CN114624445A

CN114624445A - 用于诊断膜性肾病的方法和试剂

Info

Publication number: CN114624445A
Application number: CN202111502832.XA
Authority: CN
Inventors: I-M·戴特曼; S·明多夫; C·普罗伯斯特
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-06-14
Also published as: EP4012412A3; AU2021282541A1; BR102021022687A2; EP4012412A2; US20230213534A9; US20220187320A1; CA3141736A1

Abstract

本发明涉及包被有包含SEQ ID NO:1的重组多肽的在诊断学上有用的承载体；与具有SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的分离的自身抗体；包含所述承载体的试剂盒；用于诊断膜性肾病(MN)的方法，其包括检测在来自受试者的包含抗体的液体样品中与具有SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的存在或不存在的步骤；与具有SEQ ID NO:1的多肽或包含SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的用途；和包含与具有SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的水溶液。

Description

用于诊断膜性肾病的方法和试剂

本发明涉及包被有包含SEQ ID NO:1的重组多肽的承载体；与具有SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的分离的自身抗体；包含所述承载体的试剂盒；方法，其包括检测在来自受试者的包含抗体的液体样品中与具有SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的存在或不存在的步骤；与具有SEQ ID NO:1的多肽或包含SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的用途；和包含与具有SEQ ID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的水溶液。

膜性肾病是一种自身免疫性疾病(患病率为1-2/100,000人/年)并且是高加索人成人中肾病综合征的最常见原因。最初的临床症状是水肿，其归因于增加的肾蛋白质损失(被定义为病理性蛋白尿)，其通过肾小球过滤屏障的损害而诱导。

该疾病的临床过程是可变的并且从蛋白尿的自发缓解至终末期肾病(ESRD)变动。具有自发缓解的患者(大约20-25％的患者)通常具有优异的临床结果。在疾病谱的另一端，大约20％的患者在十年的时间过程中经历ESRD，经常尽管进行了免疫抑制疗法。第三组患者表现出持续的，在大多数情况下更中等水平的蛋白尿和稳定的肾功能。

困难的是依据独个患者的需要定制疗法。如果患者属于第一组(具有自发缓解)，任何药疗法(通常是施用免疫抑制药物)将会使他暴露于此类治疗的相当大的副作用，即使如事后能够得出结论那样此类治疗不是必需的。相反地，属于第3组的患者可以得益于在治疗早期施用强的免疫抑制药物。

因此，简单地等待并观察在支持疗法下临床疾病活动性将会如何发展并且在随访时间期间考虑(如果需要)更严格的疗法选项，已成为公认的临床策略。

无论如何，将会希望尽可能早地识别处于其早期的该疾病以及该疾病的进程将会如何发展。特别地，重要的是区分自身免疫类型的MN(尤其是相关于与足细胞相关自身抗原相结合的自身抗体的那些)和与其他原因例如恶性肿瘤、感染和药物相联系的MN。这样，可以选择最佳的可能治疗。例如，可能使没有症状或有轻微症状的患者在早期经历用低剂量免疫抑制药物的治疗，并且观察他是否对此类治疗作出积极应答而不发展出临床疾病活动性，因而有可能使患者免于暴露于具有严重副作用的严苛的免疫抑制治疗。

针对磷脂酶-A2-受体(PLA2R)的自身抗体的发现为基于血清学来诊断该疾病铺平了道路(US2013/0280738；Beck,L.,Bonegio,R.G.,Lambeau,G.,Beck,D.M.,Powell,D.W.,Cummins,T.D.,Klein J.B.,Salant,D.J.(2009)N.Engl.J.Med.361(1),11-21)。这些自身抗体可以在多达70％的患者的血液中容易地检测到，这意味着在这些情况下不再需要侵入性外科手术来获得用于诊断的样品。

但是，基于PLA2R的测定法无法用于诊断其余的30％的患者。研究人员已经鉴定出了自身抗原和自身抗体来弥合这个诊断缺口。已经报道，也可以检测针对THSD7A的自身抗体(US10107810；Tomas NM,Beck LH Jr,Meyer-Schwesinger C,Seitz-Polski B,Ma H,Zahner G,Dolla G,Hoxha E,Helmchen U,Dabert-Gay AS,Debayle D,Merchant M,KleinJ,Salant DJ,Stahl RAK,Lambeau G.Thrombospondin type-1domain-containing 7A inidiopathic membranous nephropathy.N Engl J Med.2014Dec 11,371(24):2277-2287)，但患病率仅为大约5％。

最近鉴定的另外的自身抗原包括NELL-1(Sethi S,Debiec H,Madden B,Charlesworth MC,Morelle J,Gross L,Ravindran A,Buob D,Jadoul M,Fervenza FC,Ronco P.Neural epidermal growth factor-like 1protein(NELL-1)associatedmembranous nephropathy.Kidney Int.2020Jan,97(1):163-174)和脑信号蛋白(Semaphorin)3B(Sethi S,Debiec H,Madden B,Vivarelli M,Charlesworth MC,Ravindran A,Gross L,Ulinski T,Buob D,Tran CL,Emma F,Diomedi-Camassei F,Fervenza FC,Ronco P.Semaphorin3B-associated membranous nephropathy is adistinct type of disease predominantly present in pediatric patients.KidneyInt.2020Jun10:S0085-2538(20)30640-2)。

外生骨疣蛋白(Exostosin；EXT)(WO20037135；Sethi S,Madden BJ,Debiec H,Charlesworth MC,Gross L,Ravindran A,Hummel AM,Specks U,Fervenza FC,RoncoP.Exostosin 1/Exostosin 2-Associated Membranous Nephropathy.J Am SocNephrol.2019Jun,30(6):1123-1136)是另一种自身抗原。外生骨疣蛋白是负责硫酸乙酰肝素骨架的合成的糖基转移酶，其将糖胺聚糖残基添加至核心蛋白质，从而导致生成复杂的多糖。存在五个编码EXT蛋白的基因-EXT1、EXT2、EXTL1、EXTL2和EXTL3。EXT1和EXT2多肽显示出结构相似性，并且EXT1和EXT2可以以异二聚体存在并且在硫酸肝素链的延伸中作为共聚合酶起作用。EXT1/EXT2的异二聚体还具有增加的稳定性和活性。这是在我们的研究中发现EXT1/EXT2(以异二聚体形式)在一起的可能原因。EXTL蛋白显示出与EXT1和EXT2的氨基酸序列同源性，并且也可能参与硫酸乙酰肝素合成，虽然其功能还鲜为人知。EXT蛋白是十分保守的，尤其是在其C-末端区域中。除了EXTL1，EXT蛋白在各种哺乳动物组织中遍在地表达。EXT蛋白也在足细胞中表达，并且EXT1(特别地在足细胞中)的纯合敲除不导致肾小球过滤的显著缺陷，虽然注意到足细胞构造的变化和GBM的局灶性增厚。EXT蛋白是内质网中的跨膜蛋白质，并且需要进一步研究在EXT1/EXT2相关MN中检测到的EXT1和EXT2是全长蛋白质，还是代表了脱落的部分或经截短的蛋白质，还是具有翻译后修饰的蛋白质。最后，EXT1和EXT2中的突变与一种常染色体显性病症即遗传性多发性外生骨疣(其是最常见的遗传性骨骼病症之一)相关联。还不知道除了MN以外的与EXT1和EXT2的累积相关联的病症(BERTELLI等人,Molecular and Cellular Mechanisms for Proteinuria in MinimalChange Disease.Front.Med.,11June 2018,Vol 5,Article 170,pp 1-13.尤其是摘要，第2页，第2栏，第2段；US 2006/0040293A1(SALONEN等人)23February 2006(23.02.2006)摘要,[0021])。

尽管针对这些自身抗原中的每一种的自身抗体可能不存在于大多数患者中，但是它们很少与针对PLA2R的自身抗体一起出现，这意味着这些测定法帮助特别地在PLA2R-阴性患者中对诊断作出结论并因此补足现有的测定法。

Sethi等人试图通过使用在非还原条件下的Western和天然印迹法分析来检测在MN患者的血清中的针对EXT1/EXT2的循环自身抗体，但是未能检测到循环自身抗体。应当提及是，Western印迹法已被认为是用于检测针对MN相关自身抗原的自身抗体的特别灵敏的方法。这暗示，针对可以在血液样品中检测到的外生骨疣蛋白的循环自身抗体不存在。

作为本发明基础的问题是提供血清学测定法和相关试剂，其可以用于在不具有可检测的针对PLA2R或另一种MN相关自身抗原例如THSD7A的自身抗体的患者中诊断MN，或者检测针对SEQ ID NO:1的自身抗体例如人抗体。

作为本发明基础的另一个问题是增加用于诊断MN，优选地用于区分自身免疫类型的MN(尤其是相关于与足细胞相关自身抗原相结合的自身抗体的那些)和与其他原因例如其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤、感染和药物相联系的MN的诊断学的灵敏度。

在第一个方面，作为本发明基础的问题通过在诊断学上有用的承载体而得到解决，所述承载体包被有包含SEQ ID NO:1或其变体的重组多肽，优选地，包含有包含SEQ IDNO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物，其中所述承载体选自包括下列各项的组：珠粒，优选地顺磁性珠粒；测试条；微量滴定板；膜，其优选地选自包括Western印迹、线印迹和斑点印迹的组；侧流装置；玻璃表面；显微术用载玻片；微阵列；和生物芯片，并且优选地为显微术用载玻片。

在一个优选的实施方案中，所述承载体进一步包含从包括下列各项的组中选择的一种或多种重组多肽，优选地所有多肽：包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物，包含SEQ ID NO:2的多肽，包含SEQ ID NO:3的多肽，包含SEQ ID NO:4的多肽，包含SEQ ID NO:5的多肽，和包含SEQ ID NO:6或其变体的多肽。

在一个优选的实施方案中，任何经固定化的多肽由固定化在所述承载体上的细胞，优选地经固定的细胞来表达，或者是固定化在所述承载体上的重组或分离的多肽。

在一个优选的实施方案中，任何经固定化的多肽由固定化在所述承载体上的细胞来表达，并且所述承载体进一步包含经模拟转染的细胞。

在一个优选的实施方案中，与SEQ ID NO:1特异性地结合的自身抗体与包含SEQID NO:1或其变体的多肽和任选地包含标记物的二抗相结合。

在第二个方面，作为本发明基础的问题通过分离的自身抗体而得到解决，所述自身抗体与SEQ ID NO:1或其变体，优选地与包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物特异性地结合，所述复合物任选地结合至根据声索项1至5中任一项的承载体。所述自身抗体可以是经干燥的或经冻干的。

