JP2000507943A

JP2000507943A - 腫瘍壊死因子αコンバーターゼ

Info

Publication number: JP2000507943A
Application number: JP9534033A
Authority: JP
Inventors: ジェラード、エム．マックギーハン; ジェイムズ、デイビッド、ベクヘラー; マーシャ、エル．モス; フランク、ジェイ．ショーネン; ウォーレン、ジェイ．ロック; ウェン―ジイ、チェン; ジョン、アール．ディッドスバリー; ショウ―リャン、キャサリーン、ジン
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2000-06-27
Also published as: CA2249985A1; WO1997035538A3; AU2291397A; EP0900272A2; WO1997035538A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、更に詳しくはＴＮＦα前駆体を成熟ＴＮＦαにタンパク質分解で変換しうる酵素ＴＮＦαコンバーターゼ（ＴＮＦα‐ｃｏｎ）に関する。本発明は、噛乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎおよびその機能的同等物をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含んだ組換え発現ベクター、その発現ベクターを含んだ宿主細胞系、ＴＮＦα‐ｃｏｎのインヒビター、ＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製用のリガンドとしての使用向けに修飾されたインヒビターと、噛乳動物被治療体で異常レベルのＴＮＦαに起因した疾患または症状の治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍壊死因子αコンバーターゼ１．発明の分野本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、更に詳しくはＴＮＦα前駆体を成熟ＴＮＦαにタンパク質分解で変換しうる酵素ＴＮＦαコンバーターゼ（ＴＮＦα‐ｃｏｎ）に関する。本発明は、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎおよびその機能的同等物をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含んだ組換え発現ベクターおよび宿主細胞、このようなＤＮＡ配列を用いてＴＮＦα‐ｃｏｎを作るための方法、ＴＮＦα‐ｃｏｎのインヒビター、ＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製用のリガンドとしての使用向けに修飾されたインヒビターと、哺乳動物被治療体で異常レベルのＴＮＦαに起因した疾患または症状の治療方法を提供する。本発明は実施例により実証されており、そこではＴＮＦα‐ｃｏｎが単離されて、ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡがクローニングおよび配列決定されている。２．発明の背景カケクチンとしても知られるＴＮＦαは、活性化された単球およびマクロファージにより主に産生される哺乳動物タンパク質である。ＴＮＦαは、感染に対する細胞応答を媒介することにより、微生物侵襲に対する宿主防御で中心的役割を果たす、有力なサイトカインである。ＴＮＦαは正常哺乳動物血清に測定可能な量では通常存在しないが、ウイルスまたは細菌、トリパノソーマおよびプラスモジウムによる感染、およびサイトカインＩＬ‐１を含めた数タイプの刺激に対する応答で急速に出現する（Beutler and Cerami,1989,Ann.Rev.Immunol.7:625-65 5）。ＴＮＦα産生で最も強力として知られる刺激は細菌リポ多糖（ＬＰＳ）である。ＴＮＦαは、敗血症性ショックの病因（Williams and Summers,1994,Exp.Opin .Invest.Drugs,3:1051-1056）と、急性炎症または悪性疾患に伴う慢性的消耗（悪液質）（Vassali,1992 Ann.Rev.Immunol.10:411-452;Beutler and Cerami,1 989,前掲）で重要な内在因子である。ＴＮＦαは用量依存的毒性を現すとして認識されていた。例えば、ＴＮＦαが短時間であっても高レベルで存在していると、それは敗血症性ショックを誘発させることがある。ＴＮＦαが低レベルで長時間にわたり存在しすぎると、それは悪液質を起こすことがある。異常レベルのＴＮＦαは、下記疾患または症状、即ち全身性炎症応答症候群、再灌流損傷、心血管疾患、感染疾患、産科または婦人科障害、炎症疾患、自己免疫、アレルギーまたはアトピー疾患、悪性疾患、移植合併症およびその他の病因にも関係している。更に詳しくは、異常レベルのＴＮＦαは、エイズ（Folks et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:2365）、移植片対宿主疾患（Piguet et al.,1987,J.Exp.Med.166:1280）、大脳マラリア（Grau et al.,1987,Science,23 7:1210）およびリウマチ様関節炎（Brerman et al.,1989,Lancet ii:244； Elliot et al.,1994,Lancet 344:1105）で特に病原的役割を果たすようである。ヒトＴＮＦαは、約２６ｋＤａの膜結合前駆体として最初に合成される。可溶性成熟１７ｋＤａペプチドは、ＴＮＦα前駆体残基Ａｌａ₇₆およびＶａｌ₇₇間の結合の、ＴＮＦα‐ｃｏｎによる酵素開裂後に、前駆体から放出される。ＴＮＦ α前駆体は標準シグナル配列を欠いている。しかしながら、Ａｌａ₇₆‐Ｖａｌ₇₇ 開裂部位の変異が分泌を妨げることから、分泌小胞輸送現象はプロセッシングと結び付いているのかもしれない。 Mohler et al.,1994,Nature,370:218-220ではヒト単球細胞系ＴＨＰ‐１からＴＮＦα‐ｃｏｎを部分的に精製して、それがＺｎ²⁺依存性メタロプロテイナーゼであることを示した。Gearing et al.,1994,Nature,370:555-557では、コラゲナーゼのようなマトリックスメタロプロテイナーゼも正しい開裂配列でＴＮＦα 前駆体をプロセッシングしうることを証明した。加えて、セリンプロテアーゼ、セリン／システインプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよびアスパルチルプロテアーゼのようなプロテアーゼのインヒビターはＴＮＦα‐ｃｏｎ活性を阻害する上で無効であることが示された。McGeehan et al.,1994,Nature,370:558- 561では、メタロプロテイナーゼの高度保存Ｚn²⁺結合モチーフＨＥＸＧＨを標的にするヒドロキサム酸関連インヒビター、化合物ＧＩ１２９４７１が、ＴＮＦ α‐ｃｏｎ活性の特異的インヒビターであることを示した。最後に、Becherer e t al.,1995,J.Cell.Biochem.Supp.0(19B):253では、ＧＩ１２９４７１により阻害されるミクロソーム調製物中でのＴＮＦα‐ｃｏｎ酵素活性と、ＧＩ１２９４７１の光反応架橋誘導体を利用したフォトアフィニティークロマトグラフィーによる推定ＴＮＦα‐ｃｏｎの単離について報告した。様々なアプローチが、過剰のＴＮＦαを結合および中和させる上でのモノクローナルまたはキメラ抗体の使用を含めて、患者血清でＴＮＦαレベルをコントロールするために提示されてきた。例えば、米国特許第５，２３１，０２４号、米国特許第５，３６０，７１６号、米国特許第５，４３６，１５４号、米国特許第５，４４７，８５１号、ＷＯ９２／１１３８３、ＥＰ第０３６６０４３号、ＥＰ第０４９２４４８Ａ１号およびＥＰ第０５８５７０５Ａ１号明細書参照。過剰のＴＮＦαを結合させる代替アプローチは、ＴＮＦαレセプターの修飾体を投与することである。ＷＯ９２／０７０７６、ＷＯ９４／０６４７６およびＥＰ第０４１８０１４Ａ１号明細書参照。これらのアプローチに伴う１つの困難さは、投与された抗体またはペプチド分子に対して免疫反応を誘発させる可能性である。一方、米国特許第５，３４４，９１５号明細書はヒト尿から可溶性ＴＮＦα結合タンパク質の単離について開示している。別なアプローチは、ＴＮＦα前駆体ｍＲＮＡと結合してその翻訳を妨げるための、ＴＮＦαを産生する細胞における、ＴＮＦαアンチセンスｍＲＮＡの発現である。ＥＰ０４１４６０７Ａ２参照。更にもう１つのアプローチは、ＴＮＦαの合成または細胞分泌を特異的に阻害する化学化合物を同定して、投与することである。米国特許第５，３８５，９０１号明細書では、ＴＮＦαの産生を特異的に阻害するサリドマイドおよび関連化合物の使用について開示している。Mohler et al.,1994,前掲はヒドロキサム酸関連化合物を用いてＴＮＦαの放出を特異的に阻害し、それにより致死用量のＬＰＳ＋Ｄ‐ガラクトサミンで注射されたマウスの生存率を高めることができた。 Gearing et al.,1994,前掲およびMcGeehan et al.,1994,前掲では、双方とも、ＴＮＦα分泌を特異的に阻止する追加ヒドロキサム酸関連インヒビターを同定した。ＷＯ９５／０６０３１も参照。ＴＮＦα‐ｃｏｎを阻害する化合物のスクリーニングは、精製ＴＮＦα‐ ｃｏｎの容易に入手しうる豊富な供給源があれば、容易になるであろう。このようなインヒビターがあると、哺乳動物被治療体でＴＮＦαレベルを減少または調整して、それにより異常レベルのＴＮＦαに起因する疾患または症状を治療する上で有用である。加えて、多量にＴＮＦα‐ｃｏｎを入手できれば、このような治療の必要な哺乳動物被治療体でＴＮＦαレベルを調整するように働ける、ＴＮＦα‐ｃｏｎの誘導体、アナログおよびペプチドの開発および同定を容易にしうる。したがって、多量の単離ＴＮＦα‐ｃｏｎを作製するための組成物および方法を提供することが有用であろう。３．発明の概要本発明は、ＴＮＦα、更に詳しくはＴＮＦα前駆体を成熟ＴＮＦαに変換しうる生物活性を有するＴＮＦα‐ｃｏｎに関する。本発明は、酵素活性な哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列、更に詳しくはヒトＴＮＦα‐ ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列に関する。本発明は、哺乳動物ＴＮＦα‐ ｃｏｎと実質的に類似して、生物活性を示す、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドの誘導体、アナログまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列も提供する。本発明は、上記ＤＮＡ配列を含んだ組換え発現ベクター、そのＤＮＡ配列または発現ベクターを含んだ宿主細胞系と、組換え発現された酵素活性TＮＦα‐ ｃｏｎまたはその機能的同等物を更に提供する。本発明は、異常レベルのＴＮＦαに関連した疾患または症状を治療するために有用な、ＴＮＦα‐ｃｏｎの生物活性を阻害する化合物も更に提供する。本発明は、ＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製でリガンドとして使用向けの新規修飾インヒビターを更に提供する。４．図面の簡単な説明図１．ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）およびそれに対応した演鐸アミノ酸配列（配列番号２）。星印は終止コドンを示す。アミノ酸残基４０５‐４０９はメタロプロテイナーゼの亜鉛結合モチーフの保存配列を表す。図２Ａ．ブタＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製後にグリセロール勾配から集められたフラクションの、合成基質の開裂により決定されるような、酵素活性。図２Ｂ．図２Ａで試験されたものに相当するグリセロール勾配から集められたフラクションのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析。図３．脱グリコシル化前後におけるブタＴＮＦα‐ｃｏｎの還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析。図４Ａ．ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製後にグリセロール勾配から集められたフラクションの、合成基質の開裂により決定されるような、酵素活性。図４Ｂ．図４Ａで試験されたものに相当するグリセロール勾配から集められたフラクションのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析。図５．ブタＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列に特異的なプローブでブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られる、クローンｐｓＣ‐１、ｐｓＣ‐２、ｐｓＣ‐３およびｐｓＣ‐５の近接地図。配列比較では、４つのクローンが重複していることを示した。その地図では４つのクローンから２４１４塩基の全長を表している。図６．ブタＴＮＦα‐ｃｏｎの主要オープンリーディングフレームの一部をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号９）およびそれに対応した演鐸部分アミノ酸配列（配列番号１０）。星印は終止コドンを示す。アミノ酸残基８‐１２はメタロプロテイナーゼの亜鉛結合モチーフの保存配列を表す。図７．ヒト白血球（ｈｃ７、ｈｃ９、ｈｃ１１）およびヒト単球（３’＃１、３’＃４、３’＃５、５’＃４、５’＃７）のｃＤＮＡライブラリーから単離された陽性クローンの近接地図。ｈｃ７は塩基対５２５‐６１３および２１５６‐ ２２９４に２つの内部欠失を有している。図８．ＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製に有用なビオチニル化ヒドロキサム酸関連化合物の構造。図９．ビオチニル化ヒドロキサム酸関連化合物（Ｉ）の段階的（Ａ‐Ｉ）合成。図１０．図９に示された合成操作に用いられる試薬Ｃの段階的合成。図１１．ＲＡＣＥ１４クローンの配列（配列番号３９）５．発明の詳細な説明５．１．ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列本発明に従い使用できる核酸配列には、（ａ）高度厳密条件下で、例えば６８ ℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ洗浄により哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列に相補的であって（Ausubel et al.,eds.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Greene Publi shing Associations,Inc.,and John Wiley & Sons,Inc.,New York,page2.10.3.) 、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎに特徴的な生物活性を示す産物をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）中度厳密条件のようなそれほど厳密でない条件下で、例えば４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ洗浄により哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリッド形成して（Ausubel et a l.,1989,前掲）、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎに特徴的な生物活性を示す産物をコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）哺乳動物TＮＦα‐ｃｏｎに特徴的な生物活性を示す産物をコードするヌクレオチド配列を含めた、ＴＮＦα‐ｃｏｎまたはその機能的同等物をコードする核酸配列があるが、それらに限定されない。ここで用いられる“ＴＮＦα‐ｃｏｎ”という用語は、別に指摘されないかぎり、天然哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドおよびその機能的同等物に関する。本発明の目的において、ＴＮＦα‐ｃｏｎの“機能的同等物”には、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドと実質的に類似して、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎの生物活性を示す、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎのすべての誘導体、アナログおよびペプチドを包含するが、それらの用語は当業界で用いられているとおりである。ここで用いられる“実質的に類似した”という用語は、特定のアミノ酸配列が１以上のアミノ酸置換、欠失、付加または切欠、１以上の化学官能基の付加、またはそれらのある組合せにより、天然哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎ配列のアミノ酸配列から変化していることを意味する。ペプチドまたはポリペプチドは、そのアミノ酸配列が哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎの対応アミノ酸配列と少くとも約５０％相同性であり、更に好ましくは哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎの対応アミノ酸配列と少くとも約８０％相同性であるならば、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎと実質的に類似していると考えられる。哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎと実質的に類似したポリペプチドは、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎに特徴的な生物活性のうち少くとも１つのタイプを示すことも好ましい。本発明において、ＴＮＦα‐ｃｏｎに使われる“生物活性”には、（１）ヒトＴＮＦα前駆体の残基Ａｌａ₇₆およびＶａｌ₇₇間のペプチド結合に対応する開裂部位で哺乳動物ＴＮＦα前駆体をタンパク質分解で開裂しうる能力；（２）合成基質で対応ペプチド結合を開裂させる能力；または（３）哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎにより開裂されうる対応ペプチド結合を含んだＴＮＦα前駆体ポリペプチド、ＴＮＦαまたは合成基質と検出可能に結合しうる能力がある。いかなる哺乳動物組織または細胞も、分子クローニング用の、ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするヌクレオチド配列の供給源として使える。ＴＮＦα‐ｃｏｎ活性はＴＮＦα前駆体から成熟ＴＮＦαへのプロセッシングに要されるため、成熟ＴＮＦαを産生するいかなる組織または細胞もＴＮＦα‐ｃｏｎｍＲＮＡおよびＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドの供給源として使えることが合理的に推論できる。例えば、ＴＮＦαはＬＰＳへの暴露を含めた様々なタイプの刺激に応答して広範囲の哺乳動物組織および細胞で産生されることが知られている。このような哺乳動物組織には脾臓および胸腺があるが、それらに限定されない。具体的な哺乳動物細胞タイプには、マクロファージ、単球、Ｔ‐リンパ球、β‐リンパ球、マスト細胞、多形核白血球、ケラチン細胞、星状膠細胞、小膠細胞、平滑筋細胞、腸パーネト細胞および腫瘍細胞、特に繊維肉腫、上皮腫瘍系、ミエローマ、白血病Ｔ細胞と急性および慢性白血病ミエロイドの始原ミエロイドがあるが、それらに限定されない（Vassalli,1992,前掲;Beutler and Cerami,1989,前掲）。例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎｍＲＮＡおよびポリペプチドは、American Type Cultur e Collection（Rockville,Md．）（受理Ｎｏ．ＴＩＢ７１）から得られるマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（Jue et al.,1990,Biochemistry29:837 1-8377）のＬＰＳ刺激細胞から精製することができる。同様に、いかなるヒト細胞も、分子クローニング用の、ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするヌクレオチド配列の供給源として使える。例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎｍＲＮＡおよびポリペプチドは、例えば密度遠心によりヒト血液から精製しうるヒト単球から得られる（Kriegler et al.,1988,Cell,53:45-53）。