CN112704731A - 蛋白酶s273r抑制细胞焦亡的用途及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白酶S273R调节细胞焦亡的用途及方法，因此本发明提供一种细胞焦亡抑制剂，通过干扰Caspase‑1途径，抑制细胞焦亡的发生。同时，当机体感染能够编码蛋白酶S273R的病原体时，本发明还提供一种细胞焦亡促进剂，在病原体感染时，通过促进适度的细胞焦亡来清除致病微生物。

Description

蛋白酶S273R抑制细胞焦亡的用途及方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学，并且更具体地涉及一种用于诱导抗细胞焦亡或促细胞焦亡的物质及方法。
背景技术
程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)，是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。凋亡、自噬、细胞程序性坏死、细胞焦亡都是程序性死亡的表现形式。
细胞焦亡(Pyroptosis)是一种最新发现的炎症细胞程序性死亡方式，主要通过炎症小体介导包含Caspase-1在内的多种Caspase的激活，造成包括GSDMD在内的多种Gasdermin家族成员发生剪切和多聚化，引起细胞穿孔，进而引起细胞死亡。相比于细胞凋亡(apoptosis)，细胞焦亡发生的更快，并会伴随着大量促炎症因子的释放。细胞发生焦亡时，会出现肿胀。在细胞破裂之前，细胞上会形成凸出物，之后细胞膜上形成孔隙，使细胞膜失去完整性，进而细胞破裂，释放内容物，引起炎症反应。此时，细胞核位于细胞中央，随着形态学的改变，细胞核固缩，DNA断裂。
细胞焦亡信号通路分为依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4、5、11的非经典途径。
(1)依赖Caspase-1的经典途径
在细菌，病毒等信号的刺激下，细胞内的模式识别受体作为感受器，识别这些信号，通过接头蛋白ASC与Caspase-1的前体结合，形成多蛋白复合物，使Caspase-1活化，活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，释放内容物，引起炎症反应；另一方面，活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应。
(2)依赖Caspase-4、5、11的非经典途径
在细菌等信号的刺激下，Caspase-4、5、11被活化，活化的Caspase-4、5、11切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，一方面诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，释放内容物，引起炎症反应；另一方面，诱导Caspase-1的活化，对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应。
细胞焦亡是机体重要的免疫反应，在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用。广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。
在病原体感染时，适度的细胞焦亡可清除致病微生物，而过度的细胞焦亡在导致细胞死亡的同时，释放炎症因子，扩大炎症反应，造成发热，低血压、败血症等症状。以败血症为例，败血症是由致病菌侵入血液系统，并在其中生长繁殖，产生毒素，引起全身性感染。
因代谢障碍或代谢旺盛等原因引起的疾病称为代谢性疾病，常见的有糖尿病、痛风、糖尿病性心肌病等。以糖尿病性心肌病为例，由心肌细胞死亡引起，最新的研究显示高血糖可以造成活性氧的产生增加，进而上调NF-κB和TXNIP，NF-κB又可以上调NLRP3、IL-1β前体以及IL-18前体的表达；TXNIP通过改变NLRP3的结构激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，诱导心肌细胞膜穿孔、破裂，释放内容物，引起炎症反应；另一方面，活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应。
神经系统疾病包括脑损伤，癫痫等。以癫痫为例，研究发现，癫痫发作可通过钾离子外流等途径激活NLRP1炎症体，进而激活依赖Caspase-1的焦亡途径，导致癫痫进一步发展。
在动脉粥样硬化的发展中，炎症被认为是启动和驱动动脉粥样硬化的主要因素。在高血脂、氧化修饰的低密度脂蛋白等刺激下，激活Caspase-1，介导血管内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的焦亡与炎症反应，导致血管扩张功能障碍、坏死中心的形成，粥样硬化斑块的稳定，最终造成动脉粥样硬化。