在第三个方面，作为本发明基础的问题通过试剂盒而得到解决，所述试剂盒包含根据本发明的承载体，和一种或多种从包括下列各项的组中选择的组分：用于检测与SEQID NO:1，优选地包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体的工具，所述工具优选地为二抗，更优选地与IgG类抗体特异性地结合的二抗，或者为包含SEQ ID NO:1的多肽，其中所述工具优选地包含标记物；用于捕获与SEQ ID NO:1或者包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ IDNO:2或其变体的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体的工具；洗涤缓冲液；封固介质；稀释缓冲液；阳性对照；阴性对照；校准物，优选地包含三种或更多种校准物的套组；和包含SEQ ID NO:1或其变体的重组多肽。

在第四个方面，作为本发明基础的问题通过用于诊断MN的方法而得到解决，所述方法包括检测在来自受试者的包含抗体的液体样品中与SEQ ID NO:1，优选地与包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体的存在或不存在的步骤。

在一个优选的实施方案中，所述自身抗体为IgG类抗体。

在一个优选的实施方案中，所述样品选自包括下列各项的组：全血、血清和血浆。优选地，所述样品来自哺乳动物，更优选地人患者。

在一个优选的实施方案中，所述抗体通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来进行检测：免疫扩散，免疫电泳，光散射免疫测定法，凝集，标记免疫测定法例如从包括放射性标记免疫测定法的组中选择的那些，酶免疫测定法例如比色测定法，化学发光免疫测定法，和免疫荧光，更优选地免疫荧光。

在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括检测从包括下列各项的组中选择的自身抗体，优选地所有自身抗体的存在或不存在：与包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体；与SEQ ID NO:2特异性地结合的自身抗体；与SEQ ID NO:3特异性地结合的自身抗体；与SEQ ID NO:4特异性地结合的自身抗体；与SEQ ID NO:5特异性地结合的自身抗体；和与SEQ ID NO:6特异性地结合的自身抗体。

在第五个方面，作为本发明基础的问题通过这样的用途而得到解决：即与SEQ IDNO:1或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体或者根据本发明的承载体用于MN的血清学诊断的用途。

在第六个方面，作为本发明基础的问题通过这样的用途而得到解决：即包含SEQID NO:1的多肽或者包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物以及二抗用于制备诊断试剂盒的用途。

在第七个方面，作为本发明基础的问题通过这样的用途而得到解决：即与SEQ IDNO:1或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体或者与SEQ ID NO:1或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的重组抗体作为阳性对照用于检测在样品中的与SEQ IDNO:1或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体，优选地用于诊断MN的用途。

在第八个方面，作为本发明基础的问题通过水溶液而得到解决，所述水溶液包含与SEQ ID NO:1或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体。在一个优选的实施方案中，所述水溶液包含来自具有MN的人患者的样品。在另一个优选的实施方案中，所述溶液包含非生理学缓冲液或者处于超过生理学水平的浓度的生理学缓冲液，并且更优选地具有5至9，优选地6至8的pH。

在第九个方面，作为本发明基础的问题通过这样的装置而得到解决：即用于从MN患者的血液，优选地血清中去除针对SEQ ID NO:1，优选地包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的复合物的自身抗体的装置，其中所述装置包含承载体，其包被有SEQ ID NO:1，优选地，包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或其变体的复合物。

在第十个方面，作为本发明基础的问题通过这样的离体方法而得到解决：即用于从MN患者的血液，优选地血清中去除针对SEQ ID NO:1，优选地包含SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的复合物的自身抗体的离体方法。

本发明基于发明人的令人惊讶的发现：针对EXT2和EXT1/2的自身抗体在来自MN患者的血液样品中(而不是在来自健康受试者的样品中)存在并且是可检测的。它们可以通过使用免疫测定法来检测，并且可以用于建立用于诊断MN的血清学免疫测定法。包含经固定化的EXT2或EXT1/2的承载体可以用于检测此类抗体。

此外，本发明基于令人惊讶的发现：可能通过使用包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽的复合物和包含有包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物来区分自身免疫性和非自身免疫性MN。

根据本发明，使用包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽来检测针对SEQ ID NO:1的自身抗体，例如通过用包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽包被根据本发明的在诊断学上有用的承载体或者通过使用如果结合至所述抗体可以被检测的包含SEQ ID NO:1或其变体的可溶性多肽。任选地，所述承载体可以包含另一种MN-相关的自身抗原，其优选地与包含SEQID NO:1的多肽在空间上相分开。任选地，所述承载体可以包含对照，其指示它已与血清样品相接触。任选地，所述承载体可以包含对照，其指示它已与二抗，优选地与人抗体(更优选地，与人IgG抗体)相结合的二抗相接触。任选地，所述承载体可以包含至少一种校准物，优选地包含至少三种校准物的套组。校准物描述在本领域中，例如The ImmunoassayHandbook,第3版,David Wild(编者),Elsevier,2005。在一个优选的实施方案中，将所提及的任何序列理解为作为可以用于检测目的自身抗体的多肽或相似形式的一部分而呈现。特别地，这适用于其他MN-相关的自身抗原的序列。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“其他MN-相关的自身抗原”是指从包括下列各项的组中选择的一种或多种，优选地所有：包含包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的复合物，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，和SEQ ID NO:6。在本文中所提及的任何uniprot数据库序列是指在2021年10月20日可得的序列。

优选地，将包含SEQ ID NO:1的多肽或者包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或其变体的复合物固定化在所述承载体的固相上。当与样品相接触时，它可以被直接固定化在固相上，但是也可以使用竞争测定法、捕获桥测定法、免疫测量测定法、固相上的类别特异性二抗、类别捕获测定法(直接或间接的)。这些形式中的每一种的原理详细描述在TheImmunoassay Handbook,第3版,David Wild(编者)，Elsevier,2005中。更优选地，所述固相为测试条或者用于ELISA的微量滴定板的孔，优选地用于ELISA的微量滴定板的孔。

在一个优选的实施方案中，可以将固定化在固相(优选地，承载体的固相)上的任何多肽构造成用于在所述相上的固定化。例如，所述多肽可能实际上还未被固定化，但是可以与配体相联合，所述配体与与所述固相相联合的结合伙伴相结合。所述配体可以是生物素，而所述结合伙伴可以是链霉抗生物素蛋白，反之亦然。在将所述多肽和所述固相在液体溶液中混合后，所述多肽将会立即与所述固相相结合。例如，可以将所述多肽构造成用于在微量滴定板孔上的固定化。

在一个优选的实施方案中，包含有包含SEQ ID NO:1的多肽或者包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或其变体的复合物的承载体可以用于检测在液体样品，优选地血液样品，更优选地血清或血浆样品中的针对SEQ ID NO:1或者针对包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的复合物的自身抗体。

本发明的教导不仅可以通过使用所述多肽，特别是包含所提及的多肽的天然序列例如外生骨疣蛋白2(SEQ ID NO:1)的多肽，或者具有在本申请中明确地(例如通过功能、名称、序列或登录号)或暗示地提及的确切序列的核酸来实施，而且也可以通过使用此类多肽或核酸的变体来实施。示例性的变体包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、牛(UniprotO77783)、黑猩猩(A0A6D2WAN1)、狗(A0A6D2WAN1)、马(A0A5F5Q0R9)、狮子(A0A6P6IAG1)、猪(A0A480SE83)、火鸡(A0A7L0W6P6)和绵羊(A0A6P7EVF0)外生骨疣蛋白2。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“变体”可以是指所提及的全长序列的至少一个片段，更特别地一个或多个相对于全长序列而言在一个或两个末端处截短一个或多个氨基酸的氨基酸序列或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150、200、300、400、500、600、620、640、660、680或700个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以为至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、640、660、680、700或718或更多个氨基酸。

术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且也涉及包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％，优选地至少99.3％同一的氨基酸序列的多肽或其片段，其中删除或置换除了对于生物学活性(例如，抗原与(自身)抗体相结合的能力)或者所述多肽的折叠或结构来说必需的那些氨基酸以外的其他氨基酸，和/或以保守方式替代一个或多个此类必需氨基酸，和/或添加氨基酸，从而使得所述多肽的生物学活性得到保存。现有技术包括各种可以用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并且计算同一性程度的方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction tobioinformatics,Oxford University Press,2008,第3版。在一个优选的实施方案中，使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，其中使用缺省设置。技术人员将会使用现有技术文献来设计变体，例如Behnert,A.,Fritzler,M.J.,Teng,B.,Zhang,M.,Bollig,F.,Haller,H.,Skoberne,A.,Mahler,M.,和Schiffer,M.(2013)(PLOS,8(4)e61669)，以及其结果，特别是在表1和图2中的表位，可以用于指导变体的设计。另外的指引可以在US2019183969 AA中找到。

在一个优选的实施方案中，所述多肽及其变体另外还可以包含化学修饰，例如同位素标记物或共价修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化等。本领域技术人员熟悉用于修饰多肽的方法。如此设计任何修饰，从而它不会取消所述变体的生物学活性。

此外，变体也可以通过多肽、其片段或变体与其他已知的多肽或其变体(优选地选自包括下列各项的组：连接体和亲和标签，其任选地具有蛋白酶切割位点)的N-末端和/或C-末端融合来产生，并且包含活性部分或结构域，优选地当与参考序列的活性部分进行比对时具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中在本文中所使用的术语“活性部分”是指小于全长氨基酸序列的氨基酸序列，或者在核酸序列的情况下，编码小于全长氨基酸序列的核酸序列，和/或为天然序列的变体，但是保留至少一些生物学活性。优选地，所述活性部分为下述序列的活性部分：SEQID NO:1，优选地包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或其变体的复合物。连接体可以为柔韧的氨基酸链段，其例如富含甘氨酸和丝氨酸残基，优选地包含1至50个、3至30个或4至20个氨基酸。蛋白酶切割位点的例子包括凝血酶和PreScission蛋白酶切割位点。

