CN116621951A - 昆虫杆状病毒载体系统表达的二价新冠疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物及医药技术领域,涉及昆虫系统表达的二价新冠疫苗。所述串联式二聚体新冠抗原是将两条SARS‑CoV‑2株型中的相同株型的RBD或不同株型的RBD之间串联得到。采用昆虫杆状病毒载体系统进行串联式二聚体新冠疫苗的生产,结合杆状病毒载体系统安全有效,可快速扩大生产的规模的特点,可以更迅速的应对新发的流行变异株的出现。昆虫杆状病毒载体系统可在一个月内拿到大规模生产的免疫原蛋白,能够更快速的来应对。进一步地,结合新的昆虫杆状病毒载体系统和SWE佐剂的联合使用,表明昆虫杆状病毒载体系统表达的的串联式二聚体新冠疫苗具有良好的免疫原性,可激发机体产生高水平的结合抗体和高水平的中和抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物及医药技术领域,涉及昆虫系统表达的串联式二聚体新冠疫苗。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科β-冠状病毒属,是单股正链RNA囊膜病毒。
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)是一种利用杆状病毒作为外源基因的载体,通过感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来表达外源蛋白的系统,是重要的真核表达系统之一,也是疫苗和抗体生产的重要平台之一,具有安全性能好,悬浮生长易放大,对翻译后蛋白进行磷酸化、糖基化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等加工修饰,生产的蛋白更接近天然蛋白等特点。本项目采用昆虫杆状病毒载体系统进行串联式二聚体新冠疫苗的生产和研发,通过采用昆虫杆状病毒载体系统表达串联式二聚体新冠重组亚单位疫苗,并采用氢氧化铝佐剂和SWE佐剂,对激发小鼠的免疫反应,产生良好的免疫反应,对原始毒株以及当前流行的多种变异毒株都能起到良好的预防或治疗效果。
疫苗佐剂是在与抗原共同给药后增加免疫反应强度的物质。它们可用于使疫苗能够诱导强烈而持久的免疫反应,同时减少疫苗剂量和注射次数,并提高疫苗的稳定性。对于重组亚单位疫苗来讲,佐剂起着非常关键的重要作用。
疫苗佐剂来源广泛,包括植物来源、细菌来源、人工合成、细胞因子等类型。疫苗佐剂可分为无机盐类佐剂、乳剂型佐剂、水溶性佐剂、细胞因子类佐剂等,在疫苗佐剂类型中,铝盐佐剂最为常用,主要包括磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾等,其中又以磷酸铝、氢氧化铝应用最多。近几十年来开发了新技术,例如脂质体、纯化的皂角皂苷和角鲨烯型水乳剂。
SWE佐剂是一种与MF59成分相似的水包油乳剂,已成功用于各种针对脊髓灰质炎病毒等的候选疫苗的临床前研究,利什曼原虫,RSV,疟疾,乙型肝炎,肺结核和狂犬病并且正在等待临床测试(https://www.nature.com/articles/s41541-020-0187-4)。但在新冠病毒疫苗中应用效果还不得而知。
发明内容
因此本发明采用了氢氧化铝佐剂和SWE佐剂对于昆虫杆状病毒载体系统表达的串联式新冠重组亚单位疫苗的免疫原性及保护效果评价,实验结果显示,与氢氧化铝佐剂相比较,SWE佐剂显示出更佳的免疫效果,差异为显著;尤其是,SWE佐剂辅以昆虫杆状病毒载体系统生产的二联疫苗可产生良好的免疫反应,对原始毒株以及当前流行的多种变异毒株都能起到良好的预防或治疗效果。
本发明首先提供一种串联式二聚体新冠抗原的制备方法,其包括以下步骤:将编码串联式二聚体新冠抗原的核酸在昆虫表达系统中进行表达,所述串联式二聚体新冠抗原是将两条SARS-CoV-2株型中的相同株型的RBD或不同株型的RBD之间串联得到;
具体地,所述SARS-CoV-2株型选自原型株、贝塔株、德尔塔、奥密克绒株;
更优选地,所述串联式二聚体新冠抗原是原型株RBD二聚体,原型株RBD-贝塔RBD二聚体或德尔塔RBD-奥密克戎RBD二聚体。
优选地,所述RBD选择RBD结构域的第315至325位至第530至545位的区段,特别地其选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8;
任选地,两个RBD之间通过连接序列连接,优选地,所述连接如(GGS)n所示的连接序列,其中,n表示GGS的个数,n为1至10之间的整数,优选为1-5之间的整数;
进一步优选地,在所述编码串联式二聚体新冠抗原的核酸的序列的5’端具有编码信号肽的序列,优选为GP67B信号肽,3’端加上组氨酸和终止密码子得到表达盒,进行克隆表达,筛选正确的重组子,然后将其转染所述昆虫表达系统的细胞进行表达,收集细胞培养上清,从中分离获得所述重组抗原;
优选地,所述表达盒的编码的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQID NO.9所示。
在具体实施方式中,所述昆虫表达系统是昆虫细胞Hi5细胞;所述编码串联式二聚体新冠抗原的核酸构建到昆虫杆状病毒载体(例如pFastBac1)中;更优选地,所述编码串联式二聚体新冠前面有抗原的核酸针对昆虫表达系统进行密码子优化,具体地,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
进一步地,采用sf9细胞扩增所述昆虫杆状病毒,收集的病毒粒子上清感染昆虫细胞Hi5细胞,优选地收获时间在48-60小时之间,以镜检40%-60%细胞死亡为准。