在ROS及细胞毒素的作用下，JNK激酶被激活并转移到细胞核内，促进焦亡相关基因的表达，启动焦亡的形成，控制肿瘤的发展。
通过控制或干扰细胞焦亡的途径，来控制细胞焦亡的程度，从而调节机体的免疫反应，将在拮抗机体的感染和内源性危险信号如细菌感染、病毒感染中发挥重要作用；同时对于肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的治疗将产生积极影响。
发明内容
我们发现非洲猪瘟病毒(ASFV)感染能够促使细胞焦亡的执行者gasdermin D(GSDMD)降解。进一步研究发现，ASFV编码的唯一蛋白酶(S273R)能直接靶向作用并切割GSDMD，这依赖于S273R的蛋白酶活性。进一步分析表明，GSDMD中Q107-G108是S273R的酶切位点，切割后产生较短的N端片段不能触发细胞焦亡或抑制病毒复制，这与Caspase-1切割产生的N端片段不同。
因此：
第一方面，本发明提供一种细胞焦亡抑制剂，该抑制剂包含蛋白酶S273R(SEQ.ID.NO 1)，蛋白酶S273R通过作用于GSDMD中Q107-G108部位，切割后产生较短的N端片段不能触发细胞焦亡。通过干扰Caspase-1途径，抑制细胞焦亡的发生。
第二方面，当机体感染能够编码蛋白酶S273R的病原体时，本发明提供一种细胞焦亡促进剂，该促进剂包含蛋白酶S273R的活性抑制剂，该促进剂通过抑制蛋白酶S273R的活性，来促进感染了能够编码蛋白酶S273R的病毒或其他病原体的细胞的焦亡，即在病原体感染时，通过促进适度的细胞焦亡来清除致病微生物。
第三方面，本发明提供一种诱导抗细胞焦亡的方法。所述方法包括使所述细胞与含有本发明的蛋白酶S273R的药物组合物接触，从而诱导所述细胞的抗细胞焦亡。
第四方面，当机体感染能够编码蛋白酶S273R的病原体时，本发明提供一种适度促进感染细胞焦亡的方法，所述方法包括使所述细胞与含有本发明的蛋白酶S273R的活性抑制剂的药物组合物接触，从而抑制蛋白酶S273R的活性，诱导所述细胞的焦亡发生。
第五方面，本发明提供一种治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的含有本发明的细胞焦亡抑制剂S273R的药物组合物，由此治疗所述疾病或病症，所述疾病或病症与细胞焦亡的发生有关。
第六方面，当机体感染能够编码蛋白酶S273R的病原体时，本发明提供一种清除病原体的方法，所述方法包括向所述感染者或受试者施用有效量的含有本发明细胞焦亡促进剂的药物组合物，通过促进适度的细胞焦亡来清除致病微生物。
附图说明
图1：ASFV S273R能切割细胞焦亡的执行者GSDMD。
图2：ASFV S273R切割GSDMD依赖其蛋白酶活性结构域。
图3：ASFV S273R蛋白酶切割GSDMD的位点是Gly-107。
图4：ASFV S273R切割GSDMD后使其失去了诱导细胞焦亡的活性。
具体实施方式
本发明是基于出人意料的发现，即ASFV编码的唯一蛋白酶(S273R)能直接靶向作用并切割细胞内的GSDMD，导致其N端结构域被截断，从而抑制了细胞焦亡，这对于在肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展中细胞焦亡扮演重要角色的疾病治疗有重要意义；同时，抑制宿主细胞的焦亡显然有利于病毒的复制，这些结果也揭示了病原体逃避机体免疫应答的策略，因此，在适当程度上促进细胞的焦亡，有利于机体对病原体的清除。
本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意具有限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。
1、一种细胞焦亡抑制剂，该抑制剂包含蛋白酶S273R。
2、一种细胞焦亡促进剂，该促进剂包含蛋白酶S273R的活性抑制剂。
3、一种诱导细胞的抗细胞焦亡的方法，所述方法包括使所述细胞与含有蛋白酶S273R的药物组合物接触，从而诱导抗细胞焦亡作用。
4、一种适度促进感染细胞焦亡的方法，所述方法包括使所述细胞与含有蛋白酶S273R的活性抑制剂的药物组合物接触，从而抑制蛋白酶S273R的活性，诱导所述细胞的焦亡发生，其中所述感染是由能够编码蛋白酶S273R的病原体造成的感染。
5、如权利要求4所述的适度促进感染细胞焦亡的方法，所述病原体是非洲猪瘟病毒。
6、蛋白酶S273R在制备治疗或预防与细胞焦亡相关的疾病的药物中的用途，所述疾病包括肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病。
7、蛋白酶S273R的活性抑制剂在制备治疗或预防病原体感染的疾病的药物中的用途，所述感染性疾病是指能够编码蛋白酶S273R的病原体造成的机体的感染。
8、如权利要求7所述的用途，所述的病原体是指非洲猪瘟病毒。
术语的解释：