ＴＮＦα‐ ｃｏｎｍＲＮＡおよびポリペプチドの供給源として使用できる確立されたヒト単球細胞系は、ＡＴＣＣ（受理Ｎｏ．ＴＩＢ２０２）から得られるＴＨＰ‐１である。上記いずれの細胞系または組織におけるＴＮＦαの産生も、標準法により産生される抗ＴＮＦα抗体を用いて免疫学的に、あるいは当業界で知られるいくつかのバイオアッセイ、例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる Matthews and Neale,1987,Clemens et al.(eds.),Lymphokines and Interferons :A Practical Approach,IRL,Oxford,pp.221-225に記載されたような、Ｌ‐９２９マウス繊維芽細胞を用いたin vitro細胞毒性アッセイを利用して調べることができる。ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするヌクレオチド配列は、公知方法により、限定されないが、例えばｃＤＮＡを作製するために全体ｍＲＮＡから逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）により、あるいはＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子配列に独特のプローブでクローン化ゲノムＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリー）をスクリーニングすることにより、上記組織または細胞のいずれからも単離される。例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎｃＤＮＡに由来する標識プローブが、ゲノムライブラリーをスクリーニングしてＴＮＦα‐ｃｏｎ関連遺伝子を単離するために用いられる。例えば、当業界で知られる技術を用いて、全ｍＲＮＡが前記組織または細胞タイプから単離され、逆転写されて、ｃＤＮＡを得て、その後これが例えば標識プローブでスクリーニングされる。このようなプローブは、遺伝コードとその公知の縮重を考慮して、例えば同一または異なる哺乳動物種からのＴＮＦα‐ ｃｏｎポリペプチドの部分アミノ酸配列に基づきデザインすることができる。ＴＮＦα‐ｃｏｎは、上記いずれの組織または細胞からも、例えば下記セクション６．１に記載された操作に従い哺乳動物脾臓組織から単離することができる。簡単に言えば、哺乳動物脾臓組織が、一連の工程により膜調製物を得るために、４℃でプロテアーゼインヒビターを含有した適切な緩衝液中で粉砕され、その後ＴＮＦα‐ｃｏｎと結合するコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）カラムに通される。溶出した酵素のこれ以上の精製には、例えば、インヒビターへのＴＮＦα‐ ｃｏｎの結合を行わせる条件下で部分精製ＴＮＦα‐ｃｏｎ調製物をＴＮＦα‐ ｃｏｎの修飾インヒビターと接触させて、ＴＮＦα‐ｃｏｎ‐インヒビター複合体を単離するような、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー工程を典型的に要する。新規の修飾インヒビターは図８に示された式を有するヒドロキサム酸関連インヒビターであり、式中Ｒはインヒビターと結合するＴＮＦα‐ｃｏｎを単離しうるような別の化合物との結合のために使用できる部分を含んでいる。例えば、その部分はビオチンであってもよい。Ｒはインヒビターとその部分との間にスペーサーアームを更に含んでいてもよい。スペーサーアームはいかなる鎖長でもよく、ヒドロキサム酸インヒビターとビオチン部分との間にジスルフィド結合を入れてもよい。例えば、限定ではなく、Ｒは下記のいずれかである：‐（ＣＨ₂）_n‐ ビオチン（ｎ＝０〜１０）、‐（ＣＨ₂）_n‐イミノビオチン（ｎ＝０〜１０）、 ‐（ＣＨ₂）_n‐Ｓ‐Ｓ‐（ＣＨ₂）_n−ビオチン（ｎ＝０〜１０）または‐ （ＣＨ₂）_n‐Ｓ‐Ｓ‐（ＣＨ₂）_n‐イミノビオチン（ｎ＝０〜１０）。インヒビターのビオチニル化は公知方法により行える。図８に示された具体的なビオチニル化インヒビターの製法は、以下で記載されている（セクション７）。加えて、本発明には、溶解性を改善したか、またはストレプトアビジンへの親和性を増した、ビオチンの誘導体の使用を包含する。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎは、公知方法を用いた、例えば、固相マトリックスに結合されたＧＩ１２９４７１のようなＴＮＦα‐ｃｏｎのインヒビターの光反応性架橋誘導体を利用した、フォトアフィニティークロマトグラフィーにより単離してもよい。ブタ脾臓から単離されたＴＮＦα‐ｃｏｎは約８５ｋＤａの見掛け質量を有するが、脱グリコシル化後は約６２ｋＤａに低下する。そのポリペプチドが単離されると、ポリペプチドの完全または部分アミノ酸配列が、例えばエドマン分解操作により得られる（Creighton,1983,Proteins, Structures And Molecular Principles,W.H.Freeman & Co.,N.Y.,pp.34-49参照）。次いで縮重オリゴヌクレオチドプライマーが完全または部分アミノ酸配列に基づいてデザインされ、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の一部を増幅させるためにＰＣＲで用いられる。次いで増幅された部分は、ＴＮＦα‐ｃｏｎの完全ヌクレオチドコード配列を得るためにプローブとして用いられる。例えば、ブタＴＮＦα‐ｃｏｎの４１アミノ酸断片に基づきデザインされた下記の縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーが、哺乳動物ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の一部を増幅させるために有用である：配列５’‐ＧＴＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＧＡ‐３’（配列番号３）を有するプライマーｃｏｎｖ‐１；配列５’‐ＧＴＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＧＡ‐３’（配列番号４）を有するプライマーｃｏｎｖ‐２；配列５’‐ＣＣＩＡＣ（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＧＣ‐３’（配列番号５）を有するプライマーｃｏｎｖ‐３。例えば、プライマーｃｏｎｖ‐１（配列番号３）またはプライマーｃｏｎｖ‐２（配列番号４）は、ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするブタ脾臓ポリ（Ａ＋）ＲＮＡからの８９ｂｐ断片（配列番号８）をＲＴ‐ＰＣＲにより増幅させるために、プライマーｃｏｎｖ‐３（配列番号５）と併用することができる。ＰＣＲ増幅は公知方法により行える。例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Innis et al.(eds.),1995,PCR Strategies,Academic Press,Inc.,San DiegoおよびErlich（ed）1992,PCR Technology,Oxford University Press,New York参照。適切なプライマー、増幅されるヌクレオチド配列、適切な酵素および緩衝液を含んだＰＣＲ混合物が、ＤＮＡ配列を増幅させるために、標準ＰＣＲプロトコールに従いプロセッシングされる。増幅は、例えばInvitrogenのｃＤＮＡサイクルキットのような市販試薬を用いて、例えばブタ脾臓ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの逆転写により作製されたｃＤＮＡライブラリーで行える。増幅産物の配列は、それがＴＮＦα‐ｃｏｎの完全または部分アミノ酸配列と一致することを確認するために決定される。次いでこのような増幅配列は、ヒトを含めた哺乳動物ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーでＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列についてスクリーニングするために用いられる。得られると、完全ＴＮＦα‐ｃｏｎ配列は下記のように分子クローニングで特徴付けられて、用いることができる。ＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡ配列の分子クローニングでは、ＤＮＡ断片が典型的に作製され、そのうちの一部は望ましいＴＮＦα‐ｃｏｎ配列をコードしている。これらの断片を作製するため、ＤＮＡは様々な制限酵素を用いて特定部位で開裂される。一方、マンガンの存在下でＤＮＡを断片化しても、または例えば超音波でＤＮＡを物理的に剪断してもよい。次いで直鎖ＤＮＡ断片は、限定されないが、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）とカラムクロマトグラフィーを含めた標準技術により、サイズに従い分離することができる。ＤＮＡ断片が得られたら、ＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡ配列を含んだ１以上の特異的ＤＮＡ断片の同定がいくつかの手法で行われる。例えば、ある量のＴＮＦα ‐ｃｏｎ遺伝子またはその特異的ＲＮＡ、またはそれらの一部が検出可能に標識されたら、得られるＤＮＡ断片は標識されたプローブとのハイブリッド形成によりスクリーニングされる。遺伝コードの固有的な縮重のために、実質的に同様のまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質のクローニングおよび発現のため本発明の実施に用いてよい。このようなＤＮＡ配列には、上記のような高度または中度厳密条件下でＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列と相補的なヌクレオチド配列とハイブリッド形成しうるものがある。厳密条件はいくつかの手法で調整される。例えば、ＰＣＲを行うときには、鋳型へのプライマーのアニーリングが起きる温度および／または反応緩衝液中におけるＭｇＣｌ₂の濃度が調整される。ハイブリッド形成反応で放射線標識ＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを用いるとき、厳密さは洗浄液のイオン強度の変化および／または洗浄が行われる温度の慎重なコントロールにより調整される。本発明に従い用いられる改変ヌクレオチド配列には、異なるヌクレオチドの欠失、付加または置換を含んだものがあり、同様のまたは機能的に同等な遺伝子産物をコードする配列となる。ヌクレオチド配列の改変では、サイレントでもまたはサイレントでなくてもよいが、ＴＮＦα‐ｃｏｎに特徴的な生物活性を示す産物を作製するアミノ酸配列において、変化、即ち欠失、付加、置換または切欠を起こさせる。このようなヌクレオチド変化は、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性を考慮して行われる。例えば、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正電荷アミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。似た親水価を有する未電荷極性ヘッド基または無極性ヘッド基をもつアミノ酸には、以下のロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンがある。ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列が単離されたら、それは当業界で知られるいずれかの方法、例えば化学合成、ＰＣＲ増幅または宿主細胞でのクローニングにより増幅させることができる。例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Maniatis et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.； Ausubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associations & Wiley Interscience,N.Y.；Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y．に記載された技術参照。ＰＣＲ操作および他の技術を利用して、ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列がクローニングおよび配列決定されたが（配列番号１）（図１）、これはそこに示されたアミノ酸配列（配列番号２）についてコードしている。本発明の具体的態様において（下記セクション６参照）、ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎのｃＤＮＡ配列は、最初にブタＴＮＦα‐ｃｏｎを精製し、その部分的なアミノ酸配列を決定し、部分的なブタアミノ酸配列に基づき縮重ＰＣＲプライマーを合成し、ブタＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡコード領域の断片を増幅させ、ヒトＴＮＦα‐ ｃｏｎをコードする全鎖長ｃＤＮＡ配列を単離するようにプローブとしてその断片を用いてヒト白血球および単球ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。単離されると、本発明のＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡ配列は、限定されないが、 Southernハイブリッド形成、Northernハイブリッド形成、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよびＤＮＡ配列分析を含めた、公知方法により分析することができる。ＴＮＦα‐ｃｏｎ特異的プローブとのSouthernハイブリッド形成では、様々な細胞タイプで、自然のまたは導入された、ＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子の検出を行える。Northernハイブリッド形成分析は、異なる細胞タイプで、あるいは例えば発育または誘導の様々な段階で、ＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子の発現を調べるために用いることができる。SouthernおよびNorthern双方のハイブリッド形成に関するハイブリッド形成条件の厳密さは、用いられる特異的ＴＮＦα‐ｃｏｎプローブと望ましい関連度を有する核酸を確実に検出しうるように操作できる。制限エンドヌクレアーゼマッピングは、ＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子の遺伝子構造、およびＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子と他の遺伝子との相同性の程度を概略で決めるために用いることができる。制限エンドヌクレアーゼ開裂により導かれた制限地図は、ＤＮＡ配列分析により確認できる。ＤＮＡ配列分析は、限定されないが、Maxam and Gilbertの方法（1980,Meth． Enzymol.65:499-560）、Sangerジデオキシ法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl． Acad.Sci.USA,74:5463）または自動ＤＮＡシークエネーター（例えば,Applied Biosystems,Foster City,Ca．）の使用を含めた、当業界で知られるいずれかの技術により行える。５．２．ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列の発現を指示するベクターＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列が得られると、それは宿主細胞中に直接移しても、または最初に適切な発現ベクター中に挿入してから、増殖および発現のため宿主細胞に移してもよい。このようなベクターは、好ましくは、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列がそのコード配列の転写および翻訳と生物活性分子の産生に必要な１以上の調節要素と機能的に関連するように構築される。ここで用いられるような“調節要素”という用語には、発現を推進および／または調節するように働く誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび当業界で知られる他の要素を含むが、それらに限定されない。しかも、ここで用いられるようなＤＮＡコード配列は、調節要素がＤＮＡコード配列の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を有効に調節して行えるように、１以上の調節要素と“機能的に関連”している。当業界で知られる方法は、適切な調節要素と機能的に関連させたＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡ配列を含む発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およびin vivo遺伝子組換えがある。例えば、Maniatis et al.,1989，前掲；Ausubel et al.,1989,前掲；Sambrook et al.,1989，前掲に記載された技術参照。様々な宿主発現ベクター系、好ましくはＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の複製、転写および翻訳を指示する上で必要な調節要素を含んだものも、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を発現させるために、当業者により同じくうまく利用される。これらの宿主発現ベクター系には、限定されないが、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター、例えばバキュロウイルスで感染された昆虫細胞系；あるいは、ＴＮＦα‐ｃｏｎ配列を含む組換えウイルス発現ベクター、例えばアデノウイルスまたはワクシニアウイルスで感染された動物細胞系のような微生物があり、例えば、安定的に増幅されたＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列、例えばＣＨＯ／ｄｈｆｒまたはＤＭ（double-minute）染色体で不安定に増幅されたＴＮＦ α‐ｃｏｎコード配列の複数コピーを含むように工学処理された細胞系、例えばマウス細胞系もある。これらベクターの調節要素では、それらの強度および特異性が異なる。利用される宿主／ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写および翻訳要素が用いられる。例えば、哺乳動物細胞系でクローニングするときには、哺乳動物細胞のゲノムから単離されたプロモーター、例えばマウスメタロチオネインプロモーター、またはこれらの細胞で増殖するウイルスから単離されたプロモーター、例えばワクシニアウイルス７．５ＫプロモーターまたはMoloneyマウス肉腫ウイルス長末端反復配列が用いられる。組換えＤＮＡまたは合成技術により得られたプロモーターも、挿入された配列の転写を行わせるために用いてよい。例示される転写調節領域またはプロモーターには、細菌の場合では、β‐ ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左および右プロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、ｔｒｐ‐ｌａｃ融合プロモーターなど；酵母の場合では、解糖酵素プロモーター、例えばＡＤＨ‐Ｉおよび‐II プロモーター、ＧＰＫプロモーター、ＰＧＩプロモーター、ＴＲＰプロモーターなど；哺乳動物細胞の場合では、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターなどがある。特異的開始シグナルも、挿入タンパク質コード配列の十分な翻訳に必要である。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含めた全体ＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子が適切な発現ベクター中に挿入される場合、追加の翻訳コントロールシグナルは不要かもしれない。しかしながら、コード配列の一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含んだ外来翻訳コントロールシグナルが用意されねばならない。更に、開始コドンは全体インサートのインフレーム翻訳を確実にするためＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列のリーディングフレームと同調させねばならない。これらの外来翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、自然および合成双方の様々な供給源から得られる。加えて、発現の効力は転写減衰配列、エンハンサー要素などの導入により高められる。