具体地,将收获的昆虫细胞Hi5细胞离心去除沉淀,再通过滤膜过滤,进一步除去杂质得上清液;优选地滤膜是0.22μm的滤膜;更进一步地,还包括进一步纯化得到所述串联式二聚体新冠抗原的步骤,优选地将上清液通过镍亲和柱层析进行纯化;具体地,在4℃条件下,使细胞上清通过镍亲和柱(Histrap HP,Cytiva),用缓冲液A(20mM Tris,150mMNaCl,pH 8.0)洗涤,除去非特异结合蛋白;然后,用低浓度咪唑(20mM Tris,150mM NaCl,pH8.0,20mM咪唑)洗脱杂蛋白,用缓冲液B(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0,300mM咪唑)将目的蛋白从HisTrap上洗脱下来,并用10KDa浓缩管将洗脱液浓缩换液30倍以上至缓冲液A,终体积小于1mL;最后,通过SuperdexTM200 Increase 10/300PG柱子(Cytiva)进行分子筛层析,以进一步纯化目的蛋白;其中,分子筛层析缓冲液为PBS缓冲液(8mM Na2HPO4,136mMNaCl,2mM KH2PO4,2.6mM KCl,pH 7.4)。
本发明还提供一种串联式二聚体新冠疫苗的制备方法,其包括如下步骤:采用如上所述的制备方法得到串联式二聚体新冠抗原的步骤,以及添加佐剂的步骤而获得。
优选地,所述佐剂是SWE佐剂;优选地将串联式二聚体新冠抗原用PBS稀释,优选地稀释至30-50μg/mL,最优为40μg/mL;将稀释后的免疫原与SWE佐剂按照体积比1:0.9-1.1的比例混合、乳化,制备得到疫苗。
具体实施方式中,所述疫苗被制备成鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式;优选地,所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂;优选地,所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂;优选地,所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
由此,本发明还提供所述的串联式二聚体新冠疫苗的制备方法得到串联式二聚体新冠疫苗。
本发明采用昆虫杆状病毒载体系统进行串联式二聚体新冠疫苗的生产,结合杆状病毒载体系统安全有效,可快速扩大生产的规模的特点,可以更迅速的应对新发的流行变异株的出现。和哺乳的CHO系统比较,抗性筛选高产稳定克隆株大约需要3-6个月的时间,但是昆虫杆状病毒载体系统可在一个月内达到大规模生产的免疫原蛋白,能够更快速的来应对。进一步地,本发明中通过佐剂研究而采用SWE佐剂,和传统铝盐佐剂相比较,具有明显的免疫优势,可以有效和强烈的激活机体的B细胞和T细胞免疫。在相同免疫剂量的情况下,可以显著提高结合抗体和假病毒中和抗体的产生。保护的点是SWE佐剂在昆虫二联苗的搭配使用方案。
因此,本发明尤其是结合新的昆虫杆状病毒载体系统和SWE佐剂的联合使用,证明了昆虫杆状病毒载体系统表达的的串联式二聚体新冠疫苗具有良好的免疫原性,可以激发机体产生高水平的结合抗体,以及高水平的中和抗体。与PP-Bac相比较,PB-Bac针对阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔等具有更佳的假病毒中和效果,而对于后期出现的奥密克戎变异株,DO-Bac展现出了更佳且更广的假病毒中和谱。
其中,进一步地,昆虫杆状病毒系统表达二价新冠疫苗免疫原的选择,DO构建选择了Delta和Omicron BA.1的RBD进行串联表达,其优势之一是奥密克戎RBD二聚体的昆虫系统表达产量和纯度不佳,而德尔塔的RBD的引入很好的弥补了这一缺点,可很好的提升蛋白产量和蛋白纯度;优势之二是德尔塔含有L452R的氨基酸位点突变,后期出现的奥密克戎毒株逐步演化后又出现了L452R的突变,也保证了疫苗对后续毒株的良好中和保护作用。
附图说明
图1.PP-Bac分子筛纯化和SDS-PAGE胶图。
图2.PB-Bac的分子筛和SDS-PAGE胶图。
图3.DO-Bac的分子筛和SDS-PAGE胶图。
图4.PP-Bac的分析超速离心鉴定。
图5.PB-Bac的分析超速离心鉴定。
图6.DO-Bac的分析超速离心鉴定。
图7.免疫流程安排。
图8.PP-Bac、PB-Bac和DO-Bac的ELISA效价测定。
图9.免疫和采血方案。
图10.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac SWE免疫后血清ELISA检测。
图11.SWE佐剂和昆虫系统蛋白免疫小鼠脾细胞的Elispot测定。
图12.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠原型株的假毒中和。
图13.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠阿尔法株的假毒中和。
图14.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠贝塔株的假毒中和。
图15.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠伽马株的假毒中和。
图16.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠德尔塔株的假毒中和。
图17.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠奥密克戎BA.1株的假毒中和。
图18.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠奥密克戎BA.2株的假毒中和。
图19.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠奥密克戎BA.2.12.1株的假毒中和。
图20.PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac针对新冠奥密克戎BA.4/5株的假毒中和。