本发明涉及的细胞焦亡抑制剂，该抑制剂包含蛋白酶S273R，所述抑制剂可用于生产用于治疗疾病、病症或其他异常病状(如肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病)的药物组合物。
本发明涉及的细胞焦亡促进剂，该促进剂通过抑制蛋白酶S273R的活性，来促进感染了能够编码蛋白酶S273R的病毒或其他病原体的细胞的焦亡，即在病原体感染时，通过促进适度的细胞焦亡来清除该致病微生物的药物组合物。所述的促进剂包括能够使蛋白酶S273R失活的物质。如本文所用术语“受试者”是指哺乳动物受试者。此类动物包括但不限于猪、马、猫、狗、兔、小鼠、山羊、绵羊、非人灵长类动物和人。因此，本公开的方法被考虑用于兽医学应用以及人使用。
本文中的受试者的“治疗”是指治疗性和防治性或预防性措施。需要治疗的那些受试者包括已经患有疾病或病症的那些以及需要预防所述疾病或病症的那些。因此，所述受试者可能已被诊断为患有疾病或病症，或者可能易感或易患疾病或病症。
表述“有效量”是指有效预防、改善或治疗疾病或病症的抗细胞凋亡或促细胞凋亡的量。这种有效量通常将导致疾病或病症的病征、症状或其他指标的改善。
能够编码蛋白酶S273R的病毒或其他病原体具体包括非洲猪瘟病毒。
本发明的组合物通常是药物组合物，这种药物组合物除包含蛋白酶S273R或蛋白酶S273R的活性抑制剂以外，还可以包含进一步的治疗剂，如治疗性多肽或酶，以及药物学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供一种治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向受试者或其细胞或组织施用含有蛋白酶S273R或蛋白酶S273R的活性抑制剂的药物组合物，可以任何合适的方式进行组合物的施用，所述方式包括例如静脉内、腹膜内、胃肠外、原位、皮下、局部、经鼻、经口、舌下、眼内、借助于可植入储库、使用基于纳米颗粒的递送系统、微针贴片、微球体、珠粒、渗透泵或机械泵和/或其他机械手段。
提供以下实施例来进一步说明本发明的实施方案，但并不意图限制本发明的范围。虽然它们是可使用的实施例中的典型实施例，但可替代地使用本领域的技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实施例1：
实验方法
细胞系和病毒从ATCC购买了人胚肾293T(HEK293T)，并在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中进行了培养，并在培养基中添加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)，100单位/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素在37℃和5％CO2湿润的培养箱中培养。ASFV Pig/HLJ/18株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离并保存，ASFV毒株在PAMs细胞中繁殖。
质粒，抗体和试剂
为了构建表达HA标记和FLAG标记的ASFV蛋白S273R及其突变体的质粒，将ASFV的DNA克隆到pCAGGS-HA(pHA)和pCAGGS-FLAG(pFLAG)载体中。使用从PAM细胞提取的总RNA作为模板，通过标准RT-PCR扩增猪的GSDMD cDNA，并克隆到pCAGGS-HA(pHA)和pCAGGS-FLAG(pFLAG)载体中。通过定点诱变构建猪GSDMD(G78A，G107A，G320A，G345A，D279A，G107A/D279A(DM))和ASFV S273R(H168R，C232S和H168R/C232S(DM))的突变体。编码GSDMD缺失突变体的cDNA，包括1-107(1至107个氨基酸)，108-(107至488个氨基酸)，1-279(1至279个氨基酸)和280-488(280至488个氨基酸)克隆到pHA载体中。pET-22b-ASFV S273R质粒由南开大学提供，GSDMD的cDNAs被克隆到pGEX-6P1载体中表达和纯化重组蛋白。通过DNA测序验证所有构建的质粒。
针对FLAG，HA的抗体购自细胞信号技术公司(Cell Signaling Technology，CST)。Myc和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自Sigma。兔抗GSDMD购自NOVUS。山羊抗小鼠或抗兔二抗购自Sigma。山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗，通过使用纯化的重组ASFV S273R蛋白作为免疫原对小鼠进行免疫，制备了针对ASFV S273R的多克隆抗体。广谱的半胱天冬酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK购自Sigma。