多肽的变体具有生物学活性。在一个优选的实施方案中，此类生物学活性为与自身抗体特异性地结合的能力，所述自身抗体与目的自身抗原特异性地结合，所述目的自身抗原优选地选自包括下列各项的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、包含SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的复合物、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，更优选地SEQID NO:1，如在罹患与此类自身抗体相关联的自身免疫性疾病(优选地MN)的患者中所发现的。例如，多肽的变体是否具有此类生物学活性可以通过测定它是否与来自包含与野生型自身抗原相结合的自身抗体的MN患者的样品的自身抗体特异性地结合来检查，优选地如通过在本申请的实验部分中所描述的间接免疫荧光所测定的。

根据本发明，多肽，优选地包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽，可以是重组蛋白质。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“重组(的)”是指通过使用遗传工程方法在产生过程的任何阶段处产生的多肽，例如通过将编码所述多肽的核酸与用于在细胞或组织中过表达的强启动子相融合，或者通过改造所述多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(其例如描述在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH or in Brown T.A.(1986),Gene Cloning–an introduction,Chapman&Hall中)，和用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(其例如描述在由GE Healthcare Life Sciences出版的Handbooks，，Strategies for ProteinPurification“,，，Antibody Purification“中，和描述在Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009):Guide to Protein Purification中)。在另一个优选的实施方案中，根据本发明提供或使用的多肽，例如包含SEQ ID NO:1的多肽或者包含有包含SEQ ID NO:1的多肽的复合物和包含有SEQ ID NO:2或其变体的复合物或者抗体，是分离的多肽，其中术语“分离的”意指所述多肽相比于其在通过使用生物技术方法或合成方法来产生之时的状态而言已被富集，并且优选地是纯的，即在各自液体中的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及随后的考马斯蓝染色和目视检查所判断的。优选地，用作用于捕获抗体的工具的任何在承载体上的多肽是纯的。

根据本发明，医学或诊断学装置例如在诊断学上有用的承载体可以通过下列方式来制备：在细胞例如真核或原核细胞中表达SEQ ID NO:1的重组变体(其包含亲和标签，任选地具有可以包括蛋白酶切割位点的人工连接体)；使表达出的变体与固定化在固相上的与所述亲和标签特异性地结合的配体相接触；洗涤所述固相，从而使得从细胞上去除非特异性地结合的材料；和从所述固相上洗脱表达出的变体，优选地通过添加过量的非固定化的配体。然后，将变体固定化在装置上。任选地，所述亲和标签可以通过在固定化之前使所述变体与蛋白酶，优选地识别所述蛋白酶切割位点的蛋白酶相接触来去除。所述亲和标签可以选自包括下列各项的标签的组：His、18A、ACP、醛类、Avi、BCCP、钙调蛋白、几丁质结合蛋白、E-Tag、ELK16、FLAG、flash、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、GST、GFP、HA、Isope、麦芽糖结合蛋白、myc、nus、NE、ProtA、ProtC、Tho1d4、S-Tag、SnoopTag、SpyTag、SofTag、链霉抗生物素蛋白、Strep-标签II、T7表位标签、TAP、TC、硫氧还蛋白、Ty、V5、VSV和Xpress标签。有用的蛋白酶包括但不限于TEV、凝血酶、凝血因子Xa或肠肽酶。合适的连接体为载体，例如pET载体系列(Novagen)的一部分。

根据本发明，提供过表达包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽的细胞，优选地与另外过表达另一种MN-相关的自身抗原的序列或其变体(优选地SEQ ID NO:2或其变体)的另一种细胞相组合地。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“过表达”意指所述细胞已经用核酸瞬时地或稳定地进行了转染，在所述核酸(其包含处于启动子控制之下的编码包含SEQ ID NO:1的多肽或另一种MN-相关的自身抗原或其变体的核酸序列)已被掺入到细胞的基因组中这样的意义下。过表达包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽的细胞可以另外过表达包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽，从而形成包含这两种多肽的复合物。因此，经转染的细胞表达比相同类型的细胞正常地将会表达的更多的被待检测的自身抗体所识别的多肽，可能至少10％、20％、30％、50％、100％、200％或500％地更多，如通过定量Western印迹所判断的。所述启动子可以是诱导型启动子，其允许通过添加诱导剂来诱导表达。本领域技术人员熟悉用于在真核细胞中瞬时过表达多肽的实验方案和载体，例如来自Novagen的pTriEx系统，和熟悉用于稳定转染真核细胞的实验方案和载体，例如来自Invitrogen的pcDNA^TM4/TO载体系统。

在一个优选的实施方案中，可以使用经固定的哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“经固定的”细胞是指这样的细胞，其已用反应性化学化合物进行处理，以致于所述细胞不再是在代谢上有活性的，但是仍然呈递其表位用于用抗体进行的免疫染色以及其随后的检测，例如通过荧光。更优选地，所述反应性化学化合物选自包括下列各项的组：丙酮、福尔马林、甲醇和乙醇或其混合物，优选地所有它们。本领域技术人员熟悉可以用于制备经固定的细胞的实验方案。基本上，通过使用洗涤缓冲液来洗涤附着至固体支持物的细胞，随后与反应性化合物相接触，例如浸没。可以使用纯的丙酮或福尔马林或者反应性化学化合物的水性稀释物。

根据本发明，所述细胞在用于显微免疫荧光分析的承载体上。这样的承载体可以为载玻片。在载玻片上的细胞可以用封固缓冲液覆盖。封固介质为这样的液体，其有助于保持近生理学pH以维持任何在诊断学上相关的分子及其表位的分子结构，与荧光信号的发射相容，并且防止由于荧光团的漂白而引起的荧光过早丢失。同时，其光学特性与所使用的其他缓冲液相匹配，特别是其折射率，所述折射率允许有效的显微荧光分析。所述封固介质包含基础组分，其优选地选自包括下列各项的组：水、甘油、天然油或塑料或其混合物，优选地水和甘油。它可以进一步包含可以减少漂白的抗褪色组成成分，其优选地选自包括下列各项的组：NPG(N-丙基没食子酸酯)、DABCO(1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷)、4POBN((4-吡啶基-1-氧化物)-N-叔丁基硝酮)和PPD(对苯二胺)。各种组合物和方法描述在现有技术中，例如在由Wright Cell Imaging Facility,Toronto Western Research InstituteUniversity Health Network出版的“Mountants and Antifades”(https://de.scribd.com/document/47879592/Mountants-Antifades)，Krenek等人,(1989)Comparison of antifading agents used in immunofluorescence,J.Immunol.Meth117,91-97，和Nairn等人,(1969)Microphotometry in Immunofluorescence,Clin.Exp.Immunol.4,697-705中。

可以在包含样品和封固介质的组合物的顶部上放置盖玻片。具有盖玻片的载玻片(FB 112d-1005-1或ZZ 3000-0112)可从EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika,AG得到。但是，可以使用任何与荧光图式的显微分析相容的承载体。所述承载体可以包含经模拟转染的细胞，其已经用与过表达包含SEQ ID NO:1的多肽的细胞相同但没有编码该多肽的核酸的载体进行了转染。此类经模拟转染的细胞可以充当阴性对照。将所述承载体构造成用于通过使用免疫荧光显微镜来进行分析。

在一个实施方案中，所述承载体可以包含有包含根据本发明的细胞的区域。另外，所述承载体可以包含另外的区域。所述区域优选地被疏水表面围绕，并且优选地在空间上相互分开。这些区域中的每一个可以包含过表达另一种MN-相关的自身抗原或其变体的细胞。区域可以包含哺乳动物(优选地灵长类动物)肾组织的切片。

优选地，将包含SEQ ID NO:1的多肽(其优选地与包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽相复合)固定化在所述承载体的固相上。当与样品相接触时，它可以被直接固定化在固相上，但是也可以使用竞争测定法、捕获桥测定法、免疫测量测定法、固相上的类别特异性二抗、类别捕获测定法(直接或间接的)。这些形式中的每一种的原理详细描述在TheImmunoassay Handbook,第3版,David Wild(编者)，Elsevier,2005中。更优选地，所述固相为测试条或者用于ELISA的微量滴定板的孔，优选地用于ELISA的微量滴定板的孔。

在一个优选的实施方案中，二抗为与所有来自抗体类别，优选地哺乳动物抗体类别，更优选地人抗体类别例如IgG的抗体特异性地结合的抗体。二抗通常识别所述类别的恒定结构域，但是也可以识别由来自目的类别的抗体所共享的其他表位，例如跨越3D结构的构象表位。它们中的许多是商购可得的，例如从Thermo Fisher。它可以是单克隆或多克隆抗体。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“识别(的)”意指所述二抗与待检测的抗体特异性地结合。二抗可以与来自该抗体类别的所有同种型特异性地结合。例如，针对IgG类抗体的二抗可以与IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型特异性地结合。这可以通过将包含与每种IgG同种型特异性地结合的抗体的混合物或者与所有目的同种型反应的单种抗体用作针对该类别(优选地IgG类抗体)的二抗来实现。二抗的使用在Kruger,N.J.,Detectionof Polypeptides on Blots Using Secondary Antibodies,The Protein ProtocolsHandbook(J.M.Walker(编者)),第967页,第1996卷,Springer中作了解释。简而言之，此类二抗可以通过用待识别的抗体或待识别的抗体的混合物对实验室动物进行免疫接种来产生。

待检测的自身抗体或者所使用的二抗优选地分别与自身抗原或待检测的抗体特异性地结合。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“特异性地结合”优选地意指，所述结合反应比以1×10^-5M，更优选地1×10^-7M，更优选地1×10^-8M，更优选地1×10^-9M，更优选地1×10^-10M，更优选地1×10^-11M，更优选地1×10^-12M的解离常数为特征的结合反应更强，所述解离常数通过使用Biacore设备在25℃下在pH 7的PBS缓冲液中经由表面等离子体共振来测定。

