante em contato com uma protease, preferencialmente uma protease reconhecendo o sítio de divagem da protease, antes da imobilização. O marcador de afinidade pode ser selecionado a partir do grupo de marcadores compreendendo His, 18A, ACP, Aldehyd, Avi, BCCP, Calmodulina, proteína de ligação quitina, E-Tag, ELK16, FLAG, flash, poliglutamato, poli-aspartato, GST, GFP, HA, Isope, proteína de ligação à maltose, myc, nus, NE, ProtA, ProtC, Tho1d4, S-Tag, SnoopTag, SpyTag, SofTag, estreptavidina, Strep-tag II, marcador de epítopo T7, TAP, TC, Tiore-doxina, Ty, V5, VSV e marcador Xpress. As proteases úteis incluem, porém não se limitam a TEV, trombina, fator Xa ou enteropeptidase. Os ligantes adequados fazem parte de vetores, por exemplo, série de vetor pET (Novagen).
[0047] De acordo com a presente invenção, uma célula é provida a qual superexpressa um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, preferencialmente em combinação com uma outra célula que superexpressa a sequência de um outro autoan-tígeno relacionado a MN além de, ou uma variante da mesma, preferencialmente a SEQ ID NO2, ou uma variante da mesma. Em uma modalidade preferida, o termo “que superexpressa”, conforme usado no presente documento, significa que a célula foi transfectada com um ácido nucleico, seja transitoriamente ou estavelmente no sentido de que o ácido nucleico foi incorporado no genoma da célula, a qual compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou um outro autoantígeno relacionado a MN ou uma variante da mesma sob o controle de um promotor. A célula que superexpressa um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma pode adicionalmente superexpressar um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma de forma que um complexo compreendendo ambos os poli-peptídeos seja formado. Consequentemente, a célula transfectada expressa mais polipeptídeo reconhecido pelo autoanticorpo a ser detectada do que o mesmo tipo de célula normalmente teria, provavelmente pelo menos 10, 20, 30, 50, 100, 200 ou 500 % mais conforme julgado por Western Blot quantitativo. O promotor pode ser um promotor indu-zível, que permite a indução da expressão através da adição de um indutor. O versado na técnica é familiar com protocolos e vetores para transitoriamente superexpressar um polipeptídeo em uma célula euca-riótica, por exemplo o sistema pTriEx da Novagen e com protocolos e vetores para transfectar de forma estável uma célula eucariótica, por exemplo o sistema do vetor pcDNA™4/TO da Invitrogen.
[0048] Em uma modalidade preferida, uma célula de mamífero fixada pode ser usada. Em uma modalidade preferida, o termo célula “fixada”, conforme usado no presente documento, se refere a uma célula que foi tratada com um composto químico reativo até o efeito em que a célula não seja mais metabolicamente ativa, mas ainda apresente os seus epítopos para imunomarcação com anticorpos e sua detecção subsequente, por exemplo, através da fluorescência. Mais preferencialmente, o composto reativo químico é selecionado a partir do grupo compreendendo acetona, formalina, metanol e etanol ou misturas dos mesmos, preferencialmente todos eles. O versado na técnica é familiar com protocolos que podem ser usados para preparar células fixadas. Essencialmente, a célula a qual é ligada a um suporte sólido é lavada ao se usar tampão de lavagem, seguido pelo contato com o composto reativo, por exemplo imersão. A acetona pura ou formalina ou diluições aquosas do composto químico reativo podem ser usadas.
[0049] De acordo com a presente invenção, a célula está em um veículo para análise de imunofluorescência microscópica. Um referido veículo pode ser uma lâmina de vidro. A célula na lâmina de vidro pode ser coberta com um tampão de montagem. Um meio de montagem é um líquido que ajuda a manter um pH quase fisiológico para manter a estrutura molecular de qualquer estrutura molecular diagnosticamente relevante e seus epítopos, é compatível com a emissão de um sinal de fluorescência e impede uma perda prematura de fluorescência devido ao branqueamento do fluoróforo. Ao mesmo tempo as suas propriedades óticas são combinadas com outros tampões usados, em particular o seu índice refrativo que permite uma análise de fluorescência microscópica eficiente. O meio de montagem compreende um componente de base, preferencialmente selecionado a partir do grupo compreendendo água, glicerol, óleo natural ou plástico ou uma mistura dos mesmos, preferencialmente água e glicerol. Ele pode ainda compreender um constituinte antidesbotamento que pode reduzir o branqueamento, preferencialmente selecionado a partir do grupo compreendendo NPG (N-propil gaiato), DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2] octa-no), 4POBN ((4-Piridil-1-óxido)-N-terc-butil nitrona) e PPD (P-fenila-nediamina). Várias composições e métodos são descritos no estado da técnica, por exemplo em “Mountants and Antifades”, publicado por Wright Cell Imaging Facility, Toronto Western Research Institute University Health Network, (https://de.scribd.com/document/ 47879592/ Mountants-Antifades), Krenek et al. (1989) Comparison of antifading agents used in immunofluorescence, J. Immunol. Meth 117, 91-97 and Nairn et al. (1969) Microphotometry in Immunofluorescence, Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705.
[0050] Uma tampa de vidro pode ser colocada na parte superior da composição compreendendo a amostra e o meio de montagem. As lâminas com tampas de vidro (FB 112d-1005-1 ou ZZ 3000-0112) estão disponíveis a partir de EUROIMMUN Medizinische Labordiagnosti- ka, AG. No entanto, qualquer veículo compatível com análise microscópica do padrão de fluorescência pode ser usado. O veículo pode compreender uma célula mock-transfectada, a qual foi transfectada com o mesmo vetor que a célula que superexpressa um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1, mas sem o ácido nucleico que codifica a última. A referida célula mock-transfectada pode servir como um controle negativo. O veículo é configurado para análise usando um microscópio de imunofluorescência.
[0051] Em uma modalidade preferida, o veículo pode compreender um campo compreendendo a célula de acordo com a invenção. Além disso, o veículo pode compreender campos adicionais. Os campos são preferencialmente circundados por uma superfície hidrofóbica e preferencialmente espacialmente separada uma da outra. Cada um desses campos pode compreender uma célula que superexpressa um outro autoantígeno relacionado a MN ou uma variante da mesma. Um campo pode compreender uma seção de tecido renal de mamífero, preferencialmente primata.
[0052] Preferencialmente um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1, preferencialmente em complexo com um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma é imobilizado em uma fase sólida do veículo. Ele pode ser diretamente imobilizado na fase sólida quando colocada em contato com a amostra, porém um ensaio competitivo, um ensaio da ponte de captura, um ensaio imu-nométrico, um segundo anticorpo específico de classe na fase sólida, um ensaio de captura de classe, direto ou indireto também pode ser usado. O princípio de cada desses formatos está detalhado no Immunoassay Handbook, 3rd edition, edited by David Wild, Elsevier, 2005. Mais preferencialmente, a fase sólida é uma tira de teste ou um poço de uma placa de microtitulação para ELISA, preferencialmente um poço de uma placa de microtitulação para ELISA.