重组蛋白的表达和体外切割分析，重组蛋白的纯化和切割检测在体外进行。简言之，通过亲和层析从细菌裂解后的上清中纯化His-ASFV S273R蛋白。GST-pGSDMD蛋白在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。将这些蛋白质透析并储存于-80℃。
为了在体外检查pGSDMD的切割情况，按比例将的重组ASFV S273R(His-ASFVS273R)和GST-pGSDMD在缓冲液A(50mM三乙酸酯，pH8.5、1mM EDTA，10％甘油和1mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT))中孵育。在37℃下孵育2小时后，加1×上样缓冲液终止反应，然后进行蛋白质印迹分析。
免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质印迹分析。在转染30hpt时，将转染后的细胞用含有50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl，1％Triton X-100、5mM MgCl2、1mM EDTA和10％甘油，以及混合1mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解。将细胞裂解液与抗FLAG-琼脂糖珠在4℃的roller上孵育过夜，免疫沉淀物进行电泳。对于蛋白质印迹分析，将等量的细胞裂解物和免疫沉淀物加载于含10–12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上。与对应抗体一起孵育后，用近红外荧光扫描成像仪扫描。
免疫荧光检测用HA-GSDMD、其缺失突变体以及Flag-S273R质粒转染HEK293T细胞。在24-26h后，用4％多聚甲醛固定细胞，用0.3％TritonX-100透膜，然后用抗FLAG和抗HA抗体以及DAPI染色进行观察。用Zeiss LSM-980激光扫描荧光显微镜观察。
实施例2：
1、GSDMD是ASFV S273R蛋白酶的靶点
细胞焦亡(pyroptosis)是一种依赖炎性Caspase(Caspase-1/-4/-5/-11)激活的由焦亡蛋白(gasdermin D,GSDMD)介导的细胞程序性坏死,表现为细胞肿胀、破裂,内容物释出并伴随强烈的炎症反应,诱导细胞死亡。细胞焦亡对于病原体的清除和保持机体的稳态具有重要意义，而GSDMD的表达水平是检测细胞焦亡的重要指标之一。我们首先筛选了S273R对焦亡蛋白家族的切割作用，发现S273R只能够切割GSDMD，切割产生的N端片段(GSDMD-N)，分子量在10和15kDa之间，这表明ASFV S273R能够靶向切割猪源GSDMD(图1A)。为证实ASFV S273R切割GSDMD是否具有剂量依赖性，我们将FLAG-GSDMD和ASFV S273R的质粒共同转染HEK293T细胞。结果表明，随着ASFV S273R的蛋白质表达水平增加，全长FLAG-GSDMD的表达逐渐下降，并产生了GSDMD-N片段(图1B)。为进一步确认ASFV S273R在体外切割GSDMD的效果，我们将纯化的ASFV S273R(His-S273R)和GST-GSDMD共孵育，并用抗His和抗GSDMD抗体检测反应产物。如图1C所示，我们发现纯化的His-ASFV S273R可以在体外切割GST-GSDMD并产生了N端片段(约13kDa)。为了检测GSDMD是否与ASFV S273R相互作用，在HEK293T细胞中共同转染ASFV S273R和FLAG-GSDMD，并进行了免疫共沉淀试验。结果表明，FLAG-ASFV S273R与HA-GSDMD存在相互作用(图1D)，表明GSDMD及其裂解的N末端片段与ASFV S273R特异性相互作用。进一步检测S273R和GSDMD的亚细胞共定位，将单独的FLAG-S273R、HA-GSDMD或两者在HEK293T细胞中共同表达。如图1E所示，ASFV S273R仅分布在细胞质中，而GSDMD广泛的分布于细胞质和细胞核中。ASFV S273R和GSDMD主要在细胞质中共定位。
2、ASFV S273R蛋白酶活性结构域的存在对于GSDMD的切割是必需的
为了确定ASFV S273R对GSDMD的切割是否依赖于其蛋白酶活性，我们使用广谱的半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD，发现其对ASFV S273R介导的GSDMD切割没有影响(图2A和2B)，这表明切割作用并不依赖caspase酶活性，而是由ASFV S273R诱导的。为了进一步验证这个问题，我们构建了三个表达ASFV S273R(H168R，C232S和H168R和C232S)的不同突变体的质粒(图2C)，并分析相应的蛋白对GSDMD切割作用。如图2D所示，关键的活性位点H168R，C232S以及两者同时突变后，ASFV S273R蛋白酶的活性丧失，切割GSDMD的活性也丧失，这说明ASFV S273R介导的GSDMD切割依赖其蛋白酶活性。