在一个优选的实施方案中，所述细胞结合至针对SEQ ID NO:1，优选地针对包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的复合物的自身抗体，而二抗结合至所述抗体。在一个更优选的实施方案中，所述二抗识别IgG类抗体。对于免疫荧光分析，所述二抗可以包含可检测的荧光标记物，更优选地FITC(异硫氰酸荧光素)。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括提供根据本发明的承载体的步骤。然后，可以使所述承载体与被怀疑包含所述自身抗体的样品在允许任何自身抗体与所述细胞和由所述细胞所表达的SEQ ID NO:1或其变体相结合的条件下相接触。然后，可以去除样品，并且可以洗涤具有所述细胞的承载体以去除任何剩余的样品。然后，可以使二抗或者相似的试剂或工具(其与所述自身抗体相结合并且携带可检测的标记物例如荧光染料)与所述承载体在允许在任何所结合的自身抗体和所述二抗之间形成复合物的条件下相接触。然后，可以洗涤所述承载体以去除未结合的二抗。最后，通过检查是否可以检测到所述二抗来检测所述自身抗体的存在，优选地通过免疫荧光，其更优选地由荧光素或其衍生物(最优选地FITC)发射。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“诊断”以其最宽的可能含义进行使用，并且可以用于任何类型的旨在下列目的的程序：获得在评估患者(知晓的，或者来自组群的匿名受试者)是否在过去、在诊断之时或在未来罹患或可能罹患或比平均或比较受试者(其优选地具有相似的症状)更可能罹患某种疾病或病症之中有帮助的信息；发现疾病如何正在进展或在未来可能如何进展；或者评价患者通常对于某一治疗(例如，施用免疫抑制药物)的应答性；或者发现样品是否来自这样的患者。此类信息可以用于临床诊断，但是也可以为了一般性研究目的(例如为了测定在患者组群中或在群体中罹患所述疾病的受试者的比例)而通过实验和/或研究实验室来获得。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的过程，包括监测一名或多名患者对于施用药物或候选药物的应答，例如以便测定其效力。为此类目的将MN-相关的自身抗体用于测定法在本领域中已作了描述，例如在Fervenza FC等人,Rituximab or Cyclosporine in the Treatmentof Membranous Nephropathy.N Engl J Med.2019Jul 4,381(1):36-46中。虽然可以将结果分配至特定患者以用于临床诊断应用并且可以将结果传送给治疗所述患者的医生或医疗机构，但是对于其他应用，例如在用于研究目的的诊断(其中将结果分配至来自匿名患者的样品可能就足够了)中，情况就不一定如此。在另一个优选的实施方案中，检测到针对SEQID NO:1(其任选地与SEQ ID NO:2一起共表达或与之相复合)的自身抗体被认为暗示了MN的确诊，因为存在所述自身抗体。在一个优选的实施方案中，所述方法可以有助于MN的诊断，或者用于鉴定相比于平均受试者而言具有增加的在目前或未来罹患MN的风险的个体。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和试剂用于测定肾移植是否可能是成功的。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和试剂用于测定来自受试者的肾是否可以成功地移植到需要此类移植物的受者中。供者和受者均可以进行测试。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和产品可以用于相互作用研究，包括确定药物候选物或其他化合物是否可以干扰自身抗体与SEQ ID NO:1的结合或者可以影响任何下游过程或其与其靶标的结合的强度。在一个优选的实施方案中，它们可以用于监测免疫应答，更优选地针对SEQ ID NO:1的抗体的出现和/或滴度，在施用包含SEQ ID NO:1或其免疫原性变体的免疫原性组合物(例如施用给哺乳动物，其可以是除了人以外的其他哺乳动物，例如实验室动物)之后。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和产品可以用于测定针对具有SEQ ID NO:1的多肽(其优选地与具有SEQ ID NO:2的多肽相复合)的抗体的浓度。在一个更优选的实施方案中，所述抗体为来自MN患者的自身抗体。在另一个优选的实施方案中，所述抗体为重组抗体，所述重组抗体与具有SEQ ID NO:1的多肽，任选地与包含有包含SEQ IDNO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物相结合，但是被与人IgG类抗体，优选地IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型特异性地结合的二抗所识别。在一个更优选的实施方案中，需要测定这样的浓度以为了研究的目的，为了制备可以或可以不用于诊断MN的试剂、动物模型或装置，或者为了监测所述试剂、动物模型或装置的质量。

在许多情况下，仅检测自身抗体(换言之，测定在样品中是否存在可检测水平的抗体)对于诊断来说就足够了。如果可以检测到自身抗体，这将会是对于临床医师的诊断来说有帮助的信息并且指示了患者罹患疾病的可能性增加。

本领域技术人员将会意识到，临床医师通常不会仅仅基于单个诊断参数就得出患者是否疾患或可能疾患疾病、病况或病症的结论，而是需要考虑其他方面，例如其他自身抗体的存在、标志物、血液参数、患者症状的临床评估或者医学成像或其他非侵入性方法例如多导睡眠描记法的结果，以达到结论性诊断。参见Baenkler H.W.(2012),General aspectsof autoimmune diagnostics,in Renz,H.,Autoimmune diagnostics,2012,de Gruyter,第3页。诊断试剂或方法的价值可以还在于排除一种疾病的可能性，从而允许间接诊断另一种疾病。在一个优选的实施方案中，在本申请各处所提及的任何症状或疾病的含义与在本申请的申请日或优选地最早优先权日之时本领域技术人员的理解相一致，如由教科书和科学出版物所证明的。应当提及的是，如果单独采取，本发明的方法或用途或产品不能用于达到确定的、最终的诊断。

在一个优选的实施方案中，术语“诊断”也可以是指用于为患者选择最具希望的治疗方案的方法或试剂。换言之，所述方法或试剂可以涉及为受试者选择治疗方案。例如，检测到自身抗体可以表明，要选择免疫抑制疗法，其可以包括向所述患者施用一种或多种免疫抑制药物。合适的免疫抑制药物公开在US10107810 BB的第[0091]段中。

在一个优选的实施方案中，可以将证明了自身抗体的存在或不存在的任何信息或数据传送给所述患者或治疗所述患者的医生，优选地通过电话、通过传真，以书面形式或经由因特网，例如以电子邮件或短信。

在一个优选的实施方案中，如果基于至少一种方法的测定法产生阳性结果，则认为自身抗体存在于样品中，如果检查来自健康的平常人例如血液捐献者的样品，所述方法通常将会产生阴性结果。本领域技术人员知道，不同的方法偶尔产生不同的结果。更优选地，在这样的情况下，如果至少一种方法产生阳性结果，则认为存在自身抗体，即使至少一种其他方法可能给出阴性结果。在最优选的实施方案中，免疫荧光(其优选地如在实施例中所描述的那样来进行)被认为是最可靠的方法，并且在其他方面出现非结论性结果的情况下用于测定自身抗体是否存在。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“自身抗体”是指与产生所述自身抗体的动物，优选地哺乳动物，更优选地人的内源性分子特异性地结合的抗体，其中更优选地，此类抗体的水平相比于平均健康受试者而言是升高的。所述自身抗体可以具有来自制造它的动物，优选地人的抗体恒定区的序列，但是可变区能够与所述动物的内源性分子，更特别地SEQ ID NO:1或MN-相关的自身抗原特异性地结合。在一个优选的实施方案中，所述自身抗体分离和/或纯化自来自动物，优选地人的样品，优选地组织、血清、血浆、血液或CSF。所述自身抗体为来自动物的多克隆的、天然的抗体，而不是合成的或重组的抗体。所述自身抗体可以是包含防腐剂例如叠氮化合物或蛋白酶抑制剂的组合物的一部分。所述自身抗体可以在经稀释的血液样品中，所述血液样品优选地通过使用水性缓冲液来进行稀释。所述自身抗体可以充当阳性对照以开发诊断试剂盒或试剂或者确认诊断试剂盒的质量，或者可以作为阳性对照或作为试剂而被包括在所述试剂盒中，例如作为与待检测的自身抗体相竞争的配体。它可以用可检测的标记物进行标记。

根据本发明的方法优选地为体外方法。

在一个优选的实施方案中，可检测的标记物可以选自包括下列各项的组：具有酶促活性的、化学发光的、发荧光的和放射性的标记物。各种各样的标记物是商购可得的并且是在本领域中已知的，例如在The Immunoassay Handbook,第3版,David Wild(编者),Elsevier,2005中。

根据本发明，提供了试剂盒，其包含所述细胞或所述承载体，并且进一步包含从包括下列各项的组中选择的一种或多种，优选地所有试剂：二抗，其优选地用可检测的标记物进行标记；洗涤溶液；阳性对照；阴性对照；去污剂；盖玻片；封固介质；和生理盐溶液，优选地PBS，或制备它所需要的盐。在一个优选的实施方案中，所述阳性对照为经稀释的来自罹患MN的患者的样品，优选地血清或CSF，或者针对包含SEQ ID NO:1的多肽和/或包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2的多肽的复合物的单克隆抗体。所述阴性对照可以为经稀释的来自健康受试者，例如血液捐献者的样品，优选地血液样品例如血清或血浆样品。所述试剂盒可以包含关于如何进行该测定法和如何使用本发明的教导来诊断MN的说明书。优选地，所述二抗为针对IgG类抗体，优选地人IgG类抗体的二抗。根据本发明，所述试剂盒可以用于检测在血液样品，优选地哺乳动物，更优选地人血液样品中针对SEQ ID NO:1的抗体的存在或不存在。所述血液样品可以包含代表性的抗体套组。所述血液样品可以选自包括下列各项的组：全血、血清、血浆和毛细管血。所述试剂盒可以包含识别人IgG类抗体的二抗和包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽，其中所述多肽优选地是经标记的。所述试剂盒可以包含根据本发明的承载体和包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽，其中所述多肽优选地是经标记的。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了所述细胞、多肽、承载体在制备用于诊断疾病的试剂盒或组合物中的用途。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以旨在非诊断性用途，即测定与具有SEQ ID NO:1的多肽，优选地包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ IDNO:2的多肽的复合物相结合的自身抗体的存在，以用于除了诊断患者以外的其他用途。例如，所述方法或用途可以是用于在体外测试被设计成用于从患者血液中去除自身抗体的医学装置的功效，其中所述测试在除了患者血液以外的其他液体上进行。在对患者使用所述医学装置后，可以通过下述方式来检查其去除自身抗体的能力：使包含针对具有SEQ IDNO:1的多肽的抗体的溶液走样经过该装置，随后使用根据本发明的方法来确认在已经通过了该装置的溶液中有很少抗体或没有抗体，即显示该装置仍然具有从该溶液中去除抗体的能力。

