JPH08507754A

JPH08507754A - Ｍｈｃ−１拘束性抗原提示におけるａｔｐ−ユビキチン依存蛋白分解の役割およびそのインヒビター

Info

Publication number: JPH08507754A
Application number: JP6518184A
Authority: JP
Inventors: ゴールドバーグ、アルフレッド・エル; ロック、ケネス・エル
Original assignee: ザ・プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ; ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティテュート
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1994-01-27
Publication date: 1996-08-20
Also published as: AU6169194A; CA2155554A1; EP0684829A1; WO1994017816A1; EP0684829A4; AU676721B2

Abstract

(57)【要約】主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子による提示のための抗原のプロセシングを阻害する方法および薬物が本明細書に記載される。詳細には、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路のインヒビターが記載され、これはＭＨＣ−Ｉ抗原提示を阻害することができる。これらの方法および薬物は、自己免疫疾患の処置に、そして移植された臓器および移植片の拒絶の低減に有用であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】ＭＨＣ−１拘束性抗原提示におけるＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解の役割およびそのインヒビター説明背景免疫系が身体組織を攻撃し破壊することが原因となる疾患は数多くある。これらの状態は重篤な病態を引き起こし、多くの場合死に至り得る。これらの疾患のうち幾つか、例えば全身性エリテマトーデスは、個体の免疫系が自身の細胞に対してそれが外来性または病原性であるかのごとく働くことが原因である。これらの疾患をまとめて自己免疫疾患と称する。別の疾患は、身体組織中に存在する分子、例えば治療薬に対して免疫系が応答することが原因である。さらに別の疾患は、移植された体内の外来性組織に免疫系が応答する時に起こる。外来組織に対する免疫反応は、移植における移植された臓器または移植片の機能不全の主要な原因であり、この方法に対する主たる障壁である。これらの疾患において破壊的免疫反応を引き起こす細胞はリンパ球であり、大多数の例ではＴリンパ球がこれらの反応に絶対的役割を果たしている。免疫反応は、Ｔリンパ球が、抗原提示細胞の表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原のフラグメントを認識する時に開始する。ＭＨＣ分子に結合した抗原性ペプチドはＴ細胞を刺激し、抗原−ＭＨＣ複合体を有する細胞に対して応答するようこれらに命令する。幾つかの異なった種類のＴリンパ球がある。或る種の細胞表面分子の発現によって区別される二つの主なＴリンパ球サブセットは、それらの特異性および機能を異にしている。ＣＤ４分子を発現するＴ細胞はＭＨＣクラス１１分子により提示される抗原に特異的であって、通常、抗体または炎症反応を剌激する。ＣＤ８分子を発現するＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される抗原に特異的であって、宿主細胞を殺すよう機能する。このＣＤ８⁺Ｔ細胞は、上記の免疫仲介疾患の幾つかにおいて組織の損壊を仲介する。免疫仲介疾患の処置への治療的アプローチは、リンパ球の反応の遮断を目的としている。抗リンパ球グロブリンのような或る治療法は、Ｔ細胞の排除をめざしている。シクロスポリンＡおよびステロイドのような別の治療法は、リンパ球活性化を阻害することによりリンパ球の反応を遮断することをめざしている。細胞相互作用分子に対するモノクローナル抗体による処置のような、さらに別の治療法は、他の細胞とリンパ球との相互作用の遮断をめざしている。これらの治療法には全て、有意な望ましくない副作用がある。薬物の幾つかには、付随する毒性がある。例えばシクロスポリンは腎毒性を伴っており、ステロイドはクッシング病を惹起する。モノクローナル抗体は抗体に対する免疫反応を伴い、持続的治療を無効とする。全ての場合において、免疫抑制は感染に対する感受性の増大を招き、これは致死的となり得る。Ｔ細胞の反応の制御または変化へのより良いアプローチは治療上極めて有益となるであろう。発明の要約様々な自己免疫疾患の処置および移植された臓器または移植片の拒絶の防止に有用な、細胞溶解性免疫反応を遮断する薬物および方法が、本明細書に記載される。これらの方法および薬物は、ＭＨＣ−クラスＩ分子上の細胞およびウイルス抗原の、Ｔ細胞に対する初期の提示を防止することによって、細胞性免疫の成立を遮断する。この方法は、細胞内蛋白がプロセシングされてＭＨＣ−１分子に結合する抗原性ペプチドになることを防止または減少させるための、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路のインヒビターを使用することからなる。本発明は、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路の初期段階（ユビキチンの活性化）および後期段階（細胞内蛋白の、ペプチドへの開裂）の阻害が、ＭＨＣ− １分子へのペプチドの結合の成立を遮断することにより、ＭＨＣ１−抗原提示を阻害し得るということを示す、出願人等の業績に由来する。この仕事は、ＭＨＣ −１提示のためのＭＨＣ−１で提示される抗原のプロセシングにおけるこのサイトゾル蛋白減成系の役割に対する強力な証拠を提供するものである。さらに、出願人等は、ＡＴＰ−ユビキチン経路の必須成分である、プロテオソーム（多触媒プロテアーゼ複合体）の機能の新たな特徴を発見した。本出願人等の仕事の結果、抗体仲介性または炎症性反応に影響することなく細胞溶解性免疫反応を低下させるための方法および薬物が提供される。したがって本発明は、全身性免疫抑制という付随する欠点を伴わない自己免疫疾患および移植体拒絶の防止に有用な治療薬を提供するに相違ない。詳細には、本出願人等は、抗原提示を剌激するとして古くから知られてきたガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）が、プロテアソームの複数のペプチダーゼの相対活性を変え、その結果、ＭＨＣ−１結合ペプチド上に見いだされる特徴的カルボキシ末端残基を有するペプチドの生成を促進することを発見した。塩基性残基のカルボキシ側で開裂させるトリプシン様ペプチダーゼ、および疎水性残基の後ろで開裂させるキモトリプシン様ペプチダーゼは高い活性を有することが判明し、一方、酸性残基の後ろで開裂させるペプチジルグルタミルペプチダーゼは活性が低かった。さらに、プロテアソームに対するγ−ＩＦＮのこの効果は、ＭＨＣ遺伝子座の二つの遺伝子、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７の発現に依存する。第二に、本出願人等は、ＭＨＣ−Ｉ抗原提示は、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路の初期段階であるユビキチン複合体形成の不活性化によって遮断され得ることを立証した。非許容温度において、クラスＩ拘束性抗原提示は、熱不安定性ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を発現する突然変異体セルライン中で阻害されることが判明した。本出願人等はさらに、キモトリプシン様プロテアーゼのインヒビターであるキモスタチンが、抗原提示細胞によるＭＨＣ−Ｉ提示を阻害することを立証した。その他のインヒビター、とりわけプロテアソームのキモトリプシン様およびトリプシン様活性のインヒビターが、さらに本明細書中に記載される。図面の簡単な説明図１は、Ｕ９３７細胞由来のプロテアソームのペプチダーゼ活性に及ぼすガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）の効果を示す図である。上側の図は、対照細胞およびγ−ＩＦＮで処置された細胞由来のプロテアソーム画分による、示された基質の加水分解を示している。下側の図は、同じプロテアソーム画分による基質の開裂速度の動力学的分析を示している。図２は、精製された２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームのペプチダーゼ活性に及ぼすγ−ＩＦＮの効果を示す図である。図３は、野生型およびＭＨＣ欠失リンパ芽球様細胞由来のプロテアソームのペプチダーゼの活性の相違を示す図である。上側の図はペプチダーゼ活性を示している。下側の図は動力学的分析を示している。図４は、開裂してＭＨＣ−Ｉ分子上に提示されるペプチドを生成する結合の前にあるアミノ酸残基の頻度を示す図である。左側の図はカルボキシ末端のアミノ酸の頻度を示している。右側の図はアミノ末端残基に先行するアミノ酸の頻度を示している。図５（Ａ−Ｄ）は、突然変異体（ｔｓ２０．１０．２）および野生型（Ｅ３６．１２．４）細胞による卵アルブミン（ＯＶＡ）のＭＨＣクラスＩ拘束性提示を示す図である。図６（Ａ−Ｂ）は、Ｈ−２Ｋ^bＭＨＣ重鎖の合成および成熟に及ぼす温度の効果を示す図である。図７（Ａ−Ｂ）は、内因性合成されたＯＶＡ_257-264ペプチドのＭＨＣクラスＩ拘束性提示を示す図である。図８は、キモスタチンによる、卵アルブミン（左）および卵アルブミンペプチド（右）のＭＨＣクラスＩ拘束性提示の阻害を示す図である。詳細な説明本発明は、付随する感染の危険性を伴うＴリンパ球機能の全身的抑制を回避する、細胞溶解性免疫反応の阻害のためのアプローチに関するものである。このアプローチに係る方法および薬物は、自己免疫疾患の処置のために、そして移植された臓器または移植片のような外来組織の拒絶防止のために有用である。この戦略は、Ｔ細胞活性を抑制するのではなく、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子による抗原提示を阻害することである。この試みは、クラスＩＭＨＣ拘束性免疫反応にのみ選択的に作用し、抗体または他のＣＤ４⁺Ｔ細胞仲介反応には作用しないという利点がある。その結果、患者の全身的免疫抑制および感染に対する感受性が低くなるに相違ない。クラスＩ抗原提示に干渉する薬物は、他の、現存する治療法と組み合わせても有用であるに違いなく、これらの治療法において用いられる用量を少なくすることができ、それは毒性を低下させるであろう。詳細には、取り込まれた細胞またはウイルス抗原が、ＭＨＣ−Ｉ分子に結合する、抗原性ペプチドと呼ばれる種類のペプチドへとプロセシングをされることを阻害する方法および薬物が記載される。ＭＨＣ−Ｉ結合ペプチドは、厳密な配列およびサイズ要件を有する。抗原性ペプチドの不在下では、抗原は細胞表面に提示されず、ＣＤ８⁺Ｔ細胞は刺激されない。この方法は、免疫反応の開始の遮断および進行している免疫反応の停止の両方を行なわねばならない。本発明は、ＭＨＣ−Ｉに結合した抗原性ペプチドの生成の際の、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路の役割、とりわけプロテアソーム（多触媒プロテイナーゼ複合体）の役割を支持する、本出願人等の仕事（下記の実施例を参照されたい）に基づくものである。免疫系に対する、細胞内およびウイルス蛋白の提示の最初の段階は、それらがサイトゾル内で小さなペプチドに蛋白分解的に減成されることである（タウンゼントおよびボドマー、１９８９）。次いでこの抗原性フラグメントは特異的膜輸送体を介して小胞体の中に取り込まれ（モナコ、１９９２；ポウィス等、１９９１；スピースおよびデマース、１９９１、ここでＭＨＣ− Ｉ分子と結合する。次にこれらのペプチド−蛋白複合体は、細胞毒性Ｔ細胞への提示のために細胞表面に輸送される。ＭＨＣクラスＩ分子に結合できるペプチドには厳密なサイズおよび配列の制約があることから、抗原性ペプチドへの蛋白の開裂は制御されている過程であると思われる。蛋白分解がリソソームまたはエンドソーム分画に存在しないことは明白である（モリソン等、１９８６）が、開裂酵素の同定ならびにＭＨＣクラスＩ分子上に提示される８−９残基のペプチドを生成する蛋白分解工程の性格および正確な位置は明確に確立されていない。最近の研究には、抗原性ペプチドの生成における、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路の必須構成成分であるプロテアソームが関わっている。真核生物細胞には幾つかの蛋白分解系が存在し、ＡＴＰ−ユビキチン経路が蛋白減成の主要なサイトゾル経路である（フィンレイおよびチャウ、１９９１；ハーシュコおよびシーチャノーヴァー、１９８２；レクシュタイナー、１９８７）。この多段階過程においては、蛋白基質がまず複数のユビキチン部分と共有結合的に複合体形成することにより修飾され、それによりこれらは、２６ＳプロテオソームまたはＵＣＤＥＮと呼ばれる２６Ｓ（１５００ｋＤ）ＡＴＰ依存蛋白分解複合体による迅速な減成のための識別がなされる（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；ゴールドバーグ、１９９２；タナカ等、１９９２；ワクスマン等、１９８７；ハウ等、１９８７）。