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合には、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分ラダー配列に結合される。そのときには、このキメラ遺伝子はin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入される。ウイルスゲノムの非必須領域、例えば領域Ｅ３またはＥ４における挿入から、感染宿主中で生存しえて、そこでＴＮＦα‐ｃｏｎを発現しうる組換えウイルスを得る。同様に、ワクシニア７．５Ｋプロモーターも用いてよい。ＴＮＦα‐ｃｏｎを発現させるために用いられる別な発現系は、例えば Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来配列を発現させるためにベクターとして用いられるような、昆虫系である。そのウイルスは Spodoptera frugiperda細胞で増殖する。ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列は、非必須領域、例えばそのウイルスのポリヘドリン遺伝子中にクローニングされ、例えばポリヘドリンプロモーターのようなＡｃＮＰＶプロモーターのコントロール下におかれる。ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子の不活化と、非閉塞組換えウイルス、即ちポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質コートを欠いたウイルスの作製が行える。これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるSpodoptera frugiperda細胞に感染させるために用いられる。一方、両種性パッケージング細胞系で作られたレトロウイルスベクターは多数の細胞タイプで高い効率的発現を行える。この方法では、挿入されたタンパク質コード配列の細胞タイプ特異的プロセッシング、調節または機能の評価を行える。挿入された配列の発現を調節するか、または望ましい特異的融合で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択される。あるプロモーターからの発現は、あるインデューサー、例えばメタロチオネインプロモーターでは亜鉛およびカドミウムイオンの存在下で高めることができる。こうして、遺伝子工学処理されたＴＮＦα‐ｃｏｎの発現がコントロールされる。これは、クローン化外来遺伝子のタンパク質産物が宿主細胞に致死的であるならば、重要である。更に、タンパク質産物の修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化、およびプロセッシング、例えば開裂は、タンパク質の生物活性にとり重要である。異なる宿主細胞は、発現されたポリペプチドの翻訳後修飾およびプロセッシングについて、特徴的かつ特異的なメカニズムを有している。例えば、グリコシル化パターンの修飾はタンパク質の異なる機能にとり重要である。そのため、細菌系での発現は未グリコシル化“コア”タンパク質産物を生じる。酵母での発現はグリコシル化産物を生じる。哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞での発現は、異種ＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドの“自然”グリコシル化を確実にさせるために用いることができる。このような改変は、ポリペプチドの１以上の生物学的性質に変化を起こしても、または起こさなくてもよい。例えば、特定の細胞タイプで発現されたＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドは、ＴＮＦα前駆体と結合する能力を留めているが、それを開裂する能力を欠いている可能性がある。このような様々にプロセッシングされたＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドも、本発明の範囲内に属する。このようにして、細胞系または宿主系は発現タンパク質の望ましい修飾およびプロセッシングを確実にするように選択される。融合タンパク質発現ベクターも、ＴＮＦα‐ｃｏｎ融合タンパク質を発現させるために用いてよい。精製されたＴＮＦα‐ｃｏｎ融合タンパク質は、ＴＮＦα ‐ｃｏｎタンパク質に対する抗血清を作り、ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質の生化学的性質を研究し、異なる酵素活性のＴＮＦα‐ｃｏｎ融合タンパク質を工学処理して、あるいは発現されたタンパク質の同定または精製を助けるために用いられる。可能な融合タンパク質発現ベクターには、β‐ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥ融合体、マルトース結合タンパク質融合体、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ融合体およびポリヒスチジン融合体（キャリア領域）を発現するベクターがあるが、それらに限定されない。当業界で知られる方法が、このようなＴＮＦα‐ｃｏｎ融合タンパク質についてコードする発現ベクターを構築するために使用できる。例えば、Maniatis et al.,1989，前掲；Ausubel et al.,1989,前掲；Sambrook et al.,1989，前掲に記載された技術参照。ＴＮＦα‐ｃｏｎ融合タンパク質は、精製のために用いられる領域を含んでいてもよい。例えば、アミロース樹脂はマルトース結合タンパク質融合体の精製に用いられ、グルタチオン‐アガロースビーズはグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ融合タンパク質の精製に用いられ、または２価ニッケル樹脂はポリヒスチジン融合体の精製に用いられる。一方、キャリアタンパク質またはペプチドに対する抗体は、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に用いられる。例えば、モノクローナル抗体の標的エピトープについてコードするヌクレオチド配列は、調節要素と機能的に関連した発現ベクター中に工学的に入れられ、発現されたエピトープがＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドと融合するように位置決めされる。限定ではなく、例えば、親水性マーカーペプチドであるＦＬＡＧ^TM エピトープ標識についてコードするヌクレオチド配列（International Biotechnologies Inc.，ＩＢＩ）は、例えばＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドのカルボキシル末端に相当する箇所で、発現ベクター中に標準技術で挿入させることができる。発現されたＴＮＦα‐ｃｏｎ‐ＦＬＡＧ^TMエピトープ融合産物は、市販抗FＬＡＧ^TM抗体（ＩＢＩ）を用いて検出およびアフィニティー精製される。発現ベクターは、クローン化タンパク質が特異的プロテアーゼとの処理でキャリア領域から放出されるように、特異的プロテアーゼ開裂部位をコードしたポリリンカー配列を含むように、工学処理してもよい。例えば、トロンビンまたはＸａ因子開裂部位をコードするＤＮＡ配列が融合タンパク質ベクターに入れられる。ポリペプチドコード配列とリーディングフレーム内でその上流にあるシグナル配列も、発現タンパク質のトラフィッキングと分泌を指示するように、公知方法で発現ベクター中に工学的に入れてよい。シグナル配列の非制限例には、特にα ‐因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼおよびＴ細胞レセプターからのものがある。形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助けるために、発現ベクターはリポーター遺伝子産物または他の選択マーカーについてのコード配列を更に含むように工学処理してもよい。このようなコード配列は、好ましくは、上記のような調節要素コード配列と機能的に関連させるべきである。本発明で有用なリポーター遺伝子は当業界で周知であり、特にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼおよびヒト成長ホルモンをコードするものがある。本発明で有用な選択マーカーをコードするコード配列も当業界で周知であり、抗生物質または代謝拮抗物質に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードするもの、または栄養要求性を呈するものがある。このような配列の例には、特にチミジンキナーゼ活性またはメトトレキセートに対する耐性をコードするものがある。発現ベクターは、ポリペプチド発現を高めるかまたは最良にするために公知方法に従い、例えばプロモーター強度を増加させるかまたはポリペプチドコード配列自体を変化させるようにＤＮＡ調節要素を変異させることにより、更に工学処理することができる。他の修飾では、例えばメッセージ不安定化配列を最少にするかまたは除去することにより、ポリペプチドの発現で配列-または距離‐関連のネガティブな影響を最少に抑えるために、ポリペプチドコード配列の５’および／または３’末端からイントロン配列または過剰非コード配列を欠失させる。加えて、ベクターは５’末端の下流に唯一のプロテアーゼ開裂配列を含むように工学処理することができる。例えば、トロンビン開裂配列のようなプロテアーゼ配列は、開裂が活性な切欠ＴＮＦα‐ｃｏｎを生じるように置かれる。５．３．宿主細胞の形質転換／トランスフェクションおよびＴＮＦα‐ｃｏｎ発現ＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列を含んだ組換え発現ベクターは、好ましくは、適切な宿主微生物、昆虫または哺乳動物細胞系の実質的な同種培養物の１以上の細胞中に形質転換またはトランスフェクトされる。発現ベクターは、限定されないが、リン酸カルシウム沈降ＤＮＡを用いた形質転換、ＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞をウイルスと接触させることによるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ‐デキストラントランスフェクション、トランスダクション、複合化、マイクロプロジェクトル衝突（microprojectile bombardment）などを含めた公知技術に従い、宿主細胞中に導入される。発現ベクターが宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノム中へのまたはエピソーム的なポリペプチドコード配列の組込みおよび維持は、標準技術により、例えばSouthernハイブリッド形成分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）を含めたＰＣＲ分析、または予想されるタンパク質産物の免疫学的アッセイにより、確認することができる。組換えＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を含んで、生物学的に活性な産物を発現する宿主細胞は、少くとも４つの一般的アプローチ：（ｉ）ＤＮＡ‐ＤＮＡ、ＤＮＡ‐ＲＮＡまたはＲＮＡ‐アンチセンスＲＮＡハイブリッド形成、（ii）“マーカー”遺伝子機能の存在または不在の検出、（iii）宿主細胞でＴＮＦα‐ｃｏｎｍＲＮA転写物の発現により測定されるような転写レベルの評価、および（i v）例えばイムノアッセイまたは生物活性の存在により測定されるような成熟遺伝子産物の存在の検出により同定される。第一アプローチでは、ＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡ配列の存在は、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列と相同的な標識プローブを用いたヌクレオチドハイブリッド形成により検出できる。第二アプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系は、ある“マーカー”遺伝子機能、例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスで閉塞体形成などの存在または不在に基づき同定および選択できる。例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されたならば、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を含んだ組換え体はマーカー遺伝子機能の不在により同定できる。一方、マーカー遺伝子は、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の発現をコントロールするために用いられる同一または異なるプロモーターのコントロール下で、ＴＮＦα‐ ｃｏｎ配列とタンデムに置いてもよい。誘導または選択に応答したマーカーの発現は、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の発現を示す。限定ではなく、例えば、ＦＬＡＧ^TMエピトープの発現は、そのコード配列は上記のようにＴＮＦα‐ｃｏｎ配列とタンデムに置けるが、例えばwestern Exposure^TM化学発光検出系（Clontech ）と共に抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ）を用いて細胞抽出物で検出しうる。第三アプローチでは、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード領域の転写活性はハイブリッド形成アッセイにより評価できる。例えば、全細胞ｍＲＮＡは、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列またはその特定部分と相同的なプローブを用いてNorthemブロットにより単離および分析できる。第四アプローチでは、成熟タンパク質産物の発現は、例えばWesternブロット、放射性免疫沈降、酵素結合イムノアッセイなどにより、免疫的に評価できる。一方、タンパク質発現は公知方法を用いた組織化学局限化により確認して、更には特徴付けできる。例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、Bullock and Petrusz(eds),1982,Teclmiques in Immunocytochemistry,Vol I, Academic Press,Inc.,London参照。限定ではなく、例えば、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞または組織はセクションに分けられ、各セクションはポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル一次抗体でプロービングされる。次いで結合された一次抗体は標準技術により、例えばビオチニル化プロテインＡ‐アルカリホスファターゼ‐複合化ストレプトアビジン技術、または一次抗体と結合する検出可能な標識を有した二次抗体を用いて検出される。その発現系でうまくいく重要な試験には、生物活性を示すＴＮＦα‐ｃｏｎの検出がある。ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質に伴う生物活性のうち１つは、ＴＮＦ α前駆体を成熟ＴＮＦαに酵素変換しうるその能力である。もう１つは、合成基質を開裂させるＴＮＦα‐ｃｏｎの能力である。したがって、生物活性ＴＮＦα ‐ｃｏｎの存在を検出するための非制限的方法では、ＴＮＦα前駆体から成熟ＴＮＦαへの変換または合成基質の開裂を検出する。限定ではなく、例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎ生物活性は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、例えばＤＮＰ‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐ Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐ＮＨ₂（配列番号１４）（ＤＮＰ＝ジニトロフェニルアラニン）のような合成基質の開裂をクロマトグラフィー検出して、追跡することができる。この合成基質はヒトＴＮＦα前駆体の開裂部位にまたがっている。酵素活性は、最終容量１００μｌで、（注入誤差を補正するために標準として用いられる）ＤＮＰ‐Ｓｅｒ（２０μＭ）を含有した、０．２５Ｍスクロースおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；または５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭＫＣｌ、５μＭＺｎＳＯ₄および２ｍＭＣａＣｌ₂のような緩衝液中において、酵素調製物を合成基質（５０μＭ）とインキュベートすることによりアッセイされる。緩衝液は下記プロテアーゼインヒビター：ロイペプチン（１０μＭ）、ペプスタチン（１μＭ）、ホスホルアミドン（１０μＭ）、ＡＥＢＳＦ（１ｍＭ）およびＥ‐６４（１０μＭ）（SigmaまたはCalbiochem）を含有してもよい。アッセイは、好ましくは、３７℃で１５分間〜３時間にわたり行われる。次いで反応は等量の１％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）の添加により停止される。一般的なタンパク質分解活性とＴＮＦα ‐ｃｏｎによる特異的な活性とを区別するために、ＴＮＦα‐ｃｏｎの特異的インヒビターであるヒドロキサム酸関連インヒビター、例えばＧＩ１２９４７１（McGeehan et al.,1994，前掲）を含有したサンプルが二重にランされる。タンパク質分解活性の分析は、例えば、２２〜３５％アセトニトリルの水／アセトニトリル勾配を用いたＣ‐１８ Vyadac カラムでのＨＰＬＣで、基質および産物を分離および検出することにより行われるが、水およびアセトニトリルは双方とも０．１％ＨＦＢＡを含有している。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎ活性は、Ｚ‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐ Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ（Ｘ）‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ（配列番号１７）〔ＺはＮＢＤ（６‐（Ｎ‐（７‐ニトロベンゾ‐２‐オキサ‐１, ３‐ジアゾール‐４‐イル）アミノ）またはローダミンのような発蛍光団であり、側基としてＬｙｓに結合されたＸは例えばジメチルクマリン（ＤＭＣ）である〕のような合成基質の開裂後に、蛍光標識を追跡して検出してもよい。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎ活性は放射線標識された前駆体を用いて検出してもよい。例えば、ＴＮＦα前駆体ポリペプチドは、in vitro転写／翻訳キット（Promega）を用いて³⁵Ｓ‐システインの取込みにより放射線標識される。放射線標識された基質は、好ましくは、０．１〜１．０％ＮＰ‐４０、０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５およびプロテアーゼインヒビター（１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン、１ｍＭＡＥＢＳＦ）１０μＭＥ‐６４、１μＭペプスタチン、１０μＭジプロチニンＡ、１０μＭアムスタチン、１０μＭベスタチンおよび１０μＭジプロチニンＢ）を含有した緩衝液中３７℃でＴＮＦα‐ｃｏｎ調製物と共に１〜３時間インキュベートされる。反応は４％ＳＤＳ）２００ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセロールおよび０．２％ブロモフェノールブルーを含有した担持用緩衝液を加えることにより停止される。サンプルは煮沸され、産物から基質を分離させるためにポリアクリルアミドゲル上に担持され、ホスホルイメージャー(phosphorimager) （Molecular Dynamics，モデル４２５Ｆ）を用いて視覚化される。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎ活性は、ＴＮＦαの存在を検出するin vitroバイオアッセイを用いて、間接的に調べてもよい。Ｌ‐９２９マウス繊維芽細胞を用いる細胞毒性アッセイ（Matthews and Neale,1987,前掲）のような、当業界で知られるいくつかのバイオアッセイのうちいずれか１つが用いられる。５．４．発現されたＴＮＦα‐ｃｏｎの精製および特徴付け構造遺伝子が適切な宿主細胞中に安定的に導入されたら、宿主細胞は生物活性ＴＮＦα‐ｃｏｎの最大産生に導く条件下で増殖される。このような条件では、典型的には細胞を高密度に増殖させる。発現ベクターが誘導プロモーターを含んでいる場合、発現を誘導するために、適宜に、例えば温度変化、栄養素の枯渇、過剰代謝副産物の蓄積などのような誘導条件が用いられる。