CN105779651A

CN105779651A - 一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN105779651A
Application number: CN201610219128.6A
Authority: CN
Inventors: 潘晓艺; 蔺凌云; 袁雪梅; 沈锦玉; 徐洋; 姚嘉赟; 尹文林
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明公开了一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒及其检测方法，其中，中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒包括病毒RNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有用于检测中华鳖动脉炎病毒扩增用核酸引物组，该引物组包含引物TSAV‑F3、引物TSAV‑B3、引物TSAV‑FIP和引物TSAV‑BIP；本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的环介导等温扩增反应体系，不但使得中华鳖动脉炎病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测中华鳖动脉炎病毒的第一个试剂盒，填补了中华鳖动脉炎病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。

Description

一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于靶RNA片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

中华鳖动脉炎病毒(TrionyxsinensisArterivirus，TSAV)是引起中华鳖病毒性肺炎和动脉炎的主要病原之一，对中华鳖养殖产业危害极大。TSAV为单正链RNA病毒，属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，该病毒是目前发现能够感染中华鳖的第二个RNA病毒。该病毒于2012年从患腮腺炎和肺炎的中华鳖中分离获得，其造成中华鳖在养殖期大量死亡，死亡率一般为50％～70％，严重的达到80％以上，近几年造成的经济损失无法估量。被发现以来，因缺少检测方法，严重阻碍了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明中华鳖动脉炎病毒快速检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂和反应试剂，反应试剂中含有用于检测中华鳖动脉炎病毒扩增用核酸引物组，该引物组包含引物TSAV-F3、引物TSAV-B3、引物TSAV-FIP和引物TSAV-BIP；

引物TSAV-F3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

引物TSAV-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；

引物TSAV-FIP的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；

引物TSAV-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。

进一步地，病毒RNA提取试剂包含以下组分：成分为80-100mMTris、40-60mMEDTA、400-600mMNaCl、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇的pH8.0的裂解液A；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3mol/L；无水乙醇；DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。

本发明还公开了一种利用上述的中华鳖动脉炎病毒的快速检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)RNA抽提：取中华鳖脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用上述的病毒RNA提取试剂进行RNA提取；

2)中华鳖动脉炎病毒基因扩增；

3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。

进一步地，步骤2)中华鳖动脉炎病毒基因扩增具体为：

2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

2.2)吸取所述的预反应液的体积为N×23μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

2.3)向设定的N个反应管中分别加入24uL步骤2.2)得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各luL；

2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30uL反应封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；

2.5)在63℃下恒温反应50分钟。

进一步地，步骤3)中的显色检测具体为：取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入luL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明根据靶基因序列设计了中华鳖动脉炎病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在BstRNA聚合酶和AMV逆转录酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物，由于快速技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了中华鳖动脉炎病毒检测的特异性；

2)采用本发明的引物组对中华鳖动脉炎病毒进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；

3)本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测中华鳖动脉炎病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需16拷贝；

4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且产率高；

6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的环介导等温扩增反应体系，不但使得中华鳖动脉炎病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测中华鳖动脉炎病毒的第一个试剂盒，填补了中华鳖动脉炎病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。

当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明引物特异性测试图；其中，1：中华鳖动脉炎病毒；2：中华鳖小RNA病毒；3：中华鳖虹彩病毒；4：草鱼出血病病毒；5：罗氏沼虾双顺反子病毒；6：锦鲤疱疹病毒；7：嗜水气单胞菌；8：中华鳖动脉炎病毒RdRp基因阳性对照；9：正常中华鳖RNA阴性对照；

图2是本发明灵敏性检测图；其中，1.1.6×10⁵copies；2.1.6×10⁴copies；3.1.6×10³copies；4.1.6×10²copies；5.1.6×10copies；6.1.6copies；7.正常中华鳖RNA阴性对照；8.中华鳖动脉炎病毒RdRp基因阳性对照。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施，本发明所用到的材料和试剂若非特殊说明，均为本领域的公知常识。

本发明的思路为：本发明采用链置换酶和等温扩增技术，通过检测中华鳖动脉炎病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因，来检测中华鳖动脉炎病毒，这是目前国内外首次建立的TSAV检测方法。该方法的建立为中华鳖病毒性肺炎和动脉炎的监测和预防奠定基础。

实施例1

(1)RNA抽提：

取中华鳖脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中，于冰上用研磨棒研磨，加600μL裂解液A后，继续研磨充分后加600μLpH值8.0的Tris饱和酚，强烈振荡，11000g离心10分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠，混匀，再加两倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后低温静置10分钟，15000g离心5分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μLDEPC水重悬，-80℃保存备用。