图21.肺脏和鼻甲骨qPCR测定。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1:SARS-CoV-2原型株RBD二聚体(PP-Bac),原型株RBD-贝塔RBD二聚体(PB-Bac)以及德尔塔RBD-奥密克戎RBD二聚体(DO-Bac)构建体的设计
本实施例中,分别设计了SARS-CoV-2原型株RBD二聚体(PP-Bac),原型株RBD-贝塔RBD二聚体(PB-Bac)以及德尔塔RBD-奥密克戎RBD二聚体(DO-Bac)构建体的设计,具体方案如下:
(1)将两条新冠病毒原型株RBD结构域R319-K537区段(SEQ ID NO.1)的序列直接串联起来,在其N端连接GP67B信号肽(SEQ ID NO.2),在其C端加上6个组氨酸(SEQ IDNO.3),得到原型株RBD-原型株RBD同源二聚体PP-Bac建体(SEQ ID NO.4),
(2)将新冠病毒原型株RBD结构域R319-K537区段的序列(SEQ ID NO.1),贝塔变异株RBD结构域R319-K537区段的序列(SEQ ID NO.5)直接串联起来,在其N端连接GP67B信号肽(SEQ ID NO.2),在其C端加上6个组氨酸(SEQ ID NO.3)标签,得到原型株RBD-贝塔RBD嵌合RBD二聚体PB-Bac构建体(SEQ ID NO.6),
(3)将新冠病毒德尔塔RBDR319-K534(SEQ ID NO.7)和密克戎BA.1RBD结构域V320-K537区段的序列(SEQ ID NO.8)串联起来,在其N端连接GP67B信号肽(SEQ ID NO.2),在其C端加上6个组氨酸(SEQ ID NO.3)标签,得到德尔塔-奥密克戎嵌合RBD二聚体DO-Bac构建体(SEQ ID NO.9)。
实施例2:SARS-CoV-2的PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac蛋白的表达与纯化
1.表达质粒的构建
上述实施例1中所设计的两种构建体的氨基酸序列使用昆虫细胞Hi5细胞进行密码子优化,对应的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;DNA序列由苏州安升达生物技术公司和南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
2.测序正确的重组pFastBac1质粒转化DH10BacTME.coli
a.取100μL的MAXDH10BacTM感受态细胞置于冰上
b.加50-100ng重组pFastBac1质粒至100μL DH10BacTM感受态细胞中,轻轻用手指弹管壁即可,不要用枪头吹打,冰浴30min。
c.42度静置热激45秒,EP管插回冰上,静置3-5分钟。
d.超净台中加入900μL LB培养基或者SOC培养基至每个EP管。
e.37度,225rpm转速进行培养2-4小时。
f.取50μL培养的菌液涂三抗平板(含有50μg/mL卡那霉素,7μg/mL庆大霉素,10μg/mL四环霉素,100μg/mL Bluo-gal,40μg/mL IPTG的LB平板)。
g.将平板倒置于37度烘箱中培养,一般24到48小时可长出蓝白斑清晰的均匀菌落。
h.挑选均匀的白斑,每个单克隆加至50μL-3mL含有三种抗生素(含有50μg/mL卡那霉素,7μg/mL庆大霉素,10μg/mL四环霉素)的LB液态培养基中,37度,225rpm培养。
i.M13引物菌液PCR鉴定白斑是否是阳性克隆
20μL PCR体系:
PCR程序:
1%的琼脂糖胶鉴定条带(上大mark,如λ/HindIII DNA Marker),若bacmid重组成功,条带大小应该是2300bp加上目的基因bp。
j.PCR菌液鉴定为阳性的白斑菌液转接至3ml三抗LB培养基中继续37℃,225rpm培养,提取重组Bacmid。
3.得到质量良好的重组Bacmid后,用sf9昆虫细胞做转染
a.预先准备好悬浮培养的sf9细胞铺6孔板,每孔1×106个细胞,摇晃均匀后将六孔板置于27度培养箱中培养至细胞完全贴壁。
c.在超净台中,取转染试剂(FuGene6)8μL(4度保存,加前将管轻轻上下颠倒5-10次)+无抗培养基100μL,轻轻混匀,标管1,静置5分钟;Bacmid 2μL+无抗培养基100μL,轻轻混匀,标管2,静置5分钟;管1的溶液转移到管2中(总体积约210μL),轻轻混匀,孵育15-30分钟。
d.将六孔板中的培养基用移液器吸出,每孔加2mL无抗培养基洗2次,第二次洗完先不弃去培养基。
e.步骤c中Bacmid和FuGene6混合的每管加0.8mL无抗培养基,将之前六孔板中的培养基弃去。
f.放入27度培养箱中孵育5h。
g.换液为三抗的LONZA培养基2.5mL,继续培养72小时,离心收上清获得P1。
4.用sf9细胞扩增病毒,Hi5细胞表达抗原蛋白
P1扩P2实验步骤如下:铺细胞sf9,10cm盘铺细胞量为1×107个细胞,加入0.5mLP1病毒,27度培养箱继续培养,3天后用离心机转速500g,5分钟转移上清,避光4℃保存。P2扩P3的步骤和P1扩P2步骤基本一致,从而获得P3代病毒粒子。收集的病毒粒子上清感染Hi5细胞,最佳收获时间在48-60小时之间,一般以镜检50%细胞死亡为宜。
5.蛋白的纯化
感染sf9获得的含有病毒粒子的上清,加入Hi5细胞感染2天后收集上清,离心去除沉淀,再通过0.22μm的滤膜过滤,进一步除去杂质。将上清通过镍亲和柱层析进行纯化;具体地,在4℃条件下,使细胞上清通过镍亲和柱(Histrap HP,Cytiva),用缓冲液A(20mMTris,150mM NaCl,pH 8.0)洗涤,除去非特异结合蛋白;然后,用低浓度咪唑(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0,20mM咪唑)洗脱杂蛋白,用缓冲液B(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0,300mM咪唑)将目的蛋白从HisTrap上洗脱下来,并用10kD浓缩管将洗脱液浓缩换液30倍以上至缓冲液A,终体积小于1ml;最后,通过SuperdexTM200 Increase 10/300PG柱子(Cytiva)进行分子筛层析,以进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为PBS缓冲液(8mM Na2HPO4,136mM NaCl,2mM KH2PO4,2.6mM KCl,pH 7.4)。
PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac二聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果分别如图1、图2和图3可以看出,在80多mL左右均有一个洗脱峰,将该洗脱峰处的洗脱液进行SDS-PAGE分析显示,非还原(不含二硫苏糖醇DTT的上样缓冲液)和还原(含二硫苏糖醇DTT的上样缓冲液)条件下,洗脱蛋白大小都在50kDa左右,符合上述两种三聚体蛋白的分子大小。采用分析型超速离心法鉴定PP-Bac(图4)和PB-Bac(图5),DO-Bac(图6)的蛋白分子量分别为51.7kDa、51.9kDa和46.7kDa,再结合分子筛和SDS-PAGE图片结果,说明三个蛋白均以二聚体的形式稳定存在。证明通过昆虫杆状病毒载体系统纯化得到了PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac二聚体蛋白,说明纯化后的蛋白具有较高的纯度以及较高的蛋白产量。
实施例3:实验动物免疫和样品采集-佐剂效果的比较
为了检测昆虫杆状病毒载体生产的二聚体新冠RBD蛋白的免疫原性,我们将按照表1的方案进行实施例2所得纯化的二聚体蛋白PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac作为免疫原分别免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(维通利华公司),阴性对照(Sham组)采用PBS溶液进行免疫,每组6只小鼠。小鼠分组及免疫剂量情况如表3所示。佐剂使用氢氧化铝佐剂和SWE佐剂。
表1.昆虫系统表达冠状病毒RBD二聚体疫苗不同佐剂比较
具体程序如下:将免疫原PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac分别用PBS稀释至40μg/ml,将稀释后的免疫原与SWE佐剂按照体积比1:1的比例混合、乳化,制备成疫苗。阴性对照组为PBS溶液与SWE佐剂混合。
免疫方案如图7所示。具体地,按照上述方法所得疫苗通过肌肉注射的方式对BALB/c小鼠进行免疫,所有小鼠分别在第0天、第21天进行第一次和第二次免疫,每次100μL的接种体积(含抗原蛋白2μg)。在第35天,对小鼠进行取血,离心收集血清,所得血清于-80℃冰箱保存。
实施例4:通过酶联免疫吸附试验(ELISA),检测SWE佐剂混合的串联式二聚体疫苗PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac诱导产生的抗原特异性抗体滴度
本实施例中,通过酶联免疫吸附试验(ELISA),检测实施例3中采用三聚体蛋白疫苗PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac采用氢氧化铝以及SWE两种佐剂所免疫的小鼠血清的抗原特异性抗体滴度,具体程序如下:
(1)分别将PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac二聚体蛋白用ELISA包被液(索莱宝,C1050)稀释至3μg/mL,向96孔ELISA板(Coring,3590)中每孔加入100μL上述稀释液,4℃放置过夜(12h以上),以进行包被;
(2)倒掉包被液,加入PBS,洗一遍;使用PBS配置的5%脱脂牛奶作为封闭液,加入96孔板中,每孔100μL,室温放置1h,进行封闭,之后用PBS溶液洗一遍;
(3)封闭期间,用封闭液稀释小鼠血清样品;血清样品从20倍起,按照4倍梯度依次进行稀释;具体地,第一个孔加入152μL封闭液和8μl的血清样品混匀,第二个稀释度为封闭液120μL和第一个孔的溶液40μL混匀,依次稀释;稀释完之后,在ELISA板中每孔加入100μL,阴性对照组加入封闭液,37℃孵育2小时,之后使用PBST洗4遍;
(4)向每孔中加入用封闭液1:2000稀释的偶联HRP的羊抗鼠二抗(柏奥易杰,BE0102-100),37℃孵育1.5小时,之后PBST洗4遍;然后加入60μL TMB显色液显色,反应适当时间后加入60μL 2M盐酸终止反应,在酶标仪上检测OD450读值。抗体滴度值被定义为反应值大于2.5倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.5倍背景值时,该样品的滴度定义为最低稀释倍数的一半,即1:10。
第35天采集的血清(二免血清)的免疫原性检测结果如图8所示;昆虫杆状病毒载体系统表达纯化的免疫原PP-Bac,PB-Bac、DO-Bac在氢氧化铝和SWE佐剂的辅助作用下,经过两次免疫,均可以激发小鼠产生RBD特异性的结合抗体。而对于三种免疫原PP-Bac、PB-Bac以及DO-Bac,在2μg/只小鼠的剂量下SWE佐剂免疫的小鼠产生了更多的RBD特异性结合抗体,效价达到了106,而在2μg每只小鼠氢氧化铝佐剂免疫的小鼠也可以产生RBD特异性结合抗体,但是其效价只有103左右,SWE佐剂免疫的PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac的结合抗体和氢氧化铝佐剂免疫的结合抗体水平差异显著(**)。说明对于昆虫杆状病毒载体系统表达的三种二聚体疫苗,SWE佐剂的效果显著优于氢氧化铝佐剂的免疫效果。