この大きな構造は、その蛋白分解の核としての２０Ｓ（約７００ｋＤ）プロテアソームならびに多くのさらなる調節および触媒成分を含んでいる（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；オーロフスキー、１９９０；リヴェット、１９８９；ワクスマン等、１９８７；ハウ等、１９８７；アーモン等、１９９０；ドリスコルおよびゴールドバーグ、１９９０；イータン等、１９８９）。２０Ｓプロテオソームの正確な細胞内機能は明らかでない。単離された場合、この粒子は蛋白およびオリゴペプチドを減成することができるが、ユビキチンと複合体形成した蛋白を減成することはできない（ゴールドバーグ、１９９２；タナカ等、１９９２；アーモン、１９９０；ドリスコルおよびゴールドバーグ、１９９０ａ；イータン等、１９８９；ドリスコルおよびゴールドバーグ、１９８９）。２０Ｓプロテアソームは２０−３０ｋＤの別個のサブユニット約１５から成っている。これは、疎水性、塩基性および酸性アミノ酸のカルボキシ側で特異的に開裂させる３または４種の異なった中性ペプチダーゼを含んでいる（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；ゴールドバーグ、１９９２；タナカ等、１９９２；オーロフスキー、１９９０；リヴェット、１９８９）。これらのペプチダーゼはそれぞれキモトリプシン様ペプチダーゼ、トリプシン様ペプチダーゼ、およびペプチジルグルタミルペプチダーゼと呼称される。幾つかのサブユニットをコードしているｃＤＮＡがクローニングされている（タナカ等、１９９２）が、どのサブユニットがこれらの活性の原因であるかはわかっていない。最近の研究は、２０Ｓプロテアソームが、大きさおよびサブユニット構成の点でＭＨＣに連結した低分子量蛋白（ＬＭＰ）粒子に似ていることを見いだした（ドリスコルおよびフィンレイ、１９９２；ゴールドバーグおよびロック、１９９２；モナコおよびマクデヴィット、１９８６；パーハム、１９９０；マルティネスおよびモナコ、１９９１；オリッツ−ナヴァレッテ等、１９９１；グリン等、１９９１；ケリー等、１９９１；モナコおよびマクデヴィット、１９８２；ブラウン等、１９９１；ゴールドバーグ、１９９２；タナカ等、１９９２）。ＬＭＰ粒子は、ＭＨＣ染色体領域にコードされている二つのポリペプチドＬＭＰ２およびＬＭＰ７を含んでいる。ガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）による細胞の処理は抗原提示を剌激し（タウンゼントおよびボドマー、１９８９；ユーデルおよびベニンク、１９９２）、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７および他のＭＨＣ遺伝子の誘導を惹起する（グリン等、１９９１；ケリー等、１９９１；モナコおよびマクデヴィット、１９８２；ヤング等、１９９２）。免疫化学的研究は、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７が２０Ｓプロテオソーム集団の小画分を表わす粒子の二つのサブユニットであることを強く示唆する。しかしながら、これらの遺伝子の除去は、他のＭＨＣ−遺伝子の除去とは対照的に、抗原提示を妨げないということから、免疫反応におけるこれらのサブユニットの重要性は不確実である（アーノルド等、１９９２；マンブルグ等、１９９２）。さらに、γ−ＩＦＮは、ＬＭＰ２および７を欠く突然変異体において、２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームのポリペプチド構成を変えることができる（ヤング等、１９９２）。このように、プロテアソームが抗原提示で役割を果たしているかどうかは不明確である（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；ドリスコルおよびフィンレイ、１９９２；ユーデルおよびベニンク、１９９２、２６−２８の考察を参照されたい）。本明細書に記載される本出願人等の仕事は、２０Ｓおよび２６ＳプロテアソームならびにＡＴＰ−ユビキチン蛋白分解経路の、ＭＨＣ−１抗原提示のための抗原性ペプチドの生成における役割に対する確固たる証拠を提供する。さらに、この仕事は、抗原の蛋白分解経路およびプロテアソーム機能の新たな特徴を明らかにし、これが本発明につながった。第一に、彼等は、抗原提示を剌激することが知られているガンマインターフェロンが、ＭＨＣ−１分子に結合できるペプチド、即ち塩基性および疎水性カルボキシ末端残基を有するペプチドを生成させるプロテアソームのペプチダーゼ活性、即ちトリプシン様およびキモトリプシン様活性を選択的に増進することを示した（実施例１）。ガンマインターフェロンは、精製された２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームがペプチドを疎水性および塩基性残基の後ろで開裂させる能力を２ないし６倍に増大させ、一方酸性残基の後ろでの開裂を低下させた。彼等はさらに、ガンマインターフェロンによるこの増強がＭＨＣ遺伝子産物、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７の発現に依存することを示した。したがって、彼等の発見は、抗原提示におけるプロテアソームの役割を支持する証拠を提供する。さらに彼等は、プロテアソームの３種のペプチダーゼは別々に調節されている事、該ペプチダーゼの相対活性の変化はプロテアソームにより生成されるペプチドの性質を変えることができ、この事がＭＨＣ−１抗原提示に利用され得る事、そして、ＭＨＣ領域にコードされているサブュニットはペプチダーゼ活性の調節に関与している事を示した。第二に、本出願人等は、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路の初期段階であるユビキチンの複合体形成における欠陥は、ＭＨＣ−Ｉ拘束性抗原提示の低下につながることを示した（実施例２）。ユビキチン活性化酵素Ｅ１における温度感受性欠陥を示す細胞を使用して、彼等は、非許容温度は、サイトゾル中に導入された卵アルブミン（ＯＶＡ）のクラスＩ拘束性提示を阻害するが、ミニ遺伝子から合成されたＯＶＡペプチドの提示には影響を及ぼさないことを見いだした。これらの発見は、ＭＨＣ−Ｉ抗原提示におけるＡＴＰ−ユビキチン蛋白分解系の役割の証拠を提供するものである。これらは、細胞内蛋白の蛋白分解の初期段階（ユビキチンの複合体形成）または後期段階（ペプチドのカルボキシ末端のプロセシング）におけるＡＴＰ−ユビキチン系による遮断が、クラスＩ拘束性提示を阻害し得ることを立証する。この蛋白分解経路中の他の段階の阻害もまた同様の効果を産むと予想することは理にかなっている。本出願人等によるプロテオソーム機能のこれらの特徴の発見、およびＡＴＰ− ユビキチン経路中の一つの段階での阻害が抗原提示を阻害し得るという彼等の証明が、本発明につながった。この蛋白分解経路の一つまたは複数の段階を遮断するインヒビターはＭＨＣ−Ｉ拘束性抗原提示を阻害するであろうという事、そしてこのようなインヒビターはＣＤ８⁺の仲介する細胞溶解性免疫反応の低減に有用であろうという事を予想するのは理にかなっている。このようなインヒビターは、自己免疫疾患の治療または防止に、そして移植されたおよびその他の外来組織の拒絶の低減に有用であるに違いない。プロテアソームのトリプシン様およびキモトリプシン様ペプチダーゼのいずれかまたは両者のインヒビター、ならびにユビキチン複合体形成のインヒビターは、これらの目的にとって特に有用であると予想される。本明細書に記載されるように、本出願人等は、疎水性残基の後ろでの開裂を選択的に阻害するキモスタチンが、卵アルブミンのＭＨＣ−Ｉ提示を阻害することを示すことにより、本発明の実施可能性を立証した（実施例３）。サイトゾル中に導入されたＯＶＡペプチドの抗原提示は阻害されず、これは、キモスタチンがＯＶＡ蛋白からペプチドへのプロセシングに影響を及ぼしていることを示している。このおよび他のインヒビターを、以下の項においてさらに記載する。ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解経路のインヒビタープロテアソームのペプチダーゼの様々なインヒビターが報告されている（例えば、タナカ等、１９９２；オーロフスキー、１９９０；ゴールドバーグ、１９９２；リヴェット等、１９８９ａ［Arch．Biochem．Biophys．２６８巻：１−８頁］および１９８９ｂ［J．Biol．Chem．２６４巻：１２２１５−１２２１９頁］；ディック等、１９９１）。これらには、キモトリプシン様およびトリプシン様プロテアーゼの既知のインヒビター、ならびにチオール（またはシステイン）およびセリンプロテアーゼのインヒビターが包含される。加えて、プロテアソーム活性の内因性インヒビターの幾つかが単離されている。これらには、ヒト赤血球から単離された２４０ｋＤおよび２００ｋＤインヒビターが包含される（ムラカミおよびエトリンガー、１９８６；リー等、１９９１および精製されたＣＦ−２（実施例４に記載；ゴールドバーグ、１９９２）。これら既知のプロテアソームインヒビターに例示されるように、キモトリプシン様、トリプシン様、チオール、およびセリンプロテアーゼの既知のインヒビターを包含するその他の分子は、プロテオソームペプチダーゼのための検定を用いて試験することができる（実施例を参照されたい）。インヒビターは、天然から単離された、または合成の、ペプチドまたは非ペプチド分子であってよい。好ましくは、このインヒビターは、キモトリプシン様およびトリプシン様ペプチダーゼを選択的に阻害し、一方ペプチジルグルタミルペプチダーゼは相対的に影響されないままである。典型的なインヒビターは、主に塩基性残基の後ろでの開裂を阻害する、ロイペプチンのようなペプチドアルデヒド、または主に疎水性残基の後ろを阻害するキモスタチンである。アクチノマイセテスから最初に単離された（アオヤギおよびウメザワ、１９７５）これらの抗生物質性インヒビターに加えて、サイマン等（ＷＯ９１／１３９０４）により記載されるキモトリプシン様プロテアーゼのインヒビターのような、様々なペプチドアルデヒドが合成されている。新規な分子もまた取得して阻害活性について試験することができる。上記引用文献に例示されるように、所定のプロテアーゼに対するインヒビターを得るための様々な戦略が当分野において知られている。化合物または抽出物ライブラリーを、ペプチダーゼ検定を用いてインヒビターについてスクリーニングすることができる。別法として、プロテアーゼの基質についての知識に基づき、ペプチドおよびペプチド様分子を設計することもできる。例えば、プロテアーゼの触媒部位と相互作用すると思われる反応性基を有する基質類似体を合成することができる（例えば、サイマン等、ＷＯ９１／１３９０４；パワーズ等、１９８６を参照されたい）。インヒビターは、プロテオソームのキモトリプシン様活性を阻害するＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ロイシナルのような遷移中間体の安定な類似体（遷移状態類似体）であってよい（オーロフスキー、１９９０；ケネディおよびシュルツ、１９７９もまた参照されたい）。キモスタチンのような既知のインヒビターの変異体または類似体もまた合成することができる。文献に報告されている様々な天然および化学的プロテアーゼインヒビター、またはそれらに類似する分子が、二つのプロテアソームペプチダーゼの活性を阻害すると思われる。これらには、α−ジカルボニル単位を含むペプチド、例えばα −ジケトンまたはα−ケトエステル、ペプチドクロロメチルケトン、イソクマリン、ペプチドスルホニルフルオリド、ペプチジルボロナート、ペプチドエポキシドおよびペプチジルジアゾメタンが包含される（アンジェラストロ等、１９９０；ベイ等、ＥＰＯ３６３２８４；ベイ等、ＥＰＯ３６４３４４；グラブ等、ＷＯ８８／１０２６６；ヒグチ等、ＥＰＯ３９３４５７；エウォルド等、１９９２；ヘルナンデス等、１９９２；ヴラサク等、１９８９；ヒューディッヒ等、１９９１；オダック等、１８８１；ヴィジャヤラクシュミ等、１９９１；カム等、１９９０；パワーズ等、１９８９；オウェイダ等、１９９０；パワーズ等、１９９０；ヒューディッヒ等、１９８９；オーロフスキー等、１９８９；ズニーノ等、１９８８；カム等、１９８８；パークス等、１９８５；グリーンおよびシャウ、１９８１；アングリカー等、１９８７；ピューリ等、１９８９；ハナダ等、１９８３；カジワラ等、１９８７；ラオ等、１９８７；ツジナカ等、１９８８）。ユビキチンの蛋白に対する複合体形成の様々なインヒビターもまた知られている（ウィルキンソン等、１９９０を参照されたい）。ユビキチン複合体形成自体は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、標的蛋白へのユビキチンの輸送を触媒するユビキチン−担体蛋白の群（Ｅ２）、およびユビキチン−蛋白リガーゼＥ３の活動を含む、多段階過程である。これらの段階のうち任意の段階でユビキチン複合体形成を遮断する分子もまた抗原提示のインヒビターであると予想される。好ましくは、これらの酵素の特異的インヒビター、例えば基質および遷移状態類似体が使用される。例えば、基質アデニル酸ユビキチンの類似体であるアデノシル− ホスホ−ユビキチノールは、Ｅ１の特異的且つ有効なインヒビターであることが判明している（ウィルキンソン等、１９９０）。インヒビターはインビトロまたはインビボで使用してＭＨＣ−Ｉ抗原提示を遮断することができる。