(2)中华鳖动脉炎病毒的快速扩增：

根据待检测样品的数目，设置所需快速反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照(含有中华鳖动脉炎病毒RdRp基因的质粒)，l管为阴性对照(无核酸去离子水)；吸取预反应液的体积为N×23μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的N个反应管中分别加入24uL混合液，并向N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各luL；然后在每个反应管中再分别加入30uL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在63℃下恒温反应50分钟。

(3)显色检测：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入luL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有中华鳖动脉炎病毒核酸，显示为浅黄色则无中华鳖动脉炎病毒核酸。

上述预反应液含有：18～22mMpH为8.6～9.0的Tris-HC1、6～10mM硫酸镁、13～16mM氯化钾、9～11mM硫酸按、0.l～0.15％Tween-20、1～1.6mMdNTP、0.5～1.0M甜菜碱、0.15～0.3μM引物TSAV-F3、0.15～0.3μM引物TSAV-B3、1.5～2.2μM引物TSAV-FIP和1.5～2.2μM引物TSAV-BIP，其中所述的引物TSAV-F3序列如SEQIDNO：1所示；所述的引物TSAV-B3序列如SEQIDNO：2所示；所述的引物TSAV-FIP序列如SEQIDNO：3所示；所述的引物TSAV-BIP序列如SEQIDNO：4所示。

采用上述快速诊断试剂盒和方法进行快速检测中华鳖动脉炎病毒特异性和灵敏性试验结果如附图1和2所示。

图1引物特异性测试图，如图所示，仅中华鳖动脉炎病毒和中华鳖动脉炎病毒RdRp基因模版扩增后显色为阳性绿色，其它病毒或细菌显色都为阴性浅黄色，表明对其它病毒无交叉扩增性。

图2中华鳖动脉炎病毒灵敏性检测图，如图所示，经Real-timePCR定量后的中华鳖动脉炎病毒RNA系列稀释的扩增显色图，当反应体系中加入16个病毒拷贝的RNA，扩增显色结果就为阳性。

本发明利用环介导等温扩增技术快速检测中华鳖动脉炎病毒的检测试剂盒，在已试验的6种不同的病毒和1中细菌进行了检测，检测结果仅中华鳖动脉炎病毒为阳性，其它均为阴性，说明该检测方法特异性高。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒，其特征在于，包括病毒RNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有用于检测中华鳖动脉炎病毒扩增用核酸引物组，该引物组包含引物TSAV-F3、引物TSAV-B3、引物TSAV-FIP和引物TSAV-BIP；

所述的引物TSAV-F3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

所述的引物TSAV-B3的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；

所述的引物TSAV-FIP的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；

所述的引物TSAV-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。

2.根据权利要求1所述的中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述的病毒RNA提取试剂包含以下组分：成分为80-100mMTris、40-60mMEDTA、400-600mMNaCl、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇的pH8.0的裂解液A；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3mol/L；无水乙醇；DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。

3.根据权利要求1所述的中华鳖动脉炎病毒快速检测试剂盒，其特征在于，所述的反应试剂包括以下组分：

1)预反应液：18～22mMpH为8.6～9.0的Tris-HC1、6～10mM硫酸镁、13～16mM氯化钾、9～11mM硫酸按、0.1～0.15％Tween-20、1～1.6mMdNTP、0.5～1.0M甜菜碱、0.15～0.3μM引物TSAV-F3、0.15～0.3μM引物TSAV-B3、1.5～2.2μM引物TSAV-FIP和1.5～2.2μM引物TSAV-BIP；

2)反应酶：每微升含8个活性单位的BstRNA聚合酶和5个活性单位的AMV反转录酶；

3)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；

4)反应显色液：含有10％SYBRGreenI的荧光染料。

4.一种利用权利要求1所述的中华鳖动脉炎病毒的快速检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)RNA抽提：取中华鳖脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用权利要求2所述的病毒RNA提取试剂进行RNA提取；

2)中华鳖动脉炎病毒基因扩增；

3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中华鳖动脉炎病毒基因扩增具体为：

2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中1管为阳性对照，1管为阴性对照；

2.3)向设定的N个反应管中分别加入24uL步骤2.2)得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各1uL；

2.5)在63℃下恒温反应50分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的显色检测具体为：取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入1uL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。