实施例5:SWE佐剂的昆虫杆状病毒载体疫苗ELISA测定
首先之前所示的实验方法,用SWE佐剂重新免疫一批小鼠,更新免疫方案,按照图9的方案进行免疫和采血。免疫原包括PBS,PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac,免疫剂量为5μg/只小鼠,6-8周龄的雌性BalBc小鼠,采用SWE的佐剂进行三次免疫,三次采血。对采的血清进行ELISA和假病毒中和实验鉴定,检测其结合抗体和中和抗体的效价。
SWE佐剂免疫的PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac均可以激发小鼠产生RBD特异性结合抗体,结果显示一免后的结合抗体效价在103左右,DO-Bac和PP-Bac之间差异不显著,但是DO-Bac显著高于PB-Bac(*)。二免之后三种抗原激发的结合抗体效价在105左右,DO-Bac显著高于PP-Bac(*),但是PB-Bac和DO-Bac之间差异不显著。三免之后PP-Bac和PB-Bac差异不显著,都接近106,但是DO-Bac显著高于PP-Bac(*)和PB-Bac(*)。综合以上结果,采用SWE作为佐剂的三种昆虫杆状病毒载体的二聚体串联疫苗均可以产生高效的RBD特异性结合抗体,综合的DO-Bac的效果稍优于PP-Bac和PB-Bac。
实施例6:SWE佐剂的昆虫杆状病毒载体疫苗Elispot测定
采用实施例5中的三免后小鼠,三免后2周处死小鼠取脾细胞,用RBD特异性多肽库进行刺激18-36h,然后对三种细胞因子IFN-γ、IL-2,IL-4,进行Elispot检测。
具体的实验方法如下:
1.先将培养皿中加入20mL 1640培养基备用。
2.小心摘取脾脏,并转移至培养皿中。
3.用研磨棒缓慢研磨脾细胞(在100m的细胞筛上)。
4.将研磨液转移到50mL离心管中,500g离心5分钟。
5.加入4mL红细胞裂解液裂解5分钟后,加入20mL1640培养基稀释,并500g离心5分钟。
6.倒掉培养基后,先加入1mL的1640,将团状的细胞挑出,只留分散均匀的细胞。
7.再次加入20mL培养基,500g,离心5min后倒掉。
8.用1mL完全培养基重悬。
9.细胞计数器计数。
10.在已经封闭好的elispot板中加入含蛋白或多肽的培养基,并小鼠脾细胞(5×105)。
11.小心转移到培养箱培养18-36小时,把板子从培养箱拿出进行后续步骤。
12.裂解细胞:倾倒孔内的细胞及培养基,200μL/孔加入冰冷的去离子水,4度冰浴10分钟(低渗法裂解细胞)。
13.洗涤:每孔加入200μL的PBST,洗涤5次。最后一次,在吸水纸上扣干。
14.加检测抗体:每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体,室温孵育2h。
15.洗涤:每孔加入200μL的PBST,洗涤5次。最后一次,在吸水纸上扣干。
16.加酶标亲和素:每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素,室温孵育1小时。
17.洗涤:每孔加入200μL的PBST,洗涤5次。最后一次,在吸水纸上扣干。
18.显色:每孔加入100μL的显色液,室温静置5-15分钟,注意避光。
19.洗涤晾干:待斑点生长到适合的大小之后,用去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置10-30分钟,让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内,防止膜发脆、破裂。
20.结果分析:斑点计数(ELISPOT reader)。
SWE佐剂搭配昆虫杆状病毒载体系统表达的PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac二聚体蛋白免疫小鼠的Elispot结果如图11所示,三种免疫原与PBS对照组比较,均可以显著的刺激IL-2,IL-4以及IFN-γ三种分子的产生,说明SWE佐剂可以帮助昆虫杆状病毒载体系统表达的二聚体蛋白苗产生良好的T细胞反应,补齐重组亚单位疫苗T细胞反应差的短板。这三种因子中,IL-4最强,IL-2次之,IFN-γ更弱一些,PP-Bac,PB-Bac和DO-Bac三种免疫原之间差异不明显,但是与PBS对照组的差异都达到显著性差异(**),验证了SWE佐剂不仅能够激发B细胞反应,还可以刺激机体产生T细胞反应,延长有效抗体的作用时间,从而延长疫苗的保护效果时间。
实施例7:通过假病毒中和实验,检测SWE佐剂的昆虫系统二聚体蛋白疫苗PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac针对新冠病毒假病毒所产生的中和抗体滴度。
使用新冠病毒假病毒检测系统,分别检测第二次免疫后的(即第35天采集的)以及第三次免疫后的(第56天采集的)小鼠血清对新冠病毒原型株、阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔、奥密克戎BA.1、奥密克戎BA.2、奥密克戎BA.2.12.1、奥密克戎BA.4/5变异株的假病毒的50%假病毒中和滴度(pVNT50)。
本实施例中使用的新冠病毒假病毒为基于水疱性口炎病毒(VSV)骨架制备的展示新冠病毒S蛋白的假病毒,制备方法参见已经公开发表论文的方法部分(Effects of aProlonged Booster Interval on Neutralization of Omicron Variant,N Engl J Med,2022,PMID:35081296)。
检测新冠病毒假病毒(以下简称假病毒)中和抗体滴度的方法如下:
在96孔板中,将免疫小鼠血清按2倍梯度倍比稀释,初始浓度为1:20,共设置11个浓度梯度;之后,将稀释的免疫小鼠血清与假病毒分别混合(空白培养基与假病毒混合作为阴性对照(NC),未与假病毒混合的空白培养基作为空白对照(MOCK),37℃孵育1小时;然后,将免疫小鼠血清-假病毒混合液转移至已铺满Vero细胞的96孔板中,37℃孵育15小时后,通过CQ1共聚焦细胞成像仪(Yokogawa)检测并计算阳性细胞数值,然后,在GraphPad Prism软件中绘制拟合曲线,计算50%中和时对应的血清稀释度的倒数,即为50%假病毒中和滴度pVNT50。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对原型株假病毒中和抗体滴度检测结果如图12所示。二免后PP-Bac对原型株的50%假病毒中和滴度为236,PB-Bac为526,DO-Bac为734,数值上DO-Bac最高,但是统计学分析显示PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。三免后PP-Bac对原型株的50%假病毒中和滴度为12403,PB-Bac为13945,DO-Bac为6606,PB-Bac数值最高,但是PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。说明
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对阿尔法株假病毒中和抗体滴度检测结果如图13所示。二免后PP-Bac对阿尔法株的50%假病毒中和滴度为413,PB-Bac为1319,DO-Bac为2714,数值上DO-Bac最高,但是统计学分析无统计学差异。三免后PP-Bac对阿尔法株的50%假病毒中和滴度为13294,PB-Bac为48113,DO-Bac为20341,PB-Bac数值最高,但是PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。说明SWE混合三种抗原的疫苗对阿尔法株都可以有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对贝塔株假病毒中和抗体滴度检测结果如图14所示。二免后PP-Bac对贝塔株的50%假病毒中和滴度为47,PB-Bac为1530,DO-Bac为569,数值上PB-Bac最高,PB-Bac显著高于PP-Bac和DO-Bac,DO-Bac显著高于PP-Bac。三免后PP-Bac对贝塔株的50%假病毒中和滴度为10335,PB-Bac为55742,DO-Bac为15847,PB-Bac数值最高,但是PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。说明第三次免疫会大大提升三种疫苗对贝塔假病毒的中和效果,SWE混合三种抗原的疫苗对贝塔株都可以有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对伽马株假病毒中和抗体滴度检测结果如图15所示。二免后PP-Bac对伽马株的50%假病毒中和滴度为56,PB-Bac为5310,DO-Bac为891,数值上PB-Bac最高,PB-Bac显著高于PP-Bac和DO-Bac,DO-Bac和PP-Bac无显著性差异。三免后PP-Bac对伽马株的50%假病毒中和滴度为10559,PB-Bac为48879,DO-Bac为10454,PB-Bac数值最高,但是PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。说明第三次免疫会大大提升三种疫苗对伽马假病毒的中和效果,SWE混合三种抗原的疫苗对伽马株都可以有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对德尔塔株假病毒中和抗体滴度检测结果如图16所示。二免后PP-Bac对德尔塔株的50%假病毒中和滴度为304,PB-Bac为368,DO-Bac为6053,数值上DO-Bac最高,DO-Bac显著高于PP-Bac和PB-Bac。三免后PP-Bac对德尔塔株的50%假病毒中和滴度为8784,PB-Bac为11899,DO-Bac为20243,DO-Bac数值最高,但是PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。说明第三次免疫会大大提升三种疫苗对德尔塔假病毒的中和效果,SWE混合三种抗原的疫苗对德尔塔株都可以有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对奥密克戎BA.1株假病毒中和抗体滴度检测结果如图17所示。二免后PP-Bac对奥密克戎BA.1株的50%假病毒中和滴度为10,PB-Bac为17,DO-Bac为177,数值上DO-Bac最高,DO-Bac显著高于PP-Bac和PB-Bac,但是总体数值偏低。三免后PP-Bac对奥密克戎BA.1株的50%假病毒中和滴度为1898,PB-Bac为3472,DO-Bac为11763,DO-Bac数值最高,但是PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac无统计学差异。说明第三次免疫会大大提升三种疫苗对奥密克戎BA.1株假病毒的中和效果,SWE混合三种抗原的疫苗对奥密克戎BA.1株都可以有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对奥密克戎BA.2株假病毒中和抗体滴度检测结果如图18所示。二免后PP-Bac对奥密克戎BA.2株的50%假病毒中和滴度为10,PB-Bac为12,DO-Bac为71,数值上DO-Bac最高,DO-Bac显著高于PP-Bac和PB-Bac,但是总体数值偏低。三免后PP-Bac对奥密克戎BA.2株的50%假病毒中和滴度为1395,PB-Bac为1566,DO-Bac为5023,DO-Bac数值最高,但是无统计学差异。说明第三次免疫会大大提升三种疫苗对奥密克戎BA.2株假病毒的中和效果,SWE混合三种抗原的疫苗对奥密克戎BA.2株都可以有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对奥密克戎BA.2.12.1株假病毒中和抗体滴度检测结果如图19所示。二免后PP-Bac对奥密克戎BA.2.12.1株的50%假病毒中和滴度为10,PB-Bac为17,DO-Bac为90,数值上DO-Bac最高,DO-Bac显著高于PP-Bac(**)和PB-Bac(*),但是总体数值偏低。三免后PP-Bac对奥密克戎BA.2.12.1株的50%假病毒中和滴度为1443,PB-Bac为1458,DO-Bac为4856,DO-Bac数值最高,但是无统计学差异。说明第三次免疫会大大提升疫苗对奥密克戎BA.2.12.1假病毒的中和效果,SWE混合三种抗原的疫苗对奥密克戎BA.2.12.1都有良好的中和作用效果。