これらは、経口、静脈内、筋肉内、局所、および注入を包含する任意の幾つかの既知の経路によって投与することができる（例えば、プラットおよびストラッチャー、米国特許４５１０１３０号；バダラメンテ等、１９８９；スタウブリ等、１９８８を参照されたい）。好ましくは、このインヒビターは低分子量の分子である。蛋白薬物のデリバリーに好適な媒質、例えばリポソームもまた使用できる。当該薬物を、特異的組織を標的とさせるような媒質もまた使用することができる。実施例以下の実施例は、本出願人等の仕事をより詳細に説明し、且つより個別的に本発明を描写するものである。表は各実施例の末尾に掲げる。実施例１ γ−ＩＦＮおよびＭＨＣ遺伝子による、プロテアソームのペプチダーゼ活性の調節。この研究は、細胞の抗原のプロセシングにおける、γ−ＩＦＮ、プロテアソーム、およびＭＨＣコード化蛋白の役割を解明するために着手された。下に記載される仕事は、２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソーム複合体のペプチダーゼ活性のパターンが、γ−ＩＦＮにより細胞を処置した後に、そしてＬＭＰ２および７遺伝子を含むＭＨＣ領域の発現時に、変わることを証明している。このような触媒活性の変化は、ＭＨＣクラスＩ蛋白と特異的に結合する型のペプチド配列の生成に好都合であるに違いない（フォーク等、１９９１）。 γ−インターフェロンはプロテオソーム活性を変化させる。 γ−ＩＦＮがプロテアソームの機能を調節しているか否かを知るために、γ− ＩＦＮで処理されたＵ９３７細胞および対照Ｕ９３７細胞（ヒト単球ライン）由来の可溶性抽出物のおよびプロテアソームの幾つかの加水分解活性を調べた。この処理は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子およびＭＨＣ領域にコードされている蛋白（即ちＬＭＰ２またはＴＡＰＩ）の著しい誘導を惹起したが、単離されたプロテアソームまたは細胞抽出物の、¹²⁵Ｉ−ラクトアルブミンまたはユビキチン化¹²⁵Ｉ− ラクトアルブミンを酸可溶性フラグメントに減成する能力には、有意な相違は見いだされなかった。しかしながら、異なるペプチド基質を加水分解するプロテアソームの能力には、γ−ＩＦＮ処置後に明らかな変化が見いだされた。蛍光生成ペプチド基質：「キモトリプシン様」ペプチダーゼに対してはＳｕｃ−ＬＬＶＹ −ＭＣＡ［配列番号３］（疎水性）、「トリプシン様」ペプチダーゼに対してはＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ（塩基性）、そしてペプチジルグルタミルペプチダーゼに対してはＣｂｚ−ＬＬＥ−ＭＮＡ（酸性）を用いてプロテアソームの加水分解活性を測定した。 γ−ＩＦＮ処理されたＵ９３７細胞由来のプロテアソームに富む画分、ならびに粗製抽出物は、対照細胞由来の類似の調製物よりも、疎水性ペプチドＳｕｃ− ＬＬＶＹ−ＭＣＡを２ないし３倍速く、そして塩基性ペプチドＢｏｃ−ＬＲＲ− ＭＣＡを３ないし４倍速く加水分解した（図１）。γ−ＩＦＮ処置のこれらの効果は、ＡＴＰの不在下で観察された。動力学的分析は、γ−ＩＦＮが、疎水性基質を加水分解するプロテアソームの最大能力（Ｖ_max）において２倍の増大を、そして塩基性基質に関するＶ_maxにおいては６倍の増大を惹起することを示した（図１）。さらに、これらの基質に対するＫ_mに些少の増大（平均５０％）が常に見られたが、これらの効果はペプチド加水分解の加速の説明とはなり得ない（図１）。精製された２０Ｓプロテアソームを用いた類似の研究において、極めて似通ったＶ_maxの変化が観察された（下記参照）。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡまたはＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡ（各々）よりもゆっくりと減成される様々な他の疎水性および塩基性ペプチドの開裂は、これら標準基質の加水分解と同様の様式で、γ−ＩＦＮ処置後に増大した（第１表）。このように、これらの活性部位の特異性は変化しないように見えるものの、γ−ＩＦＮ処置された細胞由来のプロテアソームは一般に、疎水性および塩基性残基の後ろでの開裂に、より有効である。これらの条件の下で、これらの塩基性および疎水性ペプチドを加水分解する細胞の総合的能力は増大する。しかしながら、プロテアソームの合計含有量に変化は見られなかった。粗製抽出物がこれらのペプチドを加水分解する能力は、これらの基質に対する活性の約８０％が核を遠沈させた後の細胞抽出物に含まれる、プロテアソーム画分と類似の様式で変化した。残りのペプチダーゼ活性の殆ど（計１５％）は、ミクロソームの膜と強固に結び付いたプロテアソームに帰するものであり、γ−ＩＦＮ処置はさらに、ミクロソームおよび核画分中のプロテアソームによるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡおよびＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの開裂を増強した。 γ−ＩＦＮ処置後にプロテアソームのペプチダーゼ活性の全てが増大する訳でないことは注目に値する。γ−ＩＦＮ処置されたＵ９３７細胞由来の粗製抽出物およびプロテアソーム画分は、対照とほぼ同様の速度で酸性基質Ｃｂｚ−ＬＬＥ −ＭＮＡ（１００ｍＭ）を開裂した。しかしながら、さらなる動力学的分析は、この基質に対するＶ_max値にほぼ３０％の再現性ある低下があることを示した（図１）（Ｋ_mの低下と同様に）。このように、プロテアソームの幾つかの触媒部位が、γ−ＩＦＮによって別個の様式で調節されている。２０Ｓおよび２６Ｓ複合体の挙動細胞内でプロテアソームは、専らユビキチン複合体形成蛋白を減成する２６Ｓ（１５００ｋＤ）複合体の一部として、または、複数の蛋白分解活性を有するにも拘らずＵｂ複合体形成蛋白を自身だけでは加水分解できない２０Ｓ粒子のいずれかとして見いだされる（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；ゴールドバーグ、１９９２；タナカ等、１９９２；アーモンら、１９９０；ドリスコルおよびゴールドバーグ、１９９２；イータン等、１９８９；ドリスコルおよびゴールドバーグ、１９８９；マシューズ等、１９８９）。γ−ＩＦＮが２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの両方の触媒活性を変化させるのかどうかを調べるために、これらの構造を、陰イオン交換およびゲル濾過カラムを用いるＦＰＬＣによって精製した（図２）。プロテアソームの２０Ｓおよび２６Ｓ型の良好な分離が達成された。２０Ｓ画分の非変性ＰＡＧＥは特徴的な７００ｋＤバンドを示し、一方２０Ｓの試料は１５００ｋＤバンドおよび幾らかの７００ｋＤ物質を含んでいた。予想されたように、これらの２６Ｓ調製物はＡＴＰの存在下でユビキチン化¹² ⁵ Ｉ−ラクトアルブミンを減成したが、遊離の¹²⁵１−ラクトアルブミンに対しては殆どまたは全く活性を示さなかった。対照的に、２０Ｓ画分はこの蛋白を減成したが、ユビキチン化されていると減成しなかった。２０Ｓおよび２６Ｓ型はいずれも三種のペプチダーゼ活性を示し、これはＡＴＰにより数倍に刺激され得た。ＡＴＰ（２ｍＭ）は２０ＳプロテアソームによるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの減成を刺激し、そして対照細胞由来の２６Ｓプロテアソームによる同じ基質の減成を５倍に刺激した。ＡＴＰの存在下において、対照およびγ−ＩＦＮ処置調製物の間に２０Ｓプロテアソームについて有意な相違が維持された。インターフェロン処置は、２０Ｓおよび２６Ｓの両方のプロテアソームのペプチダーゼ活性に、より粗製の調製物で見いだされたと同様の変化を惹起した。増大％は２６Ｓ画分について幾分小さい傾向があったものの、両方の型に関して、疎水性および塩基性基質の開裂は、γ−ＩＦＮによって有意に増大した。興味深いことに、酸基質の開裂はいずれの粒子によっても増大せず、２６Ｓ粒子によるその加水分解はγ−ＩＦＮ処置後に５０％低下した（図２）。対照してみると、 γ−ＩＦＮ処置後に、ＡＴＰの存在下または不在下のいずれにおいても遊離¹²⁵ Ｉ−ラクトアルブミンまたはユビキチン化¹²⁵Ｉ−ラクトアルブミンを減成する２０Ｓまたは２６Ｓ粒子の能力に一貫した相違は観察されなかった。総合すると、これらの発見は、γ−ＩＦＮは、蛋白消化の全体速度に影響を及ぼすことなく、２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの両者によりなされるポリペプチドの開裂のパターンを変化させるということを示唆する。ＭＨＣ欠損細胞におけるプロテアソーム活性ＭＨＣ領域にコードされている二つの蛋白ＬＭＰ２およびＬＭＰ７がプロテアソームと結び付く（ドリスコルおよびフィンレイ、１９９２；ゴールドバーグおよびロック、１９９２；モナコおよびマクデヴィット、１９８６；パーハム、１９９０）ということから、そして、γ−ＩＦＮがこれらの成分の発現を刺激するということから、本出願人等は、ＭＨＣ−遺伝子座のこの部分の除去がプロテアソームのペプチダーゼ活性およびそれらのγ−ＩＦＮの反応に影響を及ぼすか否かを研究した。この目的のために彼等は、７２１ヒトＢリンパ芽球様細胞から、そしてこれらの細胞の変異体であってＬＭＰ２およびＬＭＰ７遺伝子を含むＭＨＣ領域にホモ接合の除去を有する７２１．１７４から、プロテアソーム画分を単離した（デマース等、１９８５）。突然変異体細胞由来のプロテアソームは、野生型細胞のおよそ４０％の速度で塩基性基質を、そして７０％の速度で疎水性基質を減成することがわかった（図３）。二種類の基質のＶ_max値は、突然変異体細胞由来のプロテアソームで５０％以上低下した（図３）。プロテアソームの合計含有量は二つの細胞型において似通っているように見え、¹²⁵Ｉ−リゾチームまたはユビキチン化¹²⁵Ｉ−リゾチームを酸可溶性産物に減成するプロテアソームの能力に明確な差異は見られなかった。さらに、徐々に減成されるさらに幾つかの疎水性および塩基性基質（第１表で研究されたものと同一の基質）の分解もまた、ＭＨＣ除去突然変異体では４０％ないし８０だけ低かった。これらのペプチダーゼ活性における低下とは対照的に、ＭＨＣ除去変異体由来のプロテアソームは、一貫して野生型細胞由来の同様の調製物より約４０％早く酸性基質Ｃｂｚ− ＬＬＥ−ＭＮＡを開裂させた（図３）。この基質については、少しではあるが一貫したＶ_maxの増大が観察された（図３）。三種のペプチダーゼ活性における同様の変化が、突然変異体および野生型細胞由来の粗製抽出物およびプロテアソームミクロソームまたは「核」画分に見いだされた。このように、細胞の全ての画分のプロテアソームのペプチダーゼ能はＭＨＣコード化遺伝子およびγ−ＩＦＮによって調節されるように見える。ＭＨＣコード化遺伝子の発現が、プロテアソームによる塩基性および疎水性開裂を増し、一方で酸性開裂を抑制するという発見は、Ｕ９３７細胞がγ−ＩＦＮにより処理された場合に得られる結果と近似する。これらの観察は、プロテアソーム活性におけるγ−ＩＦＮ依存性変化が、少なくとも部分的には、ＭＨＣコード化蛋白、恐らくはＬＭＰ２およびＬＭＰ７プロテアソームサブユニットの発現によって仲介されているという可能性を浮上させる。この仮説を検証するために、本出願人等は、７２１および７２１．１７４変異体を用いてγ−ＩＦＮ処理がＬＭＰ遺伝子の不在下でこれらのペプチダーゼ活性を変化させ得るか否かを調べた。 γ−ＩＦＮで処理された野生型細胞においては、疎水性および塩基性基質の減成速度の増大があり、酸性基質を開裂させる能力の低下があった。即ち、野生型リンパ球由来のプロテアソームは、Ｕ９３７細胞と同じように応答した（但し相対的変化は単球ラインの方が大きく見えた）。しかしながら、ＭＨＣ除去細胞の γ−ＩＦＮ処理は、野生型細胞由来のプロテアソームで見られた大きな変化とは対照的に、塩基性基質Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡの減成を全く変化させなかった。７２１．１７４突然変異体では、γ−ＩＦＮは、疎水性ペプチドＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの開裂において、野生型親細胞よりずっと小さな増大を惹起した。細胞間のこれらの相違は、幾つかの異なった塩基性および疎水性ペプチドについて明白であった（第２表）。驚くべき事に、野生型親細胞（およびＵ９３７ライン）においてγ−ＩＦＮが酸性基質の開裂を再現性をもって低下させたにも拘らず、突然変異体リンパ芽球においてはγ−ＩＦＮはプロテアソームによる酸性基質の加水分解を実際に穴進させた（第２表）。明らかに、プロテアソームの三つの触媒部位の活性におけるＩＦＮ誘導性変化は、直接的または間接的にＭＨＣ依存性である。蛋白分解およびプロテアソーム機能１）プロテアソームの触媒機能はガンマーインターフェロンによって質的に調節され、これらの作用はＭＨＣコード化遺伝子の存在を必要とする事；そして２）これらの粒子の異なるペプチダーゼ部位は、別個の様式で調節され得るという事、という二つの新たな一般的結論が、これらの実験から浮上した。γ−ＩＦＮ処理の後に、単球およびリンパ芽球、そして恐らくは他の多くの細胞内のプロテアソームは、疎水性および塩基性残基の後ろでペプチドを加水分解する、より高い能力を示すが、酸性残基の後ろで開裂させる能力は低下する。