発現されたタンパク質が宿主細胞中に留められる場合、細胞は収集され、溶解されて、産物が、タンパク質分解を最少に抑えるために当業界で知られる抽出条件下で、例えば４℃で、またはプロテアーゼインヒビターと共に、または双方により、溶解物から単離および精製される。発現されたタンパク質が分泌される場合には、栄養素枯渇培地が単に集められて、産物がそこから単離される。発現されたタンパク質は、限定されないが、下記方法：硫酸アンモニウム沈降、サイズ分別、例えばＤＥＡＥ‐セルロースカラムでのイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心およびアフィニティークロマトグラフィーの組合せを含めた標準方法を用いて精製される。ＴＮＦα‐ｃｏｎは、そのポリペプチドを（ａ）そのポリペプチドに対するモノクローナル抗体、（ｂ）ｃｏｎＡのようなレクチン、（ｃ）ＴＮＦαまたはその前駆体、または（ｄ）ＴＮＦα‐ｃｏｎインヒビター、例えばヒドロキサム酸関連インヒビター、特にＧＩ１２９４７１（McGeehan et al.,1994，前掲参照）に結合させることにより、アフィニティー精製される。限定ではなく、例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎは、下記（セクション７参照）のように製造されたビオチニル化ヒドロキサム酸関連インヒビターを用いてアフィニティー精製できる。簡単に言えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎを含んだ細胞溶解物、枯渇培地または部分精製酵素調製物が、ビオチニル化インヒビターへのＴＮＦα‐ｃｏｎの結合に導く条件下で、ビオチニル化ＴＮＦα‐ｃｏｎインヒビターと接触させられて、ＴＮＦα‐ｃｏｎ‐インヒビター‐ビオチン複合体を形成する。次いでＴＮＦα‐ｃｏｎ‐インヒビター‐ビオチン複合体は、ストレプトアビジンへのＴＮＦα‐ｃｏｎ‐インヒビター‐ビオチン複合体の結合に導く条件下で、3M EMPHAZE^TKBiosupport Medium ABI（Pierce）のULTRALINK^TK固定N eutravidin Plusのような固相マトリックスに結合されたストレプトアビジンとそれを接触させることにより単離される。次いで酵素は、例えば、ロイペプチン（１０μＭ）、ペプスタチン（１μＭ）、ホスホルアミドン（１０μＭ）、ＡＥＢＳＦ（１ｍＭ）およびＥ‐６４（１０μＭ）のようなプロテアーゼインヒビターと共に１０ｍＭＮａＣｌのような低塩緩衝液中で一夜にわたるサポート培地のインキュベートにより溶出される。酵素調製物の純度増加は、公知方法により、例えば各連続精製工程後にタンパク質収量対酵素活性を調べることにより、精製操作の各工程でモニターすることができる。純度は電気泳動またはクロマトグラフィー技術により評価できる。十分な純度のＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドが得られると、それは標準方法により、例えばその酵素動態および基質特異性を調べることにより特徴付けられる。例えば、短鎖ペプチドを開裂しうる精製ＴＮＦα‐ｃｏｎの能力が調べられる。これらのペプチドは好ましくはＴＮＦα前駆体の開裂配列にまたがるが、例えばアミノ酸置換、欠失または誘導の存在により、または基質鎖長の違いにより修飾してもよい（下記セクション８参照）。ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質のアミノ酸配列は、ｃＤＮＡ配列から、または例えば自動アミノ酸シークエンサーでタンパク質の直接配列決定により求めることができる。ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの演鐸されたアミノ酸配列（配列番号２）は図１に示されている。ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質配列は親水性分析（Hopp and Woods,1981,Proc.N atl.Acad.Sci.USA,78:3824）により更に特徴付けられるが、これはＴＮＦα‐ ｃｏｎタンパク質の疎水性および親水性領域と、ひいてはこのような領域をコードする遺伝子配列の対応領域を同定するために用いることができる。二次構造分析（Chou and Fasman,1974,Biochem.,13:222）は、特異的な二次構造をとるＴＮＦα‐ｃｏｎの領域を同定するために行える。Ｘ線結晶法（Engstrom,1974,Biochem.Exp.Biol.11:7-13）、コンピューターモデリング（Fl etterick and Zoller（eds）1986：Current Communications in MolecularBiolo gy,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）のような生物物理学的方法が、ＴＮＦα‐ｃｏｎとその基質との相互作用部位を地図にして研究するために用いられる。これらの部位が同定されたら、本発明は、望ましい生物学的成果に応じて、この相互作用を促進または阻害するための手段を用意できる。上記に基づき、相互作用の部位について物理的情報があれば、ＴＮＦα‐ｃｏｎ活性を調節する化合物は推理的ドラッグデザインの分野で知られる標準方法により作られる。加えて、解糖側鎖の酵素切断、レクチン結合およびＮＭＲ構造分析を含めた当業界で知られる方法によれば、発現された酵素対天然酵素のグリコシル化パターンの分析を行える。本発明には、ＴＮＦα前駆体と相互作用するＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチド上の特異的部位を同定するための、他の方法もある。例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発は、ＴＮＦα‐ｃｏｎとＴＮＦα前駆体との相互作用を破壊、阻害または変化させ、ひいてはＴＮＦα‐ｃｏｎアンタゴニストのような変種を作製するために用いられる。本発明の態様において、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード領域における一連の欠失変異体は、ＴＮＦα前駆体または合成基質と結合して、それをタンパク質分解で開裂させるための、最少アミノ酸配列要件を決めるために、構築および分析される。ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列の欠失変異体は、限定されないが、ヌクレアーゼおよび／または制限酵素、部位特異的変異誘発技術などの使用を含めた、当業界で知られる方法を用いて構築される。変異されたポリペプチドは、例えばゲルロ過アッセイにより、ＴＮＦα前駆体または合成基質と結合しうるそれらの能力についてアッセイされる。加えて、ＴＮＦα‐ｃｏｎと関連した誘導体、アナログおよびペプチドは化学的に合成できる（Merrifield,1985,Science,232:341-347）。例えば、望ましい生物活性を示すＴＮＦα‐ｃｏｎの部分に相当するペプチドは、ペプチドシンセサイザーを用いて得られる。５．５．ＴＮＦα‐ｃｏｎの誘導体、アナログおよびペプチドＴＮＦα‐ｃｏｎと関連した誘導体、アナログおよびペプチドの作製および使用も本発明の範囲内に属し、例えばイムノアッセイ、免疫、治療などに用いられる。望ましいＴＮＦα‐ｃｏｎ生物活性を保留、阻害または調節するこのような分子は、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビターとして、または更に一般的にはこのような活性のモジュレーターとして用いることができる。“アゴニスト ”、“アンタゴニスト”、“インヒビター”および“モジュレーター”という用語は機能的な意味で用いられ、特定の作用様式を有する化合物に本発明を限定するわけではない。ＴＮＦα‐ｃｏｎと関連した誘導体、アナログおよびペプチドは、限定されないが、基質結合および／または開裂の検出を含めた上記のような操作によるか、または１回以上のin vitroＴＮＦαバイオアッセイの使用により、望ましい生物活性について試験することができる。本発明の誘導体、アナログおよびペプチドは、当業界に知られた様々な方法により作製することができる。それらを作製する操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで、または双方で行える。遺伝子レベルでは、例えば、クローン化ＴＮＦ α‐ｃｏｎＤＮＡ配列が当業界で知られる様々な戦略によりin vitroで修飾される。Maniatis et al.,1989，前掲；Ausubel et al.,1989,前掲;Sambrook et a l.,1989，前掲参照。このような修飾には、エンドヌクレアーゼ切断、あるいは翻訳、開始および／または終止配列を作製または破壊するか、またはコード領域で変化をもたらす変異、あるいはそれらの組合せがあるが、それらに限定されない。限定されないが、in vitro部位特異的変異誘発を含めた、当業界で知られる変異誘発のための技術が用いられる（例えば、Hutchinson et al.,1978,J.Biol. Chem.253:6551参照）。遺伝子レベルで変化の結果として、発現されたポリペプチドはアミノ酸の欠失、付加または置換を含んでいるが、これは生物活性変異体を作製するように配列内にサイレント変化を起こしていても、またはそうでなくてもよい。ＴＮＦα‐ｃｏｎＤＮＡ配列の操作はタンパク質レベルで行ってもよい。様々な化学的修飾が、限定されないが：例えばカルバザート（carbazate）または三次中心を作るような、対応Ｄ‐アミノ酸、アミノ酸アナログまたはアミノ酸擬似物によるＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドの１以上のＬ‐アミノ酸の置換；例えば臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下の代謝合成などによる特異的化学修飾を含めた、公知技術により行われる。ＴＮＦα‐ｃｏｎのペプチドの例には、例えば、可溶性分泌型の酵素を作製するような、天然タンパク質に通常存在する貫膜ドメインの除去により作製されるか、または酵素の触媒ドメインのみを含んだ、ＴＮＦα‐ｃｏｎの切欠体がある。もう１つの例は、推定システインスイッチを除去することで、コンバーターゼ活性を活性化および／または向上させた、５’切欠体である。ＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチド、ペプチドまたはそのアナログは、限定されないが、特にアセチル基、グリコシル基、脂質およびリン酸を含めた他の化学基のタンパク質への接合により誘導される。このような接合は、ＴＮＦα‐ｃｏｎアミノ酸側鎖および／またはそのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で共有結合によりことが好ましい。水溶性ポリマー、特にポリエチレングリコールガ、ＴＮＦα拮抗作用のような望ましい生物活性を少くとも一部で留めながら、追加の望ましい性質を呈するように、ＴＮＦα‐ｃｏｎに接合される。これら追加の望ましい性質には、例えば、水溶液中の溶解性増加、貯蔵中の安定性増加、免疫原性の減少、タンパク質分解に対する耐性増加、およびin vivo半減期の増加がある。本発明のペプチドとの併用に適した水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（上記ホモポリマーおよびコポリマーは、非置換であるか、またはアルキル基により一端で置換されている）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテルおよびα，β‐ ポリ〔（２‐ヒドロキシエチル）‐ＤＬ‐アスパルトアミド〕がある。ポリエチレングリコールが特に好ましい。タンパク質の水溶性ポリマー複合体を作る方法は、特に米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，６０９，５４６号、米国特許第４，２６１，９７３号、米国特許第４，０５５，６３５号、米国特許第３，９６０，８３０号、米国特許第４，４１５，６６５号、米国特許第４，４１２,９８９号、米国特許第４，００２，５３１号、米国特許第４，４１４，１４７号、米国特許第３，７８８，９４８号、米国特許第４，７３２，８６３号、米国特許第４，７４５，１８０号、ＥＰ第１５２，８４７号、ＥＰ第９８，１１０号およびＪＰ第５，７９２，４３５号明細書に記載されている。このような誘導体、アナログおよびペプチドは、ＴＮＦα前駆体と結合する上で全鎖長野生型ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質と競合させ、こうしてＴＮＦα‐ ｃｏｎ活性を阻害するかまたはそれと拮抗するように働かせるために用いられる。これらのアンタゴニストによるＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質機能の阻害は、哺乳動物被治療体の血清または組織でＴＮＦαレベルを減少させて、敗血症性ショック、悪液質、あるいは高いかまたは異常なＴＮＦαレベルで特徴付けられる他の疾患もしくは症状を治療するために有用である。一方、成熟ＴＮＦαと結合しうるＴＮＦα‐ｃｏｎ誘導体、アナログおよびペプチドは、このような治療の必要な哺乳動物被治療体の血清または組織で過剰レベルのＴＮＦαを中和するために用いてもよい。５．６．ＴＮＦα‐ｃｏｎインヒビターのスクリーニング組換え発現されたＴＮＦα‐ｃｏｎは、ＴＮＦα‐ｃｏｎの１以上の生物活性を阻害するかまたは調節することにより、ＴＮＦαレベルを減少または調節する分子についてスクリーニングするために用いられる。このような分子には、（１）ＴＮＦα前駆体または合成基質と結合する、（２）ＴＮＦα前駆体を成熟ＴＮＦαに変換する、または（３）合成基質を開裂するＴＮＦα‐ｃｏｎの能力を阻害または調節する、小さな有機または無機化合物、抗体、ペプチドまたは他の分子がある。特に興味あるのはヒドロキサム酸関連化合物であり、そのうちいくつかはＴＮＦα‐ｃｏｎ活性を阻害することが示された。Mohler et al.,1994，前掲；Gearing et al.,1994,前掲；McGeehan et al.,1994，前掲；およびＷＯ９５／０６０３１参照。調節化合物の合成化合物、天然産物および他の可能な供給源は、いくつかの手法でスクリーニングできる。例えば、ＴＮＦα‐ｃｏｎの活性を阻害する試験分子の能力は、結合に対する効果を検出するゲルロ過アッセイ、または前駆体ペプチドの開裂に対する効果を検出するアッセイのような標準生化学方法を用いて、あるいはＴＮＦαの存在を検出するin vitroアッセイを用いて測定される。ＴＮＦα‐ｃｏｎと結合しうる化合物が単離および同定される１つの非制限的方法では、（ａ）ＴＮＦα‐ｃｏｎまたはその一部を固相マトリックスに接合させ、（ｂ）化合物をその接合させた酵素と結合させるために十分な間隔および条件下で、試験化合物を含んだ物質とＴＮＦα‐ｃｏｎ‐固相マトリックス複合体を接触させ、（ｃ）固相マトリックスから未結合物質を洗い落とし、（ｄ）接合されたＴＮＦα‐ｃｏｎと結合した化合物の存在を検出し、（ｅ）固定された酵素から結合化合物を溶出させ、および（ｆ）化合物を集めることで単離する。一方、化合物は最初に固定された酵素から溶出させて、その後検出および特徴付けしてもよい。単離されると、化合物はＴＮＦα‐ｃｏｎの１以上の生物活性を阻害または調節しうるその能力について試験することができる。アミノ酸のすべての可能な組合せからなるランダムペプチドライブラリーが、ＴＮＦα‐ｃｏｎと結合しうるペプチドを同定するために用いられてもよい。ＴＮＦα‐ｃｏｎと結合しうるペプチドの同定は、このようなペプチドライブラリーを組換えＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質でスクリーニングすることにより行ってもよい。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎのいかなる結合ドメインも別々に発現させて、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために用いてよい。ＴＮＦα‐ｃｏｎと相互作用して複合体を形成するペプチドを同定および単離する１つの非制限的方法では、このような複合体の同定を容易にするために、検出可能な標識をＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質に付ける。そのため、ＴＮＦα‐ ｃｏｎはアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、あるいは特にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）またはローダミンのような蛍光標識に接合される。ＴＮＦα‐ ｃｏｎへの検出可能な標識の接合は、当業界でルーチンな技術を用いて行える。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎ発現ベクターは、前記されたＦＬＡＧ^TMエピトープのような、市販抗体が存在するエピトープを含んだＴＮＦα‐ｃｏｎ融合タンパク質を発現するように工学処理してもよい。エピトープ特異的抗体は、例えば酵素、蛍光色素または着色もしくは磁気ビーズで標識することを含めて、当業界で周知の方法を用いて標識しても、あるいはエピトープ特異的抗体は標識された二次抗体を用いて検出してもよい。ＴＮＦα‐ｃｏｎと相互作用して複合体を形成するペプチドをコードするＤＮＡ配列は、細菌または真核細胞での過剰発現に適した発現ベクター中にクローニングされる。そのペプチドは公知方法により細胞抽出物から精製される。一方、そのペプチドは固相技術により合成して、樹脂から開裂させ、ＨＰＬＣにより精製してもよい。単離されたら、ペプチドはＴＮＦα‐ｃｏｎの生物活性を阻害または調節しうるその能力について試験することができる。５．７．抗ＴＮＦα‐ｃｏｎ抗体作製ＴＮＦα‐ｃｏｎと結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製も、本発明の範囲内に属する。ＴＮＦα‐ｃｏｎに対する抗体は、例えば、天然または組換えＴＮＦα‐ｃｏｎを精製するか、あるいは例えば組織セクション、細胞または組織抽出物、培地、または酵素調製物中におけるＴＮＦα‐ｃｏｎの存在を検出するか、あるいは治療でＴＮＦα‐ｃｏｎ活性を中和するために、アフィニティー試薬として有用である。全体ＴＮＦα‐ｃｏｎポリペプチドまたはそのサブ配列は、抗体が作られる免疫原として用いてもよい。例えば、酵素の触媒ドメインが単離されて、抗体が作られる免疫原として用いられる。抗体の作製には、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた様々な宿主動物がＴＮＦα‐ｃｏｎまたはその一部の注入で免疫される。免疫は公知方法に従い行われる。特に、フロイント（完全および不完全）、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および可能性として有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvus を含めた様々なアジュバントが、宿主種に応じて、免疫応答を増加させるために用いられる。ＴＮＦα‐ｃｏｎに対するモノクローナル抗体は、培養で連続的継代細胞系により抗体分子を産生させる技術を用いて作製される。これらには、Kohler and M ilstein（Nature,1975,256:495-497）に初めて記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al.,1983,Immunology Today,4:72;C ote et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-2030）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）があるが、それらに限定されない。加えて、適切な生物学的構造または活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、例えば適切な抗原特異性のマウス抗体分子からのような遺伝子をスプライスすることによる、 “キメラ抗体”の作製のために開発された技術も使用できる（Morrison et al., 1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855;Neuberger et al.,1984,Nature,31 2:604-608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452-454）。一方、一本鎖抗体の作製について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、ＴＮＦα‐ ｃｏｎ特異的一本鎖抗体を作製するために適用できる。ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質に対する特異的結合部位を含んだ抗体断片は、公知技術により作製される。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン切断により得られるＦ（ａｂ’）₂、およびＦ（ａｂ’）₂断片のジスルフィド架橋を還元することで得られるＦａｂ断片があるが、それらに限定されない。