[0053] Em uma modalidade preferida, um anticorpo secundário é um anticorpo que se liga especificamente a todos os anticorpos a partir de uma classe de anticorpos, preferencialmente uma classe de anticorpos de mamífero, mais preferencialmente classe de anticorpo humano tal como IgG. Os anticorpos secundários tipicamente reconhecem o domínio constante da referida classe, mas também podem reconhecer outros epítopos compartilhados por anticorpos da classe de interesse, por exemplo um epítopo conformacional através da estrutura 3D. uma ampla faixa deles está comercialmente disponível, por exemplo a partir da Thermo Fisher. Ele pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. Em uma modalidade preferida, o termo “reconhecido”, conforme usado no presente documento, significa que o anticorpo secundário se liga especificamente ao anticorpo ou anticorpos a serem detectados. Um anticorpo secundário pode se ligar especificamente a todos os isotipos a partir da classe de anticorpos. Por exemplo, um anticorpo secundário aos anticorpos da classe IgG pode ser ligar aos isotipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Isto pode ser alcançado ao se usar como um anticorpo secundário para a classe, preferencialmente para anticorpos da classe IgG, uma mistura compreendendo um anticorpo que se liga especificamente a cada isotipo IgG ou a um único anticorpo que reage com todos os isotipos de interesse. O uso de anticorpos secundários é explicado em Kruger, N. J., Detection of Polypeptides on Blots Using Secondary Antibodies, in The Protein Protocols Handbook (ed. J. M. Walker), page 967, volume 1996, Springer. Em suma, os referidos anticorpos secundários podem ser gerados ao se imunizar um animal de laboratório com o anticorpo a ser reconhecido ou uma mistura dos anticorpos a serem reconhecidos.
[0054] O autoanticorpo a ser detectado ou um anticorpo secundário usado se liga preferencialmente especificamente ao autoantígeno ou anticorpo a ser detectado, respectivamente. Em uma modalidade preferida, o termo “que se liga especificamente”, conforme usado no presente documento, preferencialmente significa que a reação de ligação é mais forte do que uma reação de ligação caracterizada por uma constante de dissociação de 1 x 10'5 M, mais preferencialmente 1x10' 7 M, mais preferencialmente 1 x 10'8 M, mais preferencialmente 1x10' 9 M, mais preferencialmente 1 x 10'10 M, mais preferencialmente 1 x 10'11 M, mais preferencialmente 1 x 10'12 M, conforme determinado pela ressonância plasmônica de superfície usando equipamento Bia-core a 25°C em tampão PBS a pH 7.
[0055] Em uma modalidade preferida, a célula é ligada a um auto-anticorpo à SEQ ID NO1, preferencialmente a um complexo compreendendo a SEQ ID NO1 e SEQ ID NO2, e um anticorpo secundário é ligado ao anticorpo. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo secundário reconhece anticorpos da classe IgG. Para análise de imu-nofluorescência, o anticorpo secundário pode compreender um marcador fluorescente detectável, mais preferencialmente FITC (isotiocia-nato de fluoresceína).
[0056] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a presente invenção compreende a etapa provendo o veículo de acordo coma presente invenção. O veículo pode ser então colocado em contato com a amostra suposta de compreender o autoanticorpo sob condições que permitem a ligação de qualquer autoanticorpo à célula e SEQ ID NO1 ou variante da mesma expressada pela célula. A amostra pode ser então removida e o veículo com a célula podem ser lavados para remover qualquer amostra restante. Um autoanticorpo secundário ou reagente similar ou meios que se ligam ao autoanticorpo e carregam marcador detectável tal como um corante fluorescente podem ser então colocados em contato com o veículo sob condições que permitem a formação de um complexo entre qualquer autoanticorpo ligado e o anticorpo secundário. O veículo pode ser lavado então para remover anticorpo secundário não ligado. Por fim, a presença do autoanticorpo é detectada ao se checar se o anticorpo secundário pode ser detectado, preferencialmente através de imunofluorescência, mais preferencialmente emitida por fluoresceína ou um derivado da mesma, ainda mais preferencialmente FITC.
[0057] Em uma modalidade preferida, o termo “diagnóstico”, conforme usado no presente documento, deve ser usado em seu sentido mais amplo possível e pode ser qualquer tipo de procedimento que deseja obter informação instrumental na avaliação se um paciente, conhecido ou um indivíduo anônimo a partir de um coorte, sofre ou provavelmente ou mais do que provavelmente do que a média ou um indivíduo comparativo, o último preferencialmente tendo sintomas similares, para sofrer de uma certa doença ou distúrbio no passado, no momento do diagnóstico ou no futuro, para verificar como a doença está progredindo ou é provável de progredir no futuro ou para avaliar a res-ponsividade de um paciente ou pacientes em geral com relação a um certo tratamento, por exemplo a administração de fármacos imunossu-pressores, ou para descobrir se uma amostra é de um referido paciente. A referida informação pode ser usada para um diagnóstico clínico, mas também pode ser obtida por um laboratório experimental e/ou laboratório de pesquisa para a finalidade de pesquisa geral, por exemplo para determinar a proporção de indivíduos que sofrem da doença em um coorte de pacientes ou em uma população. Em outras palavras, o termo “diagnóstico” compreende não apenas diagnosticar, mas também prognosticar e/ou monitorar o curso de uma doença ou distúrbio, incluindo monitorar a resposta de um ou mais pacientes à administração de um fármaco ou fármaco candidato, por exemplo para determinar a sua eficácia. O uso de um autoanticorpo relacionado a MN para ensaio para as referidas finalidades foi descrito na técnica, por exemplo em Fervenza FC et al. Rituximab or Cyclosporine in the Treatment of Membranous Nephropathy. N Engl J Med. 2019 Jul 4;381(1):36-46. Enquanto o resultado possa ser atribuído a um específico paciente para aplicações de diagnóstico clínico e possa ser comunicado a um médico ou instituição que trata o referido paciente, isto não é necessariamente o caso para outras aplicações, por exemplo no diagnóstico para finalidades de pesquisa, onde ele pode ser suficiente para atribuir os resultados a uma amostra a partir de um paciente anônimo. Em uma outra modalidade preferida, a detecção de um autoanticorpo na SEQ ID NO1, opcionalmente coexpressada ou em complexo com a SEQ ID NO2, considera implicar um diagnóstico definitivo de MN devido à presença do autoanticorpo. Em uma modalidade preferida, o método pode auxiliar no diagnóstico de MN ou servir para identificar um indivíduo tendo um risco aumentado, comparado com um indivíduo médio, de sofrer de MN no presente ou futuro. Em uma modalidade preferida, o método e reagentes de acordo com a presente invenção são usados para determinar se é provável que um transplante de rim seja bem-sucedido. Em uma outra modalidade preferida, o método e reagentes de acordo com a presente invenção são usados para determinar se um rim de um indivíduo pode ser transplantado de forma bem-sucedida a um receptor que necessita de um referido transplante. Ambos o doador e o receptor podem ser testados.