かつての研究は、プロテアソームに可逆的に結合してその三つのペプチダーゼの活性を協調的に剌激（デュビール等、１９９２；マー等、１９９２ｂ）または阻害（ドリスコル等、１９９２；リー等、１９９１）することのできる幾つかの細胞因子を証明した（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；ゴールドバーグ、１９９２；タナカ等、１９９２）。対照的に、γ−ＩＦＮは、恐らくは遺伝子発現を調節しそれによりプロテアソームのサブユニット組成を変化させるため、これらの触媒部位の各々に別々に影響を及ぼす（下記参照）。興味深いことに、 γ−ＩＦＮが、２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソームのいずれかによる蛋白基質¹² ⁵ Ｉ−ラクトアルブミンまたはユビキチン複合体化¹²⁵Ｉ−ラクトアルブミンから酸可溶性フラグメントへの消化速度を変化させることは見いだされなかった。これらの発見は、インビボにおいて、プロテアソームによるポリペプチドまたはユビキチン化蛋白の、初期の、恐らくは律速的な開裂は、γ−ＩＦＮにより変化を受けないことを示唆している。その代わり、このサイトカインは、この経路の後期段階、即ち、続いて起こる酸可溶性蛋白フラグメントから短いペプチドへの開裂に作用すると思われる。このように、三つのペプチダーゼの相対活性の変化が、プロテアソームにより生成され且つさらなる蛋白分解的プロセシングおよび／またはＭＨＣ−クラスＩ分子への運搬に利用される、オリコペプチドの性質を変化させるに違いない（下記参照）。塩基性および疎水性配列の後ろの加水分解速度の増大および酸性残基の後ろでの開裂の低下をもたらすプロテアーゼの構造的変化を規定することが重要であろう。γ−ＩＦＮにより誘発されるこれらの活性の主要な変化は、明らかに、ＬＭＰ２および７遺伝子を含むＭＨＣ領域の一部分の存在を必要とする。この領域の除去単独（γ−ＩＦＮ処置無し）では、γ−ＩＦＮにより誘発されるペプチダーゼ活性とは逆の変化が惹起された。さらに、γ−ＩＦＮは二つのＭＨＣコード化サブユニットＬＭＰ２およびＬＭＰ７の発現を刺激し、細胞内の「ＬＭＰ粒子」（即ち、ＬＭＰサブユニットを含むプロテアソーム）の量を増加させることが知られている。これらの発見の最も簡単な説明は、γ−ＩＦＮにより誘発される触媒の性質の変化が、これらＭＨＣコード化サブユニットのプロテアソーム内への取り込みに起因するということである。ＬＭＰ２および／またはＬＭＰ７蛋白は、それ自身に「トリプシン様」または「キモトリプシン様」部位を含んでいるかも知れない。もしそうであるならば、これらの部位がγ−ＩＦＮ不在下で存在しているペプチダーゼ部位を補足し、またはそれらをより高い触媒効率の部位と交換させることができる。この趣旨において、酵母では、プロテアソームの「キモトリプシン様」活性が、ＬＭＰ２に極めてホモローガスなプロテアソームサブユニット遺伝子内の点突然変異によって不活性化されるということは興味深い（ドリスコル等、１９９２；リー等、１９９１；マー等、１９９２）。これとは別に、ＬＭＰ２またはＬＭＰ７をプロテアソーム中に組み込むと、トリプシン様またはキモトリプシン様触媒部位を含む他のサブユニットの活性が増大するかも知れない。同様に、これらのＭＨＣコード化サブユニットの組込みは、プロテアソームのペプチジルグルタミル触媒部位を含むサブユニットの活性にとって替わり、またはこれを低下させるかも知れない。これらの発見はＬＭＰコード化サブユニットの機能を示唆してはいるが、γ− ＩＦＮは、明らかに、ＬＭＰ２およびLＭＰ７遺伝子を欠く突然変異体のプロテアソーム活性に幾らかの変化を誘発する。これらの細胞において、γ−ＩＦＮはキモトリプシン活性に小さな（しかしながら再現性のある）増大を惹起した。加えて、突然変異体のペプチジルグルタミル活性は、野生型細胞でこの活性が低下したにも拘らず、γ−ＩＦＮ処理の際増大した。これらの機能的変化は、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７を含まない、プロテアソームサブユニット組成における他の変化を介して起こるに違いない。恐らくは、γ−ＩＦＮは、ＭＨＣ領域のこの部分以外にコードされているサブユニットの合成を低下させまたは抑制することができ、または、他の手段でプロテアソーム構造を修飾し得るのであろう。事実、ピーターソンおよび共同研究者等（ヤング等、１９９２）は、γ−ＩＦＮがＬＭＰ遺伝子を欠く突然変異体のプロテアソームサブユニットのパターンを変化させることを報告している。ＬＭＰ２およびＬＭＰ７蛋白が細胞のプロテアソームの一つのサブセットにのみ存在し（ブラウン等、１９９１）、このサブセット内に、これらのサブユニットのうち１個だけを含む幾つかの粒子が存在し得、他の粒子は両方を含み得るということは注目に値する。γ−ＩＦＮによるこれらのサブセットまたはプロテアソームの誘導は、３日以内に細胞の総ペプチダーゼ活性に大きな変化をもたらすことが観察されていることから、いずれの場合においても、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７含有集団は、恐らく、それらの加水分解活性の点で、既に存在している集団とは非常に大きく異なっているであろう。したがって、ここで見いだされた触媒活性の変化は、恐らくプロテアソームのＬＭＰ含有およびＬＭＰ欠失サブセットの間の活性の実際の相違を過小評価しているであろう。かつてプロテアソームは、一般に、特徴的な酵素の性質を有する単一構造型として考察されてきた。この見方は、これらの粒子の機能的異質性および可塑性を強調するこの発見に照らす時、明らかに単純すぎ、または誤っている。これらの発見は、多くの細胞において、プロテアソームの性質は、γ−ＩＦＮレベルが上昇し免疫反応が活性化される、感染または敗血症またはその他の状態の最中に、インビボで変化することを示唆している。プロテアソームの性質のこれらの変化は、このサイトカインの用量および暴露の期間にも依存するに違いない。細胞内のプロテアソームの機能的に別個のサブクラスの存在は、他の多くの生物学的状況においても重要であり得る。事実、恐らくは機能上別個の変化をもたらし、本発明において報告されたものとは異なった生理学的結果となる、細胞の発達中のプロテアソームサブユニット組成の変化に関する報告がある（アーン等、１９９１；シェラー、１９９０）。抗原提示に対する関係正常な蛋白代謝回転の一部として、サイトゾルまたは核内のプロテアソームにより生成されるペプチドの殆どは、非プロテアソームペプチダーゼによって速やかに遊離アミノ酸へと消化されねばならない。しかしながら、或る画分は、ＴＡＰ１−２複合体により小胞体（ＥＲ）中に輸送され、直接またはさらなる蛋白分解的プロセシング後にＭＨＣ−クラスＩ分子と結合するように見える（タウンゼントおよびボドマー、１９８９；ユーデルおよびベニンク、１９９２；モナコ、１９９２；ポウィス等、１９９１；スピースおよびデマース、１９９１）。γ− ＩＦＮにより誘発されるまたはＭＨＣ除去によりもたらされるプロテアソーム活性の変化は、細胞のおよびウイルスの蛋白の減成中にプロテアソームにより生成されるペプチドを変化させ、それによりＴ細胞への提示に利用されるペプチドのレパートリーを変化させるに違いない。塩基性、疎水性、および酸性残基の後ろでの開裂の相対速度のこれらの変化は、異なったペプチド群、または同じペプチドを、非常に異なった比率で生成させる結果を産むに違いない。詳細には、「キモトリプシン様」および「トリプシン様」活性における２ないし６倍の増大ならびにペプチジルグルタミル活性の低下は、塩基性または疎水性カルボキシ末端の末尾を有する短いペプチドをより多く、そして酸性カルボキシ末端の末尾を有するペプチドをより少なく生成させるに違いない。 γ−ＩＦＮまたはＭＨＣコード化遺伝子の発現による触媒性質のこれらの変化は、このようにＭＨＣ−クラスＩ分子に結合することが知られているペプチドのまさにその型を生成させるのに好都合であるようである。抗原性ペプチドのＣ末端残基は、幾つかのＭＨＣ−蛋白−ペプチド複合体のＸ線解析からも明白であるように（ロツシュケおよびフォーク、１９９１；フレモント等、１９９２；シルヴァー等、１９９２；ツァング等、１９９２）、特異的ＭＨＣ−クラスＩ分子へのそれらの結合において重要な役割を果たしている（フォーク等、１９９１；ギュオ等、１９９２；ハント等、１９９２；ジャーデツキー等、１９９１；マツムラ等、１９９２；パーハム、１９９２）。クラスＩ分子と結合することが見いだされた天然においてプロセシングを受けるペプチドの大半が疎水性または塩基性Ｃ末端を有し、酸性C末端を有するものは実際全く無いという事は、非常に印象的である（図４）。この結論は、ＭＨＣ−結合ペプチドについての刊行されている文献の、本出願人等による調査に基づいている。さらに、疎水性Ｃ末端に対する、さらに強い偏向が、ＭＨＣ−クラスＩ蛋白の二つの特異的サブタイプから溶出され得るペプチドの平均集団の配列において明らかである。この、塩基性および疎水性残基の優位性は、ＭＨＣ−結合ペプチドのＮ末端に先行するアミノ酸では見られなかった（図４）。ＬＭＰ２およびＬＭＰ７サブユニットについて、幾つかの免疫学的役割が考えられた。ＬＭＰサブユニットはプロテアソーム粒子を小胞体（ＥＲ）に振り向け、そこでこれらはＴＡＰ−１／２輸送体と隣接するであろうということが提唱された。しかしながら、本出願人等および他の研究者（ヤング等、１９９２）は、ＬＭＰ遺伝子の喪失またはＬＭＰ発現のγ−ＩＦＮ刺激がプロテアソームの亜細胞分布に影響を及ぼすという証拠を見いださなかった。代わりに、本出願人等は、γ−ＩＦＮ処理およびＭＨＣ除去が、細胞の可溶性画分中のプロテアソームのペプチダーゼ活性、ならびにＥＲ（計１０％）および核画分と結び付いたプロテアソームの小集団の活性を変化させるということを発見した。ＥＲ中へ輸送されるために、可溶性プロテアソームにより生成されたこれらの抗原性ペプチドは、サイトゾルのエキソペプチダーゼによる完全な加水分解に、なんとかして抵抗せねばならない。より近年に、ＭＨＣ除去細胞（７２１．１７４のような）は、もしそれがＴＡＰ−１および−２輸送体に対する遺伝子によってのみトランスフェクトされるならば、抗原を提示できるのであるから、ＬＭＰは抗原提示で重要な役割を果たしていないという議論がなされた（アーノルド等、１９９２；マンブルグ等、１９９２）。しかしながらこの仕事は、これらの突然変異体細胞から単離されたプロテアソームは依然としてトリプシン様およびキモトリプシン様活性を表わすということを示している。これらの発見は、何故ＭＨＣ除去細胞が依然としてクラスＩ分子上に抗原を提示できるのかということを説明し得る。この結果は、ＭＨＣ除去突然変異体細胞による抗原プロセシングおよび提示の効率の低下の予想につながる。これは実際にハマーリングおよび共同研究者等によって報告された（マンブルグ等、１９９２）。これに反して、ＬＭＰの発現を増大させ、それによりプロテアソームにより生成されるペプチドのパターンを変化させるγ−ＩＦＮの働きは、輸送体およびＭＨＣ−クラスＩ蛋白の誘導と共に、抗原提示の増強に寄与し得る。方法 γ−ＩＦＮによる細胞の処理１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃で７２時間、１０００Ｕ／ｍｌのヒト組み替えγ−ＩＦＮ（バイオジェン・Inc．、ケンブリッジ、ＭＡの好意により提供された）の存在下または不在下で、１５０ｃｍ³のフラスコ中でＵ９３７細胞（０．１５ｘ１０⁶／ｍｌ）を増殖させた。予備実験において、この濃度のγ−ＩＦＮは、Ｕ９３７細胞においてプロテアソームペプチダーゼ活性の最大変化を惹起することが見いだされた。突然変異体（７２１．１７４）および野生型（７２１）細胞を、ペプチダーゼ活性の最大変化を惹起することが見いだされている３０００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮの存在下または不在下で３日間増殖させた。ペプチダーゼ検定１０％トリクロロ酢酸に可溶性の放射性ペプチドの産生を測定することにより、¹²⁵Ｉ−ヒトラクトアルブミンまたはユビキチン複合体形成¹²⁵Ｉ−ラクトアルブミンの加水分解を検定した（ワクスマン等、１９８７）。プロテアソーム画分または粗製抽出物（０.１ｍｇ／ｍｌ）および精製プロテアソーム（５μｇ／ｍｌの２０Ｓまたは１５μｇ／ｍｌの２０Ｓ）を、ＡＴＰ２ｍＭまたはアピラーゼ（残余のＡＴＰを分解するため）５Ｕ／ｍｌの存在下で放射性基質と共に緩衝液Ｂ（図１の詳細な説明を参照されたい）中で、３７℃で６０または１２０分間インキュベートした。非放射性ラクトアルブミン（２０μｇ／ｍｌ）を、Ｕｂ−¹²⁵ Ｉ−ラクトアルブミンを含有する反応混合物に加えた。粗製の細胞抽出物およびプロテオソームに富む画分の調製。抽出物を調製するために、細胞を７００ｘｇで５分間遠心することにより集め、２回洗浄し、ホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭＡＴＰ、２５０ｍＭシュクロース、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。細胞懸濁液を、ダウンスホモジナイザー（フィートン）に数回かけ、その後ガラスビーズと共に３分間撹拌することにより、ホモジナイズした。１００００ｘｇで２０分間遠心した後、上清（「粗製抽出物」）を１０００００ｘｇで１時間遠心して「ミクロソームペレット」を得た。ミクロソーム後上清を１０００００ｘｇで５時間遠心することにより「プロテアソーム画分」を得た。