一方、ＴＮＦα‐ｃｏｎタンパク質に対して望ましい特異性を有するＦａｂ断片の迅速な同定を行えるＦａｂ発現ライブラリーも構築してよい（Huse et al.,1989, Science,246:1275-1281）。モノクローナル抗体、抗体断片などの作製技術は当業界で周知であって、更に Harlow and Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratoryにも記載されており、これは引用することにより本明細書の開示の一部とされる。５．８．アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム本発明の範囲内には、ＴＮＦα‐ｃｏｎｍＲＮＡと結合する、それを分解するおよび／またはその翻訳を阻害するように機能する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチド配列、ホスホロチオエートおよびリボザイムもある。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと結合して、タンパク質翻訳を妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。例えば、ＴＮＦα‐ ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列（図１）のユニーク領域と相補的な少くとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば慣用的なホスホジエステル技術により合成できる。リボザイムはＲＮＡの特異的開裂を触媒しうる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド形成と、その後エンドヌクレオチド開裂からなる。ＴＮＦα‐ ｃｏｎＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド開裂を特異的および効率的に触媒する工学処理ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子も、本発明の範囲内にある。どんな存在しうるＲＮＡ標的内にある特異的リボザイム開裂部位も、下記配列ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含めたリボザイム開裂部位について標的分子をスキャンすることにより、最初に特定される。特定されたら、開裂部位を含んだ標的遺伝子の領域に相当する約１５〜２０リボヌクレオチドの短鎖ＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチド配列を不適合にさせる二次構造のような予想される構造的特徴について評価される。候補標的の適合性は、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成へのそれらのアクセス性を試験することにより評価してもよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは双方とも、公知方法により作製される。これらには、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成によるような、化学合成の技術がある。一方、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivo転写により作製してもよい。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組込んだ、様々なベクター中に組み込まれる。本発明のオリゴヌクレオチドへの様々な修飾が、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入される。可能な修飾には、分子の５’および／または３’末端へのリボ‐またはデオキシリボ‐ヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド主鎖内でホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエートまたは２’‐Ｏ‐メチルの使用があるが、それらに限定されない。５．９．治療使用の方法哺乳動物被治療体の血清または組織でＴＮＦα前駆体から成熟ＴＮＦαへの変換を阻害するか、またはＴＮＦαの有効レベルを調節する化合物が、被治療体でＴＮＦαの高いまたは異常なレベルに関連した疾患または症状を治療するために用いられる。疾患または症状に関連してここで用いられる“治療”という用語は広く用いられ、その疾患または症状の治癒方法に限定されない。“治療”という用語には、疾患または症状の１以上の病理作用または徴候を減少させ、あるいは１以上のこのような病理作用または徴候の進行速度を遅らせるように働くあらゆる方法を含む。本発明の方法により治療される疾患または症状は、１以上の下記基準：哺乳動物被治療体の血清または組織でＴＮＦαの高いまたは異常なレベル、敗血症性ショックの発生または悪液質の発生により特徴付けられる疾患である。ここで用いられる“高い”および“異常”という用語は関連した用語であって、似た年齢、性別、体重などの正常体と比較して治療の必要な被治療体でＴＮＦαのレベルを表すために用いられる。本発明は、被治療体でＴＮＦαのレベルまたは生物活性を減少または調節する化合物の有効量を被治療体に投与することからなる、このような治療の必要な哺乳動物被治療体でこのような疾患または症状を治療するための方法を提供する。その化合物は、例えば、ＴＮＦα前駆体をＴＮＦαに変換するＴＮＦα‐ｃｏｎの能力を阻害するか、ＴＮＦαの細胞分泌を阻害するか、または被治療体の血清または組織で可溶性ＴＮＦαと結合してその有効濃度を減少させるなどのメカニズムにより、被治療体でＴＮＦαの絶対または有効量を変えることができる。本発明の方法に従い治療される疾患または症状には、特に全身性炎症応答症候群、再灌流損傷、心血管疾患、感染疾患、産科または婦人科障害、炎症疾患、自己免疫、アレルギーまたはアトピー疾患、悪性疾患、移植合併症がある。更に詳しくは、本発明の方法で治療される疾患または症状には、特に、敗血症性ショック、悪液質、エイズ、移植片対宿主疾患、大脳マラリア、クローン病、糖尿病、骨粗鬆症、再狭窄、乾癬、リウマチ様関節炎、黄斑変性、骨関節炎、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症があるが、それらに限定されない。本発明の方法は、例えば虚血現象に起因する梗塞を防止するかまたはその程度を減少させるために用いてもよい。本発明では、前記のようなＴＮＦα‐ｃｏｎの生物活性を阻害または調節する１種以上の化合物が、哺乳動物被治療体における疾患または症状の治療で１種以上の他の試薬と併用することができる、組合せ療法の使用についても更に考えている。このような他の試薬には、例えば、哺乳動物被治療体における疾患または症状の根源にあるＴＮＦα‐ｃｏｎまたは他の成分もしくは因子に対する小さな有機もしくは無機分子または抗体があり、その場合に組合せ療法はその疾患または症状の治療効力を増加または改善するように働く。例えば、１種以上のＴＮＦ α‐ｃｏｎインヒビターが、治療効力を高めるために、例えばリウマチ様関節炎のような自己免疫疾患に関与するような炎症応答の成分に対する抗体と併用されてもよい。例えば、１種以上のＴＮＦα‐ｃｏｎインヒビターが、自己免疫疾患を治療するために、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ２３抗体と併用される。ヒト化抗ＣＤ４抗体はＰＣＴＧＢ９１／０１５７８に開示されている。抗ＣＤ２３抗体はDougall et al.,1994,Tibtech,12:372-379に記載されている。一方、１種以上のＴＮＦα‐ｃｏｎインヒビターが、特にメトトレキセートまたはシクロスポリンＡのような１種以上の慣用的治療剤と併用されてもよい。本発明では、ＴＮＦαに関連した疾患または症状を治療する上で有用な、その酵素の活性を調節しうる治療剤とＴＮＦα‐ｃｏｎとを含んだ複合剤についても更に考えている。このような複合剤は酵素の基質を更に含んでいてもよい。本発明では、哺乳動物被治療体の血清または組織でＴＮＦαの有効レベルを減少または調節する１種以上の化合物と、薬学上許容されるキャリアとを含んでなる、治療方法に使用の医薬組成物または処方物を更に提供する。本発明には、ＴＮＦα‐ｃｏｎの生物活性を阻害する１種以上の化合物、治療される哺乳動物被治療体での疾患または症状に関与する他の成分を阻害する１種以上の化合物と、および薬学上許容されるキャリアとを含んでなる、組合せ療法用の処方物も更に包含している。水、緩衝化された水、０．４％塩水、０．３％グリシンなどのような様々な水性キャリアが、本発明の医薬処方物に用いられる。医薬処方物は、保存剤、タンパク質安定剤などを含めた、医薬処方物の貯蔵寿命を延ばすように働く追加成分も含んでいてよい。その処方物は好ましくは無菌であって、（注射可能な形のために）粒状物を含まない。これらの組成物は慣例的な周知の滅菌技術により滅菌される。組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような、近似的生理条件のために必要とされる、薬学上許容される補助物質を含有していてもよい。本発明の処方物は、経口、筋肉内、皮下、静脈内、眼内などを含めた様々な投与様式向けに適合化される。被治療体への投与に必要な非経口投与しうる組成物および調製物を製造する現実的な方法は、当業者に知られているかまたは明らかであり、例えばRemington's Pharmaceutical Science,17th Ed .,Mack Publishing Company,Easton Pa（1985）で更に詳細に記載されていて、これは引用することにより本明細書の開示の一部とされる。本発明は、ＴＮＦα‐ｃｏｎの生物活性を阻害または調節することにより、被治療体で全または有効ＴＮＦαレベルを減少または調節する、１種以上の化合物の徐放出のための処方物を更に提供する。このような徐放性処方物の例には、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸‐コグルコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどのような生物適合性ポリマーの複合物がある。ドラッグデリバリービヒクルにおける分解性ポリマーの構造、選択および使用は、A.Domb et al .,1992,Polymers for Advanced Teclmologies 3:279-292を含めたいくつかの文献でみられる。医薬処方物でポリマーを選択および使用する際の追加指針は、M. Chasin and R.Langer(eds.),1990,”Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems”,Drugs and the Parmaceutical Sciences,Vol.45,M.Dekker,New York のテキストでみられる。リポソームも、ＴＮＦα‐ｃｏｎアンタゴニストまたは他の調節化合物を徐放出させるために用いてよい。興味ある薬物のリポソーム処方物の使用および製造方法に関する詳細は、特に米国特許第４，９４４，９４８号、米国特許第５，００８，０５０号、米国特許第４，９２１，７０６号、米国特許第４，９２７，６３７号、米国特許第４，４５２，７４７号、米国特許第４，０１６，１００号、米国特許第４，３１１，７１２号、米国特許第４，３７０，３４９号、米国特許第４，３７２，９４９号、米国特許第４，５２９，５６１号、米国特許第５，００９，９５６号、米国特許第４，７２５，４４２号、米国特許第４，７３７，３２３号、米国特許第４，９２０，０１６号明細書でみられる。徐放性処方物は、例えば感染部位などで、高局所濃度のＴＮＦα‐ｃｏｎアンタゴニストを供することが望まれるときに、特に興味ある。精製されたＴＮＦα‐ｃｏｎインヒビターまたは他の調節化合物は、適合した無毒性の医薬賦形剤と組み合わせて、例えば、被治療体の血清または組織でＴＮＦαの高いまたは異常なレベルにより特徴付けられる疾患または症状を治療するために、哺乳動物被治療体に投与される。“哺乳動物被治療体”という用語は、ヒトと動物を含めた意味である。動物への投与の場合には、可能であれば農家ですぐ使用できる薬物および栄養物質の組合せ調製物として、動物の飼料中に薬物を配合することが好ましい。その化合物は、いずれか適切な薬学的投薬形で、ヒトに経口、直腸、経皮、肺浸潤、吸入または非経口（静脈内、皮下および筋肉内を含む）で投与される。有効な投薬量および治療プロトコールは、実験動物で低用量から始め、投薬量を増加させていきながら、効果をモニターして、投薬法を計画的に変えていくという、慣例的な手段により決められる。多くのファクターが、所定の被治療体で最適の投薬量を決めるとき、臨床医により考慮される。これらのうちで、第一は被治療体の血清または組織中におけるＴＮＦαのレベルである。追加ファクターには、被治療体の大きさ、被治療体の年齢、被治療体の一般的状態、治療される具体的な疾患または症状、疾患の重篤度、被治療体における他の薬剤の存在、アンタゴニストまたは調節化合物のin vivo活性などがある。試験投薬量は、ＴＮＦαまたはＴＮＦα‐ｃｏｎのモジュレーターの投与に関する動物研究の結果と臨床文献の考慮後に選択されることが好ましい。in vitroＴＮＦα‐ｃｏｎ結合競合アッセイから導かれる結合定数およびＫｉのような情報も投薬量を計算するために用いてよいことは、当業者にとり明らかであろう。ＴＮＦα‐ｃｏｎアンタゴニストまたは他の調節化合物の典型的な１日ヒト用量は、例えば、約０．１〜約２００mg/kg体重、更に好ましくは約１〜約１００m g/kg体重、最も好ましくは約５〜約５０mg/kg体重の量である。５．１０．遺伝子療法本発明の範囲内には、変異ＴＮＦα‐ｃｏｎをその遺伝子の野生型補体に代えるか、またはＴＮＦα‐ｃｏｎの一部にアンチセンスなヌクレオチド配列を被治療体に移すという、遺伝子療法の用途もある。このような例の遺伝子療法は、被治療体でＴＮＦαまたはＴＮＦα‐ｃｏｎの高いまたは異常なレベルに起因する疾患または症状を治療するために有用である。野生型ＴＮＦα‐ｃｏｎ遺伝子を標的組織中に移す方法には、標的細胞中へのデリバリーのための、リポソーム中への組換えＴＮＦα‐ｃｏｎ分子の再調製がある。一方、組換えウイルスベクターは野生型ＴＮＦα‐ｃｏｎを発現するように工学処理してもよい。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターは、標的細胞集団中に野生型ＴＮＦα‐ｃｏｎをデリバリーするために用いられる。当業者に周知の方法が、ＴＮＦα‐ｃｏｎコード配列を含む組換えウイルスベクターを構築するために使用できる。例えば、Maniatis et al.,1989，前掲；Ausubel et al.,1989,前掲；Sambrook et al.,1989，前掲に記載された技術参照。６．例：ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡの単離６．１．ブタＴＮＦα‐ｃｏｎの精製６．１．１．物質および方法膜調製ブタＴＮＦα‐ｃｏｎをブタ脾臓から単離した。すべての工程は４℃で行った。全部で３〜６ｋｇの約１０〜２０個の新鮮ブタ脾臓を小片に切り、冷粉砕用緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、０．２５Ｍスクロース、２ｍＭＭｇＣｌ₂）をプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドンおよび５０μＭＤＣＩ）と共に含有したビーカーに入れた。脾臓組織の容量に対して、３倍容量の粉砕用緩衝液を用いた。各片を低速、中速、その後高速で１０秒バーストを用いて４ｌブレンダー中でホモゲナイズした。粉砕された組織をファイバーガラススクリーンに通して、懸濁物をロ過した。フィルターを通過した物質を２０００×ｇで１０分間にわたりＧＳ‐３ローターで遠心した。上澄を除去し、ＣａＣｌ₂を８ｍＭの最終濃度で撹拌しながら加えた。ＣａＣｌ₂が溶解してから１０分後に、溶液を１０，０００×ｇで２０分間にわたりＧＳ‐３ローターで遠心した。ペレットをプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ）１ μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドンおよび５０μＭＤＣＩ）と共に緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、０．２５Ｍスクロース）中に上澄の１／６容量で再懸濁させ、膜懸濁物であるこの調製物を速やかに凍結して、将来の使用のために−７０℃で貯蔵した。緩衝液Ｂ（０．０５％ＮＰ‐４０、１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、２００ｍＭＮａＣｌ）を、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μ Ｍペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン）と共に、緩衝液：膜容量比が３：１となるように、解凍された膜懸濁物に加えた。ブタ脾臓３ｋｇは膜懸濁物約１ｌを生じた。緩衝液および膜懸濁物を一緒に混合した後、膜をＴＦＡ２０．２５０ローターで１時間にわたり２０，０００ｒｐｍで遠心によりペレット化した。ペレットを、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン）と共に、最初の膜懸濁物１ｌにつき６ｌの緩衝液Ｃ（１％ＮＰ‐４０含有の緩衝液B）と混合した。溶液を４℃で３０分間にわたり撹拌し、その後２０，０００ｒｐｍで１時間にわたりＴＦＡ２０．２５０ローターで遠心した。クロマトグラフィー上澄を、２０ml/minの流速で上澄と同一の緩衝液で平衡化された１ｌｃｏｎＡカラム（Pharmacia）上に担持させた。カラムをプロテアーゼインヒビターなしに５倍容量の緩衝液Ｃ、その後５倍容量の緩衝液Ｄ（緩衝液Ｃ（プロテアーゼインヒビターなし）と同様だが、ＮａＣｌ濃度は１０ｍＭである）で洗浄した。コンバーターゼ活性体は、合成ＤＮＰ基質の開裂のＨＰＬＣモニターにより調べながら、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ）１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン）を含有した１０倍カラム容量の緩衝液Ｅ（２５０ｍＭメチルマンノピラノシドを含有した緩衝液Ｄ）で溶出させた。溶離物は５００ｍｌＱ fast flowカラム（Pharmacia）上に直接担持させた。カラムを緩衝液Ｆ（０．５％ＮＰ‐４０および１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）で洗浄した。コンバーターゼ活性体を、２００ｍＭまたは５００ｍＭＮａＣｌとプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン）を含有した緩衝液Ｆで溶出させた。溶出したタンパク質を、ＮａＣｌなしに、但しプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μ ＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン）を含有した緩衝液Ｆに対して４℃で一夜透析した。次いでその物質を２ｍｌ POROS^TMＨＱカラム（Perseptive Biosystems）上に担持させた。溶出は５００ｍＭＮａＣｌとプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン）を含有した緩衝液Ｆで行った。コンバーターゼ活性体を含有したフラクションは、アフィニティークロマトグラフィーにより更に精製した。場合により、上記透析工程前に、Ｑ fast flowカラムからの物質をCibacron Blue 3000（Sigma）で更に精製した。簡単に言えば、溶離物を１０ml/minの流速で３００ｍｌカラム上に担持させた。カラムを、プロテアーゼインヒビターなしに２００ｍＭＮａＣｌを含有した３倍カラム容量の緩衝液Ｆで洗浄した。次いで、活性体を、１．５ＭＮａＣｌとプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン）を含有した緩衝液Ｆで、カラムから溶出させた。次いで溶出したタンパク質を上記のように透析した。アフィニティー精製アフィニティー精製のため、下記（セクション７）のように製造されたビオチニル化ヒドロキサム酸インヒビターを透析されたタンパク質に１μＭの最終濃度まで加えた。４℃で１０〜３０分間のインキュベート後、アフィニティービーズ（3M EMPHAZE^TK Biosupport Medium ABI（Pierce）のULTRALINK^TK固定 Neutravidin Plus）を加えた（酵素溶液１ｍｌ当たりスラリー０．４ｍｌ）。穏やかに揺動させながら１０分間のインキュベート後、スラリーを微小遠心管で遠心によりペレット化させた。ビーズを０．５ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ｆ１．５ｍｌで３回洗浄した。酵素は、ＮａＣｌなしにプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン）を含有した緩衝液Ｆ中４℃で一夜穏やかに揺動することにより、ビーズから溶出させた。