[0058] Em uma modalidade preferida, os métodos e produtos de acordo com a presente invenção podem ser usados para estudos de interação, incluindo determinar se um candidato a fármaco ou outro composto pode interferir com a ligação de um autoanticorpo à SEQ ID NO1 ou pode afetar qualquer processo a jusante ou a força de sua ligação ao seu alvo. Em uma modalidade preferida, eles podem ser usados para monitorar a resposta imune, mais preferencialmente a emergência e/ou título de anticorpos para SEQ ID NO1, seguindo a administração de uma composição imunogênica compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante imunogênica da mesma, por exemplo a um mamífero, o qual pode ser um mamífero diferente de um humano tal como um animal de laboratório.
[0059] Em uma outra modalidade preferida, os métodos e produtos de acordo com a presente invenção podem ser usados para determinar a concentração de um anticorpo a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente em complexo com um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2. Em uma modalidade mais preferida, o referido anticorpo é um autoanticorpo a partir de um paciente com MN. Em uma outra modalidade preferida, o referido anticorpo é um anticorpo recombinante que se liga a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, opcionalmente a um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO2, porém é reconhecido por um anticorpo secundário que se liga especificamente a anticorpos de classe IgG humana, preferencialmente isotipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. Em uma modalidade mais preferida, uma referida concentração precisa ser determinada para as finalidades de pesquisa, para a preparação ou para a monitoração dos reagentes, modelos animais ou dispositivos que podem ou não ser usados para o diagnóstico de MN.
[0060] Em muitos casos a mera detecção do autoanticorpo, em outras palavras a determinação se os níveis detectáveis do anticorpo estão presentes ou não na amostra, é suficiente para o diagnóstico. Se o autoanticorpo pode ser detectado, essa será a informação instrumental para o diagnóstico clínico e indica uma probabilidade aumentada de que o paciente sofra de uma doença.
[0061] O versado na técnica apreciará que um clínico não conclui geralmente se o paciente sofre ou não ou tem a probabilidade de sofrer de uma doença, condição ou distúrbios somente com base em um único parâmetro diagnóstico, mas precisa levar em conta outros aspectos, por exemplo a presença de outros autoanticorpos, marcadores, parâmetros de sangue, avaliação clínica dos sintomas do paciente ou dos resultados de imagens médicas ou outros métodos não invasi-vos tais como polissonografia para chegar a um diagnóstico conclusivo. Vide Baenkler H. W. (2012), General aspects of autoimmune diagnostics, in Renz, H., Autoimmune diagnostics, 2012, de Gruyter, page 3. O valor de um agente ou método diagnóstico também pode residir na possibilidade de excluir uma doença, permitindo assim o diagnóstico indireto de uma outra. Em uma modalidade preferida, o significado de quaisquer sintomas ou doenças referidos ao longo deste pedido está de acordo com o entendimento do versado na técnica como a data de depósito ou, preferencialmente, a data de prioridade inicial deste pedido conforme evidenciado pelos livros e publicações científicas. Deve ser mencionado que os métodos inventivos ou usos ou produtos, sozinhos, não podem ser usados para chegar a um diagnóstico definitivo, final.
[0062] Em uma modalidade preferida, o termo “diagnóstico” também pode se referir a um método ou agente usado para escolher o regime de tratamento mais promissor para um paciente. Em outras palavras, o método ou agente pode se referir à seleção de um regime de tratamento para um indivíduo. Por exemplo, a detecção de autoanticorpos pode indicar que uma terapia imunossupressora deve ser selecionada, a qual pode incluir administrar ao paciente um ou mais fár-macos imunossupressores. Os fármacos imunossupressores adequados estão divulgados em US10107810 BB, parágrafo [0091] ,
[0063] Em uma modalidade preferida, qualquer informação ou dados que demonstram a presença da ausência do autoanticorpo pode ser comunicada ao paciente ou a um médico tratando o paciente, preferencialmente por telefone, por fax, em uma forma escrita ou através da internet, por exemplo como um e-mail ou mensagem de texto.
[0064] Em uma modalidade preferida, o autoanticorpo é considerado como presente em uma amostra se um ensaio baseado em pelo menos método rende um resultado positivo, cujo método renderia normalmente um resultado negativo se uma amostra a partir de uma pessoa média saudável tal como doador de sangue fosse examinada. O versado na técnica está ciente de que diferentes métodos ocasionalmente rendem resultados diferentes. Mais preferencialmente, no referido caso o autoanticorpo é considerado presente se pelo menos um método render um resultado positivo, mesmo se pelo menos um outro método puder dar um resultado negativo. Em uma modalidade mais preferida, a imunofluorescência, preferencialmente realizada conforme descrito nos exemplos, é considerada o método mais confiável e é usado no caso de alguns outros resultados inconclusivos para determinar se o autoanticorpo está presente.
[0065] Em uma modalidade preferida, o termo “autoanticorpo”, conforme usado no presente documento, se refere a um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula endógena do animal, preferencialmente mamífero, mais preferencialmente humano, o qual produz o referido autoanticorpo, em que o nível do referido anticorpo é mais preferencialmente elevado comparado com o indivíduo médio saudável. O autoanticorpo pode ter a sequência de regiões constantes de um anticorpo a partir do animal, preferencialmente humano, tornando a mesma, porém a região variável é capaz de se ligar especificamente à molécula endógena do animal, mais especificamente a SEQ ID NO1 ou um autoantígeno relacionado a MN. Em uma modalidade preferida, o autoanticorpo é isolado e/ou purificado a partir de uma amostra, preferencialmente tecido, soro, plasma, sangue ou CSF a partir do animal, preferencialmente humano. O autoanticorpo é um anticorpo nativo, policlonal a partir do animal em vez de um anticorpo sintético ou recombinante. O autoanticorpo pode fazer parte de uma composição que compreende um conservante tal como azida ou um inibidor de protease. O autoanticorpo pode estar em uma amostra de sangue diluída, preferencialmente diluída usando um tampão aquoso. O autoanticorpo pode servir como um controle positive para desenvolver um kit ou reagente diagnóstico ou confirmar a qualidade ou kit diagnóstico ou pode ser incluído no kit como um controle positivo ou como um reagente, por exemplo como um ligante competindo com um autoanticorpo a ser detectado. Ele pode ser marcado com um marcador detectável.
[0066] O método de acordo com a presente invenção é preferencialmente um método in vitro.
[0067] Em uma modalidade preferida, um marcador detectável pode ser selecionado a partir do grupo compreendendo um marcador en-zimaticamente ativo, quimioluminescente, fluorescente e radioativo. Uma variedade de marcadores está comercialmente disponível e conhecida na técnica, por exemplo no Immunoassay Handbook, 3rd edition, edited by David Wild, Elsevier, 2005.