ペレットを約１０容量の緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＡＴＰ、２０％グリセロール）に再懸濁し、ホモジナイズし、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。粗製抽出物中の蛋白の２０％を含有する上清を、蛋白分解活性の検定前に、粗製抽出物と同じ１ｍｇ／ｍｌの濃度（ブラッドフォード、１９７６）に調節した（緩衝液Ａで透析後）。培養細胞の各組について、二組の抽出物を調製し、平行して分析した。この二組について得られた結果の平均を、個々の実験の結果として採用した。図１の詳細な説明図１の上側の図は、対照細胞およびγ−ＩＦＮで処理された細胞からのプロテアソーム画分による、示された基質（１００μＭ）の加水分解を示している（マンブルグら、１９９２）。ペプチダーゼ活性は、蛍光生成ペプチド基質からの７ −アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）またはメトキシナフチルアミン（ＭＮＡ）の放出によって決定した（イシウラ等、１９８５）。プロテアソーム画分（最終蛋白濃度：緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス、５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．４、アピラーゼ５Ｕ／ｍｌを含有）０.１ｍｌ中５０μｇ／ｍｌ）を３７℃で４０または６０分間インキュベートした。１％ドデシル硫酸ナトリウム１ｍｌの添加により反応を停止させた。疎水性および塩基性基質の減成の増大は高度に有意であった（ｎ＝６の異なる実験でＰ＜０.０１）。粗製抽出物においては、極めて類似の変化（Ｐ＜０.０２、ｎ＝３）がＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡおよびＢｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡについて観察されたが、一方Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＭＮＡの減成は有意に変化しなかった。単位＝１時間当り蛋白１ｍｇ当りの開裂した基質のｍＭ。図１の下側の図は、上で使用されたものと同じプロテアソーム画分による基質の開裂速度（ｖ）の動力学的分析（ラインウィーヴァー−バーク法）を示している。異なる基質濃度（Ｓ）を用いて、上側の図と同様にインキュベーシヨンを行なった。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡについてのＶ_maxは０.７単位であり、γ−ＩＦＮ有りでは１.６であり；Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡについては０.３単位であり γ−ＩＦＮ有りでは１.９であり；Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＭＮＡについては０.３単位でありγ−ＩＦＮ有りでは０.２であった。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡについてのＫ_mは０.２ｍＭであり、γ−ＩＦＮ有りでは０.３ｍＭであり；Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡについては０.４ｍＭでありγ−ＩＦＮ有りでは０.５ｍＭであり；Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＭＮＡについては０.１０ｍＭでありγ−ＩＦＮ有りでは０.０６ｍＭであった。図２の詳細な説明図２は、Ｕ９３７細胞から精製された２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソーム中のペプチダーゼ活性に及ぼすγ−ＩＦＮ処理の効果を示している。結果は三つの異なる実験の代表である。対照調製物およびγ−ＩＦＮ処理細胞由来の調製物の間の相違は全て統計学的に有意（Ｐ＜０.０１）であったが、２０ＳによるＣｂｚ −ＬＬＥ−ＭＮＡの開裂では有意な差異は見られなかった。単位および検定条件は図１の場合と同じであるが、プロテアソームの最終濃度は２.５−３.０μｇ／ｍｌ（２６Ｓ）または８−１０μｇ／ｍｌ（２０Ｓ）であった。２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームは、Ｑセファロース陰イオン交換およびスーパーロース６ゲル濾過ＦＰＬＣクロマトグラフィー（ファルマシア）によりプロテアソーム画分から単離した（ドリスコルおよびゴールドバーグ、１９８９；マシューズ等、１９８９）。２６Ｓに富む画分を、Ｕｂ−¹²⁵Ｉ−ラクトアルブミンのＡＴＰ依存減成を支持する能力によって同定した。常法により、３０μｇの２６Ｓおよび９０μｇの２０Ｓをプロテアソーム画分５ｍｇから取得した。図３の詳細な説明図３の上側の図は、野生型（７２１）およびＭＨＣ欠損（７２１．１７４）リンパ芽球様細胞由来のプロテアソームのペプチダーゼ活性の相違を示している。三種類の基質（１００μＭ）の加水分解速度を、図１で実施したようにプロテアソーム画分中で測定した。三つの活性全ての相違は統計学的に有意であった（Ｐ＜０.０１、ｎ＝４の異なる調製物）。図３の下側の図は、野生型および突然変異体細胞由来の同じプロテアソーム画分による、異なった濃度（Ｓ）における全ての基質の開裂の動力学的分析を示している。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡについてのＶ_maxは６.５単位（野生型）対２ .４（突然変異体）であり；Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡについては１.６単位対０. ７であり；Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＭＮＡについては０.７単位対１.２であった。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡについてのＫ_mは０.５ｍＭ（野生型）対０.３ｍＭ（突然変異体）であり；Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＭＣＡについては０.３ｍＭ対０.５ｍＭであり；Ｃｂｚ−ＬＬＥ−ＭＮＡについては０.４ｍＭ（野生型および突然変異体）であった。二つの異なる実験において極めて類似の結果が得られた。図４の詳細な説明図４の左側の図は、ＭＨＣクラスＩ分子と結合する４４のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸の頻度を示している。データは、公開されているペプチドの配列から集めた（フォーク等、１９９１；ギュオ等、１９９２；ハント等、１９９２；ジャーデッキー等、１９９１；マツムラ等、１９９２）。これらの配列は、ＭＨＣクラスＩ分子から溶離し精製された個々のペプチドのエドマン分解、または、合成の抗原性ペプチドの機能分析および既知のＭＨＣ結合モチーフに対するアラインメントのいずれかによる、異なった研究において決定された。この分析に含まれるＭＨＣクラスＩ分子は二つの群：一般に疎水性Ｃ末端残基を有するペプチドに結合するＫ^b、Ｄ^b、Ｋ^d、Ｌ^dおよびＨＬＡ−Ａ２．１、ならびに一般に塩基性Ｃ末端残基を有するペプチドに結合するＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−ＡＷ６８、に分類される。図４の右側の図は、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドのＮ末端の前にあるアミノ酸の頻度を示している。左側の図中の３９個のペプチドが誘導された蛋白配列が求められた。データは、ＥＭＢＬ（ハイデルベルク、ドイツ）およびナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション（ベセスダ、Ｍｄ）データベースから集められた。実施例２ユビキチン複合体形成の欠陥によるＭＨＣ−Ｉ抗原提示の阻害。殆どの細胞蛋白の完全な減成の律速段階は、それらのユビキチンとの共有結合による複合体形成である（ハーシュコおよびシーチャノーヴァー、１９９２；レヒトシュタイナー、１９８７）。この工程により、蛋白は、プロテアソームと呼ばれる２０Ｓ（７００ｋＤ）の減成粒子を含む２６Ｓ（１５００ｋＤ）蛋白分解複合体による速やかな加水分解のための識別がなされる（ゴールドバーグ、１９９２；ゴールドバーグおよびロック、１９９２）。細胞蛋白の完全な加水分解に加えて、サイトゾルの或る系は、内因性合成された細胞およびウイルス蛋白から抗原性ペプチドを生成させる（タウンゼント等、１９８５；タウンゼント等、１９８６；モリソン等、１９８６；モーア等、１９８８；スピースおよびデマース、１９９１；ポウィス等、１９９１）。これらのペプチドは、新たに合成された小胞体内のクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、次いでペプチド−クラスＩ複合体は細胞毒性Ｔ細胞への提示のために細胞表面へ輸送される（ユーデルおよびベニンク、１９９２；モナコ、１９９２）。間接的な証拠は、２０Ｓ（７００ｋＤ）プロテアソームに酷似し恐らくは同一である蛋白分解粒子（ＬＭＰ）の役割を示唆してはいるが（ゴールドバーグおよびロック、１９９２；モナコ、１９９２；パーハム、１９９０；ヤング等、１９９２）、抗原性ペプチドがどの様に産生されているのかは詳しく知られていない。故に本出願人等は、ＡＴＰ−ユビキチン依存蛋白分解系がＭＨＣクラスＩ拘束性抗原（Ａｇ）提示に関与しているかどうかを試験した。ユビキチン複合体形成に際し温度感受性の欠陥を示す細胞を使用して、本出願人等は、非許容温度が、サイトゾル中に導入された卵アルブミン（ＯＶＡ）のクラスＩ拘束性提示を阻害するが、ミニ遺伝子から合成されたＯＶＡペプチドの提示には影響を及ぼさないことを発見した。これらの結果は、抗原性ペプチドの産生におけるユビキチン依存蛋白分解経路の関連を意味するものである。化学的に突然変異生成させたチャイニーズハムスター肺細胞セルラインＥ３６の変異体であるＴｓ２０細胞は、熱不安定性ユビキチン複合体形成酵素Ｅ１を発現する（クルカ等、１９８８）。Ｅ１は、細胞蛋白へのユビキチンの複合体形成の必須第一段階である、ユビキチンのＡＴＰ依存活性化を触媒する（ハーシュコおよびシーチャノーヴァー、１９９２；レヒトシュタイナー、１９８７）。ユビキチン−蛋白複合体形成および蛋白減成は、ｔｓ２０細胞において非許容温度（４１℃）で低下する（クルカ等、１９８８；グロッパー等、１９９１）。Ｅ１はｔｓ２０細胞中４１℃で不可逆的に不活性化する。ユビキチン複合体形成の遮断がクラスＩ拘束性Ａｇ提示に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ｔｓ２０およびＥ３６細胞をＨ−２Ｋ^bおよびＩＣＡＭ− １に対するｃＤＮＡ遺伝子でトランスフェクトし、該細胞がＯＶＡ特異的Ｋ^b− 拘束性マウスＴ細胞ハイブリドーマラインＲＦ３３．７０にＡｇを提示できるようにした（ロック等、１９９０）。トランスフェクトさせたセルラインｔｓ２０．１０．２（突然変異体）およびＥ３６．１２．４（野生型）を４１℃または３７ ℃で１時間インキュベートし、その後ピノソームの浸透溶解によりＯＶＡをサイトゾル中に導入した（タウンゼント等、１９８６）。ＯＶＡの導入中およびその後のインキュベーションは３７℃で実施したが、そうすることにより、ＯＶＡへの暴露中およびその後の群間の変数としての温度が排除された。この細胞に１時間Ａｇをプロセシングさせ、その後アルデヒド固定によりＡｇプロセシングを停止させた。４１℃でのインキュベーションは突然変異体によるＯＶＡの提示を大きく低下させた（図５Ａ）が、野生型（図５Ｂ）細胞では低下させなかった。これらの結果を説明するために幾つかの仮説を提示することができる。これらの可能性を調査した。上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、飲作用によってＯＶＡを獲得した（タウンゼント等、１９８６）。よって、突然変異体細胞によるＯＶＡの提示は、４１℃への暴露が飲作用を遮断するならば阻害され得たはずである。４１℃または３７℃でインキュベートされた突然変異体細胞は、液相飲作用の通常使用されるマーカーであるポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）の取り込みによって決定されるように（ウィレイおよびマッキンレイ、１９８７）、細胞外液の取り込みの点で相違しなかった（０.９４±０.２７ｎｌ／１０⁶細胞（４１℃ ）対０.９６±０.４７ｎｌ／１０⁶細胞（３７℃）。四つの実験の平均値±ＳＤ。）。ＰＶＰとのインキュベーション条件は、ＯＶＡについて上に記載された条件と同一であった。このように、突然変異体細胞がＯＶＡを提示しなかったのは、飲作用の欠陥に起因するものではなかった。上の理由に代わって、４１℃でインキュベートされた突然変異体細胞の、サイトゾルＯＶＡ提示の不能性は、抗原性ＯＶＡペプチド−Ｋ^b複合体の生成または提示における遮断に起因するものであったかも知れない。４１℃でのインキュベーションは、突然変異体（図５Ｃ）または野生型（図５Ｄ）細胞が、培地に添加された外因性ＯＶＡ_257-264ペプチド（卵アルブミンのアミノ酸２５７−２６４）を提示する能力に影響を及ぼさなかった。これらの条件の下で、合成ＯＶＡ₂₅ _7-264 ペプチド（これは卵アルブミン由来の天然にプロセシングされたエピトープを表わす）は、細胞表面でＫ^bに直接結合する（フォーク等、１９９１；ロック等、１９９２）。