グリセロール勾配８５ｋＤａバンドがコンバーターゼ活性体と共移動することを証明するために、ＴＮＦα‐ｃｏｎを下記のような遠心力下でのグリセロール勾配による沈降からなる最終分離工程に付した。アフィニティー樹脂から溶出された物質を、下記のように作られた８〜２７．８％グリセロール勾配の上にのせた。１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５５＋０．０５％ＮＰ‐４０中の下記グリセロール希釈液を１２ｍｌポリカーボネート超遠心管（Sorvall,ｃａｔ．Ｎｏ．０３６９９）に慎重に入れた：２７．８％（１．１ｍｌ）、２５．6％（１．１ｍｌ）、２３．４％（１ｍｌ）、２１．２％（１ｍｌ）、１９％（１ｍｌ）、１６．８％（１ｍｌ）、１４．６％（１ｍｌ）、１２．４％（１ｍｌ）、１０．２％（１ｍｌ）、８％（０．８ｍｌ）。管を４℃で１７時間貯蔵して連続勾配を形成させ、その後溶出した物質０．２ｍｌを各勾配の上にのせた。勾配をSorvall超遠心管（モデルＲＣ７０）において４０，０００ｒｐｍで４８時間にわたり４℃で遠心した。遠心後、勾配を上から底まで０．３５ｍｌずつ取出すことにより分別した。各フラクションの一部（２０μｌ）を、上記のようにＨＰＬＣにより合成基質の開裂を検出することにより、酵素活性についてアッセイした。加えて、各フラクションの活性をゲルに存在するタンパク質バンドと相関させるために、各フラクションの一部（３０μｌ）をLaemmli担持緩衝液（４×ストック）１０μｌと混合し、変性条件下で１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ（Laemmli,19 70,Nature,227:680-685）、その後銀染色（Daichi銀染色キット）した。脱グリコシル化脱グリコシル化用の試薬をNew England Biolabs（Beverly,Mass.）からキットとして得た。グリセロール勾配工程のプールされたフラクション１６〜２０から得られたＴＮＦα‐ｃｏｎ調製物の一部（２５μｌ）を、１０×変性用緩衝液２．５μｌの存在下１００℃で１０分間インキュベートした。次いで以下を加えた：ＮＰ‐４０（３．５μｌ）、１０×Ｇ７緩衝液（３．５μｌ）および純粋ＰＮＧアーゼＦ（０．５μｌ、１０単位）。反応を３７℃で１時間ランさせ、その後４×Laemmli担持溶液１２μｌの添加により停止させ、次いで１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させてから、上記のように銀染色した。ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの精製ヒトＴＮＦα ‐ｃｏｎの分子質量を上記のように単離されたそのブタ対応物と比較する手段として、ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの精製スキームを上記操作に基づき開発した。すべての工程は４℃で行った。そのため、８．２×１０¹⁰MonoMac6 細胞を含有したペレットを粉砕用緩衝液で６００ｍｌの最終容量まで再懸濁した。細胞は、それらを１０００ｐｓｉの窒素ガスに３０分間曝してから急速に圧力放出させるキャビテーションにより破壊させた。溶解物をＧＳ３ローター(Sorva ll)で１０分間にわたり３５００ｒｐｍで遠心した。次いで上澄をＴＦＡ２０．２５０ローター(Sorvall)で４５分間にわたり２０，０００ｒｐｍで遠心した。ペレットを、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン）と共に１．２％ＮＰ‐４０を含有した緩衝液Ｃで７５０ｍｌまで再懸濁し、３０分間ゆっくり撹拌させて抽出して、その後同ローターで４５分間にわたり２０，０００ｒｐｍで遠心して、不溶性物質を除去した。次いで上澄を１００ｍｌｃｏｎＡ‐セファロースカラムに１０ml/minで担持させた。カラムをプロテアーゼインヒビターなしの緩衝液Ｃ２００ｍｌ、その後上記のようなプロテアーゼインヒビター含有緩衝液Ｄ８００ｍｌ、で洗浄した。次いで活性体を上記のようなプロテアーゼインヒビター含有緩衝液Ｅ８５０ｍｌで溶出させた。この溶離物を緩衝液Ｅ１０ｍｌで洗浄された２ｍｌ POROS^TMＨＱカラムに適用し、０．５ＭＮａＣｌを含有した上記のようなプロテアーゼインヒビターで溶出させ、１ｍｌフラクションを集めた。９０％を超えるＴＮＦα‐ｃｏｎ活性体を含有したフラクション２および３をプールした。このプールの一部（０．５ｍｌ）を上記のような１nmolビオチニル化インヒビターで１５分間インキュベートし、その後アフィニティービーズ（3M EMPHAZE^TK Biosupport Medium ABI（Pierce）の ULTRALINK^TK固定Neutravidin Plus）のスラリー０．１ｍｌを加え、１時間インキュベートしてから、ビーズを０．５ＭＮａＣｌを含有した緩衝液Ｆで３回洗浄した。活性体を、ＮａＣｌなしに０．１％ＮＰ‐４０およびプロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１μＭペプスタチン、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭホスホルアミドン）を含有した緩衝液Ｆと共に４ ℃で一夜のインキュベートによりビーズから溶出させた。溶出した物質を前記のようなグリセロール勾配で更に精製した。ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの酵素活性およびＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、ブタＴＮＦα‐ｃｏｎについて前記されたように行った。ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの脱グリコシル化分析は、精製酵素の量が限られていたため、行わなかった。６．１．２．結果上記のように作製されたブタＴＮＦα‐ｃｏｎの純度を、還元条件下でＳＤＳ ‐ＰＡＧＥにより評価した（図２Ｂ）。上記のように作製して単離されたブタＴＮＦα‐ｃｏｎは、グリセロール勾配フラクション全体にわたる酵素活性と８５ｋＤａバンドとの相関により示されるように、約８５ｋＤａの見掛け分子量を有している（図２Ａ）。脱グリコシル化後、分子量は約６２ｋＤａに下がる（図３）。単離されたヒトＴＮＦα‐ｃｏｎは、グリセロール勾配フラクション全体にわたる酵素活性と８６．５ｋＤａバンドとの相関により示されるように（図４Ａ）、約８６．５ｋＤａの非常に似た見掛け分子量を有している（図４Ｂ）。６．２．ブタＴＮＦα‐ｃｏｎをコードする部分ｃＤＮＡ配列の単離６．２．１．物質および方法Ｎ末端配列決定アフィニティー精製された物質は直接配列決定するか、またはトリス‐グリシン緩衝液中で２つの８〜１６％Novox（San Diego,ＣＡ）ミニゲル（１００×１００×１ｍｍ）を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分析した。電気泳動で分離されたタンパク質は製造業者の指示に従いＩＳＳ Pro-Green（Natick，ＭＡ）を用いて検出した。約８５ｋＤａの主要バンドを切出し、タンパク質をMoyer et al. ,1994,Crabb,J.(ed)Techniques in Protein chemistry,Vol.V,pp.195-204, Academic Press,San Diego,CAに記載されたように、Hewlett-Packard Ｃ１８配列決定カラム上に直接電気溶出させた。In situ還元、アルキル化およびＬｙｓ ‐ｃｏｎ（Wako）切断はBurkhart et al.,1993,Angeletti,R.(ed),Techniques i n Protein chemistry,Vol.IV,pp.399-406,Academic Press,San Diego,CAに従い行ったが、但し４０％アセトニトリルを切断用緩衝液に用いた。切断後、カラムをHypersil ＯＤＳ（０．８×３００ｍｍ，ＬＣ Packings）に接合された Hewlett-Packard G1007Aカラムアダプターを用いてＨＰＬＣとインラインで置いた。ペプチドは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中０〜８０％アセトニトリルの勾配で観察されなかった。その後、配列決定カラムをカラムアダプターから取外し、オンラインＰＴＨ分析のHewlett-Packard G1005Sタンパク質配列決定システムに入れた。下記のような単一配列を配列決定サポートに結合した物質から４２サイクル後に得た。ブタＴＮＦα‐ｃｏｎのクローニング縮重したおよび反対向きのオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを、上記で決定されたブタＴＮＦα‐ｃｏｎの部分アミノ酸配列、特にアミノ酸配列ＶａｌＧｌｎＡｓｐＶａｌＩｌｅＧｌｕ₆（配列番号１１）およびアミノ酸配列ＡｌａＡｓｐＡｓｎＩｌｅＶａｌＧｌｙ₃₀（配列番号１２）に基づきデザインした。２つのプライマーを各方向から合成して、配列縮重性を減少させた。こうして、プライマーｃｏｎｖ‐１は配列５’‐ＧＴＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＣＡ‐３’（配列番号３）を有し、プライマーｃｏｎｖ‐２は配列５’‐ＧＴＩＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＧＡ‐３’（配列番号４）を有し、プライマーｃｏｎｖ‐３は配列５’−ＣＣＩＡＣ（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＧＣ‐３' （配列番号５）を有し、プライマーｃｏｎｖ‐４は配列５’−ＣＣＩＡＣ（Ａ／Ｇ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＧＣ‐３’（配列番号６）を有している。プライマーｃｏｎｖ‐１（配列番号３）およびｃｏｎｖ‐２（配列番号４）は５’ヌクレオチド配列を表し、２つのプライマーは上記されたように１つの塩基位置だけで異なる。ｃｏｎｖ‐３（配列番号５）およびｃｏｎｖ‐ ４（配列番号６）は示されたように３’プライマーである。逆転写酵素ＰＣＲは、製造業者のプロトコール（Invitrogen ｃＤＮＡサイクルキット）に従い、ブタ脾臓ポリ（Ａ＋）ＲＮＡで行った。４回のＰＣＲの各々では、１対のプライマー、１つは５’プライマー、即ちｃｏｎｖ‐１（配列番号３）またはｃｏｎｖ‐２（配列番号４）、および１つは３’プライマー、即ちｃｏｎｖ‐３（配列番号５）またはｃｏｎｖ‐４（配列番号６）を、各々２ｍＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲ混合物を３５回にわたりサイクルさせ（１サイクル＝９４℃で４５秒間、５５℃で２分間および７２℃で３分間）、その後１．２％アガロースゲルで電気泳動に付した。予想された８９ｂｐＰＣＲ断片（配列番号８）は、プライマーｃｏｎｖ‐３（配列番号５）を反応でプライマーｃｏｎｖ‐ １（配列番号３）またはｃｏｎｖ‐２（配列番号４）と併用したときに得られた。しかしながら、プライマーｃｏｎｖ‐４（配列番号６）は、ｃｏｎｖ‐１（配列番号３）またはｃｏｎｖ‐２（配列番号４）と一緒にすると、約３００ｂｐの断片を生じた。こうして得られた２つのＰＣＲ断片をブラント末端化し、ＳｍａＩ部位でBluescript II ＳＫ中にサブクローニングして、Ｔａｑジデオキシターミネーター法を用いるＤＮＡ配列決定に付した。ＤＮＡ配列分析では、８９ｂｐ断片（配列番号８）が、下記のように、プライマーがベースとしたブタＴＮＦα‐ｃｏｎの公知部分ペプチド配列と同一のアミノ酸配列（配列番号１５）をコードしていることを示した。しかしながら、３００ｂｐ断片はGenBankデータベースとの配列比較によるとヒトアクチン結合タンパク質（フィラミン）と高度に相同的であり、非特異的ＰＣＲ断片がプライマーｃｏｎｖ‐４（配列番号６）を用いて増幅されることを示した。８９ｂｐ断片（配列番号８）をプローブとして用いて、λｇｔ１０で構築されたブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。プローブは³²ｐ‐ｄｃＴＰの存在下でランダムプライミング（ＢＲＬキット）により標識した。５５ｂｐの一本鎖オリゴヌクレオチドも、８９ｂｐ断片の配列に従いプローブとして合成した。５５ｂｐオリゴマーは下記のように５’および３’ＰＣＲプライマー間に位置していた：５５ｂｐオリゴマーはγ³²Ｐ‐ＡＴＰを用いてキナーゼ末端ラベリングにより標識した。スクリーニングフィルターのハイブリッド形成は３９℃で４０％ホルムアミド緩衝液中で行い、最終洗浄は４６℃で１×ＳＳＣ（５５ｂｐオリゴマープローブ）または０．２×ＳＳＣ（８９ｂｐプローブ）であった。６．２．２．結果初回スクリーニングでは、２．５×１０⁵組換え体から４つの陽性クローンを単離した。これら４つのクローン（ｐｓＣ‐１、ｐｓＣ‐２、ｐｓＣ‐３およびｐｓＣ‐５）はサイズが１．１〜２．３ｋｂであり、Bluescript II ＳＫのＥｃｏＲＩ部位中へのサブクローニング後に配列決定した。クローンｐｓＣ‐３は、そのもっと小さな制限断片をBluescript II ＳＫ中にサブクローニングして、配列決定プライマーとしてフランキングＴ３およびＴ７配列を用いることにより、両方向で完全に配列決定した。配列比較では、４つのクローンが重複していることを示した。図５は４つのクローンによりカバーされる２４１４塩基の全鎖長の近接地図を示している。配列分析では、２４１４ｂｐドメインが精製ブタ脾臓ＴＮＦα‐ｃｏｎから得られる公知の４１アミノ酸ペプチド配列のコード配列を含んでいるが、ブタＴＮＦα‐ｃｏｎのＮ末端のコード領域を含まないことを証明した。メタロプロテイナーゼの保存Ｚｎ²⁺結合モチーフも欠いていた。ブタＴＮＦα‐ｃｏｎの５’ヌクレオチド配列を更に得るために、ｐｓＣ‐２クローンの５’１２０ｂｐＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ断片を単離し、プローブとして用いて、ブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした。３つの陽性クローンを得た。配列比較では、１つのクローンｐｓＣ‐８だけが伸長した５’ 配列を有することを示した。このクローンはｐｓＣ‐２クローンの５’側にある５０ｂｐコード配列を含んでいた。５０ｂｐ領域はＨＥＬＧＨモチーフをコードしている。全部で２４６４ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号９）および演繹アミノ酸配列（配列番号１０）は、ブタＴＮＦα‐ｃｏｎの部分配列を表していて、図６に示されている。６．３．ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列の単離６．３．１．物質および方法ヒト白血球ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（Clontech）またはヒト単球ポリ（Ａ＋）ＲＮＡから構築された２つのλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーを用いて、全鎖長ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎｃＤＮＡについてスクリーニングした。ブタｐｓＣ‐２クローンからの１２０ｂｐＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ断片およびそのフランキング３ ’６９０ｂｐＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をランダムプライミング（ＢＲＬキット）により標識し、双方のライブラリーをスクリーニングするために用いた。複製フィルターを５０％ホルムアミド中４２℃でハイブリッド形成させ、最終洗浄を５５℃で０．１％ＳＤＳ含有の０．２×ＳＳＣであった。各ライブラリーからの約２．５×１０⁵クローンの中で、１４の陽性クローンのうち図７に示されたような６つ（ｈｃ７、ｈｃ９、ｈｃ１１、３’＃１、３’＃４、３’＃５）をプラーク精製して、配列決定した。ｃＤＮＡの極５’末端を得るために、２つの異なる操作を行ったところ、等しい結果を生じた。第一操作では、ｈｃ１１の５’末端に相当する３３０ｂｐＥｃｏＲＩ‐ＥｃｏＲＶＤＮＡ断片（図７）をランダムヘキサマープライマー（Amersham）により標識し、ヒト単球ライブラリーをスクリーニングするために用いた。フィルターを５０％ホルムアミド中４２℃でハイブリッド形成させ、６５℃で０．２×ＳＳＣで洗浄した。７つの陽性クローンを約２．５×１０⁵クローンのスクリーニング後に単離した。図７に示されたような最長５’伸長部分を含んだ７クローンのうち２つ（５’＃４、５’＃７）を、更なる配列分析のためにプラーク精製した。第二操作では、５’ＲＡＣＥ操作を、下記のようにGibco/ＢＲＬのＲＡＣＥキットを用いて行った。引用することにより本明細書の開示の一部とされる、 Frohman et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8998-9002も参照。第一鎖ｃＤＮＡ合成第一鎖の合成は、ｂｐｎｏ．１６４‐１６６にＭｅｔ開始部位を有する配列で、ＴＮＦα‐ｃｏｎのｂｐｎｏ．５４１‐５２０（図１）と相補的な、下記配列５’‐ＣＣＴＡＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣ‐３’（配列番号３２）を有する、オリゴヌクレオチドプライマーＲＡＣＥ１（２２マー）を用いて行った。以下を混合した：ＲＡＣＥ１オリゴヌクレオチド（２．５ｐmol/μｌ）１μｌ；ＴＮＦαおよびジブチリルサイクリックＡＭＰ（０．８４μｇ）で３時間処理されたＴＨＰ１‐５Ａ細胞からのポリ（Ａ＋）ＲＮＡ１μｌ；およびＤＥＰＣ処理ｄＨ₂Ｏ９．５μｌ。混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、その後氷上で１分間冷却した。以下を上記混合物に加えた：１０×反応用緩衝液（２００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭＫＣｌ）２．５μｌ；２５ｍＭＭｇＣｌ₂３．０ μｌ；１０ｍＭｄＮＴＰｓ１．０μｌ；０．１ＭＤＴＴ２．５μｌ；およびＲＮＡｓｉｎ（２０Ｕ）０．５μｌ。溶液を混合し、４２℃で２分間インキュベートした。SUPERSCRIPT^TM逆転写酵素（１μｌ、２００Ｕ、Gibco/ＢＲＬ）を加え、混合物を４２℃で３０分間、その後７０℃で１５分間インキュベートした。ＲＮａｓｅＨ(１μｌ、２Ｕ）を加え、混合物を５５℃で１０分間インキュベートし、その後氷上で冷却した。ｃＤＮＡを製造業者のプロトコールに従いGLAS SMAX^TMＤＮＡ単離カートリッジ（Gibco/ＢＲＬ、カタログｎｏ．１８３７４‐０２５）を用いて精製した。サンプルを真空下で部分乾燥させて、容量を約３０μ ｌにした。ｃＤＮＡのＴｄＴテーリング以下を３つの別々な相当する反応液で混合した：ＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏ７．５ μｌ；１０×反応用緩衝液２．５μｌ；２５ｍＭＭｇＣｌ₂ １．５μｌ；２ｍＭＤＣＴＰ２．５μｌ；およびｃＤＮＡサンプル１０μｌ。混合物を９４ ℃で２分間インキュベートし、その後氷上で１分間冷却して、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（１０Ｕ／μｌ）１μｌを加えた。次いで混合物を３７℃で１０分間、７０℃で１０分間インキュベートし、その後氷上に保った。ｃＤＮＡのＰＣＲおよび回収１５の別々な相当する反応液５０μｌの各々において、以下を混合した：ｄＨ₂Ｏ３０μｌ；１０×反応用緩衝液４．０μｌ；２５ｍＭＭｇＣｌ₂ ３．０μｌ；１０ｍＭｄＮＴＰｓ１．０μｌ；ＲＡＣＥ２Ｂオリゴヌクレオチド（１０ｐmol/μｌ)１μｌ；およびAnchorオリゴヌクレオチド（１０ｐmol/μｌ）１μｌ。ＲＡＣＥ２Ｂオリゴヌクレオチド（４８マー）は下記配列（配列番号３３）を有している： MluI ｂｐｎｏ．１６４‐１６６にＭｅｔ開始部位を有する SalI 配列でｂｐｎｏ．４６７‐４３５と相補的 SpeI； Gibco/ＢＲＬのAnchorオリゴヌクレオチドは下記配列（配列番号３４）を有している：５’‐ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ‐３’ 反応混合物を８０℃で５分間インキュベートした。１×反応用緩衝液中HOTTUB^TM ポリメラーゼ（Amersham Inc．）（１Ｕ／５μｌ）５μｌを加え、混合物をPe rkin Elmer9600サーマルサイクラーで３４回（９４℃で１分間、５０℃で３０秒間、７２℃で２分間）；および１回（９４℃で１分間、５０℃で３０秒間、７２℃で１０分間）サイクルさせた。全部で１５の反応混合物を合わせ、ＤＮＡを−２０℃で２Ｍ酢酸アンモニウムおよび２倍容量の１００％ＥｔＯＨで沈降させた。ＤＮＡ沈降物を遠心により集め、冷７０％ＥｔＯＨですすぎ、真空下で乾燥させ、ｄＨ₂Ｏ２０μｌに再懸濁させた。ＤＮＡを０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１．５％アガロースゲルにより電気泳動させた。約３７５‐７００ｂｐからの染色スミアとして移動するＤＮＡを１００ｍＭ酢酸アンモニウム含有ウェル中への電気溶出により集めた。