[0068] De acordo com a presente invenção, um kit é provido, compreendendo a célula ou o veículo e adicionalmente compreendendo um ou mais, preferencialmente todos os reagentes a partir do grupo compreendendo um anticorpo secundário, preferencialmente marcador com um marcador detectável, uma solução de lavagem, um controle positivo, um controle negativo, um detergente, uma tampa de vidro, um meio de montagem e uma solução de sal fisiológico, preferencialmente PBS, ou sal necessário para prepará-lo. Em uma modalidade preferida, o controle positivo é uma amostra diluída, preferencialmente soro ou CSF, a partir de um paciente que sofre de MN ou um anticorpo monoclonal a um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e/ou um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2. O controle negativo pode ser uma amostra diluída de um indivíduo saudável, por exemplo um doador de sangue, preferencialmente um doador de sangue tal como uma amostra de soro ou plasma. O kit pode compreender instruções de como realizar o ensaio e como diagnosticar MN usando os ensinamentos da invenção. Preferencialmente, o anticorpo secundário é um anticorpo secundário para os anticorpos de classe IgG, preferencialmente anticorpos da classe IgG humana. De acordo com a invenção, o kit pode ser usado para detectar a presença ou ausência de um anticorpo para a SEQ ID NO1 em uma amostra de sangue, preferencialmente mamífero, mais preferencialmente amostra de sangue humano. A amostra de sangue pode compreender um conjunto representativo de anticorpos. A amostra de sangue pode ser selecionada a partir do grupo compreendendo sangue total, soro, plasma e sangue capilar. O kit pode compreender um anticorpo secundário reconhecendo anticorpos de classe IgG humana e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, em que o polipeptídeo é preferencialmente marcado. O kit pode compreender o veículo de acordo com a presente invenção e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, em que o polipeptídeo é preferencialmente marcado.
[0069] Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um uso da célula, do polipeptídeo, do veículo para a fabricação de kit de uma composição para o diagnóstico de uma doença.
[0070] Em uma modalidade preferida, qualquer método ou uso de acordo com a presente invenção pode ser pretendido para um uso não diagnóstico, isto é, determinar a presença de um autoanticorpo para se ligar a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, para um uso diferente do diagnóstico de um paciente. Por exemplo, o método ou uso pode ser para testagem in vitro da eficiência de um dispositivo médico para remover urn autoanticorpo a partir de um sangue de um paciente, em que a testa-gem é realizada em um líquido diferente do sangue do paciente. Depois do uso do dispositivo médico com um paciente, a sua capacidade para remover autoanticorpo pode ser checada ao se mover uma solução compreendendo anticorpo a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ao longo do dispositivo, seguido pelo uso do método de acordo com a presente invenção para confirmar que menos ou nenhum anticorpo está na solução que foi passada através do dispositivo, isto é, mostrando que o dispositivo ainda tem a capacidade de remover anticorpo da solução.
[0071] Em uma outra modalidade preferida, o método pode ser para confirmar a confiabilidade de um ensaio diagnóstico e pode envolver detectar um anticorpo para um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 em uma solução, a qual não é uma amostra a partir de um paciente que necessite de um diagnóstico, porém é conhecido por compreender um anticorpo para um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente em uma concentração conhecida. Por exemplo, ele pode ser um anticorpo recombinante ou uma amostra diluída em um tampão de diluição tal como PBS a partir de um paciente anônimo cuja identidade não pode ser encontrada. De forma alternativa, a solução pode ser um controle negativo não compreendendo o anticorpo para checar o histórico. O referido método pode acontecer em paralelo com, depois ou antes de um método diagnóstico. Em uma modalidade preferida, qualquer método ou uso de acordo com a presente invenção pode ser pretendido para gerar um perfil de autoanticorpo, preferencialmente para detectar uma doença em um mamífero, preferencialmente um humano.
[0072] Em uma modalidade preferida, qualquer método ou uso de acordo com a presente invenção pode ser para identificar um indivíduo em risco de sofrer ou desenvolver uma doença e/ou um tumor.
[0073] Em uma modalidade preferida, o método pode ser para detector um anticorpo, preferencialmente autoanticorpo em uma solução que não é uma amostra a partir de um mamífero a ser diagnosticado ou para a finalidade de prover um diagnóstico, em particular não um diagnóstico de MN.
[0074] Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um aparelho para analisar uma amostra a partir de um paciente para detectar um autoanticorpo contra um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, indicando uma probabilidade aumentada de uma doença ou de desenvolver uma doença, compreendendo:
- a. um veículo, o qual contém um meio para capturar o autoanticorpo a partir da amostra quando a amostra é colocada em contato com o veículo, em que o meio é a célula e o veículo é o veículo de acordo com a presente invenção,
- b. um meio detectável capaz de se ligar ao anticorpo capturado pelo veículo quando o meio detectável é colocado em contato com o veículo, em que o meio detectável é preferencialmente um anticorpo secundário marcado capaz de se ligar ao autoanticorpo capturado no veículo,
- c. opcionalmente um meio para remover qualquer amostra do veículo e meio detectável, preferencialmente através de lavagem;
- d. um dispositivo de detecção para detector a presença do meio detectável e converter os resultados em um sinal elétrico, por exemplo um leitor de fluorescência ou um microscópio de fluorescência conectado com um software capaz de reconhecer um padrão característico de uma célula marcada que superexpressa um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma em uma imagem da célula tomada pelo leitor de fluorescência ou câmera, e
[0075] De acordo com a presente invenção, um dispositivo para remover um autoanticorpo a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, a partir de sangue, preferencialmente soro de um paciente com MN, em que o dispositivo compreende um veículo revestido com um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma é provida como um método ex vivo para remover um autoanticorpo para um polipeptídeo tendo SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo SEQ ID NO2, a partir de sangue, preferencialmente soro de um paciente com MN. Um dispositivo revestido com um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma pode ser usado ou um dispositivo revestido com um anticorpo secundário ou proteína capturando todos os anticorpos de classe IgG, dentre eles os autoanticorpos de classe IgG para um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1. Os métodos adequados estão descritos em Eisei Noiri and Noria Hanafusa, The Concise Manual of Apharesis Therapy, Springer Tokyo, 2014. Hamilton, P., Kani-gicherla, D., Hanumapura, P., Walz, L, Kramer, D., Fischer, M., Brenchley, P., and Mitra, S. (2018) J. Clin. Aph. 33(3), 283-290. Um outro método está divulgado em EP3477300.
