CN104862426B - 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104862426B
CN104862426B CN201510330728.5A CN201510330728A CN104862426B CN 104862426 B CN104862426 B CN 104862426B CN 201510330728 A CN201510330728 A CN 201510330728A CN 104862426 B CN104862426 B CN 104862426B
Authority
CN
China
Prior art keywords
citrus
primer
correlated virus
chlorisis
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510330728.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104862426A (zh
Inventor
刘科宏
周常勇
李中安
陈洪明
周彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest university citrus research institute
Original Assignee
Southwest university citrus research institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest university citrus research institute filed Critical Southwest university citrus research institute
Priority to CN201510330728.5A priority Critical patent/CN104862426B/zh
Publication of CN104862426A publication Critical patent/CN104862426A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104862426B publication Critical patent/CN104862426B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP检测的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP，以待测样品总DNA为模板，应用上述的内外引物对在63～65℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60～80min，扩增完成后78～82℃反应5～10min中止反应，然后根据浑浊度或利用荧光染料染色通过颜色变化或电泳条带进行可视化判断，鉴定植株样品是否感染柑桔褪绿矮化相关病毒。本发明操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分钟就可完成对样品的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高。

Description

柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种环介导等温扩增分子检测方法，尤其涉及一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
柑桔褪绿矮化病由柑桔褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)引起，CCDaV属于菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)，为单链环状的DNA病毒，基因组为3.4-3.6kb，具有5个ORFs。柑桔褪绿矮化病主要分布于土耳其，近年来我国相继在云南、四川等地发现了柑橘褪绿矮化病，其发生呈不断扩大、加重的趋势，可通过杨梅粉虱(Parabemisia myricae Kuwana)传播。CCDaV可侵染多种柑桔寄主，如葡萄柚、柠檬、椪柑、酸橙及甜橙等，引起植株叶片变形、扭曲、花叶等症状，并造成果实变小，产量降低。该病在土耳其被认为是威胁柑桔生产最严重病害之一，且已经在土耳其造成了严重的损失，特别是在梅尔辛造成当地柑桔减产60～70％。
目前我国柑桔的种植面积和产量均居世界第一，柑桔已成为我国农民增收的重要途径，也是我国一个重要的产业。柑桔褪绿矮化病已在我国时有发生，且日趋严重，对柑桔产业是一个巨大的威胁，且该病目前尚无有效的药物可进行防治，因此柑桔褪绿矮化病的防控对我国柑桔产业的发展具有十分重要的意义。
柑桔褪绿矮化病的检测，目前可用的方法有：常规PCR和实时荧光PCR。PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与诊断，实时荧光PCR的灵敏度高于常规PCR。PCR方法虽然能对CCDaV进行有效的检测，但都需要专业的PCR仪、电泳仪等特殊仪器，使其在田间和基层的应用受到很大的限制。因此建立一套快速、有效、简便的柑桔褪绿矮化病的检测方法，对我国柑桔产业健康、稳定发展具有十分重要的意义。
2000年由Notomi等发明的环形介导逆转录等温扩增技术(LAMP)是一种新的恒温核酸扩增方法，较传统的核酸扩增方法具有灵敏度高、特异性强、操作方法简单、快速等优点，现已越来越多的应用于各种病毒的检测。其主要原理是通过采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物(2条内引物-FIP/BIP，2条外引物-F3/B3)及链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在等温条件下(60-65℃左右)DNA开始合成。利用可以产生环状结构的引物和Bst DNA聚合酶的链置换合成活性，靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构。当一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链解离变成单链，引物在恒温条件下不断引发新链的合成，靶基因因此得到高效扩增，最终的扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳显现出不同大小条带组成的阶梯式图谱。该方法可加入荧光燃料进行可视化判断也可根据浑浊度判断检测结果，反应也不需要特殊仪器，在烘箱或水浴锅中就能完成反应，因此特别适合在田间和基层使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP引物组。