在另一个优选的实施方案中，所述方法可以是用于确认诊断测定法的可靠性，并且可以涉及检测在溶液中的针对具有SEQ ID NO:1的多肽的抗体，所述溶液并非是来自需要诊断的患者的样品，但是已知包含针对具有SEQ ID NO:1的多肽的抗体，优选地以已知的浓度。例如，它可以是重组抗体或者来自其身份无法追溯的匿名患者的在稀释缓冲液例如PBS中进行稀释的样品。备选地，所述溶液可以是不包含所述抗体的阴性对照以用于检查背景。这样的方法可以与诊断方法相平行地、在其之后或在其之前运行。在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以旨在产生自身抗体谱，优选地用于在哺乳动物，优选地人中检测疾病。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以用于鉴定处于罹患或发展出疾病和/或肿瘤的风险中的受试者。

在一个优选的实施方案中，所述方法可以用于检测在并非是来自待诊断的哺乳动物的样品的溶液中的抗体，优选地自身抗体，或者是为了提供诊断的目的，特别地不是诊断MN。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了仪器，其用于分析来自患者的样品以检测针对具有SEQ ID NO:1的多肽的自身抗体，从而指示疾病或发展出疾病的可能性增加，所述仪器包含：

a.承载体，其包含用于在当所述样品与所述承载体相接触时从所述样品中捕获自身抗体的工具，其中所述工具为细胞并且所述承载体为根据本发明的承载体；

b.可检测的工具，其在当所述可检测的工具与所述承载体相接触时能够与由所述承载体所捕获的抗体相结合，其中所述可检测的工具优选地为能够与被捕获在所述承载体上的自身抗体相结合的经标记的二抗；

c.任选地，用于从所述承载体和所述可检测的工具上去除任何样品(优选地通过洗涤)的工具；

d.用于检测所述可检测的工具的存在和将结果转换为电信号的检测装置，例如连接有软件的荧光阅读器或荧光显微镜，所述软件能够识别在由荧光阅读器或照相机所摄取的细胞图像中经染色的过表达包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽的细胞的特征性图式，和

任选地，这样的工具，其用于接受来自所述检测装置的电信号并且确定该信号的水平是否指示具有或发展出疾病的可能性增加，通过与野生型或未染色的细胞的特征性图式(优选地，通过在相同承载体上的未被与具有SEQ ID NO:1或其变体的多肽特异性地结合的自身抗体阳性染色的经模拟转染的细胞)或者用来自健康受试者的样品获得的输入参考值进行比较，或者通过将用一个样品获得的信号水平与用在后来的时间点(优选地，至少一个月后)获得的第二个样品获得的信号水平进行比较。

根据本发明，提供了用于从MN患者的血液，优选地血清中去除针对具有SEQ IDNO:1的多肽，优选地包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物的自身抗体的装置，其中所述装置包含承载体，其包被有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽，优选地，包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物，作为用于从MN患者的血液，优选地血清中去除针对具有SEQ ID NO:1的多肽，优选地包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物的自身抗体的离体方法。可以使用包被有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽的装置，或者包被有捕获所有IgG类抗体(其中包括针对具有SEQ ID NO:1的多肽的IgG类自身抗体)的二抗或蛋白质的装置。合适的方法描述在Eisei Noiri和Noria Hanafusa,The Concise Manual of Apharesis Therapy,Springer Tokyo,2014；Hamilton,P.,Kanigicherla,D.,Hanumapura,P.,Walz,L.,Kramer,D.,Fischer,M.,Brenchley,P.,和Mitra,S.(2018)J.Clin.Aph.33(3),283-290中。另一种方法公开在EP3477300中。

序列：

本发明包括一系列新的多肽，更特别地：

SEQ ID NO:1[外生骨疣蛋白2]

MCASVKYNIRGPALIPRMKTKHRIYYITLFSIVLLGLIATGMFQFWPHSIESSNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCFDVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISDSDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNHLLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPVYSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGESVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGARLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMSDVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPYAAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESLFRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAENKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVGYPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTYKMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPECTAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDDFPEKLKSFPNIGSL

SEQ ID NO: 2 [外生骨疣蛋白1]

MQAKKRYFILLSAGSCLALLFYFGGLQFRASRSHSRREEHSGRNGLHHPSPDHFWPRFPDALRPFVPWDQLENEDSSVHISPRQKRDANSSIYKGKKCRMESCFDFTLCKKNGFKVYVYPQQKGEKIAESYQNILAAIEGSRFYTSDPSQACLFVLSLDTLDRDQLSPQYVHNLRSKVQSLHLWNNGRNHLIFNLYSGTWPDYTEDVGFDIGQAMLAKASISTENFRPNFDVSIPLFSKDHPRTGGERGFLKFNTIPPLRKYMLVFKGKRYLTGIGSDTRNALYHVHNGEDVVLLTTCKHGKDWQKHKDSRCDRDNTEYEKYDYREMLHNATFCLVPRGRRLGSFRFLEALQAACVPVMLSNGWELPFSEVINWNQAAVIGDERLLLQIPSTIRSIHQDKILALRQQTQFLWEAYFSSVEKIVLTTLEIIQDRIFKHISRNSLIWNKHPGGLFVLPQYSSYLGDFPYYYANLGLKPPSKFTAVIHAVTPLVSQSQPVLKLLVAAAKSQYCAQIIVLWNCDKPLPAKHRWPATAVPVVVIEGESKVMSSRFLPYDNIITDAVLSLDEDTVLSTTEVDFAFTVWQSFPERIVGYPARSHFWDNSKERWGYTSKWTNDYSMVLTGAAIYHKYYHYLYSHYLPASLKNMVDQLANCEDILMNFLVSAVTKLPPIKVTQKKQYKETMMGQTSRASRWADPDHFAQRQSCMNTFASWFGYMPLIHSQMRLDPVLFKDQVSILRKKYRDIERL

SEQ ID NO: 3 [MN-相关的自身抗原PLA2R]

MLLSPSLLLLLLLGAPRGCAEGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEKDAWKYYATHCEPGWNPYNRNCYKLQKEEKTWHEALRSCQADNSALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSNDSSVIFTNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGHVLSDAESGCQEGWERHGGFCYKIDTVLRSFDQASSGYYCPPALVTITNRFEQAFITSLISSVVKMKDSYFWIALQDQNDTGEYTWKPVGQKPEPVQYTHWNTHQPRYSGGCVAMRGRHPLGRWEVKHCRHFKAMSLCKQPVENQEKAEYEERWPFHPCYLDWESEPGLASCFKVFHSEKVLMKRTWREAEAFCEEFGAHLASFAHIEEENFVNELLHSKFNWTEERQFWIGFNKRNPLNAGSWEWSDRTPVVSSFLDNTYFGEDARNCAVYKANKTLLPLHCGSKREWICKIPRDVKPKIPFWYQYDVPWLFYQDAEYLFHTFASEWLNFEFVCSWLHSDLLTIHSAHEQEFIHSKIKALSKYGASWWIGLQEERANDEFRWRDGTPVIYQNWDTGRERTVNNQSQRCGFISSITGLWGSEECSVSMPSICKRKKVWLIEKKKDTPKQHGTCPKGWLYFNYKCLLLNIPKDPSSWKNWTHAQHFCAEEGGTLVAIESEVEQAFITMNLFGQTTSVWIGLQNDDYETWLNGKPVVYSNWSPFDIINIPSHNTTEVQKHIPLCALLSSNPNFHFTGKWYFEDCGKEGYGFVCEKMQDTSGHGVNTSDMYPMPNTLEYGNRTYKIINANMTWYAAIKTCLMHKAQLVSITDQYHQSFLTVVLNRLGYAHWIGLFTTDNGLNFDWSDGTKSSFTFWKDEESSLLGDCVFADSNGRWHSTACESFLQGAICHVPPETRQSEHPELCSETSIPWIKFKSNCYSFSTVLDSMSFEAAHEFCKKEGSNLLTIKDEAENAFLLEELFAFGSSVQMVWLNAQFDGNNETIKWFDGTPTDQSNWGIRKPDTDYFKPHHCVALRIPEGLWQLSPCQEKKGFICKMEADIHTAEALPEKGPSHSIIPLAVVLTLIVIVAICTLSFCIYKHNGGFFRRLAGFRNPYYPATNFSTVYLEENILISDLEKSDQ

SEQ ID NO: 4 [MN-相关的自身抗原THSD7A]

MGLQARRWASGSRGAAGPRRGVLQLLPLPLPLPLLLLLLLRPGAGRAAAQGEAEAPTLYLWKTGPWGRCMGDECGPGGIQTRAVWCAHVEGWTTLHTNCKQAERPNNQQNCFKVCDWHKELYDWRLGPWNQCQPVISKSLEKPLECIKGEEGIQVREIACIQKDKDIPAEDIICEYFEPKPLLEQACLIPCQQDCIVSEFSAWSECSKTCGSGLQHRTRHVVAPPQFGGSGCPNLTEFQVCQSSPCEAEELRYSLHVGPWSTCSMPHSRQVRQARRRGKNKEREKDRSKGVKDPEARELIKKKRNRNRQNRQENKYWDIQIGYQTREVMCINKTGKAADLSFCQQEKLPMTFQSCVITKECQVSEWSEWSPCSKTCHDMVSPAGTRVRTRTIRQFPIGSEKECPEFEEKEPCLSQGDGVVPCATYGWRTTEWTECRVDPLLSQQDKRRGNQTALCGGGIQTREVYCVQANENLLSQLSTHKNKEASKPMDLKLCTGPIPNTTQLCHIPCPTECEVSPWSAWGPCTYENCNDQQGKKGFKLRKRRITNEPTGGSGVTGNCPHLLEAIPCEEPACYDWKAVRLGNCEPDNGKECGPGTQVQEVVCINSDGEEVDRQLCRDAIFPIPVACDAPCPKDCVLSTWSTWSSCSHTCSGKTTEGKQIRARSILAYAGEEGGIRCPNSSALQEVRSCNEHPCTVYHWQTGPWGQCIEDTSVSSFNTTTTWNGEASCSVGMQTRKVICVRVNVGQVGPKKCPESLRPETVRPCLLPCKKDCIVTPYSDWTSCPSSCKEGDSSIRKQSRHRVIIQLPANGGRDCTDPLYEEKACEAPQACQSYRWKTHKWRRCQLVPWSVQQDSPGAQEGCGPGRQARAITCRKQDGGQAGIHECLQYAGPVPALTQACQIPCQDDCQLTSWSKFSSCNGDCGAVRTRKRTLVGKSKKKEKCKNSHLYPLIETQYCPCDKYNAQPVGNWSDCILPEGKVEVLLGMKVQGDIKECGQGYRYQAMACYDQNGRLVETSRCNSHGYIEEACIIPCPSDCKLSEWSNWSRCSKSCGSGVKVRSKWLREKPYNGGRPCPKLDHVNQAQVYEVVPCHSDCNQYLWVTEPWSICKVTFVNMRENCGEGVQTRKVRCMQNTADGPSEHVEDYLCDPEEMPLGSRVCKLPCPEDCVISEWGPWTQCVLPCNQSSFRQRSADPIRQPADEGRSCPNAVEKEPCNLNKNCYHYDYNVTDWSTCQLSEKAVCGNGIKTRMLDCVRSDGKSVDLKYCEALGLEKNWQMNTSCMVECPVNCQLSDWSPWSECSQTCGLTGKMIRRRTVTQPFQGDGRPCPSLMDQSKPCPVKPCYRWQYGQWSPCQVQEAQCGEGTRTRNISCVVSDGSADDFSKVVDEEFCADIELIIDGNKNMVLEESCSQPCPGDCYLKDWSSWSLCQLTCVNGEDLGFGGIQVRSRPVIIQELENQHLCPEQMLETKSCYDGQCYEYKWMASAWKGSSRTVWCQRSDGINVTGGCLVMSQPDADRSCNPPCSQPHSYCSETKTCHCEEGYTEVMSSNSTLEQCTLIPVVVLPTMEDKRGDVKTSRAVHPTQPSSNPAGRGRTWFLQPFGPDGRLKTWVYGVAAGAFVLLIFIVSMIYLACKKPKKPQRRQNNRLKPLTLAYDGDADM