各免疫组小鼠在二免和三免后的血清对奥密克戎BA.4/5株假病毒中和抗体滴度检测结果如图20所示。二免后PP-Bac对奥密克戎BA.4/5株的50%假病毒中和滴度为10,PB-Bac为10,DO-Bac为37,数值上DO-Bac最高,但是无显著差异且总体数值偏低。三免后PP-Bac对奥密克戎BA.4/5株的50%假病毒中和滴度为209,PB-Bac为120,DO-Bac为952,DO-Bac数值最高。SWE混合三种抗原的三种疫苗对奥密克戎BA.4/5株仍然具有保护效果,相比较PP-Bac和PB-Bac,DO-Bac效果较好。
SWE佐剂辅助昆虫杆状病毒载体系统表达的PP-Bac、PB-Bac和DO-Bac可对多种新冠流行变异株有良好的假病毒中和效果。与PP-Bac和PB-Bac相比较,DO-Bac对奥密克戎BA.1,BA.2,BA.2.12.1,BA.4/5仍然具有良好的广谱的假毒中和效果。
实施例8攻毒保护实验
小鼠的分组如表2所示:PBS和DO-Bac分别免疫三组BALB/c小鼠(6-8周雌性,维通利华),按照之前安排的时间节点进行三次免疫(图9),在三免后2周进行攻毒保护实验,攻毒种类包括新冠病毒流行变异株德尔塔,奥密克戎BA.1和奥密克戎BA.2。
表2实验小鼠的分组和对应攻毒种类
编号 | 免疫分组 | 免疫剂量 | 佐剂 | 攻毒种类 |
1 | PBS | 100μL | SWE | 德尔塔 |
2 | DO-Bac | 5μg | SWE | 德尔塔 |
3 | PBS | 100μL | SWE | 奥密克戎BA.1 |
4 | DO-Bac | 5μg | SWE | 奥密克戎BA.1 |
5 | PBS | 100μL | SWE | 奥密克戎BA.2 |
6 | DO-Bac | 5μg | SWE | 奥密克戎BA.2 |
由于德尔塔毒株的刺突蛋白S不含有N501Y突变,从而对于普通的BALB/c小鼠不易感,因此在攻毒前(5天)需要提前用Ad5-hACE2处理感染,再通过滴鼻进行新冠病毒德尔塔毒株攻击。攻毒奥密克戎BA1和奥密克戎BA.2的刺突蛋白S含有N501Y突变,对普通的BALB/c小鼠易感,因此实验组可直接通过滴鼻进行新冠病毒奥密克戎BA.1和BA.2攻击。
肺脏标本采集:攻毒后第3天分别采集攻毒感染后小鼠的鼻甲骨和肺脏组织(分为两部分),其中将鼻甲骨和部分肺脏-80℃冰箱冻存,用于测定病毒载量。剩余肺脏置于固定液中保存用于制备病理切片。
RNA的提取(P3实验室)
1.将鼻甲骨和部分肺脏放到加有500μL DMEM的研磨管中用生物安全型组织匀浆器进行研磨,研磨完之后用生物安全型离心机离心转速7000g,离心5分钟,把400μL上清转入事先做好标记的空管中,加140μL研磨后上清到预先加好RNA提取试剂盒的AVL(560μL)混匀,放置10分钟,然后加入560μL的100%乙醇溶液,混匀,病毒即被灭活。
2.按照QIAGEN病毒RNA提取试剂盒的说明书,进行RNA提取,分次把上清加入到吸附柱中,结合2-5分钟,然后13000rpm离心1分钟,弃下液,用AW1洗一次,13000rpm离心1分钟弃下液,用600μL AW2洗一次,13000rpm离心1分钟弃下液,空转13000rpm离心5分钟弃下液,把吸附柱放在新的进口无RNA酶的EP管上,用80μL DEPC水进行洗脱,13000rpm离心2分钟,为了提高产量,可以洗脱两次,提取完的RNA保存在-80冰箱备用。
qPCR实验鉴定
表3 qPCR体系配置
试剂 | 体系(单位:μL) |
2*qPCR | 10 |
25FastKing Enzyme Mix | 0.8 |
N-gene-F | 0.5 |
N-gene-R | 0.5 |
N-gene-probe | 0.4 |
ddH2O | 2.8 |
模板RNA | 5 |
体系体积 | 20 |
表4qPCR程序
N-gene-F:CCCTGTGGGTTTTACACTTAA;
N-gene-R:ACGATTGTGCATCAGCTGA;
N-gene-probe:5'-the FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
按照表3和表4进行qPCR体系的配置和qPCR程序的设定进行实验,上下游引物及探针按照上面所述进行合成,需平行设定标准质粒的不同浓度梯度。在肺脏和鼻甲骨qPCR的实验结果如图21所示,在肺脏中在gRNA水平DO-Bac免疫组和PBS对照组在病毒载量水平差异显著,其中德尔塔病毒载量降低120倍(**),奥密克戎BA.1病毒载量降低2565倍(**),奥密克戎BA.2病毒载量降低50倍(ns),说明DO-Bac对德尔塔和奥密克戎BA.1变异株显著地降低了小鼠肺脏中gRNA载量。小鼠鼻甲骨在gRNA水平DO-Bac免疫组和PBS对照组相比显著降低,其中德尔塔病毒载量降低1047倍(**),奥密克戎BA.1病毒载量降低314倍(**),奥密克戎BA.2病毒载量降低了316倍(*),说明DO-Bac对德尔塔、奥密克戎BA.1和奥密克戎BA.2都显著地降低了小鼠鼻甲骨中gRNA载量。实验结果证明在攻毒保护实验中,与对照相比较,DO-Bac可以保护小鼠在上呼吸道和下呼吸道显著降低病毒的载量。