一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组，由外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP组成：
外引物对：
F3：5’-ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3’；
B3：5’-CCTTACACCCCGGAGGAA-3’；
内引物对：
FIP：5’-ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3’；
BIP：5’-AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3’。
本发明的另一目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性的柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测试剂盒。
一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测试剂盒，含有前述的柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、Bst buffer、MgCl2、Betaine、dNTPs、Bst聚合酶。
本发明还提供了一种不需要专门的核酸扩增和检测仪器、操作简单方便、特异性好、灵敏度高、检测快速的柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP检测方法。
一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测方法，是以待测样品总DNA为模板，应用上述的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP在63～65℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60～80min，扩增完成后78～82℃反应5～10min中止反应，然后根据浑浊度或荧光染料染色或电泳条带，鉴定植株样品是否感染柑桔褪绿矮化相关病毒。
扩增反应中，总体积25μL的反应体系含有18μL反应液A、5μL引物液B、浓度为20～100ng/μL的DNA溶液2μL；其中18μL反应液A含有：2.5μL 10×Bst buffer、6μL 25mM的MgCl2、2μL 4mM的Betaine、3.5μL 10mM的dNTPs、1μL 8U/μL的Bst聚合酶、3μL水；所述5μL引物液B包括2μL 20μM的FIP、2μL 20μM的BIP、0.5μL 10μM的F3、0.5μL 10μM的B3。
本发明的有益效果是：以待测样品总DNA为模板，建立了快速检测柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP技术，操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器和电泳仪，几十分钟就可完成对样品的检测，其主要优点有：
(1)本发明首次提供了柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒和方法，所述的引物特异性良好，对于柑桔褪绿矮化相关病毒能够实现特异性扩增，而对于其它病毒不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。
(2)可快速、准确、大批量地检测柑桔褪绿矮化相关病毒，所需样品量少；本发明方法敏感性极高，10-15分钟的短时间内DNA模板数量可增加至109倍，是一种反应快速，操作简便的快速检测技术，适应于检测对象的快速筛检。
(3)灵敏度高：实验证明本发明检测方法检测灵敏度比常规PCR高100倍，具有与实时荧光PCR相等的检测灵敏度。
(4)本发明为田间和基层单位对柑桔褪绿矮化相关病毒的检测提供了一种高效、快速、成本低、准确、灵敏的检测方法，填补柑桔褪绿矮化相关病毒现场快速检测方法的空白。
附图说明
图1为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP浑浊度可视化检测结果示意图；1为感染柑桔褪绿矮化相关病毒的样品，2为健康叶片对照，3为水对照。
图2为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP引物组的特异性检测图；其中1为感染柑桔褪绿矮化相关病毒的样品，2-7分别为感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒和柑桔黄龙病菌的样品。
图3为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP扩增产物酶切鉴定图；M为50bp Ladder DNAMarker；1、3为LAMP扩增产物；2为LAMP扩增产物经MboⅡ酶切后电泳。
图4为柑桔褪绿矮化相关病毒常规PCR(上排泳道)和LAMP(下排泳道)检测灵敏度检测对比图；M为100bp Ladder DNA Marker；1-6依次为柑桔褪绿矮化相关病毒样品稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106检测结果。
图5为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP灵敏度检测浑浊度观察图；1-6依次为柑桔褪绿矮化相关病毒样品稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍LAMP检测结果。
图6为柑桔褪绿矮化相关病毒实时荧光PCR检测灵敏度检测图；1-6依次为柑桔褪绿矮化相关病毒样品稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍实时荧光PCR检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的实验材料：
本实验所用分别感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病菌以及柑桔褪绿矮化相关病毒的植株样品来源于西南大学柑桔研究所保存毒源。
主要试剂及生产者：
Betaine(Promega公司，美国)，Bst聚合酶(New England Biolabs，美国)，SYBRGREENI(鼎国公司，中国)，MboⅡ内切酶(New England Biolabs，美国),Ladder DNA Marker(Biomed公司，俄罗斯)，10×Bst buffer(New England Biolabs，美国)。
实施例1柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测特异性验证
1、用于检测柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP引物组
根据柑桔褪绿矮化相关病毒的移动蛋白(movement protein,MP)基因序列设计了环介导等温核酸扩增的4条特异性引物：外引物对F3、B3，内引物对FIP、BIP，引物序列如下：
外引物对：
F3：5’-ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3’；
B3：5’-CCTTACACCCCGGAGGAA-3’；
内引物对：
FIP：5’-ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3’；
BIP：5’-AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3’。
2、印迹浸提法提取总DNA
采用印迹浸提法提取样品的总DNA：取柑桔的叶和茎，用刀片横切样品茎和叶柄，随即均匀地压印于硝酸纤维素膜(NCM)上，干燥后，剪下NCM上1cm2面积的印迹浸泡于50μL超纯水中，即得印迹浸提液，-20℃保存。
3、LAMP扩增
在反应管中加入18μL反应液A和5μL引物液B，再加入2μL前述提取的印迹浸提液，建立体积为25μL的扩增反应体系。64℃进行反应(水浴或者烘箱)，反应时间为60min；然后80℃反应5min。18μL反应液A含有：2.5μL 10×Bst buffer、6μL 25mM的MgCl2、2μL 4mM的Betaine(甜菜碱)、3.5μL 10mM的dNTPs、1μL 8U/μL的Bst聚合酶、3μL水；所述5μL引物液B包括2μL 20μM的FIP、2μL 20μM的BIP、0.5μL 10μM的F3、0.5μL 10μM的B3。
4、结果观察与验证
对前述扩增产物进行结果分析，可用肉眼观察浑浊度，结果如图1所示，表现CCDaV典型症状的样品1中的反应液变浑浊，表明检测到了柑桔褪绿矮化相关病毒；健康叶片的负对照样品2和水对照样品3中的反应液仍澄清，表明未检测到柑桔褪绿矮化相关病毒。
或在扩增产物中加入1μL 100倍稀释的显色液荧光染料SYBR GREEN I，可见表现CCDaV典型症状的样品1的扩增产物颜色由无色变为黄绿色，表明检测到了柑桔褪绿矮化相关病毒；健康叶片的负对照样品2和水对照样品3中的扩增产物中加入SYBR GREEN I后，离心管中的颜色仍为SYBR GREEN I的红棕色，未发生颜色变化，表明未检测到柑桔褪绿矮化相关病毒。
5、特异性鉴定
按照前述“2印迹浸提法提取总DNA”的方法分别提取感染了柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病菌以及柑桔褪绿矮化相关病毒的柑桔叶片的印迹浸提液，使用前述建立的LAMP体系对获得的印迹浸提液进行检测，结果表明，只有柑桔褪绿矮化相关病毒样品反应液变浑浊(如图2所示)或加入荧光燃料后由无色变为黄绿色，说明检测到了柑桔褪绿矮化相关病毒；其余病毒反应液仍澄清或加入荧光燃料为红棕色；说明该检测方法对柑桔褪绿矮化相关病毒检测具有特异性。
6、酶切鉴定
用BioEdit软件对柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP扩增产物片段进行分析，筛选出MboⅡ限制性内切酶对产物进行酶切分析，酶切产物理论值为81、108和127bp。建立20μL的酶切体系，酶切体系为：1μL MboⅡ(10U/μL)、2μL10X H Buffer、2μL LAMP扩增产物、15μL水。37℃反应3h，用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，经EB染色后用凝胶成像系统观察。结果如图3所示，柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP扩增产物经MboⅡ酶切后出现了与理论值相同大小的81、108和127bp的条带，证明柑桔褪绿矮化相关病毒样品LAMP体系扩增出的确实为柑桔褪绿矮化相关病毒目的条带。
实施例2柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测灵敏度检测
对图1中感染柑桔黄脉病的样品1的印迹浸提液模板进行10倍梯度稀释至105倍，分别采用常规PCR、实时荧光PCR和实施例1中的LAMP方法进行扩增检测。常规PCR得到444bp的特异性扩增片段，电泳结果如图4中上排泳道所示，样品1稀释到103倍时常规PCR无法进行检测；当样品1稀释到105倍时LAMP方法仍可检测出CCDaV，电泳结果如图4中下排泳道所示。LAMP检测结果浑浊度如图5所示，与电泳结果一致。当样品1稀释到105倍时实时荧光PCR仍可检测出CCDaV,检测结果如图6所示。由此可见LAMP检测的灵敏度是常规PCR的100倍，与实时荧光PCR检测的灵敏度相同。柑桔褪绿矮化相关病毒的常规PCR所用引物为：上游引物：5’-GTTCTGTGTTTCGACCCGTT-3’；下游引物：5’-GGGATTCGCATGGATAGCTCATCCAA-3’。实时荧光PCR所用引物为：上游引物：5’-GTGTTGAAGGGTTCTCATTTTTGTC-3’；下游引物：5-CTACTTGATTTAGCCGCGCTTAG-3’。