[0076] Sequências:
[0077] A presente invenção compreende uma gama de novos poli-peptídeos, mais especificamente
[0078] SEQ ID NO1 [Exostosina 2] MCASVKYNIRGPALIPRMKTKHRIYYITLFSIVLLGLIATGMFQFWPHSI ESSNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCFDVYRC GFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISDSDYYTD DINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNHLLFNMLP GGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPVYSPLSAE VDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGESVLVLDK CTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGARLGQAVL SDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMSDVYSILQS IPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPYAAISYEE WNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESLFRVITEV SKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAENKLSNRF FPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVGYPGRLHL WDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTYKMPGDIK NWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPECTAIDGLS LDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDDFPEKLKS FPNIGSL
[0079] SEQ ID NO2 [Exostosina 1]
[0080] MQAKKRYFILLSAGSCLALLFYFGGLQFRASRSHSRREEH SGRNGLHHPSPDHFWPRFPDALRPFVPWDQLENEDSSVHISPRQKR DANSSIYKGKKCRMESCFDFTLCKKNGFKVYVYPQQKGEKIAESYQN ILAAIEGSRFYTSDPSQACLFVLSLDTLDRDQLSPQYVHNLRSKVQSL HLWNNGRNHLIFNLYSGTWPDYTEDVGFDIGQAMLAKASISTENFRP NFDVSIPLFSKDHPRTGGERGFLKFNTIPPLRKYMLVFKGKRYLTGIG SDTRNALYHVHNGEDVVLLTTCKHGKDWQKHKDSRCDRDNTEYEK YDYREMLHNATFCLVPRGRRLGSFRFLEALQAACVPVMLSNGWELP FSEVINWNQAAVIGDERLLLQIPSTIRSIHQDKILALRQQTQFLWEAYF SSVEKIVLTTLEIIQDRIFKHISRNSLIWNKHPGGLFVLPQYSSYLGDFP YYYANLGLKPPSKFTAVIHAVTPLVSQSQPVLKLLVAAAKSQYCAQIIV LWNCDKPLPAKHRWPATAVPVVVIEGESKVMSSRFLPYDNIITDAVLS LDEDTVLSTTEVDFAFTVWQSFPERIVGYPARSHFWDNSKERWGYT SKWTNDYSMVLTGAAIYHKYYHYLYSHYLPASLKNMVDQLANCEDIL MNFLVSAVTKLPPIKVTQKKQYKETMMGQTSRASRWADPDHFAQRQ SCMNTFASWFGYMPLIHSQMRLDPVLFKDQVSILRKKYRDIERL
[0081] SEQ ID NO3 [Autoantígeno PLA2R relacionado a MN]
[0082] MLLSPSLLLLLLLGAPRGCAEGVAAALTPERLLEWQDKGI FVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGS GCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVA HDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMF PFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSA EVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITD ETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWS PEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEI VEKDAWKYYATHCEPGWNPYNRNCYKLQKEEKTWHEALRSCQADN SALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSNDSSVIF TNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGH VLSDAESGCQEGWERHGGFCYKIDTVLRSFDQASSGYYCPPALVTIT NRFEQAFITSLISSVVKMKDSYFWIALQDQNDTGEYTWKPVGQKPEP VQYTHWNTHQPRYSGGCVAMRGRHPLGRWEVKHCRHFKAMSLCK QPVENQEKAEYEERWPFHPCYLDWESEPGLASCFKVFHSEKVLMK RTWREAEAFCEEFGAHLASFAHIEEENFVNELLHSKFNWTEERQFWI GFNKRNPLNAGSWEWSDRTPVVSSFLDNTYFGEDARNCAVYKANK TLLPLHCGSKREWICKIPRDVKPKIPFWYQYDVPWLFYQDAEYLFHTF ASEWLNFEFVCSWLHSDLLTIHSAHEQEFIHSKIKALSKYGASWWIGL QEERANDEFRWRDGTPVIYQNWDTGRERTVNNQSQRCGFISSITGL WGSEECSVSMPSICKRKKVWLIEKKKDTPKQHGTCPKGWLYFNYKC LLLNIPKDPSSWKNWTHAQHFCAEEGGTLVAIESEVEQAFITMNLFG QTTSVWIGLQNDDYETWLNGKPVVYSNWSPFDIINIPSHNTTEVQKHI PLCALLSSNPNFHFTGKWYFEDCGKEGYGFVCEKMQDTSGHGVNT SDMYPMPNTLEYGNRTYKIINANMTWYAAIKTCLMHKAQLVSITDQY HQSFLTVVLNRLGYAHWIGLFTTDNGLNFDWSDGTKSSFTFWKDEE SSLLGDCVFADSNGRWHSTACESFLQGAICHVPPETRQSEHPELCS ETSIPWIKFKSNCYSFSTVLDSMSFEAAHEFCKKEGSNLLTIKDEAEN AFLLEELFAFGSSVQMVWLNAQFDGNNETIKWFDGTPTDQSNWGIR KPDTDYFKPHHCVALRIPEGLWQLSPCQEKKGFICKMEADIHTAEALP EKGPSHSIIPLAVVLTLIVIVAICTLSFCIYKHNGGFFRRLAGFRNPYYP ATNFSTVYLEENILISDLEKSDQ
[0083] SEQ ID NO4 [Autoantígeno THSD7A relacionado a MN]
[0084] MGLQARRWASGSRGAAGPRRGVLQLLPLPLPLPLLLLLLL RPGAGRAAAQGEAEAPTLYLWKTGPWGRCMGDECGPGGIQTRAV WCAHVEGWTTLHTNCKQAERPNNQQNCFKVCDWHKELYDWRLGP WNQCQPVISKSLEKPLECIKGEEGIQVREIACIQKDKDIPAEDIICEYFE PKPLLEQACLIPCQQDCIVSEFSAWSECSKTCGSGLQHRTRHVVAPP QFGGSGCPNLTEFQVCQSSPCEAEELRYSLHVGPWSTCSMPHSRQ VRQARRRGKNKEREKDRSKGVKDPEARELIKKKRNRNRQNRQENK YWDIQIGYQTREVMCINKTGKAADLSFCQQEKLPMTFQSCVITKECQ VSEWSEWSPCSKTCHDMVSPAGTRVRTRTIRQFPIGSEKECPEFEE KEPCLSQGDGVVPCATYGWRTTEWTECRVDPLLSQQDKRRGNQTA LCGGGIQTREVYCVQANENLLSQLSTHKNKEASKPMDLKLCTGPIPN TTQLCHIPCPTECEVSPWSAWGPCTYENCNDQQGKKGFKLRKRRIT NEPTGGSGVTGNCPHLLEAIPCEEPACYDWKAVRLGNCEPDNGKEC GPGTQVQEVVCINSDGEEVDRQLCRDAIFPIPVACDAPCPKDCVLST WSTWSSCSHTCSGKTTEGKQIRARSILAYAGEEGGIRCPNSSALQEV RSCNEHPCTVYHWQTGPWGQCIEDTSVSSFNTTTTWNGEASCSVG MQTRKVICVRVNVGQVGPKKCPESLRPETVRPCLLPCKKDCIVTPYS DWTSCPSSCKEGDSSIRKQSRHRVIIQLPANGGRDCTDPLYEEKACE APQACQSYRWKTHKWRRCQLVPWSVQQDSPGAQEGCGPGRQAR AITCRKQDGGQAGIHECLQYAGPVPALTQACQIPCQDDCQLTSWSK FSSCNGDCGAVRTRKRTLVGKSKKKEKCKNSHLYPLIETQYCPCDKY NAQPVGNWSDCILPEGKVEVLLGMKVQGDIKECGQGYRYQAMACY DQNGRLVETSRCNSHGYIEEACIIPCPSDCKLSEWSNWSRCSKSCG SGVKVRSKWLREKPYNGGRPCPKLDHVNQAQVYEVVPCHSDCNQY LWVTEPWSICKVTFVNMRENCGEGVQTRKVRCMQNTADGPSEHVE DYLCDPEEMPLGSRVCKLPCPEDCVISEWGPWTQCVLPCNQSSFR QRSADPIRQPADEGRSCPNAVEKEPCNLNKNCYHYDYNVTDWSTC QLSEKAVCGNGIKTRMLDCVRSDGKSVDLKYCEALGLEKNWQMNTS CMVECPVNCQLSDWSPWSECSQTCGLTGKMIRRRTVTQPFQGDGR PCPSLMDQSKPCPVKPCYRWQYGQWSPCQVQEAQCGEGTRTRNI SCVVSDGSADDFSKVVDEEFCADIELIIDGNKNMVLEESCSQPCPGD CYLKDWSSWSLCQLTCVNGEDLGFGGIQVRSRPVIIQELENQHLCPE QMLETKSCYDGQCYEYKWMASAWKGSSRTVWCQRSDGINVTGGC LVMSQPDADRSCNPPCSQPHSYCSETKTCHCEEGYTEVMSSNSTLE QCTLIPVVVLPTMEDKRGDVKTSRAVHPTQPSSNPAGRGRTWFLQP FGPDGRLKTWVYGVAAGAFVLLIFIVSMIYLACKKPKKPQRRQNNRLK PLTLAYDGDADM
[0085] SEQ ID NO5 [Autoantígeno NELL-1 relacionado a MN]