SEQ ID NO: 5 [MN-相关的自身抗原NELL-1]

MPMDLILVVWFCVCTARTVVGFGMDPDLQMDIVTELDLVNTTLGVAQVSGMHNASKAFLFQDIEREIHAAPHVSEKLIQLFRNKSEFTILATVQQKPSTSGVILSIRELEHSYFELESSGLRDEIRYHYIHNGKPRTEALPYRMADGQWHKVALSVSASHLLLHVDCNRIYERVIDPPDTNLPPGINLWLGQRNQKHGLFKGIIQDGKIIFMPNGYITQCPNLNHTCPTCSDFLSLVQGIMDLQELLAKMTAKLNYAETRLSQLENCHCEKTCQVSGLLYRDQDSWVDGDHCRNCTCKSGAVECRRMSCPPLNCSPDSLPVHIAGQCCKVCRPKCIYGGKVLAEGQRILTKSCRECRGGVLVKITEMCPPLNCSEKDHILPENQCCRVCRGHNFCAEGPKCGENSECKNWNTKATCECKSGYISVQGDSAYCEDIDECAAKMHYCHANTVCVNLPGLYRCDCVPGYIRVDDFSCTEHDECGSGQHNCDENAICTNTVQGHSCTCKPGYVGNGTICRAFCEEGCRYGGTCVAPNKCVCPSGFTGSHCEKDIDECSEGIIECHNHSRCVNLPGWYHCECRSGFHDDGTYSLSGESCIDIDECALRTHTCWNDSACINLAGGFDCLCPSGPSCSGDCPHEGGLKHNGQVWTLKEDRCSVCSCKDGKIFCRRTACDCQNPSADLFCCPECDTRVTSQCLDQNGHKLYRSGDNWTHSCQQCRCLEGEVDCWPLTCPNLSCEYTAILEGECCPRCVSDPCLADNITYDIRKTCLDSYGVSRLSGSVWTMAGSPCTTCKCKNGRVCCSVDFECLQNN

SEQ ID NO: 6 [MN-相关的自身抗原脑信号蛋白3B]

MGRAGAAAVIPGLALLWAVGLGSAAPSPPRLRLSFQELQAWHGLQTFSLERTCCYQALLVDEERGRLFVGAENHVASLNLDNISKRAKKLAWPAPVEWREECNWAGKDIGTECMNFVKLLHAYNRTHLLACGTGAFHPTCAFVEVGHRAEEPVLRLDPGRIEDGKGKSPYDPRHRAASVLVGEELYSGVAADLMGRDFTIFRSLGQRPSLRTEPHDSRWLNEPKFVKVFWIPESENPDDDKIYFFFRETAVEAAPALGRLSVSRVGQICRNDVGGQRSLVNKWTTFLKARLVCSVPGVEGDTHFDQLQDVFLLSSRDHRTPLLYAVFSTSSIFQGSAVCVYSMNDVRRAFLGPFAHKEGPMHQWVSYQGRVPYPRPGMCPSKTFGTFSSTKDFPDDVIQFARNHPLMYNSVLPTGGRPLFLQVGANYTFTQIAADRVAAADGHYDVLFIGTDVGTVLKVISVPKGSRPSAEGLLLEELHVFEDSAAVTSMQISSKRHQLYVASRSAVAQIALHRCAAHGRVCTECCLARDPYCAWDGVACTRFQPSAKRRFRRQDVRNGDPSTLCSGDSSRPALLEHKVFGVEGSSAFLECEPRSLQARVEWTFQRAGVTAHTQVLAEERTERTARGLLLRRLRRRDSGVYLCAAVEQGFTQPLRRLSLHVLSATQAERLARAEEAAPAAPPGPKLWYRDFLQLVEPGGGGSANSLRMCRPQPALQSLPLESRRKGRNRRTHAPEPRAERGPRSATHW

SEQ ID NO:7[具有C-末端His标签的外生骨疣蛋白2]

MCASVKYNIRGPALIPRMKTKHRIYYITLFSIVLLGLIATGMFQFWPHSIESSNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCFDVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISDSDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNHLLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPVYSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGESVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGARLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMSDVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPYAAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESLFRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAENKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVGYPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTYKMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPECTAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDDFPEKLKSFPNIGSLLEHHHHHHHH

SEQ ID NO:8[具有C-末端His标签的外生骨疣蛋白1]

MQAKKRYFILLSAGSCLALLFYFGGLQFRASRSHSRREEHSGRNGLHHPSPDHFWPRFPDALRPFVPWDQLENEDSSVHISPRQKRDANSSIYKGKKCRMESCFDFTLCKKNGFKVYVYPQQKGEKIAESYQNILAAIEGSRFYTSDPSQACLFVLSLDTLDRDQLSPQYVHNLRSKVQSLHLWNNGRNHLIFNLYSGTWPDYTEDVGFDIGQAMLAKASISTENFRPNFDVSIPLFSKDHPRTGGERGFLKFNTIPPLRKYMLVFKGKRYLTGIGSDTRNALYHVHNGEDVVLLTTCKHGKDWQKHKDSRCDRDNTEYEKYDYREMLHNATFCLVPRGRRLGSFRFLEALQAACVPVMLSNGWELPFSEVINWNQAAVIGDERLLLQIPSTIRSIHQDKILALRQQTQFLWEAYFSSVEKIVLTTLEIIQDRIFKHISRNSLIWNKHPGGLFVLPQYSSYLGDFPYYYANLGLKPPSKFTAVIHAVTPLVSQSQPVLKLLVAAAKSQYCAQIIVLWNCDKPLPAKHRWPATAVPVVVIEGESKVMSSRFLPYDNIITDAVLSLDEDTVLSTTEVDFAFTVWQSFPERIVGYPARSHFWDNSKERWGYTSKWTNDYSMVLTGAAIYHKYYHYLYSHYLPASLKNMVDQLANCEDILMNFLVSAVTKLPPIKVTQKKQYKETMMGQTSRASRWADPDHFAQRQSCMNTFASWFGYMPLIHSQMRLDPVLFKDQVSILRKKYRDIERLLEHHHHHHHH

SEQ ID NO:9[具有C-末端His标签的外生骨疣蛋白2片段]

SNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCFDVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISDSDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNHLLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPVYSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGESVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGARLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMSDVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPYAAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESLFRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAENKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVGYPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTYKMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPECTAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDDFPEKLKSFPNIGSLHHHHHH

SEQ ID NO:10[外生骨疣蛋白2片段]

SNDWNVEKRSIRDVPVVRLPADSPIPERGDLSCRMHTCFDVYRCGFNPKNKIKVYIYALKKYVDDFGVSVSNTISREYNELLMAISDSDYYTDDINRACLFVPSIDVLNQNTLRIKETAQAMAQLSRWDRGTNHLLFNMLPGGPPDYNTALDVPRDRALLAGGGFSTWTYRQGYDVSIPVYSPLSAEVDLPEKGPGPRQYFLLSSQVGLHPEYREDLEALQVKHGESVLVLDKCTNLSEGVLSVRKRCHKHQVFDYPQVLQEATFCVVLRGARLGQAVLSDVLQAGCVPVVIADSYILPFSEVLDWKRASVVVPEEKMSDVYSILQSIPQRQIEEMQRQARWFWEAYFQSIKAIALATLQIINDRIYPYAAISYEEWNDPPAVKWGSVSNPLFLPLIPPQSQGFTAIVLTYDRVESLFRVITEVSKVPSLSKLLVVWNNQNKNPPEDSLWPKIRVPLKVVRTAENKLSNRFFPYDEIETEAVLAIDDDIIMLTSDELQFGYEVWREFPDRLVGYPGRLHLWDHEMNKWKYESEWTNEVSMVLTGAAFYHKYFNYLYTYKMPGDIKNWVDAHMNCEDIAMNFLVANVTGKAVIKVTPRKKFKCPECTAIDGLSLDQTHMVERSECINKFASVFGTMPLKVVEHRADPVLYKDDFPEKLKSFPNIGSL

本发明通过下面的非限制性实施例来进一步举例说明，从这些实施例中可以得到本发明的进一步特征、实施方案、方面和优点。

图1至4显示了通过使用免疫荧光测定法来检测循环自身抗体，如在实施例中所描述的。

图5显示了通过使用基于细胞的测定法(CBA)的免疫荧光(如在实施例1中的)所获得的结果和通过使用经纯化的EXT2重组片段的ELISA(如在实施例2中的)所获得的结果的相关性。显示了荧光强度(FI)和以nm(nm)的吸收(通过ELISA所检测的)。这两个实验均使用下列样品来进行：两个包含针对EXT2的自身抗体(如通过CBA所检测到的)的血清样品，其分别产生1.5和3的FI；13个来自健康血液捐献者的样品；和抗-His标签。