故に、ＡＰＣ表面でのＯＶＡペプチド−Ｋ^b複合体の提示は、ユビキチン複合体形成の遮断により有意な影響を受けなかった。抗原性ペプチドが、新たに合成されたクラスＩ分子に結合した後に、このペプチドークラスＩ複合体は、ゴルジ体を介してＴ細胞への提示のために細胞表面に輸送される。故に、本出願人等は、突然変異体細胞中でのＨ−２Ｋ^bの合成および輸送に及ぼす４１℃の影響を調べた。４１℃または３７℃で１時間インキュベーションした後に細胞を［³⁵Ｓ］−メチオニンで放射標識し、組み立てられたＫ^b 分子に特異的なｍＡｂ（Ｙ−３）によってＨ−２Ｋ^b分子を連続的に免疫沈降させた（タウンゼント等、１９９０）。引続きウサギ抗重鎖抗血清（エキソン８）によって沈降させた（スミスおよびバーバー、１９９０）。同様の量の組み立てられたＨ−２Ｋ^bを、二種類の温度でインキュベートした突然変異体細胞から免疫沈降させた（図６Ａ）。さらに本出願人等は、ペプチドとの組み立てに利用できる可能性のある、類似の量の遊離重鎖（図６Ａ）およびβ²−ミクログロブリンを、両方の温度で見いだした。組み立てられたＫｂ分子の、ゴルジ体を介した輸送を分析するために、細胞を４１℃または３７℃で１時間インキュベートし、次いでパルス放射標識し、３７ ℃でチェイスした。Ｈ−２Ｋ^b分子を免疫沈降させ、二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。突然変異体または野生型細胞のいずれにおいても、温度はＫ^b 分子の電荷または分子量異質性の程度に影響しなかった（図６Ｂ）。クラスＩ分子の細胞内成熟の間の電荷および分子量の変化はゴルジ体における複合糖の添加と結び付いているのであるから、これらの発見は、Ｈ−２Ｋ^bの組み立ておよび輸送は、通常、突然変異体細胞において４１℃のインキュベーション後に起こるという事を示す。この事は、Ａｇ提示の阻害が抗原性ＯＶＡペプチドの産生の選択的欠陥に起因するものであることを示唆している。この点をさらに調査するため、図５に記載のように処理された突然変異体細胞を、ＯＶＡとインキュベーションするか、または、開始Ｍｅｔの先行するＯＶＡ_257-264 ペプチドをコードしているミニ遺伝子を含む組み替えワクシニアウイルス（ＯＶＡ_257-264Ｖａｃ）に感染させた。内因性合成されたＯＶＡ_257-264ペプチドの提示は４１℃でのインキュベーションによる影響を受けなかった（図７Ａ）が、一方、先に示したように、ＯＶＡの提示は阻害された（図７Ｂ）。１時間の感染の後、ワクシニア感染細胞によるＯＶＡ_257-264＋Ｋ^bの提示は、ＯＶＡとインキュベートされた細胞による提示より有意に低かった（図７Ａおよび７Ｂ中の３７℃の群を比較されたい）。よって、ＯＶＡ_257-264ペプチドの過剰産生が、ワクシニア感染を受けた突然変異体細胞による提示に及ぼす４１℃のインキュベーションの効果の欠如を説明するとは考えにくい（図７の詳細な説明をも参照されたい）。この発見は、突然変異体細胞を４１℃でインキュベーションすることにより惹起されたユビキチン複合体形成の低下が、サイトゾルから小胞体へのＯＶＡ_257-264ペプチドの輸送、その後のＯＶＡ_257-264ペプチドおよびＨ−２Ｋ^b の組み立て、または細胞表面へのクラスＩ−ペプチド複合体の輸送のいずれにも影響しなかった事を示している。この発見の最も単純な解釈は、ユビキチン複合体形成が、クラスＩ拘束性提示のためのＯＶＡのプロセシングにおいて重要な役割を果たしているということである。関連する研究において、本出願人等は、ユビキチン依存経路はＡＴＰ、ユビキチン、ウサギ網状赤血球由来のプロテアソーム画分、および卵アルブミン上の遊離アミノ基を必要とすることから、無細胞抽出物に添加されたＯＶＡがユビキチン依存経路により減成されることを見いだした。プロテアソーム中の二つのＭＨＣコード化蛋白の存在は、プロテアソームが細胞およびウイルス抗原のプロセシングに関わっているという仮説を導いた（パーハム、１９９０；ヤング等、１９９２）。しかしながら、最近のデータは、これらのサブユニットはクラスＩ拘束性Ａｇ提示に必須でないことを示している（ハマリング等からの私信）。ユビキチン複合体化蛋白は２６Ｓプロテアソーム複合体により減成される（ゴールドバーグ、１９９２；ゴールドバーグおよびロック、１９９２）のであるから、これらの発見は、クラスＩ拘束性提示のためのＡｇのプロセシングにおけるこの構造の関わりを直接意味する。即ち、免疫系は、クラスＩのためのＡＴＰ−ユビキチン−プロテアソーム依存経路およびクラスＩＩ拘束性提示のための液胞経路という、抗原性ペプチドを供給するための、基本的且つ系統発生上古い、細胞の二つの減成経路を利用している。図５の詳細な説明図５は、突然変異体（ｔｓ２０．１０．２）および野生型（Ｅ３６．１２．４）細胞によるＯＶＡのＭＨＣクラスＩ拘束性提示を示している。Ｔｓ２０．１０．２（ＡおよびＣ）およびＥ３６．１２．４（ＢおよびＤ）細胞を４１℃（塗りつぶし）または３７℃（白抜き）でインキュベートし、次にＯＶＡ有り（ＡおよびＢ）または無し（ＣおよびＤ）でインキュベートした。ＯＶＡと共にインキュベートされた示された数のＡＰＣをＲＦ３３．７０と共に培養し（ＡおよびＢ）、または対照ＡＰＣ（５ｘ１０⁴）をＲＦ３３．７０および示された濃度のＯＶＡ_257-264ペプチドと共に培養した（ＣおよびＤ）。Ｔｓ２０．１０．２（突然変異体）およびＥ３６．１２．４（野生型）細胞（２ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）を４１℃または３７℃で１時間インキュベートした。ＯＶＡをサイトゾル中に導入するため、かつて記載されたように、細胞を高張性培地中、２０ｍｇ／ｍｌＯＶＡと共に３７℃で１０分間インキュベートし、低張性培地で処理し、次いで氷冷無血清ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した（タウンゼント等、１９８６；マイカレック等、１９９１）。洗浄されたＡＰＣ（２ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）を３７℃で１時間インキュベートして、細胞表面のプロセシングされたＡｇを発現させた。この３７℃のインキュベーション中に、前に４１℃でインキュベートした突然変異体細胞に、若干のユビキチン複合体形成活性の回復（三つの実験の平均値±ＳＤが１６±１０％）が起こった。ユビキチン複合体形成および／またはＡｇプロセシングのさらなる回復を防止するため、ＡＰＣを１％パラホルムアルデヒドで固定し、かつて記載されたように、ＲＦ３３．７０（１０⁵ 細胞）を含む二つのミクロ培養（２００μｌ）に加えた（マイカレック等、１９９１）。対照ＡＰＣは、高張性培地からＯＶＡを除くこと以外は上の記載の通りとした。ＲＦ３３．７０を刺激して、ＡＰＣ表面上のプロセシングされたＯＶＡ＋Ｋ^bが認識された時にＩＬ−２を産生させた（ロック等、１９９０ｂ）。先に記載のようにミクロ培養を調製し、インキュベートし、そしてＩＬ−２含有量を検定した（マイカレック等、１９９１）。Ｈ−２Ｋ^b ｃＤＮＡ、ｐＢＧ３６７−Ｋ^bは、ジェラルド・ワネック博士の好意により提供された。ベクターｐｃＤＬ−ＳＲｃα２９６はナオコ・アライ博士により提供された（タケベ等、１９８８）。Ｈ−２Ｋ^b ｃＤＮＡをｐｃＤＬ− ＳＲα２９６ベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。ｐＨ_BＡＰｒ−１−ネオベクター中のマウスＩＣＡＭ−ＩｃＤＮＡは、ヘドリックおよびブライアン両博士により提供された（シュー等、１９８９）。Ｅ３６およびtｓ２０細胞を、リポフェクチン試薬（ＢＲＬ）を用いてＨ−２Ｋ^bおよびＩＣＡＭ−Ｉで同時トランスフェクトし、ｔｓ２０細胞をトランスフェクション後に３７℃で増殖させること以外はかつて記載されたようにＧ４１８（ジブコ）による選択を実施した（ダング等、１９９０）。Ｇ４１８耐性クローンを、ｍＡｂＹＮ１／１．７．４（ダング等、１９９０）およびＢ８−２４−３（ケーラー等、１９８１）によってそれそれＩＣＡＭ−ＩおよびＨ２Ｋ^bの発現についてスクリーニングした。トランスフェクトされたセルラインｔｓ２０．１０．２およびＥ３６．１２．４をそれぞれ３１℃および３７℃で継代した。図６の詳細な説明図６は、Ｈ−２Ｋ^bの合成および成熟に及ぼす温度の影響を示している。図６Ａでは、突然変異体（ｔｓ２０．１０．２）および野生型（Ｅ３６．１２．４）細胞を４１℃または３７℃で１時間インキュベートし、次に３７℃で１５分間代謝的に放射標識した。Ｈ−２Ｋ^bをＹ−３（ジョーンズおよびジェインウェイ、１９８１）により免疫沈降、引続き抗エキソン８（スミスおよびバーバー、１９９０）（トロント大学のブライアン・バーバー博士からの好意による寄贈）により連続的に沈降させ、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｙ−３はＨ−２Ｋ^bのα１およびα２ドメインにより形成された立体配座的エピトープを認識し、組み立てられたＨ−２Ｋ^b分子のみに結合するが、一方、抗エキソン８抗血清は、Ｈ−２Ｋ^bのＣ末端細胞質ドメイン（エキソン８によりコードされている）に対して生成され、組み立てられたＨ２Ｋ^b分子および遊離の重鎖の両方に結合する。Ｈ−２Ｋ^b重鎖（Ｈ）およびβ₂−ミクログロブリン（Ｌ）の位置ならびに相対分子量標準（Ｍ_rｘ１０^-3）を図６に示す。４０００万の細胞をメチオニンを含まない培地中４１℃または３７℃で１時間インキュベートし、次いで０.７ｍＣｉの［³⁵Ｓ］−メチオニン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ）により３７℃で１５分間放射標識した。界面活性剤溶菌液、免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを、最初の免疫沈降の前および後にそれぞれＩｇＧソルブ（５回）およびＰＡ−セファロース（１回）によるさらなる前洗浄工程を含めること以外は、本質的には記載に従って実施した（タウンゼント等、１９９０）。図６Ｂにおいては、ｔｓ２０．１０．２およびＥ３６．１２．４細胞を４１℃ または３７℃で１時間インキュベートし、３７℃で１０分間代謝的にパルス放射標識し、次いで３７℃で５０分間チェイスした。Ｈ−２Ｋ^bをＹ−３により免疫沈降させ、二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。チェイスの時刻０において作成された免疫沈降を分析すると、単一の未成熟の重鎖のスポットが示され、これは上に示された、より酸性で且つより大きな分子量の型へとチェイスされた。Ｈ−２Ｋ^bの重鎖をＨで示し、β₂−ミクログロブリンをＬで示す。細胞を、上記のようにインキュベートし［³⁵Ｓ］−メチオニンにより１０分間パルス放射標識した。次いでこの細胞をコールドなメチオニン（１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下に３７℃で５０分間チェイスした。細胞溶解液を調製し、Ｙ−３による免疫沈降を上記のように実施した。二次元ＩＥＦ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、この免疫沈降物をイモビライン・ドライストリップ・キット（ファルマシア）を用いて分析した。ゲルをオートフラワー（ナリオナル・ダイアグノスティクス）中でインキュベートし、放射標識された蛋白をオートラジオグラフィーにより −８０℃で可視化した。図７の詳細な説明図７は、内因性合成されたＯＶＡ_257-264ペプチドのＭＨＣクラスＩ拘束性提示を示している。Ｔｓ２０．１０．２細胞を４１℃（塗りつぶし）または３７℃ （白抜き）で１時間インキュベートし、次いでＯｖａ_257-164Ｖａｃにより３７ ℃で１時間感染させる（図７Ａ）か、またはＯＶＡと共にインキュベート（図７Ｂ）した。示された数のＡＰＣをＲＦ３３．７０と共にインキュベートした。Ｔｓ２０．１０．２細胞（７ｘ１０⁵細胞／ｍｌ）を４１℃または３７℃で１時間インキュベートし、次いで組み替えワクシニアウイルス（１０ＰＦＵ／細胞）により３７℃で１時間感染させた（図７Ａ）。ＴＳ２０．１０．２細胞を４１ ℃および３７℃でインキュベートし、ＯＶＡで処理し、次いで上記のように３７ ℃でインキュベートした（図５の詳細な説明を参照されたい）。ワクシニアウイルスに感染したＡＰＣまたはＯＶＡと共にインキュベートしたＡＰＣを１％パラホルムアルデヒドで固定し、図５の詳細な説明に記載のようにＲＦ３３．７０（１０⁵細胞）と共にミクロ培養中でインキュベートした。同じくそこに記載の通り、ミクロ培養を調製し、インキュベートし、そしてＩＬ−２含有量について検定した。インフルエンザ核蛋白遺伝子を含む組み替えワクシニアウイルスに感染したＡＰＣはＲＦ３３．７０を刺激しなかった。３時間感染させた細胞はＲＦ３３．７０の刺激において６４倍有効であるため、Ｏｖａ_257-264Ｖａｃを用いた経時実験は、１時間感染した細胞表面上のＯＶＡ_257-264ペプチド−Ｋ^b複合体の量は限定的であることを示した。Ｏｖａ_257-264Ｖａｃは、合成オリゴヌクレオチドをｐＳｃ１１におけるワクシニアウイルスｐ７．５初期／後期プロモーターの後ろに挿入することにより組み立てられ（チャクラバティ等、１９８５）、これは、制限部位ＳａｌＩおよびＮｏｔＩがＳｍａＩ部位に代わって置き換えられるように修飾された。