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で１回抽出し、−２０℃で２Ｍ酢酸アンモニウムおよび２倍容量の１００％ＥｔＯＨで沈降させた。ＤＮＡ沈降物を遠心により集め、冷７０％ＥｔＯＨですすぎ、真空下で乾燥させ、ｄＨ₂Ｏ２１．５μｌに再懸濁させた。制限とプラスミド中へのｃＤＮＡの結合１０×Ｈ緩衝液（２．５μｌ）(BoehringerMannheim)およびＳｐｅＩ（１μｌ、１０Ｕ／ｍｌ）をＤＮＡサンプルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＤＮＡを０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１．５％アガロースゲルにより電気泳動させた。約２００‐８００ｂｐからの染色スミアとして移動するＤＮＡをゲルから切出し、製造業者のプロトコールに従いSPINBIND^TMカートリッジ（ＦＭＣ Corp. ）を用いて回収し、カートリッジから溶出後にフェノール／クロロホルム（１：１）で更に抽出した。ＤＮＡを−２０℃で２Ｍ酢酸アンモニウムおよび２倍容量の１００％ＥｔＯＨで沈降させた。ＤＮＡ沈降物を遠心により集め、冷７０％ＥｔＯＨですすぎ、真空下で乾燥させ、ｄＨ₂Ｏ７．２５μｌに再懸濁させた。そのＤＮＡに、ＳｐｅＩで切断されて子牛腸ホスファターゼで脱リン酸化されたｐＢＳ‐ＳＫII＋プラスミド（Invitrogen）（１．０μｌ、約２５ｎｇ）を加えた。混合物を５５℃で２分間インキュベートした。次いで以下の１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液（１μｌ）(Boehringer Marmheim)、１０ｍＭＡＴＰ０．５μｌおよびＴ４リガーゼ(Boehringer Marmheim)（１Ｕ／μｌ）０．２５μｌを加え、結合混合物を１５℃で７．５分間インキュベートした。細菌形質転換およびクローン特徴付けＤＨ５α MAX EFFICIENCY^TM細胞（Gibco/ＢＲＬ）（１００μｌ）を製造業者のプロトコールに従い結合混合物１．５μｌで形質転換させた。細胞を５０μg/ mlアンピシリン含有の１００ｍｍＬＢプレートに入れ、Bluo-Gal ７５μｌおよび１００ｍＭＩＰＴＧ１０μｌを加え、３７℃で一夜インキュベートした。白色コロニーからのプラスミドＤＮＡを標準方法により単離し、ＳｐｅＩでの切断と、０．５×ＴＢＥ緩衝液中１．０％アガロースゲルでの電気泳動により、ｃＤＮＡインサートについて分析した。ｃＤＮＡインサートを含んだクローンを配列決定し、陽性クローンをＴＮＦｃクローンｈｃ１１の５’‐ヌクレオチド配列との比較により同定した。ＲＡＣＥ１４クローンのＤＮＡは配列（配列番号３９）は図１１に示されている。ＴＮＦコンバーターゼの全体オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｃＤＮＡの構築ＲＡＣＥ１４およびｈｃ‐１１のアセンブリーＲＡＣＥ１４ｃＤＮＡ（配列番号３９）（図１１）をBluescriptプラスミドｐＢＳ‐ＳＫII＋のＳｐｅＩ部位にクローニングして、そのｃＤＮＡの３’末端がベクター上でＴ７プロモーター部位に最も近くなるようにした。ＲＡＣＥ１４／ｐＢＳ‐ＳＫII（３４８５ｂｐ）をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで切断し、末端を脱リン酸化させた。ｈｃ‐１１ｃＤＮＡをBluescriptプラスミドｐＢＳ‐ ＳＫII＋のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、そのｃＤＮＡの３’末端がベクター上でＴ７プロモーター部位に最も近くなるようにした。ｈｃ‐１１／ｐＢＳ ‐ＳＫII（４３２３ｂｐ）をＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで切断して、ｈｃ‐１１ｃＤＮＡを切り出した。ＢｇｌII／ＨｉｎｄIII切断ｈｃ−１１ｃＤＮＡをＢｇｌII／ＨｉｎｄIII切断RＡＣＥ１４／ｐＢＳ‐ＳＫIIに結合させた。得られたプラスミド（４６７７ｂｐ）はＲＡＣＥ１４／ｈｃ１１‐ｐＢＳ‐ＳＫIIと命名した。ｈｃ‐７およびｈｃ‐９のＯＲＦとのＲＡＣＥ１４／ｈｃ１１のアセンブリーＲＡＣＥ１４／ｈｃ１１‐ｐＢＳ‐ＳＫIIをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断し、ｈｃ‐１１ｃＤＮＡの切出片から精製して、脱リン酸化させた。ｈｃ‐７ｃＤＮＡ（図７）をBluescriptプラスミドｐＢＳ‐ＳＫII＋のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、そのｃＤＮＡの３’末端がベクター上でT３プロモーター部位に最も近くなるようにした。ｈｃ‐７／ｐＢＳ‐ＳＫII（４８１３ｂｐ）をＥａｅＩおよびＮｏｔＩで切断した。ＤＮＡ断片を１％アガロース、０．５×ＴＢＥゲル上で分離し、ｈｃ‐７の７５０ｂｐＥａｅＩ／ＮｏｔＩ断片を上記のようにSPINBIND^TMカートリッジを用いて単離した。ｈｃ‐９ｃＤＮＡ（図７）をBluescriptプラスミドｐＢＳ‐ＳＫII＋のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、そのｃＤＮＡの３’末端がベクター上でＴ７プロモーター部位に最も近くなるようにした。ｈｃ‐９／ｐＢＳ‐ＳＫII（４８９５ｂｐ）をＥａｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ＤＮＡ断片を０．７％アガロース、０．５×ＴＢＥゲル上で分離し、ｈｃ‐９の１０９８ｂｐＥａｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片を上記のようにSP INBIND^TMカートリッジを用いて単離した。ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ切断ＲＡＣＥ１４／ｈｃ１１‐ｐＢＳ‐ＳＫIIをｈｃ‐７の７５０ｂｐＥａｅＩ／ＮｏｔＩ断片およびｈｃ‐９の１０９８ｂｐＥａｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片の双方と混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一緒に結合させた。ＴＮＦα‐ｃｏｎの全体ＯＲＦをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ作製ＲＡＣＥ１４／ｈｃ１１‐ｐＢＳ‐ＳＫII、ｈｃ−７の７５０ｂｐＥａｅＩ／ＮｏｔＩ断片およびｈｃ‐９の１０９８ｂｐＥａｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片の結合用混合物（１０μｌ）を、以下を混合することによりＰＣＲに付した：１０μ ｌ結合用混合物１μｌ、５’‐オリゴヌクレオチドプライマー‐ＴＮＦＣ‐４（ｂｐ１６４‐１９０）（配列番号３５）（１００ｐmol/ml）（下記参照）１μｌ、３’‐オリゴヌクレオチドプライマー‐ＴＮＦＣ‐４（ｂｐ２７５４‐２７１９）（配列番号３６）（１００ｐmol/ml）（下記参照）１μｌ、１０×HOT TUB^T ^M 緩衝液（低マグネシウム、Amersham）４．５μｌ、１０ｍＭｄＴＮＰｓ１μ ｌおよびdＨ₂Ｏ３６．５μｌＴＮＦＣ‐４オリゴヌクレオチド配列（配列番号３５）は以下である： BamHI ＴＮＦα‐ｃｏｎｃＤＮＡのｂｐｎｏ．１６４‐１９０ＴＮＦＣ‐３オリゴヌクレオチド配列（配列番号３６）は以下である： NotI ＴＮＦα‐ｃｏｎｃＤＮＡのｂｐｎｏ．２７５４‐２７１９（図１）混合物を８０℃で５分間インキュベートし、その後１×緩衝液中HOT TUB^TMポリメラーゼ（Amersham）（１Ｕ）５μｌを加えた。混合物をPerkin Elmer 9600 サーマルサイクラーで２５回（９４℃で１分間、５5０５℃で２分間、７２℃で２分間）；および１回（９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で１０分間）サイクルさせた。制限酵素切断およびプラスミド中へのｃＤＮＡの結合ＰＣＲ反応混合物をフェノール／クロロホルム（１：１）で１回抽出し、−２０℃で２Ｍ酢酸アンモニウムおよび２倍容量の１００％ＥｔＯＨで沈降させた。ＤＮＡ沈降物を遠心により集め、冷７０％ＥｔＯＨですすぎ、真空下で乾燥させ、１００μg/mlＢＳＡ、１５ＵＮｏｔＩおよび１０ＵＢａｍＨＩを含有した１×ＮＥＢ３緩衝液に再懸濁し、３７℃で３時間インキュベートした。切断されたＤＮＡを０．５×ＴＢＥ緩衝液中で０．７％アガロースゲルにより電気泳動し、約２５００ｂｐとして移動するＤＮＡをゲルから切出し、上記のように SPINBIND^TMカートリッジを用いて回収し、カートリッジから溶出後にフェノール／クロロホルム（１：１）で更に抽出した。ＤＮＡを−２０℃で２Ｍ酢酸アンモニウムおよび２倍容量の１００％ＥｔＯＨで沈降させた。ＤＮＡ沈降物を遠心により集め、冷７０％ＥｔＯＨですすぎ、真空下で乾燥させ、ｄＨ₂Ｏ１０μｌに再懸濁させた。以下を第一の管の中で混合した：ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで既に切断されて子牛腸ホスファターゼで脱リン酸化されたｐＢＳ‐ＳＫII＋プラスミド（Invitrogen）（約２５ｎｇ）１．０μｌ；上記の切断ＰＣＲ製作ｃＤＮＡ１μ ｌ；およびｄＨ₂Ｏ６．２５μｌ以下を第二の管の中で混合した：ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで既に切断されて子牛腸ホスファターゼで脱リン酸化されたｐＢＳ‐ＳＫII＋プラスミド（Invitrogen）（約２５ｎｇ）１μｌ；上記の切断ＰＣＲ作製ｃＤＮＡ３．０μ ｌ；およびｄＨ₂Ｏ４．２５μｌ各管内の混合物を５５℃で２分間インキュベートした。各管に１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液(Boehringer Mannheim)１μｌ、１０ｍＭＡＴＰ０．５μｌおよびＴ４リガーゼ(Boehringer Mannheim)（１Ｕ／μｌ）０．２５μｌを加え、各管を１５℃で６時間インキュベートした。細菌形質転換およびクローン特徴付けＤＨ５α MAX EFFICIENCY^TM細胞（Gibco/ＢＲＬ）（６７μｌ）を製造業者のプロトコールに従い上記からの各結合用混合物１．５μｌで形質転換させた。細胞を５０μg/mlアンピシリン含有のＬＢプレートに入れ、Bluo-Gal７５μｌおよび１００ｍＭＩＰＴＧ１０μｌを加え、３７℃で一夜インキュベートした。“ 白色”コロニーからのプラスミドＤＮＡを標準方法により単離し、ＰｓｔＩ切断によりｃＤＮＡインサートについて分析し、重複して一部をＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで切断して、０．５×ＴＢＥ緩衝液中１．０％アガロースゲルで電気泳動に付した。６つのうち４つのクローンは、予想された制限酵素切断パターンでｃＤＮＡを含んでいた。２クローンからのＤＮＡを配列決定した。２クローンのうち１つからのＤＮＡ、ｐＢＳ／ＴＮＦＣ‐１は、そのＤＮＡ配列により調べたところ、正確にアセンブリーされていた。ｐＢＳ／ＴＮＦＣ‐１は図１に示されたＴＮＦα‐ｃｏｎをコードするｃＤＮＡ配列のｂｐ１６４‐２７５４に相当するが、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ末端が配列に加えられている。発現ベクター構築ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎをコードする全鎖長ｃＤＮＡを、下記のようにバキュロウイルス発現ベクターｐFastBacl（Gibco/ＢＲＬ）中にサブクローニングした：ｐＢＳ／ＴＮFＣ‐１（５μｇ）をＢａｍＨＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）１μｌ、ＮｏｔＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）１μｌ、ＰｖｕＩ（Gibco/ＢＲＬ，１０Ｕ／μｌ）１μｌ（注記：ＰｖｕＩは、更にｐBluescriptＳＫを切断して、バンド同定およびゲルからの単離を容易にするために加えた）および１０×New Englan d Biolabs（ＮＥＢ）制限緩衝液ｎｏ．３３μｌで切断し、水で３０μｌの最終容量に調整した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、その後１％アガロース‐ＴＡＥゲルでランさせた。ゲル上の約２．９ｋｂＢａｍＨＩ‐ＮｏｔＩインサートバンドをゲルピースで切り出した。ゲルピースを−７０℃で１５分間冷凍し、３７℃で１５分間インキュベートし、Milliporeスピンフィルターユニット（ULTRAFREE^TMProbind）の上部チャンバー内に入れ、その後微小遠心管（Eppendorf）で１０分間にわたり最大速度で遠心した。底の管に集まった溶離物を取り出した。この物質をポリヘドリンプロモーターを含むｐFastBac1（ｐＦＢＰＨ）に結合させ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩでの二重切断により複数のクローニング部位で開かせ、ｐＢＳ／ＴＮＦＣ‐１について上記されたように精製した。いくつかの結合用反応液を、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌを含有した２０μｌの最終容量で、固定濃度（５０ｎｇ）のｐFastBac1と様々な量のインサート（０、５０および２５０ｎｇ）で調製した。反応液を１２℃で一夜インキュベートした。結合された物質（１０μｌ）は、供給業者の指示に従い塩化カルシウム沈降によりＤＨ５α MAX EFFICIENCY^TMコンピテント細胞（Gibco/ＢＲＬ）１００μｌを形質転換させるために用いた。形質転換用混合物（１００μｌ）を１００μg/ mlアンピシリン含有の２×ＹＴ／寒天プレート上に置いた。そのプレートを３７ ℃で一夜インキュベートした。コロニーをプレートから取出し、寒天なしに同培地２ｍｌで希釈した。これらの培養物を激しく振盪しながら３７℃で一夜インキュベートした。プラスミドを製造業者の指示に従いWIZARD^TMminiprep ＤＮＡ精製キット(Promega)を用いて単離した。各単離プラスミド５μｌを１０×ＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４１μｌ、ＮｏｔＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）０．５μｌおよびＢａｍＨＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）０．５μｌと共にインキュベートし、水で１０μｌの最終容量に調整した。３７℃で１時間のインキュベート後に、サンプルを１％アガロース‐ＴＡＥゲルでランし、正しい制限パターンの１つの候補を同定した。もっと多くのプラスミド調製物をこの単離物から作り（上記と同様の培地中１００ｍｌ）、プラスミドを抽出し、製造業者の指示に従いQiagenプラスミドMidiキットを用いて精製した。純粋なプラスミドの配列は、Glaxo Wellcome Core ＤＮＡ Sequencing Facilityで配列決定分析により確認した。このプラスミドはｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣと命名した。部分ＴＮＦα‐ｃｏｎｃＤＮＡを含んだ発現ベクターも、コドン１６４（Ｍｅｔ）から始まりコドン６５１（Ａｒｇ）で終わるように、ｐFastBacで構築した。この領域は、触媒ドメイン前から貫膜ドメイン前にわたるポリペプチドをコードしている。この構築物は下記のように作った。オリゴヌクレオチドＭ３およびＭ７を用いて、ＰＣＲによりｐＢＳ／ｈｃ‐７から望ましいｃＤＮＡ断片を得た：Ｍ３およびＭ７を精製後に水中２０μＭの最終濃度まで希釈した。各プライマー（１μｌ）を水１１．５μｌ含有管に加え、その後Stratagene OPTIPREP^TM緩衝液ｎｏ．３２μｌ、１０mg/ml牛血清アルブミン２μｌ、ｐＢＳ／ｈｃ‐７１μｌ（０．１μｇ）、１００ｍＭデオキシヌクレオチド混合物（Stratagene ）０．５μｌおよびVENT^TMポリメラーゼ(New England Biolabs)１μｌを加えた。反応混合物を、Perkin Elmerモデル9600サーマルサイクラーで、下記ＰＣＲプロトコール：９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で２分間を用いて、全部で３０サイクルにわたりサイクルさせた。反応完了後、２μｌを１％アガロース‐ＴＡＥ緩衝液でランさせて、製品サイズおよび品質を確認した。得られた物質を水で８５μｌに希釈し、その後１０×ＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４１０μ ｌおよびＢａｍＨＩ（New England Biolabs,２０Ｕ／μｌ）５μｌを加えた。制限反応液を３７℃で一夜インキュベートし、サンプルを１％アガロース‐ＴＡＥプレパラティブゲルに溶解させた。制限ＰＣＲ産物に相当するＤＮＡバンドを切出し、ゲルピースを上記のようにスピンロ過により精製した。遠心管の底から集められた溶離物を、下記のようにＳｔｕＩおよびＢａｍＨＩで切断された逆位複数クローニング部位を含むｐFastBac1（Gibco/ＢＲＬ）への結合反応に用いた：ｐFastBac1 １０μｌ（１μｇ）を１０×ＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４５μｌ、ＳｔｕＩ（New England Biolabs,１０Ｕ／μｌ）２．５μｌおよび水３０μｌと混合した。ＳｔｕＩ開裂反応を３７℃で３時間進行させ、その後ＢａｍＨＩ（New England Biolabs,２０Ｕ／μｌ）２．５μｌを加えて、更に３７ ℃で３時間インキュベートした。制限プラスミドをＰＣＲ産物について記載されたように精製した。結合を２０μｌの最終容量中で行い、形質転換およびコロニースクリーニングを上記のように行った。結合反応液は制限ｐFastBac1 ２μｌ（約５０ｎｇ）、制限ＰＣＲ産物１０μｌ（約１５０ｎｇ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Promega)２μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ‐ＨＣ(Promega)２μ ｌからなっていた。反応液を１２℃で一夜インキュベートした。結合された物質（１０μｌ）は、供給業者の指示に従い塩化カルシウム沈降によりＤＨ５α MAX EFFICIENCY^TMコンピテント細胞（Gibco/ＢＲＬ）１００μｌを形質転換させるために用いた。形質転換用混合物１００μｌを１００μg/mlアンピシリン含有の２×ＹＴ／寒天プレート上に置いた。そのプレートを３７℃で一夜インキュベートした。コロニーを取出し、ＤＮＡを抽出して、上記のように精製した。各単離プラスミド５μｌを１０×ＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４１μｌ、ＮｄｅＩ（New England Biolabs,１０Ｕ／μｌ）０．５μｌおよびＢａｍＨＩ（Pr omega,１０Ｕ／μｌ）０．５μｌと共にインキュベートして、水で１０μｌの最終容量に調整した。３７℃で１時間のインキュベート後に、サンプルを１％アガロース‐ＴＢＥゲルでランし、正しい制限パターンの１つの候補を同定した。もっと多くのプラスミドを上記のように作製した。純粋なプラスミド（ｐＦＢＮ２）の配列はＤＮＡ配列決定分析により確認した。ｐＦＢＮ２を得た後、ｐＢＳ／ｈｃ‐７が１５１２位にＴからＣへの塩基変化を含み（図１Ｂ）、翻訳されたアミノ酸配列でＰｈｅからＳｅｒへの変化を生じていることが調べられた。この変異は、下記多工程操作で、ｐＦＢＮ２のＮｃｏＩ‐ＸｈｏＩ断片（変異を含む）をクローンｈｃ‐１１からのＮｃｏＩ‐ＸｈｏＩ断片（１５１２位に野生型Ｔ）に代えることにより固定させた。操作の第一工程では、ｐＦＢＮ２の複数クローニング部位における追加ＸｈｏＩ部位をアウトクローニング（outcloning）した。ｐＦＢＮ２２μｌ（４μｇ）をＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４２μｌ、ＮｏｔＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）１μｌ、ＨｉｎdIII（Promega,１０Ｕ／μｌ）１μｌおよび水１４μｌと共に３７℃で３時間インキュベートした。次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（０．５μｌ）およびｄＮＴＰｓ混合物（Stratagene，各々１００ｍＭ）０．５μｌを加え、インキュベートを３７℃で１時間進めた。１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Promega) ２μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega,ＨＣ）２μｌを加え、混合物を１２ ℃で６時間インキュベートした。E.coli Ｓｔｂｌ‐２ MAX EFFICIENCY^TMコンピテント細胞（Gibco/ＢＲＬ）２００μｌを管に加え、形質転換用混合物を氷上で３０分間インキュベートし、その後４２℃で３０秒間パルス処理し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の２×ＹＴ／寒天プレート上に全混合物をプレーティングした。