显示了不表达外生骨疣蛋白的经模拟感染的细胞(图1)、表达EXT1的细胞(图2)、表达EXT2的细胞(图3)和表达EXT2和ETX1的细胞(图4)。使用白色箭头标记经免疫染色的细胞。

实施例1：

HEK 293细胞

使用包含经固定的用没有插入片段的空pTriEx-1载体(图1)、表达具有和没有His标签的EXT1(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8)的pTriEx-1载体(图2)、表达具有和没有His标签的EXT2(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7)的pTriEx-1载体(图3)或者表达EXT1的pTriEx-1载体和表达EXT2的pTriEx-1载体两者(各自具有和没有His标签)(图4)进行瞬时转染的HEK 293细胞的比较载玻片，分析了296份来自被怀疑罹患MN的患者的样品。通过使用来自EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG的抗-PLA2R和抗-THDSD7A IFT(IgG，产品FA 1254-1001，EUROIMMUN，用于检测针对PLA2R和THSD7A的抗体两者)，先前已显示在这些样品中的185份中不存在针对PLA2R和THSD7A的抗体。显示在300份来自健康血液捐献者的血清中不存在针对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的抗体。

使细胞在包含10％经热灭活的胎牛血清和1％抗生素-抗霉菌剂(Invitrogen#15240)的DMEM培养基中在37℃和5％CO₂下进行生长。对于瞬时转染，使用ExGen500实验方案(目录号12783652，Thermo Fisher)。通过下述方式来制备经固定的细胞：通过在PBS中洗涤所述细胞并随后在100％丙酮中短暂温育来使在显微术载玻片上生长的细胞与丙酮相接触。

方法和试剂

所使用的方法和试剂按照在IIFT Neurology Mosaics中的制造商的说明书(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG，产品编号FA112d-1)。该测试系统围绕底物与经稀释的患者样品的组合的温育。如果反应是阳性的，那么IgA、IgG和IgM类型的特异性抗体附着至抗原。在第二个步骤中，用经FITC标记的抗人抗体对所附着的抗体进行染色并且用荧光显微镜使其可见。

简而言之，将人血清样品在PBS-Tween中进行稀释，随后涡旋振荡2秒钟。通过使用TITERPLANE技术将30μl样品/区域温育30分钟，随后在PBS-Tween中洗涤1秒钟，随后在比色皿中在PBS-Tween中温育5分钟以进行彻底洗涤。然后，施加25μl的二抗缀合物并且通过使用TITERPLANE技术温育30分钟，随后在PBS-Tween中洗涤1秒钟，随后在比色皿中在PBS-Tween中温育5分钟以进行彻底洗涤。

在温育之后，用直至10μl/区域的封固介质和盖玻片覆盖具有所述区域的承载体，随后通过使用EUROSTAR显微镜(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,Lübeck)进行荧光显微术分析。

结果：

分别显示表达EXT2和EXT1/EXT2的细胞的图3和4显示了清晰的荧光信号，如果细胞不表达外生骨疣蛋白或仅表达EXT1，则荧光信号不存在(图1和2)。

针对SEQ ID NO:1的抗体可以在185份来自PLA2R-和THSD7A-阴性的患者的样品中的1份之中被检测到，但是在111份来自PLA2R-和THSD7A-阳性的患者的样品中均未被检测到。在300份来自健康血液捐献者的样品中的任一份之中都未检测到所述自身抗体。

因此，可以得出结论：针对EXT2的自身抗体和针对包含EXT2/EXT1的复合物的自身抗体与MN相关联。有趣的是，此类自身抗体不仅可以在组织学样品中被检测，如由WO20037135的发明人所暗示的，而且还在一些患者中作为血清中的循环自身抗体而出现并且可以通过使用血清学测定法来检测，这与WO20037135的公开内容相反。应当提及的是，WO20037135的发明人使用的是天然印迹法，其通常是一种非常灵敏的方法，绝不是因为所使用的抗原的结构不受暴露于严苛的非生理学条件的影响。

由于它们在来自其中不存在针对PLA2R和THSD7A的自身抗体的患者的样品中出现，因而它们可以用于增加血清学调查的总体灵敏度。因此，增加了在不存在来自肾活组织检查分析的结果(其仅可以通过使用侵入性外科手术来获得)的情况下可以被诊断的患者的数目。

在第二轮中，使用更大的血清组群(包括2147份来自罹患MN或者因为不同的临床症状而被怀疑罹患MN的患者的样品)来重复实验1。在这些样品中，发现两份样品包含针对SEQ ID NO:1的自身抗体。

实施例2：

为了在微量滴定ELISA中使用，将经纯化的蛋白质在PBS中稀释至大约0.2μg/ml的最终浓度(人外生骨疣蛋白1/2异二聚体蛋白，具有C-末端2-His和HA标签的Arg29-Leu746(EXT1)和具有C-末端6-His标签的Ser53-Leu718(SEQ ID NO:9，R&D systems，产品编号8567-GT-020))并且用于过夜包被ELISA微量滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)。通过使用标准方法，将平板与各自100μl的蛋白质一起进行温育(在室温下2小时)，充分进行洗涤，并且使用在PBS中的0.1％(w/v)酪蛋白来进行封闭。

将样品在IgG样品缓冲液中进行1:101稀释，施加至微量滴定板，并且进行温育，如对于商业EUROIMMUN ELISA测试试剂盒所描述的那样，其中使用商购可得的试剂(例如，EI2260-9601G/A)。遵循EI 2260-9601G/A的手册。抗-his抗体(Merck Chemicals；70796-3)充当阳性对照。简而言之：在37℃下60分钟；使用200μl的洗涤缓冲液进行3个洗涤步骤；每个孔添加100μl的标记有过氧化物酶的抗人IgG缀合物(兔)或抗小鼠IgG(H+L)-POD(JacksonResearch；115-035-062)；在37℃下温育30分钟；使用EUROIMMUN洗涤液进行3个洗涤步骤；每个孔添加100μl的色原/底物溶液(TMB/H₂O₂)；在室温下温育30分钟；添加100μl的终止溶液(0.5M硫酸)；测量在450nm处的光密度，针对作为参考的620nm。低于0.065的结果被认为是阴性的，而大于0.066的结果被认为是阳性的。

图5显示了用13份来自健康血液捐献者的样品和两份通过IFT被鉴定为包含针对EXT2的自身抗体的样品的结果(如在实施例2中)，相比于通过使用IFT而获得的结果而言。

清楚的是，所述两份阳性样品可以容易地与来自健康受试者的样品区分开来，这证明基于SEQ ID NO:1的片段的ELISA可以用于实施根据本发明的方法，作为在实施例1中所描述的IFT的备选方案。

序列表

<110> 欧蒙医学实验诊断股份公司

<120> 用于诊断膜性肾病的方法和试剂

<130> 20PP162EP

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 718

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Cys Ala Ser Val Lys Tyr Asn Ile Arg Gly Pro Ala Leu Ile Pro

1 5 10 15

Arg Met Lys Thr Lys His Arg Ile Tyr Tyr Ile Thr Leu Phe Ser Ile

20 25 30

Val Leu Leu Gly Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Gln Phe Trp Pro His

35 40 45

Ser Ile Glu Ser Ser Asn Asp Trp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Arg

50 55 60

Asp Val Pro Val Val Arg Leu Pro Ala Asp Ser Pro Ile Pro Glu Arg

65 70 75 80

Gly Asp Leu Ser Cys Arg Met His Thr Cys Phe Asp Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Gly Phe Asn Pro Lys Asn Lys Ile Lys Val Tyr Ile Tyr Ala Leu Lys

100 105 110

Lys Tyr Val Asp Asp Phe Gly Val Ser Val Ser Asn Thr Ile Ser Arg

115 120 125

Glu Tyr Asn Glu Leu Leu Met Ala Ile Ser Asp Ser Asp Tyr Tyr Thr

130 135 140

Asp Asp Ile Asn Arg Ala Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Asp Val Leu

145 150 155 160

Asn Gln Asn Thr Leu Arg Ile Lys Glu Thr Ala Gln Ala Met Ala Gln

165 170 175

Leu Ser Arg Trp Asp Arg Gly Thr Asn His Leu Leu Phe Asn Met Leu

180 185 190

Pro Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Asn Thr Ala Leu Asp Val Pro Arg Asp

195 200 205

Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Thr Trp Thr Tyr Arg Gln

210 215 220

Gly Tyr Asp Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Asp Leu Pro Glu Lys Gly Pro Gly Pro Arg Gln Tyr Phe Leu Leu Ser

245 250 255

Ser Gln Val Gly Leu His Pro Glu Tyr Arg Glu Asp Leu Glu Ala Leu

260 265 270

Gln Val Lys His Gly Glu Ser Val Leu Val Leu Asp Lys Cys Thr Asn

275 280 285

Leu Ser Glu Gly Val Leu Ser Val Arg Lys Arg Cys His Lys His Gln

290 295 300

Val Phe Asp Tyr Pro Gln Val Leu Gln Glu Ala Thr Phe Cys Val Val

305 310 315 320

Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gly Gln Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Gln

325 330 335

Ala Gly Cys Val Pro Val Val Ile Ala Asp Ser Tyr Ile Leu Pro Phe

340 345 350

Ser Glu Val Leu Asp Trp Lys Arg Ala Ser Val Val Val Pro Glu Glu

355 360 365

Lys Met Ser Asp Val Tyr Ser Ile Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Gln

370 375 380

Ile Glu Glu Met Gln Arg Gln Ala Arg Trp Phe Trp Glu Ala Tyr Phe

385 390 395 400

Gln Ser Ile Lys Ala Ile Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ile Ile Asn Asp

405 410 415

Arg Ile Tyr Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Tyr Glu Glu Trp Asn Asp Pro

420 425 430

Pro Ala Val Lys Trp Gly Ser Val Ser Asn Pro Leu Phe Leu Pro Leu

435 440 445

Ile Pro Pro Gln Ser Gln Gly Phe Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Asp