このオリゴヌクレオチド：（配列番号１）は、ＳａｌＩ部位、有効な翻訳のためのコザック共通配列、開始コドン、ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２）をコードしているヌクレオチド、２個の停止コドン、および、ｐＳＣ１１には存在せず、故にこのプラスミド中の挿入物の存在を決定する簡単な方法を提供するＮｏｔＩ部位から成っていた。鎖をアニーリングした後、この合成オリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで燐酸化した。ｐＳＣ１１をＳａ１ＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製し、そしてＴ４リガーゼを用いてこのオリゴヌクレオチドとライゲーションした。次いで、ワクシニアウイルスとプラスミドとの相同的組み替え、選択、および組み替え体の増殖を、記載のように実施した（モスおよびアール、１９９１）。実施例３キモスタチンによるＭＨＣ−１提示の阻害。抗原提示細胞この実験の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、正常マウス血清（１％）およびリポ多糖（１０μｇ／ｍｌｘ７２時間）を添加した培地で継代したマウスＢリンパ芽球様細胞セルライン（ＬＢ２７.４）であった。リポ多糖を含有させたこと以外は、これはロック等、１９９０ｂに記載されている。インヒビター処理および抗原のローディング。ＬＢ２７．４細胞を血清を含まないよう洗浄し、キモスタチン（２００μｇ／ｍｌ；ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）の存在下または不在下に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、この細胞を、抗原卵アルブミン（３０ｍｇ／ｍｌ）または卵アルブミンのアミノ酸２５７−２６４に相当する合成ペプチドのいずれかを含有する電気穿孔緩衝液（燐酸緩衝化食塩水、１ｍＭヘペス、０.４Ｍマンニトール；さらにキモスタチンを適当な群に添加した）に再懸濁した。次に、この再懸濁された細胞を、ジブコＢＲＬ（ガイサースバーグ、ＭＤ）からのセル−ポレイター上で、４℃で、高オーム、キャパシタンス１１８０の設定で電気穿孔に付した。細胞を４℃で４回洗浄し、引続きキモスタチンの存在下または不在下に３７℃で２時間インキュベートした。この２時間のインキュベーションの後に、細胞を１％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定し、その後洗浄した。抗原提示検定示された数の固定された抗原提示細胞を、１０⁵のＲＦ３３．７０細胞（ＯＶＡ＋Ｋ^b特異性Ｔ−Ｔハイブリドーマ）と共に、２００μｌのミクロ培養中で２個ずつインキュベートした。３７℃で１８時間後、培養上清のアリコート（１００μｌ）を収穫し、ロック等、１９９０ａおよび１９９０ｂに記載のように、ＨＴ−２細胞を用いてＩＬ−２含有量について検定した。図８の詳細な説明図８は、卵アルブミン（ＯＶＡ。左側の図）および卵アルブミンペプチド（右側の図）のＭＨＣ−Ｉ提示を示している。左側の図では、ＡＰＣをキモスタチン有り（白抜きの丸）または無し（塗りつぶした丸）で処理し、卵アルブミンと共に電気穿孔した。右側の図では、ＡＰＣをキモスタチン有り（白抜きの丸）または無し（塗りつぶした丸）で処理し、卵アルブミンペプチドと共に電気穿孔した。左側の図は、キモスタチンが、クラスＩＭＨＣ分子による卵アルブミンの提示を阻害することを証明している。右側の図は、キモスタチンが、電気穿孔されたペプチドの提示を阻害しないことを証明している。この結果は、抗原提示の阻害が、卵アルブミン蛋白から卵アルブミンペプチドへのプロセシングをキモスタチンが阻害することによって起こっていることを示すものである。実施例４プロテアソームの内因性インヒビターの単離。実施例７に示されるように、プロテアソームの蛋白分解活性を阻害する、プロテアソームの４０ｋＤａポリペプチド調節物質が、網状赤血球から精製され、そしてこれは、その放出が蛋白分解を活性化すると思われる、ＡＴＰ結合蛋白であることが示された。単離されたインヒビターは２５０ｋＤａの多量体として存在し、かなり不安定である（４２℃において）。これはＡＴＰまたは加水分解を受けないＡＴＰ類似体の添加により安定化されるが、精製されたインヒビターはプロテアソーム機能の阻害にＡＴＰを必要とせず、ＡＴＰアーゼ活性を欠く。このインヒビターは、１５００ｋＤａの蛋白分解複合体の必須構成成分に相当することが示された。網状赤血球がＡＴＰを涸渇すると、１５００ｋＤａＵＣＤＥＮは見いだされない。これに代わり、ギャノス等は、ＣＦ−１、ＣＦ−２およびＣＦ−３と表示される３個の構成成分を同定した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻１２４１２−１２４１９頁（１９８８））。本明細書に記載のように単離されたインヒビターは、多くの基準によりＣＦ−２と同一であるように思われる。これらの発見は、このインヒビターがＵＣＤＥＮ複合体のＡＴＰ依存機作において役割を果たしているという考えを示している。例えば、蛋白の分解中に、この１５００ｋＤａ複合体中で、ＡＴＰの加水分解が４０ｋＤａインヒビターの機能的放出を導き、これが一時的なプロテアソーム活性を可能にし、そしてユビキチン化蛋白がこの機作の引金を引くということが考え得る。この精製された因子は、蛍光生成テトラペプチドおよび蛋白基質の両方のプロテアソームによる加水分解を阻害することが示された。インヒビター、プロテアソームおよび部分精製されたＣＦ−１をＡＴＰおよびＭｇ²⁺の存在下で混合すると、１５００ｋＤａ複合体が再構成され、Ｕｂ−¹²⁵Ｉ−リゾチームの減成が起こった。この、プロテアソームの複数のペプチダーゼ活性のインヒビターの単離は、薬理学的介入のための魅力的な部位を利用可能とする。後述するように、これは、プロテアソームインヒビターの開発に有用な情報を提供するためにその構造的および機能的特徴が評価される、天然のインヒビターを提供する。材料および方法ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ−５２）、ＣＭセルロース（ＣＭ−５２）、およびホスホセルロース（Ｐ１１）はファットマンから入手した。Ｕｂ−複合体形成酵素（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）はＵｂ−セファロース親和カラムクロマトグラフィーを用いて単離し（ハーシュコ等、J．Biol．Chem．、２５８巻８２０６−８２１５頁（１９８３））、Ｕｂ−¹²⁵Ｉ−リゾチーム複合体の製造に使用した（ハーシュコおよびヘラー、Biochem．Biophys．Res．Comm．、１２８巻１０７９− １０８６頁（１９８５））。使用された他の全ての材料は前記実施例に記載の通りであった。精製フェニルヒドラジン注射により誘導されたウサギの網状赤血球を調製した（前記の通りに、またはグリーン・ヘクタールズ（オレゴン、ＷＩ）から購入）。これらは、記載に従って２，４−ジニトロフェノールおよび２−デオキシグルコースと共にインキュベーションすることにより、ＡＴＰを涸渇させた（シーチャノーヴァー等、Biochem．Biophys．Res．Comm．、８１巻１１００−１１０５頁（１９７８））。次に溶菌液を調製し、ＤＥ−５２クロマトグラフィーに付した。０.５ＭＫＣｌによって溶出した蛋白（ハーシュコ等、J．Biol．Chem.、２５８巻８２０６−８２１４頁（１９８３））を硫酸アンモニウムを用いて８０％飽和まで濃縮し、１００００ｘｇで２０分間遠心し、そして２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１ｍＭＤＴＴ（緩衝液Ａ）に懸濁した。同じ緩衝液に対して充分透析を行なった後、蛋白（画分ＩＩ）を０.５ｍＭＡＴＰ中−８０ ℃で保存するか、またはさらに分画した。画分ＩＩ（−２００ｍｇ）をＵｂ−セファロースカラムに適用し、Ｕｂ複合体形成酵素を特異的に溶出させ（ハーシュコ等、J．Biol．Chem．、２５８巻８２０６−８２１４頁（１９８３））、Ｕｂ−リゾチームの作成に使用した（ハーシュコおよびヘラー、Biochem．Biophys．Res．Comm．、１２８巻１０７９−１０８６頁（１９８５））。吸収されなかった画分を硫酸アンモニウムを用いて３８％飽和とし、ギャノス等により記載のように２０分間混合した（ギャノス等、J ．Biol．Chem．、２６３巻１２４１２−１２４１９頁（１９８８））。沈澱した蛋白を、１００００ｘｇで１５分間遠心することにより集めた。ペレットを緩衝液Ａに再懸濁し、再度硫酸アンモニウムで３８％飽和とした。沈澱した物質を上のように集め、次いで１０％グリセロールを含有する緩衝液Ａに懸濁した。この緩衝液に対して透析した後、０−３８％のペレットを、１０％グリセロールを含有する緩衝液Ａで平衡化したモノＱ陰イオン交換カラム上でクロマトグラフィーに付した。蛋白を、２０から４００ｍＭに至るＮａＣｌ直線勾配６０ｍｌを用いて溶離した。プロテアソームのペプチダーゼ活性を阻害した画分をプールし、濃縮し、次いで、１００ｍＭＮａＣｌおよび０.２ｍＭＡＴＰを含有する緩衝液Ａで平衡化したスーパーロース６（ＨＲ１０／３０）ゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付した。このカラムに流速０.２ｍｌ／分で流し、１ｍｌの画分を集めた。二回目の、より狭いモノＱクロマトグラフィー勾配（５０から３００ｍＭに至るＮａＣｌ）により、このインヒビターのさらなる精製を達成し、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色後に４０ｋＤａのバンドのみが見える、インヒビターの鋭いピークを与えた。プロテアソームに対する阻害活性を有する画分をプールし、２０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ６.５）、１０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴおよび１ｍＭＡＴＰを含有する緩衝液Ｂに対して透析した。次にこの試料を、緩衝液Ｂで平衡化した２ｍｌのホスホセルロースカラムに適用した。カラムをこの緩衝液４ｍｌ、その後この緩衝液４ｍｌ、その後ＮａＣｌ２０、５０、１００、４００または６００ｍＭのいずれかを含有する緩衝液Ｂ４ｍｌで洗浄した。部分的に純粋なＣＦ−１を得るために、１００ないし２４０ｍＭのＮａＣｌから溶出したモノＱ画分をプールし、１ｍｌに濃縮し、そして１００ｍＭＮａＣｌおよび０.２ｍＭＡＴＰを含有する緩衝液Ａで平衡化したスーパーロース６カラムに適用した。およそ６００ｋＤａにおいて溶出した画分をＣＦ−１含有画分として使用した。二つの３８％硫酸アンモニウム沈澱の上清からプロテアソームを単離した。この上清を硫酸アンモニウムで８０％飽和とし、２０分間混合した。沈澱した蛋白を遠心によって集め、緩衝液Ａに再懸濁し、この緩衝液に対して充分透析した。このプロテアソームを、先に記載のようにモノＱ陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離し、その後スーパーロース６上でゲル濾過した（ドリスコルおよびゴールドバーグ、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、８６巻７８９−７９１頁（1 989））。網状赤血球の画分ＩＩを、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）中、２ｍＭＡＴＰ、５ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、１５００ｋＤａ蛋白分解複合体を生成させた。３８％飽和とした硫酸アンモニウムで沈澱化させた後、ペレットを１０分間の１００００ｘｇで集め、緩衝液Ａに懸濁し、そしてモノＱ陰イオン交換およびスーパーロース６クロマトグラフィーによって単離した。検定個々のカラム画分を１ｍＭＡＴＰの存在下に３７℃で１０分間プロテアソームとプレインキュベートすることにより、プロテアソームの阻害を測定した。プレインキュベーションの後、反応管を氷上に置き、¹²⁵Ｉ−リゾチームまたはＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡのいずれかを添加した。¹²⁵Ｉ−リゾチームについては３７℃で６０分間、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡについては１０分間反応を実施した。蛋白の加水分解を１０％トリクロロ酢酸に可溶性の放射活性の産生を測定することにより、そしてペプチドの加水分解をメチルクマリル−７−アミドの放出により、検定した（ドリスコルおよびゴールドバーグ、Proc．Natl．Acad.Sci．ＵＳＡ、８６巻７８９−７９１頁（１９８９））。Ｕｂ複合体化¹²⁵Ｉ−リゾチームの減成を、２７℃で６０分間検定した。反応は５ｍＭＥＤＴＡまたは２ｍＭＡＴＰおよび５ｍＭＭｇＣｌ₂を含み、１０％トリクロロ酢酸の添加により反応を停止させた。結果インヒビターの単離プロテアソームがインビボでどのように調節されているか、そしてこれがＵｂ複合体減成複合体にどのように機能しているかを理解するために、本出願人等は、その活性に影響する因子を単離しようと試みた。網状赤血球の画分ＩＩを、０ −３８％または４０−８０％で沈澱する画分中へ、硫酸アンモニウムを用いて分離した。後者の画分をプロテアソームの単離に使用した。