[0086] MPMDLILVVWFCVCTARTVVGFGMDPDLQMDIVTELDLV NTTLGVAQVSGMHNASKAFLFQDIEREIHAAPHVSEKLIQLFRNKSEF TILATVQQKPSTSGVILSIRELEHSYFELESSGLRDEIRYHYIHNGKPR TEALPYRMADGQWHKVALSVSASHLLLHVDCNRIYERVIDPPDTNLP PGINLWLGQRNQKHGLFKGIIQDGKIIFMPNGYITQCPNLNHTCPTCS DFLSLVQGIMDLQELLAKMTAKLNYAETRLSQLENCHCEKTCQVSGL LYRDQDSWVDGDHCRNCTCKSGAVECRRMSCPPLNCSPDSLPVHI AGQCCKVCRPKCIYGGKVLAEGQRILTKSCRECRGGVLVKITEMCPP LNCSEKDHILPENQCCRVCRGHNFCAEGPKCGENSECKNWNTKAT CECKSGYISVQGDSAYCEDIDECAAKMHYCHANTVCVNLPGLYRCD CVPGYIRVDDFSCTEHDECGSGQHNCDENAICTNTVQGHSCTCKPG YVGNGTICRAFCEEGCRYGGTCVAPNKCVCPSGFTGSHCEKDIDEC SEGIIECHNHSRCVNLPGWYHCECRSGFHDDGTYSLSGESCIDIDEC ALRTHTCWNDSACINLAGGFDCLCPSGPSCSGDCPHEGGLKHNGQ VWTLKEDRCSVCSCKDGKIFCRRTACDCQNPSADLFCCPECDTRVT SQCLDQNGHKLYRSGDNWTHSCQQCRCLEGEVDCWPLTCPNLSCE YTAILEGECCPRCVSDPCLADNITYDIRKTCLDSYGVSRLSGSVWTM AGSPCTTCKCKNGRVCCSVDFECLQNN
[0087] SEQ ID NO6 [Autoantígeno Semaforina 3B relacionado a MN]
[0088] MGRAGAAAVIPGLALLWAVGLGSAAPSPPRLRLSFQELQ AWHGLQTFSLERTCCYQALLVDEERGRLFVGAENHVASLNLDNISKR AKKLAWPAPVEWREECNWAGKDIGTECMNFVKLLHAYNRTHLLACG AFHPTCAFVEVGHRAEEPVLRLDPGRIEDGKGKSPYDPRHRAASVLV GEELYSGVAADLMGRDFTIFRSLGQRPSLRTEPHDSRWLNEPKFVK VFWIPESENPDDDKIYFFFRETAVEAAPALGRLSVSRVGQICRNDVG GQRSLVNKWTTFLKARLVCSVPGVEGDTHFDQLQDVFLLSSRDHRT PLLYAVFSTSSIFQGSAVCVYSMNDVRRAFLGPFAHKEGPMHQWVS YQGRVPYPRPGMCPSKTFGTFSSTKDFPDDVIQFARNHPLMYNSVL PTGGRPLFLQVGANYTFTQIAADRVAAADGHYDVLFIGTDVGTVLKVI SVPKGSRPSAEGLLLEELHVFEDSAAVTSMQISSKRHQLYVASRSAV AQIALHRCAAHGRVCTECCLARDPYCAWDGVACTRFQPSAKRRFRR QDVRNGDPSTLCSGDSSRPALLEHKVFGVEGSSAFLECEPRSLQAR VEWTFQRAGVTAHTQVLAEERTERTARGLLLRRLRRRDSGVYLCAA VEQGFTQPLRRLSLHVLSATQAERLARAEEAAPAAPPGPKLWYRDFL QLVEPGGGGSANSLRMCRPQPALQSLPLESRRKGRNRRTHAPEPR AERGPRSATHW
[0089] SEQ ID NO7 [Exostosina 2 com marcador His C-terminal]
[0090] MCASVKYNIRGPALIPRMKTKHRIYYITLFSIVLLGLIATGMF QFWPHSIESSNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTC FDVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISD SDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNH LLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPV YSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGE SVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGA RLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMS DVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPY AAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESL FRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAE NKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVG YPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTY KMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPEC TAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDD FPEKLKSFPNIGSLLEHHHHHHHH
[0091] SEQ ID NO8 [Exostosina 1 com marcador His C-terminal]
[0092] MQAKKRYFILLSAGSCLALLFYFGGLQFRASRSHSRREEH SGRNGLHHPSPDHFWPRFPDALRPFVPWDQLENEDSSVHISPRQKR DANSSIYKGKKCRMESCFDFTLCKKNGFKVYVYPQQKGEKIAESYQN ILAAIEGSRFYTSDPSQACLFVLSLDTLDRDQLSPQYVHNLRSKVQSL HLWNNGRNHLIFNLYSGTWPDYTEDVGFDIGQAMLAKASISTENFRP NFDVSIPLFSKDHPRTGGERGFLKFNTIPPLRKYMLVFKGKRYLTGIG SDTRNALYHVHNGEDVVLLTTCKHGKDWQKHKDSRCDRDNTEYEK YDYREMLHNATFCLVPRGRRLGSFRFLEALQAACVPVMLSNGWELP FSEVINWNQAAVIGDERLLLQIPSTIRSIHQDKILALRQQTQFLWEAYF SSVEKIVLTTLEIIQDRIFKHISRNSLIWNKHPGGLFVLPQYSSYLGDFP YYYANLGLKPPSKFTAVIHAVTPLVSQSQPVLKLLVAAAKSQYCAQIIV LWNCDKPLPAKHRWPATAVPVVVIEGESKVMSSRFLPYDNIITDAVLS LDEDTVLSTTEVDFAFTVWQSFPERIVGYPARSHFWDNSKERWGYT SKWTNDYSMVLTGAAIYHKYYHYLYSHYLPASLKNMVDQLANCEDIL MNFLVSAVTKLPPIKVTQKKQYKETMMGQTSRASRWADPDHFAQRQ SCMNTFASWFGYMPLIHSQMRLDPVLFKDQVSILRKKYRDIERLLEH HHHHHHH
[0093] SEQ ID NO9 [Fragmento de exostosina 2 com marcador His C-terminal]
[0094] SNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCF DVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISD SDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNH LLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPV YSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGE SVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGA RLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMS DVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPY AAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESL FRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAE NKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVG YPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTY KMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPEC TAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDD FPEKLKSFPNIGSLHHHHHH
[0095] SEQ ID NO10 [fragmento de Exostosina 2]
[0096] SNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCF DVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISD SDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNH LLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPV YSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGE SVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGA RLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMS DVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPY AAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESL FRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAE NKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVG YPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTY KMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPEC TAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDD FPEKLKSFPNIGSL
[0097] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos não limitantes seguintes a partir dos quais características, modalidades, aspectos e vantagens adicionais da presente invenção podem ser considerados.