3、ASFV S273R蛋白酶切割GSDMD的位点是Gly-107
ASFV S273R切割GSDMD能产生一个氨基端片段GSDMD-N。有报道显示，ASFV S273R在Gly-Gly的氨基酸位点切割病毒编码的多聚蛋白前体，如pp62和pp220(图3A)。我们分析了猪源GSDMD上潜在ASFV S273R切割位点。分析结果表明，猪源GSDMD的氨基酸序列可能存在四个潜在的ASFV S273R切割位点(图3B)。为了进一步验证这些切割位点是否被切割，我们构建了一系列GSDMD点突变体，然后使GSDMD或其点突变体与ASFV S273R在HEK293T细胞中共表达。如图3C所示，当GSDMD的107位甘氨酸(Gly)突变成丙氨酸(Ala)后，其表达的GSDMD突变体就不能被ASFV S273R切割了。而其它突变体(G78A，G320A和G345A)依然能够被ASFV S273R切割。为了进一步确证Gly-107是否是正确的切割位点，我们分别构建了GSDMDG107A、D279A(预测的猪caspase-1切割位点)以及双突变体(GSDMD-DM)(图3D)，并与ASFVS273R共表达。如图3E所示，我们发现GSDMD-G107A不能被ASFV S273R的切割，但能够被猪源caspase-1切割，其切割后的氨基端大小(35kDa)与ASFV S273R切割后的氨基端大小(15kDa)不同(图3F)。综上所述，这些结果表明，ASFV S273R切割GSDMD的位点是第107位甘氨酸。
4、ASFV S273R切割GSDMD后使其失去了诱导细胞焦亡的活性
有文献报道，caspase-1切割GSDMD形成的GSDMD1-275片段在细胞膜上形成孔道，从而使细胞内外离子浓度失衡，细胞内物质释放，细胞膨胀、破裂，细胞发生焦亡。为了评估ASFV S273R切割GSDMD产生的片段是否有类似的作用，我们检测了GSDMD被切割后的片段是否影响细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)的释放。首先，构建表达GSDMD1-279和GSDMD280-488片段的质粒，模拟caspase-1切割后的产物。同时，构建GSDMD1-107和GSDMD108-488质粒，模拟ASFVS273R切割后产生的片段(图4A)，然后分别在HEK293T细胞中过表达(图4B)并观察其定位情况。结果显示GSDMD1-279定位到细胞膜上，其它片段则定位到胞质和细胞膜(图4C)。从转染后的细胞形态上可以看到，GSDMD1-279呈现了明显的细胞焦亡特征，其它片段则并不明显(图4D)。与全长的GSDMD相比，只有GSDMD1-279可以明显导致乳酸脱氢酶(LDH)释放，细胞活力明显下降，其它片段则未表现出类似的表型(图4E和4F)。这些结果表明，仅有GSDMD1-279片段可以诱导细胞焦亡，与报道的结果一致。而GSDMD被ASFV S273R切割后的片段失去了诱导细胞焦亡的活性，即ASFV S273R通过切割GSDMD抑制细胞焦亡。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 蛋白酶S273R 抑制细胞焦亡的用途及方法
<130> XH2021P0003
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 273
<212> PRT
<213> 蛋白酶S273R()
<400> 1
Met Ser Ile Leu Glu Lys Ile Thr Ser Ser Pro Ser Glu Cys Ala Glu
1 5 10 15
His Leu Thr Asn Lys Asp Ser Cys Leu Ser Lys Lys Ile Gln Lys Glu
20 25 30
Leu Thr Ser Phe Leu Glu Lys Lys Glu Thr Leu Gly Cys Asp Ser Glu
35 40 45
Ser Cys Val Ile Thr His Pro Ala Val Lys Ala Tyr Ala Gln Gln Lys
50 55 60
Gly Leu Asp Leu Ser Lys Glu Leu Glu Thr Arg Phe Lys Ala Pro Gly
65 70 75 80
Pro Arg Asn Asn Thr Gly Leu Leu Thr Asn Phe Asn Ile Asp Glu Thr
85 90 95
Leu Gln Arg Trp Ala Ile Lys Tyr Thr Lys Phe Phe Asn Cys Pro Phe
100 105 110
Ser Met Met Asp Phe Glu Arg Val His Tyr Lys Phe Asn Gln Val Asp
115 120 125