Claims (2)

1.一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测方法，其特征在于：以待测样品总DNA为模板，应用外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP在63～65℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60～80min，扩增完成后78～82℃反应5～10min中止反应，然后根据浑浊度或荧光染料染色或电泳条带，鉴定植株样品是否感染柑桔褪绿矮化相关病毒；所述引物序列为:
外引物对：
F3：5’-ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3’；
B3：5’-CCTTACACCCCGGAGGAA-3’；
内引物对：
FIP：5’-ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3’；
BIP：5’-AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3’。
2.如权利要求1所述的柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测方法，其特征在于：扩增反应中，总体积25μL的反应体系含有18μL反应液A、5μL引物液B、浓度为20～100ng/μL的DNA溶液2μL；其中18μL反应液A含有：2.5μL 10×Bst buffer、6μL 25mM的MgCl2、2μL 4mM的Betaine、3.5μL 10mM的dNTPs、1μL 8U/μL的Bst聚合酶、3μL水；所述5μL引物液B包括2μL 20μM的FIP、2μL 20μM的BIP、0.5μL 10μM的F3、0.5μL 10μM的B3。
CN201510330728.5A 2015-06-15 2015-06-15 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 Expired - Fee Related CN104862426B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510330728.5A CN104862426B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510330728.5A CN104862426B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104862426A CN104862426A (zh) 2015-08-26
CN104862426B true CN104862426B (zh) 2017-12-08

Family

ID=53908594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510330728.5A Expired - Fee Related CN104862426B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104862426B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107447049B (zh) * 2017-09-06 2019-03-26 遵义市精科信检测有限公司 一种快速检测土壤中病原微生物的方法
CN108441582A (zh) * 2018-06-11 2018-08-24 西南大学 柑橘鳞皮病毒的rt-lamp检测试剂盒和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104862426A (zh) 2015-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110295255A (zh) 一种基于rt-lamp-lfd检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法
CN105624336B (zh) 检测中华鳖细小病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒
CN107177700A (zh) 一种检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN104862426B (zh) 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN105238876A (zh) 用于烟草青枯病菌检测的lamp引物组及其使用方法
CN109280715A (zh) 一种检测花生黑腐病菌的lamp引物组及其快速检测方法和试剂盒
CN104561278A (zh) 一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法
CN110878371A (zh) 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物lamp快速检测方法
CN106086211A (zh) 检测荷花腐败病菌的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN104673889B (zh) 基于特异性ss‑coi引物的棉长管蚜pcr快速检测方法
CN107988383B (zh) 一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的lamp引物组和方法
CN103667530B (zh) 一种番茄褪绿病毒的逆转录环介导等温检测方法
CN103498010B (zh) 快速检测番茄褪绿病毒的引物、试剂盒及其应用
CN108546772A (zh) 玉米大斑病菌lamp检测引物及其快速检测方法和应用
CN108315469A (zh) 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途
CN108546771A (zh) 杧果小孢拟盘多毛孢病菌lamp检测引物及其可视化检测方法和应用
CN107815490A (zh) 一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法
CN104031997A (zh) 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的lamp引物组、试剂盒及其检测方法
CN105420362A (zh) 兔中型艾美耳球虫荧光定量pcr检测引物和试剂盒
CN105238878B (zh) 甘蔗线条花叶病毒rt-lamp引物组、检测方法及其应用
CN105274258A (zh) 用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN116287439A (zh) 朱顶红褪绿环斑病毒rt-lamp检测引物、试剂盒及其应用和方法
CN109207619A (zh) 检测栗黑水疫霉菌的lamp引物对及其扩增方法和用途
CN103937912A (zh) 用于检测传染性胰脏坏死病毒的lamp引物组合物及其应用
CN108315391A (zh) 一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20171208

Termination date: 20180615