450 455 460

Arg Val Glu Ser Leu Phe Arg Val Ile Thr Glu Val Ser Lys Val Pro

465 470 475 480

Ser Leu Ser Lys Leu Leu Val Val Trp Asn Asn Gln Asn Lys Asn Pro

485 490 495

Pro Glu Asp Ser Leu Trp Pro Lys Ile Arg Val Pro Leu Lys Val Val

500 505 510

Arg Thr Ala Glu Asn Lys Leu Ser Asn Arg Phe Phe Pro Tyr Asp Glu

515 520 525

Ile Glu Thr Glu Ala Val Leu Ala Ile Asp Asp Asp Ile Ile Met Leu

530 535 540

Thr Ser Asp Glu Leu Gln Phe Gly Tyr Glu Val Trp Arg Glu Phe Pro

545 550 555 560

Asp Arg Leu Val Gly Tyr Pro Gly Arg Leu His Leu Trp Asp His Glu

565 570 575

Met Asn Lys Trp Lys Tyr Glu Ser Glu Trp Thr Asn Glu Val Ser Met

580 585 590

Val Leu Thr Gly Ala Ala Phe Tyr His Lys Tyr Phe Asn Tyr Leu Tyr

595 600 605

Thr Tyr Lys Met Pro Gly Asp Ile Lys Asn Trp Val Asp Ala His Met

610 615 620

Asn Cys Glu Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ala Asn Val Thr Gly

625 630 635 640

Lys Ala Val Ile Lys Val Thr Pro Arg Lys Lys Phe Lys Cys Pro Glu

645 650 655

Cys Thr Ala Ile Asp Gly Leu Ser Leu Asp Gln Thr His Met Val Glu

660 665 670

Arg Ser Glu Cys Ile Asn Lys Phe Ala Ser Val Phe Gly Thr Met Pro

675 680 685

Leu Lys Val Val Glu His Arg Ala Asp Pro Val Leu Tyr Lys Asp Asp

690 695 700

Phe Pro Glu Lys Leu Lys Ser Phe Pro Asn Ile Gly Ser Leu

705 710 715

<210> 2

<211> 746

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Gln Ala Lys Lys Arg Tyr Phe Ile Leu Leu Ser Ala Gly Ser Cys

1 5 10 15

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Arg Ala Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Asp Val Leu Asn Gln Asn Thr

100 105 110

Leu Arg Ile Lys Glu Thr Ala Gln Ala Met Ala Gln Leu Ser Arg Trp

115 120 125

Asp Arg Gly Thr Asn His Leu Leu Phe Asn Met Leu Pro Gly Gly Pro

130 135 140

Pro Asp Tyr Asn Thr Ala Leu Asp Val Pro Arg Asp Arg Ala Leu Leu

145 150 155 160

Ala Gly Gly Gly Phe Ser Thr Trp Thr Tyr Arg Gln Gly Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Pro Val Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Glu Val Asp Leu Pro Glu

180 185 190

Lys Gly Pro Gly Pro Arg Gln Tyr Phe Leu Leu Ser Ser Gln Val Gly

195 200 205

Leu His Pro Glu Tyr Arg Glu Asp Leu Glu Ala Leu Gln Val Lys His

210 215 220

Gly Glu Ser Val Leu Val Leu Asp Lys Cys Thr Asn Leu Ser Glu Gly

225 230 235 240

Val Leu Ser Val Arg Lys Arg Cys His Lys His Gln Val Phe Asp Tyr

245 250 255

Pro Gln Val Leu Gln Glu Ala Thr Phe Cys Val Val Leu Arg Gly Ala

260 265 270

Arg Leu Gly Gln Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Gln Ala Gly Cys Val

275 280 285

Pro Val Val Ile Ala Asp Ser Tyr Ile Leu Pro Phe Ser Glu Val Leu

290 295 300

Asp Trp Lys Arg Ala Ser Val Val Val Pro Glu Glu Lys Met Ser Asp

305 310 315 320

Val Tyr Ser Ile Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Gln Ile Glu Glu Met

325 330 335

Gln Arg Gln Ala Arg Trp Phe Trp Glu Ala Tyr Phe Gln Ser Ile Lys

340 345 350

Ala Ile Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ile Ile Asn Asp Arg Ile Tyr Pro

355 360 365

Tyr Ala Ala Ile Ser Tyr Glu Glu Trp Asn Asp Pro Pro Ala Val Lys

370 375 380

Trp Gly Ser Val Ser Asn Pro Leu Phe Leu Pro Leu Ile Pro Pro Gln

385 390 395 400

Ser Gln Gly Phe Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Asp Arg Val Glu Ser

405 410 415

Leu Phe Arg Val Ile Thr Glu Val Ser Lys Val Pro Ser Leu Ser Lys

420 425 430

Leu Leu Val Val Trp Asn Asn Gln Asn Lys Asn Pro Pro Glu Asp Ser

435 440 445

Leu Trp Pro Lys Ile Arg Val Pro Leu Lys Val Val Arg Thr Ala Glu

450 455 460

Asn Lys Leu Ser Asn Arg Phe Phe Pro Tyr Asp Glu Ile Glu Thr Glu

465 470 475 480

Ala Val Leu Ala Ile Asp Asp Asp Ile Ile Met Leu Thr Ser Asp Glu

485 490 495

Leu Gln Phe Gly Tyr Glu Val Trp Arg Glu Phe Pro Asp Arg Leu Val

500 505 510

Gly Tyr Pro Gly Arg Leu His Leu Trp Asp His Glu Met Asn Lys Trp

515 520 525

Lys Tyr Glu Ser Glu Trp Thr Asn Glu Val Ser Met Val Leu Thr Gly

530 535 540

Ala Ala Phe Tyr His Lys Tyr Phe Asn Tyr Leu Tyr Thr Tyr Lys Met

545 550 555 560

Pro Gly Asp Ile Lys Asn Trp Val Asp Ala His Met Asn Cys Glu Asp

565 570 575

Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ala Asn Val Thr Gly Lys Ala Val Ile

580 585 590

Lys Val Thr Pro Arg Lys Lys Phe Lys Cys Pro Glu Cys Thr Ala Ile

595 600 605

Asp Gly Leu Ser Leu Asp Gln Thr His Met Val Glu Arg Ser Glu Cys

610 615 620

Ile Asn Lys Phe Ala Ser Val Phe Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Val

625 630 635 640

Glu His Arg Ala Asp Pro Val Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Pro Glu Lys

645 650 655

Leu Lys Ser Phe Pro Asn Ile Gly Ser Leu

660 665

Claims

1.在诊断学上有用的承载体，其包被有包含SEQ ID NO:1或其变体的重组多肽，优选地，包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物，其中所述承载体选自包括下列各项的组：珠粒，优选地顺磁性珠粒；测试条；微量滴定板；膜，其优选地选自包括Western印迹、线印迹和斑点印迹的组；侧流装置；玻璃表面；显微术用载玻片；微阵列；和生物芯片，并且优选地为显微术用载玻片。

2.根据权利要求1的承载体，其中所述承载体进一步包含从包括下列各项的组中选择的一种或多种重组多肽，优选地所有多肽：包含有包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物，包含SEQ ID NO:2的多肽，包含SEQ ID NO:3的多肽，包含SEQ ID NO:4的多肽，包含SEQ ID NO:5的多肽，和包含SEQ ID NO:6或其变体的多肽。

3.根据权利要求2至3中任一项的承载体，其中任何经固定化的多肽由固定化在所述承载体上的细胞，优选地经固定的细胞来表达，或者是固定化在所述承载体上的重组或分离的多肽。

4.根据权利要求1至3中任一项的承载体，其中任何经固定化的多肽由固定化在所述承载体上的细胞来表达，并且所述承载体进一步包含经模拟转染的细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项的承载体，其中与SEQ ID NO:1特异性地结合的自身抗体与包含SEQ ID NO:1或其变体的多肽和任选地包含标记物的二抗相结合。

6.分离的，优选地可溶的自身抗体，其与具有SEQ ID NO:1的多肽，优选地与包含具有SEQ ID NO:1或其变体的多肽和具有SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物特异性地结合，所述复合物任选地结合至根据权利要求1至5中任一项的承载体。

7.试剂盒，其包含根据权利要求1至5中任一项的承载体，和一种或多种从包括下列各项的组中选择的组分：用于检测与具有SEQ ID NO:1的多肽，优选地包含具有SEQ ID NO:1或其变体的多肽和具有SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体的工具，所述工具优选地为二抗，更优选地与IgG类抗体特异性地结合的二抗，或者为包含SEQID NO:1或其变体的多肽，其中所述工具优选地包含标记物；用于捕获与具有SEQ ID NO:1的多肽或者包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体的工具；洗涤缓冲液；封固介质；稀释缓冲液；阳性对照；阴性对照；校准物，优选地包含三种或更多种校准物的套组；和包含SEQ ID NO:1或其变体的重组多肽，其任选地与包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽相复合。

8.用于诊断MN的方法，其包括检测在来自受试者的包含抗体的液体样品中与SEQ IDNO:1，优选地与包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体的存在或不存在的步骤。

9.根据权利要求8的方法，其中所述样品选自包括下列各项的组：全血、血清和血浆。

10.根据权利要求8至9中任一项的方法，其进一步包括检测从包括下列各项的组中选择的自身抗体，优选地所有自身抗体的存在或不存在：与包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体；与具有SEQ ID NO:2的多肽特异性地结合的自身抗体；与具有SEQ ID NO:3的多肽特异性地结合的自身抗体；与具有SEQ IDNO:4的多肽特异性地结合的自身抗体；与具有SEQ ID NO:5的多肽特异性地结合的自身抗体；和与具有SEQ ID NO:6的多肽特异性地结合的自身抗体。

11.与具有SEQ ID NO:1的多肽或者包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体或者根据权利要求1至5中任一项的承载体用于MN的血清学诊断或者用于制备诊断试剂盒的用途。

12.与具有SEQ ID NO:1的多肽或者包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体或者与具有SEQ ID NO:1的多肽或者包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的重组抗体，其优选地被针对人IgG类免疫球蛋白的二抗所识别，作为阳性对照用于检测在样品中的与具有SEQID NO:1的多肽特异性地结合的自身抗体的用途。

13.水溶液，其包含与具有SEQ ID NO:1的多肽或者包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物特异性地结合的自身抗体，其优选地是IgG类的。

14.用于从MN患者的血液，优选地血清中去除针对具有SEQ ID NO:1的多肽，优选地包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物的自身抗体的装置，其中所述装置包含承载体，其包被有包含SEQ ID NO:1的多肽，优选地，包含有包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:2或其变体的多肽的复合物。

15.用于从MN患者的血液，优选地血清中去除针对具有SEQ ID NO:1的多肽，优选地包含具有SEQ ID NO:1的多肽和具有SEQ ID NO:2的多肽的复合物的自身抗体的离体方法。