Met Val Lys Val Tyr Lys Gly Glu Glu Leu Gln Tyr Val Glu Gly Lys
130 135 140
Val Val Lys Arg Pro Cys Asn Thr Phe Gly Cys Val Leu Asn Thr Asp
145 150 155 160
Phe Ser Thr Gly Thr Gly Lys His Trp Val Ala Ile Phe Val Asp Met
165 170 175
Arg Gly Asp Cys Trp Ser Ile Glu Tyr Phe Asn Ser Thr Gly Asn Ser
180 185 190
Pro Pro Gly Pro Val Ile Arg Trp Met Glu Arg Val Lys Gln Gln Leu
195 200 205
Leu Lys Ile His His Thr Val Lys Thr Leu Ala Val Thr Asn Ile Arg
210 215 220
His Gln Arg Ser Gln Thr Glu Cys Gly Pro Tyr Ser Leu Phe Tyr Ile
225 230 235 240
Arg Ala Arg Leu Asp Asn Val Ser Tyr Ala His Phe Ile Ser Ala Arg
245 250 255
Ile Thr Asp Glu Asp Met Tyr Lys Phe Arg Thr His Leu Phe Arg Ile
260 265 270
Ala

Claims (8)

1.一种细胞焦亡抑制剂，该抑制剂包含蛋白酶S273R。
2.一种细胞焦亡促进剂，该促进剂包含蛋白酶S273R的活性抑制剂。
3.一种诱导抗细胞焦亡的方法，所述方法包括使所述细胞与含有蛋白酶S273R的药物组合物接触，从而诱导所述细胞的抗细胞焦亡。
4.一种适度促进感染细胞焦亡的方法，所述方法包括使所述细胞与含有蛋白酶S273R的活性抑制剂的药物组合物接触，从而抑制蛋白酶S273R的活性，诱导所述细胞的焦亡发生，其中所述感染是由能够编码蛋白酶S273R的病原体造成的感染。
5.如权利要求4所述的适度促进感染细胞焦亡的方法，所述病原体是非洲猪瘟病毒。
6.蛋白酶S273R在制备治疗或预防与细胞焦亡相关的疾病的药物中的用途，所述疾病包括肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病。
7.蛋白酶S273R的活性抑制剂在制备治疗或预防病原体感染的疾病的药物中的用途，所述感染性疾病是指能够编码蛋白酶S273R的病原体造成的机体的感染。
8.如权利要求7所述的用途，所述的病原体是指非洲猪瘟病毒。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100080792A1 (en) * 2005-06-16 2010-04-01 Dorothee Herlyn Method for Identifying a MHC Class II-Dependent Tumor-Associated T Helper Cell Antigen
US20140308657A1 (en) * 2010-12-09 2014-10-16 Philadelphia Health & Education Corporation D/B/A Drexel University College Of Medicine Serine protease inhibitor kazal antibodies
CN110354248A (zh) * 2019-04-26 2019-10-22 南开大学 拟肽醛类化合物在制备治疗猪瘟病毒(asfv)感染疾病药物的应用
CN110873792A (zh) * 2019-11-29 2020-03-10 江苏省农业科学院 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒
CN110914445A (zh) * 2017-02-03 2020-03-24 科德克希思公司 工程化糖基转移酶和甜菊醇糖苷葡糖基化方法
CN111485000A (zh) * 2020-05-06 2020-08-04 浙江大学 猪gsdmd蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法
US20200306360A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic compositions and vaccines comprising african swine fever virus peptides and proteins and uses thereof