综上所述,本发明昆虫杆状病毒载体系统表达的的PP-Bac,PB-Bac,DO-Bac二聚体疫苗辅以SWE佐剂共同免疫小鼠,可诱导更强且更广谱的免疫反应;当前流行的新冠病毒毒株变化较快,而未来流行毒株的种类及其免疫学特点都极难预测,而假病毒中和实验和真病毒攻毒的攻毒保护实验结果都显示昆虫系统表达的DO-Bac疫苗佐以SWE佐剂对于目前流行的新冠病毒流行变异株的广谱预防和保护作用。而这些数据也证明昆虫细胞表达的异源二聚体DO-Bac加SWE作为疫苗的上述特性对于预防流行毒株的变化或者多种毒株的共流行具有极大的应用价值。
Claims (10)
1.一种串联式二聚体新冠抗原的制备方法,其包括以下步骤:将编码串联式二聚体新冠抗原的核酸在昆虫表达系统中进行表达,所述串联式二聚体新冠抗原是将两条SARS-CoV-2株型中的相同株型的RBD或不同株型的RBD之间串联得到;
具体地,所述SARS-CoV-2株型选自原型株、贝塔株、德尔塔、奥密克绒株;
更优选地,所述串联式二聚体新冠抗原是原型株RBD二聚体,原型株RBD-贝塔RBD二聚体或德尔塔RBD-奥密克戎RBD二聚体。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述RBD选择RBD结构域的第315至325位至第530至545位的区段,特别地其选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8;
任选地,两个RBD之间通过连接序列连接,优选地,所述连接如(GGS)n所示的连接序列,其中,n表示GGS的个数,n为1至10之间的整数,优选为1-5之间的整数。
3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,在所述编码串联式二聚体新冠抗原的核酸的序列的5’端具有编码信号肽的序列,优选为GP67B信号肽,3’端加上组氨酸和终止密码子得到表达盒,进行克隆表达,筛选正确的重组子,然后将其转染所述昆虫表达系统的细胞进行表达,收集细胞培养上清,从中分离获得所述重组抗原;
优选地,所述表达盒的编码的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.9所示。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述昆虫表达系统是昆虫细胞Hi5细胞;所述编码串联式二聚体新冠抗原的核酸构建到昆虫杆状病毒载体(例如pFastBac1)中;更优选地,所述编码串联式二聚体新冠前面有抗原的核酸针对昆虫表达系统进行密码子优化,具体地,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
5.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,采用sf9细胞扩增所述昆虫杆状病毒,收集的病毒粒子上清感染昆虫细胞Hi5细胞,优选地收获时间在48-60小时之间,以镜检40%-60%细胞死亡为准。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,将收获的昆虫细胞Hi5细胞离心去除沉淀,再通过滤膜过滤,进一步除去杂质得上清液;优选地滤膜是0.22 μm的滤膜;更进一步地,还包括进一步纯化得到所述串联式二聚体新冠抗原的步骤,优选地将上清液通过镍亲和柱层析进行纯化;具体地,在4℃条件下,使细胞上清通过镍亲和柱(Histrap HP,Cytiva),用缓冲液A(20 mM Tris,150 mM NaCl, pH 8.0)洗涤,除去非特异结合蛋白;然后,用低浓度咪唑(20 mM Tris,150 mM NaCl,pH 8.0,20mM 咪唑)洗脱杂蛋白,用缓冲液B(20 mM Tris,150 mM NaCl,pH 8.0,300 mM咪唑)将目的蛋白从HisTrap上洗脱下来,并用10 KDa浓缩管将洗脱液浓缩换液30倍以上至缓冲液A,终体积小于1mL;最后,通过SuperdexTM200 Increase 10/300PG柱子(Cytiva)进行分子筛层析,以进一步纯化目的蛋白;其中,分子筛层析缓冲液为PBS缓冲液(8 mM Na2HPO4,136 mM NaCl,2 mM KH2PO4,2.6mM KCl,pH 7.4)。
7.一种串联式二聚体新冠疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:采用如权利要求1-6任一项所述的制备方法得到串联式二聚体新冠抗原的步骤,以及添加佐剂的步骤而获得。
8.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述佐剂是SWE 佐剂;优选地将串联式二聚体新冠抗原用PBS稀释,优选地稀释至30-50µg/mL ,最优为40 µg/mL;将稀释后的免疫原与SWE佐剂按照体积比1:0.9-1.1的比例混合、乳化,制备得到疫苗。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述疫苗被制备成鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式;优选地,所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂;优选地,所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂;优选地,所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
10.如权利要求7至9任一项所述的串联式二聚体新冠疫苗的制备方法得到串联式二聚体新冠疫苗。
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