[0098] As Figs. 1 a 4 mostram a detecção de autoanticorpos circulantes usando um ensaio de imunofluorescência conforme descrito nos exemplos.
[0099] A Fig. 5 mostra a correlação dos resultados obtidos por imunofluorescência usando o ensaio à base celular (CBA) conforme no exemplo 1 e o ELISA usando um fragmento purificado recombinante de EXT2 como no Exemplo 2. A intensidade da fluorescência (FI) e a absorção em nm (nm) conforme detectada por ELISA é mostrada. Ambos os experimentos foram realizados usando duas amostras de soro compreendendo autoanticorpos para EXT2 conforme detectado por CBA, os quais rendem valores de Fl de 1,5 e 3, respectivamente, 13 amostras a partir de doadores de sangue saudáveis e um marcador anti-His.
[00100] Uma célula mock-transfectada não expressando nenhuma Exostosina (Fig. 1), uma célula expressando EXT1 (Fig. 2), uma célula expressando EXT2 (Fig. 3) e uma célula expressando EXT2 e ETX1 (Fig. 4) é mostrada. As células imunomarcadas são marcadas usando setas brancas.
[00101] Ao se usar lâminas comparativas compreendendo células HEK 293 fixadas transitoriamente transfectadas com um vetor pTriEx-1 vazio sem inserção (Fig. 1), os vetores pTriEx-1 expressando EXT1 com e sem marcador His (SEQ ID NO2 e SEQ ID NO8) (Fig. 2), vetor pTriEx-1 expressando EXT2 com e sem marcador His (SEQ ID NO1 e SEQ ID NO7) (Fig. 3), ou ambos os vetores pTriEx-1 expressando EXT1 e o vetor pTriEx-1 expressando EXT2, cada um com e sem marcador His (Fig. 4), 296 amostras a partir de pacientes suspeitos de sofrer de MN foram analisadas. Os anticorpos para PLA2R e THSD7A anteriormente se mostraram ausentes em 185 dessas amostras usando o Anti-PLA2R e Anti-THDSD7A IFT (IgG, produto FA 1254-1001, EUROIMMUN, para a detecção de ambos os anticorpos para PLA2R e THSD7A) a partir da EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG. Os anticorpos para a SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO7 e SEQ ID NO8 se mostraram ausentes em 300 soros a partir de doadores de sangue saudáveis.
[00102] As células foram desenvolvidas em meio DMEM compreendendo 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor e 1 % anti-biótico-antimicótico (Invitrogen # 15240) a 37°C e 5% de C02. Para as transfecções transitórias, o protocolo ExGenõOO (número do catálogo 12783652, Thermo Fisher) foi usado. As células fixadas foram preparadas ao se contatar as células desenvolvidas em lâminas de microscópio com acetona ao lavar as células em PBS seguido pela breve incubação em 100% de acetona.
[00103] A metodologia e reagentes usados estavam de acordo com a instrução do fabricante no IIFT Neurology Mosaics (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, número do produto FA112d-1). Os centros do sistema de teste em torno da incubação de combinações de substratos com a amostra de paciente diluída. Se a reação é positiva, anticorpos específicos de classes IgA, IgG e IgM se ligam aos an-tígenos. Em uma segunda etapa, os anticorpos ligados são marcados com anticorpos anti-humanos marcados com FITC e tornados visíveis com um microscópio de fluorescência.
[00104] Em suma, as amostras de soro humano foram diluídas em PBS-Tween, seguido pela agitação por 2 segundos. 30 pl de amostra por campo foram incubados por 30 minutos usando a tecnologia Tl-TERPLANE, seguida pela lavagem em PBS-Tween por 1 s, seguida pela incubação em PBS-Tween por 5 minutos em uma cuveta para lavagem completa. 25 μΙ do conjugado de anticorpo secundário foram então aplicados por 30 minutos usando a tecnologia TITERPLANE, seguida pela lavagem em PBS-Tween por 1 s, seguida pela incubação em PBS-Tween por 5 minutos em uma cuveta para lavagem completa.
[00105] Depois das incubações, o veículo com os campos foi coberto com até 10 μΙ do meio de montagem por campo e uma lâmina de vidro, seguida pela análise com microscopia de fluorescência usando um microscópio EUROSTAR (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck).
[00106] As Figs. 3 e 4, mostrando células que expressam EXT2 e EXT1/EXT2, respectivamente, mostraram um sinal fluorescente claro que estava ausente caso uma célula não expressando nenhuma Exos-tosina ou EXT1 apenas fosse expressada (Figs. 1 e 2).
[00107] Os anticorpos para a SEQ ID NO1 poderiam ser detectados em 1 de 185 amostras a partir de pacientes PLA2R- e THSD7A-negativos, mas em nenhuma das 111 amostras a partir de pacientes PLA2R- ou THSD7A-positivos. O autoanticorpo não foi detectado em nenhuma das 300 amostras a partir de doadores de sangue saudáveis.
[00108] Consequentemente, pode se concluir que os autoanticorpos para EXT2 e autoanticorpos para o complexo compreendendo EXT2/EXT1 estão associados com MN. De forma interessante, os referidos autoanticorpos podem não apenas ser detectados em amostras histológicas conforme sugerido pelos inventores da publicação internacional W020037135, mas acontecem em alguns pacientes como autoanticorpos circulantes no soro e podem ser detectados usando ensaios sorológicos, contrário à divulgação da publicação internacional W020037135. Deve ser mencionado que o blotting nativo foi usado pelos inventores da publicação internacional W020037135, o qual é geralmente um método muito sensível, de modo nenhum devido à estrutura de antígenos usada não ser afetada pela exposição a condições não fisiológicas severas.