US20220031831A1 (en) * 2018-11-15 2022-02-03 Kansas State University Research Foundation Immunogenic compositions for african swine fever virus
WO2023030246A1 (zh) * 2021-09-01 2023-03-09 联邦生物科技(珠海横琴)有限公司 一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组prrsv及其药物组合物

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100080792A1 (en) * 2005-06-16 2010-04-01 Dorothee Herlyn Method for Identifying a MHC Class II-Dependent Tumor-Associated T Helper Cell Antigen
US20140308657A1 (en) * 2010-12-09 2014-10-16 Philadelphia Health & Education Corporation D/B/A Drexel University College Of Medicine Serine protease inhibitor kazal antibodies
CN110914445A (zh) * 2017-02-03 2020-03-24 科德克希思公司 工程化糖基转移酶和甜菊醇糖苷葡糖基化方法
US20220031831A1 (en) * 2018-11-15 2022-02-03 Kansas State University Research Foundation Immunogenic compositions for african swine fever virus
US20200306360A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic compositions and vaccines comprising african swine fever virus peptides and proteins and uses thereof
CN110354248A (zh) * 2019-04-26 2019-10-22 南开大学 拟肽醛类化合物在制备治疗猪瘟病毒(asfv)感染疾病药物的应用
CN110873792A (zh) * 2019-11-29 2020-03-10 江苏省农业科学院 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒
CN111485000A (zh) * 2020-05-06 2020-08-04 浙江大学 猪gsdmd蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法
WO2023030246A1 (zh) * 2021-09-01 2023-03-09 联邦生物科技(珠海横琴)有限公司 一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组prrsv及其药物组合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAINA MA等: "FoxJ1 inhibits African swine fever virus replication and viral S273R protein decreases the expression of FoxJ1 to impair its antiviral effect", VIROLOGICA SINICA, pages 445 - 454 *
GAIHONG ZHAO等: "African swine fever virus cysteine protease pS273R inhibits pyroptosis by noncanonically cleaving gasdermin D", J. BIOL. CHEM, vol. 298, no. 1, pages 1 - 13 *
张萌等: "非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备", 畜牧兽医学报, vol. 52, no. 3, pages 839 - 844 *
梅旦;张玲玲;魏伟;: "细胞焦亡机制及与疾病的关系", 生理科学进展, no. 02, pages 73 - 78 *
王彦伟;王孟月;张素玲;吴?;白露露;王同燕;李向东;逄文强;田克恭;: "非洲猪瘟病毒pS273R蛋白酶的可溶性表达与胞外活性鉴定", 病毒学报, no. 05, pages 141 - 146 *

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