この粒子（ＡＴＰ涸渇網状赤血球からこのようにして得られた）は¹²⁵Ｉ−リゾチームおよびＳｕｃ− ＬＬＶＹ−ＭＣＡに対して認め得る活性を示し、これはＡＴＰとは独立していた（イータン等、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、８６巻７７５１−７７５５頁（１９８９）；ドリスコルおよびゴールドバーグ、J．Biol．Chem．、２６５巻４７８９−４７９２頁（１９９０））。プロテアソームまたは０−３８％画分のいずれも、Ｕｂ複合体化¹²⁵Ｉ−リゾチームに対して有意な活性を示さなかった（イータン等、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、８６巻７７５１−７７５５頁（１９８９）；ドリスコルおよびゴールドバーグ、J．Biol．Chem．、２６５巻４７８９−４７９２頁（１９９０））。しかしなから、かつて報告されたように、ユビキチン化リゾチームのＡＴＰ依存減成は、プロテアーゼおよび０−３８％画分をＡＴＰの存在下で一緒にプレインキュベートした後に観察された。次に、０−３８％沈澱化物質をモノＱ陰イオン交換を用いて分離し、各々の画分を、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡまたは¹²⁵Ｉ−リゾチームに対するプロテアソーム活性に影響を及ぼす能力について検定した。カラム画分をプロテアソームと共に１０分間プレインキュベートし、次いでいずれかの基質を添加した。いずれのカラム画分も、それ自身だけでは有意な加水分解活性を示さなかった。阻害活性のピークは２４０ないし２８０ｍＭＮａＣｌ近辺で溶出された。これは両基質に対する蛋白分解活性を有意に低下させた。リゾチームおよびペプチドの加水分解は同程度に阻害された。阻害活性をさらに精製するために、活性な画分をプールし、ゲル濾過によるクロマトグラフィーに付した。インヒビターは、見かけ分子量約１００−１５０ｋＤａの鋭いピークとして溶出した。次にこの活性画分をプールし、プロテアソームの基質加水分解活性を阻害する能力について検定した。インヒビター濃度が上がるにつれて、プロテアソーム活性は¹²⁵Ｉ−リゾチームおよびＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡの両方の基質について直線的に低下したが、阻害の程度は、調製試料間で大きく変動していた。インヒビターは１５００ｋＤａ蛋白分解複合体の構成成分である。インヒビターと同様に、１５００ｋＤａ蛋白分解複合体（ＣＦ−２）の一つの構成成分が、約２５０ｋＤａの分子量を有すると報告された。インヒビターがＣＦ−２に対応するかどうかを試験するため、ゲル濾過により得られたインヒビターをホスホセルロースクロマトグラフィーに付した。イータン等は、ＣＦ−２がホスホセルロースに対して親和性が殆ど無く、１００ｍＭ未満のＮａＣｌにより溶出されることを記載した。これに合致して、本出願人等は、阻害活性がフロースルーおよび２０ｍＭＮａＣｌ溶出液中に回収されることを見いだした（即ち、ＣＦ−２活性が報告された領域）。次いで個々のホスホセルロース画分を、ユビキチン化リゾチームの減成を再構成する能力について検定した。個別的にまたは合した場合、プロテアソームおよびＣＦ−１含有画分はユビキチン化リゾチームの迅速な分解を支持しなかった。しかしながら、この混合物をインヒビター活性のピークと合すると、Ｕｂ−¹²⁵Ｉ−リゾチームの減成速度は明確に上昇した。他のいずれのホスホセルロース画分もこの工程を剌激しなかった。これらの結果は、インヒビターがＣＦ−２に対応する事、そしてそれ故にＵｂ −ライゲーションした蛋白の加水分解にとって必須である事を強く示唆する。ＣＦ−２の珍しい性質の一つは、これが４２℃に加熱される時かなり不安定であるが、ＡＴＰにより安定化されることである（ギャノス等、J．Biol．Chem．、２６３巻１２４１２−１２４１９頁（１９８８））。プロテアソームのインヒビターがＣＦ−２に対応するかどうかをさらに試験するため、精製されたインヒビターをＡＴＰまたは加水分解され得ない類似体ＡＭＰＰＮＰ有りまたは無しで４２℃でプレインキュベートした。プロテアソームを添加し、１０分後にペプチダーゼ活性を検定した。阻害の程度は、ヌクレオチド添加無しのプレインキュベーション中に速やかに低下した。ＡＴＰまたはＡＭＰＰＮＰいずれかの存在は、この活性喪失を防止した。さらに、Ｕｂ−複合体化リゾチームの減成を再構成するこの物質の能力もまた、４２℃のインキュベーション中に速やかに低下し、ＡＴＰまたはＡＭＰＰＮＰの添加（示されていない）がこの活性化を防止した。Ｕｂ −複合体の減成の阻害および再構成は類似の不活性化速度を示し且つＡＴＰにより同じように安定化されたことから、これら二つの機能は恐らく、ＡＴＰと結合するらしい一つの分子に存在していると思われる。ＡＴＰは阻害因子を安定化するが、これはプロテアソームの阻害に必須である訳ではない。ＡＴＰ有りまたは無しでこのインヒビターを２０分までプロテアソームとプレインキュベートした後に、同じような程度の阻害が観察された。それにも拘らず、ＡＴＰによる安定化のためにこのヌクレオチドは全てのインキュベーションに対して画一的に添加された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する時、インヒビター調製物は４０ｋＤａの主要なバンドを示した。この４０ｋＤａサブユニットが１５００ｋＤａ複合体のサブユニットのいずれかに対応するかどうかを試験するため、画分ＩＩをＭｇ²⁺−ＡＴＰと共にインキュベートすることにより１５００ｋＤａ複合体を生成させ、陰イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより単離した。これらの活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、この複合体についてかつて報告されたものと類似の多くのポリペプチドを示した（ハウ等、J．Biol．Chem．、２６２巻８３０３−８３１３頁（１９８７）；ギャノス等、J．Biol．Chem．、２６３巻１２４１２− １２５４１９頁（１９８８）；Ｅ．イータン等、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、８６巻７７５１−７７５５頁（１９８９））。しかしながら、容易に見える４０ｋＤａのバンドが、この画分において明らかであった。プロテアソームに付随する蛋白の問題にさらに取り組むため、画分ＩＩを抗プロテアソームモノクローナル抗体を用いて免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｕｂ複合体減成活性は、画分ＩＩの免疫沈降時に除去されることがかつて見いだされている（マシューズ等、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、８６巻２５９７− ２６０１頁（１９８９））。免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの際、本出願人等は、他の、より高い分子量のバンドと共に、２０ないし３４ｋＤａの範囲の特徴的なプロテアソームサブユニットの組を観察した。重要なことに、インヒビターのバンドに類似し、且つ部分精製複合体において見られたバンドに類似する、４０ｋＤａのバンドが、この免疫沈降物中に検出された。参考文献Ｊ．Ｙ．アーン等、J．Biol．Chem.、２６６巻１５７４６頁（１９９１）。Ｊ．アレクサンダー等、イミュノジェネティクス、３１巻１６９−１７８頁（１９９０）。アンジェラストロ等、J．Med．Chem.、３３巻１１−１３頁（１９９０）。Ｈ．アングリカー等、Biochem．J.、２４１巻８７１−８７５頁（１９８７）。Ｔ．アオヤギおよびＨ．ウメザワ、プロテアーゼズ・アンド・バイオロジカル・コントロール、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９７５、４２９−４５４頁。Ｔ．アーモン等、J．Biol．Chem.、２６５巻２０７２３頁（９９０）。Ｄ．アーノルト等、ネイチャー、３６０巻１７１頁（１９９２）。バダラメンテ等、Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ、８６巻５９８３−５９８７頁（１９８９）。ベイ等、ＥＰＯ３６３２８４号、１９９０年４月１１日。ベイ等、ＥＰＯ３６４３４４号、１９９０年４月１８日。ブラッドフォード、Anal．Biochem．、７２巻２４８頁（１９７６）。Ｍ．Ｇ．ブラウン等、ネイチャー、３５３巻３５５頁（１９９１）。Ｓ．チャクラバティ、Ｋ．ブレクリングおよびＢ．モス、Mol．Cell 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（Ｄ）他の情報：／note＝配列Leu Val Val Tyrは、構造Suc-Leu Val Val Tyr-MCAを持った修飾ペプチドの一部である。（xi）配列：配列番号３：（xi）配列：配列番号３：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロック、ケネス・エルアメリカ合衆国02167マサチューセッツ州、チェスナット・ヒル、ウォルナット・ヒル・ロード145番【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原提示細胞においてＭＨＣ−Ｉ抗原提示を阻害する方法であって、該細胞を、阻害剤が該細胞に入るのに好適な条件下で、ＡＴＰ−ユビキチン依存経路による細胞内蛋白の蛋白分解を阻害するインヒビターと接触させることからなる方法。２．該インヒビターがプロテアソームのペプチダーゼを阻害し、該ペプチダーゼが、ａ）塩基性残基の後ろでの開裂；ｂ）疎水性残基の後ろでの開裂；および、ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ、より成る群から選ばれる活性を有する、請求項１に記載の方法。３．該インヒビターがペプチドアルデヒドである、請求項２に記載の方法。４．ペプチドアルデヒドがキモスタチンおよびロイペプチンより成る群から選ばれる、請求項３に記載の方法。５．該インヒビターが細胞内蛋白のユビキチン複合体形成を阻害する、請求項１に記載の方法。６．該インヒビターが、ａ）ユビキチン活性化酵素とも呼称されるＥ１；ｂ）ユビキチン−担体蛋白とも呼称されるＥ２；および、ｃ）ユビキチン−蛋白リガーゼとも呼称されるＥ３、より成る群から選ばれる蛋白を阻害する、請求項５に記載の方法。７．Ｅ１のインヒビターがアデニル酸ユビキチンの基質類似体である、請求項６に記載の方法。８．組織を、インヒビターが組織内の抗原提示細胞に入るのに好適な条件下で、ＡＴＰ−ユビキチン依存経路による細胞内蛋白の蛋白分解を阻害するインヒビターと接触させることからなる、哺乳動物組織の細胞溶解性免疫反応を阻害する方法。９．該インヒビターが、ａ）塩基性残基の後ろでの開裂および疎水性残基の後ろでの開裂より成る群から選ばれる、プロテアソームのペプチダーゼによる開裂；ｂ）ユビキチン複合体形成；および、ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ、より成る群から選ばれる、蛋白分解における一つの工程を阻害する、請求項８に記載の方法。１０．該インヒビターが、ａ）ユビキチン活性化酵素とも呼称されるＥ１；ｂ）ユビキチン−担体蛋白とも呼称されるＥ２；および、ｃ）ユビキチン−蛋白リガーゼとも呼称されるＥ３、より成る群から選ばれる蛋白を阻害する、請求項９に記載の方法。１１．個体に、該インヒビターが個体内の抗原提示細胞に入るのに好適な条件下で、ＡＴＰ−ユビキチン依存経路による細胞内蛋白の蛋白分解を阻害するインヒビターを投与することからなる、個体の細胞溶解免疫反応を阻害する方法。１２．該インヒビターが、ａ）塩基性残基の後ろでの開裂および疎水性残基の後ろでの開裂より成る群から選ばれる、プロテアソームのペプチダーゼによる開裂；ｂ）ユビキチン複合体形成；および、ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ、より成る群から選ばれる、蛋白分解における一つの工程を阻害する、請求項１１に記載の方法。１３．個体に、該インヒビターが個体内の抗原提示細胞に入るのに好適な条件下で、ＡＴＰ−ユビキチン依存経路による細胞内蛋白の蛋白分解を阻害するインヒビターを投与することからなる、個体の自己免疫疾患の治療または防止の方法。１４．該インヒビターが、ａ）塩基性残基の後ろでの開裂および疎水性残基の後ろでの開裂より成る群から選ばれる、プロテアソームのペプチダーゼによる開裂；ｂ）ユビキチン複合体形成；および、ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ、より成る群から選ばれる、蛋白分解における一つの工程を阻害する、請求項１３に記載の方法。１５．個体に、該インヒビターが個体内の抗原提示細胞に入るのに好適な条件下で、ＡＴＰ−ユビキチン依存経路による細胞内蛋白の蛋白分解を阻害するインヒビターを投与することからなる、個体による外来組織の拒絶を低減する方法。１６．該インヒビターが、ａ）塩基性残基の後ろでの開裂および疎水性残基の後ろでの開裂より成る群から選ばれる、プロテアソームのペプチダーゼによる開裂；ｂ）ユビキチン複合体形成；および、ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ、より成る群から選ばれる、蛋白分解における一つの工程を阻害する、請求項１５に記載の方法。１７．外来組織が、移植された臓器または移植片である、請求項１５に記載の方法。