[00109] Uma vez que elas acontecem em amostras a partir de pacientes nos quais os autoanticorpos para PLA2R e THSD7A estão ausentes, eles podem ser usados para aumentar a sensibilidade total das investigações sorológicas. Deste modo, o número dos pacientes que podem ser diagnosticados sem os resultados da análise das biópsias renais, as quais podem ser apenas obtidas usando cirurgia invasiva, é aumentado.
[00110] Em uma segunda rodada, o experimento 1 foi repetido usando um coorte maior de soro compreendendo 2147 amostras, a partir de pacientes que sofrem de MN ou suspeitos de sofrerem de MN devido a sintomas clínicos distintos. Dentre essas amostras, verificou-se que duas amostras compreendem um autoanticorpo para SEQ ID NO1.
[00111] Para uso em microtitulação ELISA a proteína purificada foi diluída em PBS até as concentrações finais de aproximadamente 0,2 pg/ml de proteína heterodimérica de Exostosina 1/2 Arg29-Leu746 com um marcador 2-His e HA C-terminal (EXT1) & Ser53-Leu718 com um marcador 6-His C-terminal (SEQ ID NO9, R&D systems, produto no. 8567-GT-020) e usada para revestir as placas de microtitulação ELISA (Nunc, Roskilde, Denmark) de um dia para o outro. As placas foram incubadas com 100 pi de proteína cada (2 h em temperatura ambiente), lavadas extensivamente e bloqueadas usando 0,1 % (p/v) de caseína em PBS usando métodos padrão.
[00112] As amostras foram diluídas 1:101 em tampão de amostra IgG, aplicadas a placas de microtitulação e incubadas conforme descrito para kits de teste comerciais EUROIMMUN ELISA, usando reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, El 2260-9601 G/A). O manual de El 2260-9601 G/A foi seguido. Um anticorpo anti-his (Merck Chemicals; 70796-3) serviu como um controle positivo. Em suma: 60 min a 37°C; 3 etapas de lavagem usando 200 pl de tampão de lavagem; adição de 100 μΙ de conjugado de IgG anti-humana marcado com peroxidase (coelho) bzw. Anti-camundongo-lgG (H+L)-POD (Jackson Research; 115-035-062) (por poço; incubação por 30 min a 37°C; 3 etapas de lavagem usando tampão de lavagem EUROIMMUN; adição de 100 μΙ de solução de cromogênio/substrato (TMB/H2O2) por poço; incubação por 30 min em temperatura ambiente; adição de 100 μΙ de solução de parada (ácido sulfúrico 0,5 M); medição da densidade ótica em 450 nm contra 620 nm como uma referência. Os resultados abaixo 0,065 foram considerados negativos e os resultados de mais do que 0,066 positivos.
[00113] A Fig. 5 mostra os resultados com 13 amostras a partir de doadores de sangue saudáveis e duas amostras identificadas como compreendendo autoanticorpos para EXT2 por IFT como no exemplo 2, comparado com os resultados obtidos usando IFT.
[00114] Fica claro que as duas amostras positivas podem ser facilmente distinguidas das amostras de indivíduos saudáveis, demonstrando que ELISA baseado em um fragmento da SEQ ID NO1 pode ser usado para realizar o método de acordo com a presente invenção como uma alternativa ao IFT descrito no exemplo 1.
Claims (15)
- Veículo diagnosticamente útil revestido com um polipep-tídeo recombinante compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, preferencialmente um complexo compreendendo um poli-peptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, caracterizado pelo fato de que o veículo é selecionado a partir do grupo compreendendo uma esfera, preferencialmente uma esfera paramagnética, uma tira de teste, uma placa de microtitulação, uma membrana, preferencialmente a partir do grupo compreendendo western blot, line blot e dot blot, um dispositivo de fluxo lateral, uma superfície de vidro, uma lâmina para microscópio, um microarranjo e um bi-ochip e é preferencialmente uma lâmina para microscópio.
- Veículo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o veículo ainda compreende um ou mais polipeptí-deos recombinantes, preferencialmente todos os polipeptídeos a partir do grupo compreendendo um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO3, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO4, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO5 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO6 ou uma variante do mesmo.
- Veículo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que qualquer polipeptídeo imobilizado é expressado por uma célula imobilizada no veículo, preferencialmente uma célula fixada ou é um polipeptídeo recombinante ou isolado imobilizado no veículo.
- Veículo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que qualquer polipeptídeo imobilizado é expressado por uma célula imobilizada no veículo e o veículo ainda compreende uma célula mock-transfectada.
- Veículo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1 é ligado ao polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e opcionalmente um anticorpo secundário compreendendo um marcador.
- Autoanticorpo isolado, preferencialmente solúvel caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, opcionalmente ligada ao veículo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
- Kit caracterizado pelo fato de que compreende o veículo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um ou mais a partir do grupo compreendendo um meio para detectar um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma, cujo meio é preferencialmente um anticorpo secundário, mais preferencialmente um anticorpo secundário que se liga especificamente a anticorpos de classe IgG, ou é um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, em que o meio preferencialmente compreende um marcador, um meio para capturar um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo SEQ ID NO2, um tampão de lavagem, um meio de montagem, um tampão de diluição, um controle positivo, um controle negativo, um calibrador, preferencialmente um conjunto compreendendo três ou mais calibradores, e um polipeptídeo recombinante compreendendo a SEQ ID NO1 ou uma variante da mesma, opcionalmente em complexo com um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma.
- Método para o diagnóstico de MN caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de detecção da presença ou ausência de um autoanticorpo que se liga especificamente à SEQ ID NO1, preferencialmente a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, em uma amostra líquida compreendendo anticorpos a partir de um indivíduo.
- Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada a partir do grupo compreendendo sangue total, soro e plasma.
- Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 e 9, caracterizado pelo fato de que ainda compreende detectar a presença ou ausência de um autoanticorpo a partir do grupo, preferencialmente todos os autoanticorpos a partir do grupo compreendendo um autoanticorpo que se liga especificamente ao complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO3, um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO4, um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO5 e um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO6.
- Uso de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, ou o veículo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para o diagnóstico sorológico de MN ou para a fabricação de um kit diagnóstico.
- Uso de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2 ou um anticorpo recombinante que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo SEQ ID NO2, caracterizado pelo fato de que é preferencialmente reconhecido por anticorpos secundários às imunoglobulinas de classe IgG humana, como um controle positivo para a detecção de um autoanticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 em uma amostra.
- Solução aquosa caracterizada pelo fato de que compreende um autoanticorpo, preferencialmente da classe IgG, que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 ou a um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2.
- Dispositivo para remover um autoanticorpo para um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, a partir do sangue, preferencialmente soro de um paciente com MN, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende um veículo revestido com um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO2 ou uma variante da mesma.
- Método ex vivo caracterizado pelo fato de que é para remover um autoanticorpo para um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1, preferencialmente um complexo compreendendo um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO1 e um polipeptídeo tendo a SEQ ID NO2, a partir do sangue, preferencialmente soro de um paciente com MN.
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