プレートを２４時間インキュベートし、コロニーを取出し、プラスミド miniprepを上記のように作製した。制限分析は、ＨｉｎｄIII、ＮｏｔＩおよび余分なＸｈｏＩ部位の欠失を確認するために組み合わされたＸｈｏＩ、Ｈｉｎｄ III、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ‐ＡｃｃＩを用いて行った。正しい制限パターンの１つの構築物を同定し、そのプラスミドＤＮＡを前記のように作製し、配列決定した。このプラスミドはｐＦＢＮ２／ΔＸｈｏＩと命名したが、その配列は、複数クローニング部位のＨｉｎｄIII‐ＮｏｔＩセグメントの欠失以外は、ｐＦＢＮ２と同一である。操作の第二工程では、ｐＦＢＮ２／ΔＸｈｏＩおよびｐＢＳ／ｈｃ‐１１の双方を下記のようにＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断した。どちらかのプラスミド１０μｇをＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４６μｌ、ＮｃｏＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）３ μｌ、ＸｈｏＩ（Gibco/ＢＲＬ，１０Ｕ／μｌ）３μlと混合し、水で６０μｌの最終容量に調整した。次いでこれらの混合物を３７℃で２時間インキュベートし、１％アガロース‐ＴＡＥプレパラティブゲルに担持させた。ｐＦＢＮ２／Δ ＸｈｏＩの主鎖断片およびｐＢＳ／ｈｃ‐１１の約３８０ｂｐ断片を切出し、上記のようにスピンロ過により精製した。主鎖断片５０ｎｇ（４μｌ）を小ｈｃ‐ １１断片１２ｎｇ（１２μｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Promega)２ μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega,ＨＣ）２μｌと混合し、１２℃で一夜インキュベートした。Ｓｔｂｌ‐２ MAX EFFICIENCY^TMコンピテント細胞（２００μｌ，Gibco/ＢＲＬ）を加え、混合物を０℃で３０分間インキュベートし、その後４２℃で３０秒間パルス処理し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の２× ＹＴ／寒天プレート上にプレーティングした。プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。コロニーを取出し、プラスミドminiprepを上記のように行った。単離されたプラスミドをＸｈｏＩ（Gibco/ＢＲＬ，１０Ｕ／μｌ）およびＡｃｃＩ（New England Biolabs,１０Ｕ／μｌ）で二重切断により分析した。１つのプラスミドは正しい制限パターンを示し、相当する単離物を上記のようにもっと多くのプラスミド調製物を作るために用いた。こうして得られたプラスミドは、野生型配列を確認するために配列決定した。このプラスミドはｐＦＢＮ２／ｈｃ ‐１１と命名したが、その配列は、１５１２位で野生型Ｔ残基の存在以外は、ｐＦＢＮ２／ΔＸｈｏＩの場合と同一である。操作の第三工程では、ｐＦＢＮ２／ｈｃ‐１１を用いてｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣを修復した。ｐＦＢＮ２／ｈｃ‐１１（１０μｇ）およびｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣ（５μｇ）の双方をＮＥＢ緩衝液ｎｏ．４５μｌ、ＮｓｉＩ（New England Bi olabs,１０Ｕ／μｌ）２．５μｌ、ＮｃｏＩ（Promega,１０Ｕ／μｌ）２．５μ ｌと混合し、水で５０μｌに調整した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、切断物を１％アガロース‐ＴＡＥプレパラティブゲルで分割させた。ｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣの主鎖断片およびｐＦＢＮ２／ｈｃ‐１１の約６００ｂｐ断片を切出し、上記のように精製した。次いでｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣ主鎖断片５０ｎｇ（２μｌ）をｐＦＢＮ２／ｈｃ‐１１５０ｎｇ（１０μｌ）、１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Promega)２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Promega,ＨＣ)２μｌおよび水４μｌと混合した。反応液を１２℃で一夜インキュベートし、その後Ｓｔｂｌ‐２コンピテント細胞２００μｌを上記のようにこの結合物で形質転換させた。形質転換株コロニーを単離し、ＤＮＡを精製して、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩで制限切断することにより上記のように分析した。３つの正しい単離物を配列確認について記載されたように後処理した。新規な全鎖長発現ベクターはｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣＡと命名したが、１５１２位で正しいＴ残基の存在によりｐＦＢＰＨ／ＴＮＦＣと異なっている。６．３．２．結果ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎは、図１に示されたｃＤＮＡ配列（配列番号１）および演鐸アミノ酸配列（配列番号２）により特徴付けられる。そのｃＤＮＡは、５’ 末端に１６３ｂｐ非翻訳領域、その後２４７５ｂｐのタンパク質コード領域、および３’末端に３０４ｂｐ非翻訳領域を含んでいる。第一のメチオニン残基（図１で第一アミノ酸残基として表示）は、この残基の上流に塩基６２‐６４の終止コドン（ＴＡＧ）の存在で示されるような、開始メチオニンである。全鎖長ＴＮＦα‐ｃｏｎは８２４アミノ酸を含んでいる。ＴＮＦα‐ｃｏｎはアミノ酸Ｍｅｔで始まり、アミノ酸Ｃｙｓで終わる。演繹アミノ酸配列によると、そのタンパク質の予想分子量は９３．０２ｋＤａである。ヒドロパシープロットでは、アミノ酸残基１‐１７で推定シグナルペプチドを表す２つの疎水性セグメントと、アミノ酸残基６７２‐６９１で貫膜領域とを現している。GeneBankのサーチでは、メタロプロテイナーゼファミリーに独特な下記モチーフ：システインスイッチモチーフ（ａａ１８１‐１８５）、亜鉛結合モチーフ（ａａ４０５‐ ４０９）およびＭｅｔターンモチーフ（ａａ４３５‐４３７）を同定した。７．例：ＴＮＦα‐ｃｏｎのビオチニル化インヒビターの製造上記（セクション６．１．１）のようなＴＮＦα‐ｃｏｎのアフィニティー精製に有用なＴＮＦα‐ｃｏｎのビオチニル化インヒビターは、下記のように製造した。別に指摘されないかぎり、化学物質は市販業者から得て、更に精製せずに用いた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析はMerck ６０Ｆ₂₅₄０．２５ミクロンシリカゲルプレートで行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュシリカゲル（ＥＭ Science）を用いて行った。化合物均質性は、溶離液Ａ（水、０．１％ＴＦＡ）およびＢ（アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）でDynamax-６０Ａカラムを用いた分析逆相ＨＰＬＣにより、１．５ml/minの流速で３０分間にわたる８５％Ａ：１５％Ｂ〜２０％Ａ：８０％Ｂの勾配溶出で調べた。化合物精製は、分析ＨＰＬＣについて記載されたのと同様の溶離液を用いて、４５ml/minの流速で勾配を適宜に変えて、２ｉｎ径Dynamax-６０Ａカラムを用いたプレパラティブ逆相ＨＰＬＣにより行った。¹ＨＮＭＲスペクトルは０．５Ｈｚのラインブロードニングおよび０．１秒の緩和遅延でVarian Unity ３００により得た。プロトンデカップル¹³Ｃスペクトルは７５ＭＨｚで同様の機器を用いて得た。化学シフトはｐｐｍで報告している。低分解質量スペクトルは、高速原子衝突（ＦＡＢ）を用いたＪＥＯＬＡＸ５０５で、マトリックス溶媒としてチオグリセロール、３‐ニトロベンジルアルコールまたは３‐ニトロベンジルアルコール／酢酸リチウムを用いて行った。（Ａ）の製造２５℃のＣＨ₂Ｃｌ₂（７０ｍｌ）中ＣＢＺ‐フェニルアラニン（５．５７ｇ、０．０１９２mol）の溶液にＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ（２．９４ｇ、０．０１９２mol）、ＢＯＣ‐１，６‐ヘキサンジアミン（５．０ｇ、０．０１９８mol）およびＥｔ₃Ｎ（２．９７ｍｌ、０．０２１３mol）を加えた。溶液を０℃に冷却した。溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（４．３１ｇ、０．０２０９mol）を加え、溶液を撹拌し、２５℃で１６時間にわたり加温した。混合液をロ過し、ロ液を希ＨＣｌで洗浄し、各層を分離した。有機層を飽和水性ＮａＨＣＯ₃で洗浄し、各層を分離した。有機層を（ＭｇＳＯ₄）乾燥し、ロ過し、ロ液を濃縮して、生成物（Ａ）（図９Ａ）９．５３ｇ（９９％）を得た。この物質は更に精製せずに次の反応に用いた。Ｒｆ０．４２（３０％ＥｔＯＡｃ：ＣＨ₂Ｃｌ₂）；¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１．００‐１．４０（ｍ，８Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），２．９‐３．２（ｍ，６Ｈ），４．３５（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．５５（ｂｒｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），５．４４（ｂｒｓ，１Ｈ），５．７８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．１０‐７．４０（ｍ，１０Ｈ）（Ｂ）の製造ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（１．０ｍｌ）およびＥｔＯＡｃ（４０ｍｌ）中生成物（Ａ）（５．００ｇ、０．０１００mol）の溶液に１０％Ｐｄ／Ｃ（１．００ｇ）を加え、反応フラスコを窒素で排気およびパージした。反応フラスコを水素で排気およびパージし、混合液を１ａｔｍの水素下２５℃で６時間撹拌した。反応フラスコを窒素で排気およびパージし、混合液をロ過し、ロ液を濃縮して、生成物（Ｂ）（図９Ｂ）３．２２ｇ（８８％）を得た。この物質は更に精製せずに次の反応に用いた。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１．２ ‐１.６（ｍ，１７Ｈ），２．６‐２．８（ｍ，１Ｈ），３．０‐３．３（ｍ，４Ｈ），３．５８‐３．６２（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｂｒｓ，１Ｈ），７．２‐７．４（ｍ，５Ｈ）．（Ｃ）の製造試薬（Ｃ）（図９Ｃ）を下記操作により製造した。蒸留水（３５０ｍｌ）中濃硫酸（７５ｍｌ）の溶液にＤ‐ロイシン（図１０Ａ）（５０．０ｇ、０．３８１ mol）および臭化カリウム（１５８ｇ、１．３３mol）を加え、溶液をちょうど０ ℃に冷却した。その溶液に蒸留水（１００ｍｌ）中の溶液として亜硝酸ナトリウム（３４．８ｇ、０．５０４mol）を１時間かけて滴下した。添加終了後、混合液を０℃で１時間撹拌した。ジクロロメタンを溶液に加え、混合液を数分間撹拌した。各層を分離し、水層をジクロロメタンで抽出した。各層を分離し、合わせた有機層を（ＭｇＳＯ₄）乾燥し、ロ過し、ロ液を濃縮して、粗製生成物４５ｇ（６１％）を得た。この物質は更に精製せずに次の反応に用いた。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ０．９２‐０．９６（ｍ，６Ｈ），１．７‐１．８５（ｍ，１Ｈ），１．９０‐１．９５（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）．ジクロロメタン（２００ｍｌ）中上記で製造されたブロモ酸（４５．６ｇ、０．２３３mol）の冷（−７８℃）溶液に、冷フィンガー（−７８℃）を用いてイソブテン（２００ｍｌ）を導入した。その溶液に濃硫酸（１．５ｍｌ）を滴下し、溶液を撹拌して、２５℃に１７時間にわたり加温した。溶液は、減圧下で溶媒を除去することにより、原容量の半分に濃縮した。得られた溶液を１０％水性ＮａＨＣＯ₃（２×２００ｍｌ）で洗浄し、各層を分離した。有機層を（ＭｇＳＯ₄ ）乾燥し、ロ過し、ロ液を減圧下で濃縮して、粗製生成物（図１０Ｂ）４７ｇ（８１％）を得た。この物質は更に精製せずに次の反応に用いた。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ０．８５‐０．９５（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．６‐１．８（ｍ，１Ｈ），１．８０‐１．８５（ｍ，２Ｈ），４．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）．２５℃のＤＭＦ（８０ｍｌ）中マロン酸ジベンジル（４６．５ｇ、０．１８６ mol）の溶液に、（場合により氷浴で）冷却しながら、カリウムtert‐ブトキシド（２０．７ｇ、０．１８４mol）を少しずつ加えた。均質溶液の形成後、溶液を（０℃）冷却し、ブロモエステル（４．７７ｇ、０．１８９mol）をＤＭＦ（８０ｍｌ）中の溶液として滴下した。添加終了後、溶液を５℃で４日間撹拌した。混合液を酢酸エチルと飽和水性塩化アンモニウムに分配し、各層を分離した。水層を酢酸エチルで抽出して、各層を分離した。合わせた有機層を減圧下で濃縮し、残渣をジエチルエーテルに溶解して、塩水で洗浄した。各層を分離し、有機層を（ＭｇＳＯ₄）乾燥し、ロ過し、ロ液を濃縮した。残渣は、２３０〜４００メッシュシリカゲルでフラッシュカラムクロマトグラフィー（９７．５％ヘキサン：酢酸エチル〜９０％ヘキサン：酢酸エチルを用いた勾配溶出）を用いて精製し、生成物（図１０Ｃ）５０ｇ（６０％）を得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ０．８０‐０．９０（ｍ，６Ｈ），１．０‐１．１（ｍ，ＩＨ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４５‐１．６０（ｍ，２Ｈ），３．０‐３．１（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ），５．０‐５．２（ｍ，４Ｈ），７．２‐７．４（ｍ，１０Ｈ）；ＭＳ（陽イオンＦＡＢ）ｍ／ｚ＝４５５（〔Ｍ＋Ｈ〕⁺）． tert‐ブチルエステル（３４．２ｇ、０．０７５３mol）にＴＦＡ・Ｈ₂Ｏ（９５：５）の溶液（５２．５ｍｌ）を加え、溶液を０℃で１２時間貯蔵した。ＴＦＡを減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンで希釈した。溶液を塩水で洗浄し、各層を分離した。有機層を（ＭｇＳＯ₄）乾燥し、ロ過し、ロ液を濃縮して、粗製生成物（図１０Ｄ、しかも図９ではＣとして示されている）３０ｇ（１００％）を得た。この物質は更に精製せずに次の反応に用いた。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ０．８０‐０．８５（ｍ，６Ｈ），１．１‐１．２（ｍ，１Ｈ），１．５‐１．７（ｍ，２Ｈ），３．１０‐３．２５（ｍ，１Ｈ），３．８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．０‐５．２（ｍ，４Ｈ），７．２‐７．４（ｍ，１０Ｈ），１０．０‐１０．２（ｂｒｓ，１Ｈ）．（Ｄ）の製造ＤＭＦ（２０ｍｌ）中酸（Ｃ）（図９Ｃ）（３．１０ｇ、０．０７７mol）の溶液に、ＴＨＦ（２０ｍｌ）中の溶液としてＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ（１．３６ｇ、０．００８８６mol）、４‐メチルモルホリン（０．９４７ｍｌ、０．００８８６m ol）および生成物（Ｂ）（図９Ｂ）（３．２２ｇ、０．００８８６mol）を加え、溶液を２５℃で１６時間撹拌した。混合液をロ過し、ロ液を減圧下で濃縮して、油状残渣を得た。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、１０％クエン酸水溶液で洗浄し、各層を分離した。有機層を１０％ＮａＨＣＯ₃の水溶液で洗浄し、各層を分離した。有機層をＮａＣｌの飽和水溶液で洗浄し、各層を分離した。有機層を（ＭｇＳＯ₄）乾燥し、ロ過し、ロ液を濃縮した。残渣は、２３０〜４００メッシュシリカゲルでフラッシュカラムクロマトグラフィー（１００％ＣＨ₂Ｃｌ₂〜３０％Ｅｔ₂Ｏ：ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いた勾配溶出）を用いて精製し、主ジアステレオマー（Ｄ）（図９Ｄ）３．７０ｇ（６４％）および副ジアステレオマー１．２５ｇ（２０％）を得た。¹ＨＮＭＲデータは主ジアステレオマーのみについて報告した。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ０．７４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），０．７６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），１．０‐１．５（ｍ，１１Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），２．８‐３．２（ｍ，６Ｈ），３．８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），４．４‐４．６（ｍ，２Ｈ），５．０‐５．２（ｍ，４Ｈ），５．７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），６．５８（d，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２‐７．４（ｍ，１５Ｈ）．（Ｅ）の製造ＥｔＯＨ（２１ｍｌ）中（Ｄ）（図９Ｄ）（２．８９ｇ、０．００３８９mol ）の溶液にギ酸アンモニウム（１．２３ｇ、０．０１９５mol）を加えた。その混合液にイソプロパノール（５．２５ｍｌ）中のスラリーとして１０％Ｐｄ／Ｃ（５７８ｍｇ）を加え、混合液を２５℃で４５分間撹拌した。触媒を濾去し、ロ液をピペリジン（０．４２３ｍｌ、０．００４２８mol）で処理し、溶液を２５ ℃で１５分間撹拌してから、水性３７％ホルムアルデヒド（２．００ｍｌ、０．０２４５mol）を加えた。溶液を２５℃で１９時間撹拌してから、溶液を還流温度まで加温し、１時間撹拌した。溶液を２５℃に冷却し、溶媒を減圧下で除去して、残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、１０％クエン酸水溶液で酸性化した。各層を分離し、有機層を水性１％Ｋ₂ＣＯ₃で洗浄した。各層を分離し、水層を６ＮＨＣｌでｐＨ４に酸性化して、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機層を（ＭｇＳＯ₄）乾燥し、ロ過し、ロ液を濃縮した。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃを用いた溶出）を用いて精製し、生成物（Ｅ）（図９Ｅ）１．１５ｇ（５６％）を得た。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ₆ ）δ０．７３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），０．７８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），１．０‐１．６（ｍ，１１Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ），２．６‐３．０（ｍ，６Ｈ），３．３‐３．４（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），５．１０（ｓ，１Ｈ），５．８０（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．０‐７．２（ｍ，５Ｈ），７．８０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．３５（ｂｒｓ，１Ｈ）；ＭＳ（陽イオンＦＡＢ）ｍ／ｚ＝５３８（〔Ｍ＋Ｌｉ〕⁺）．（Ｆ）の製造 α，β‐不飽和酸（Ｅ）（１．１５ｇ、０．００２１６mol）にチオフェノール（７．３２ｍｌ、０．０７１４mol）を加え、混合物を暗所下６０℃で１日間撹拌した。溶液を２５℃に冷却し、Ｅｔ₂Ｏを加えて生成物を沈殿させた。生成物を濾取し、固体物をエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、ジアステレオマー生成物（Ｆ）（図９Ｆ）の３．５：１混合物０．９４０ｇ（６５％）を得た。ジアステレオマーのこの粗製混合物は更に精製せずに次の反応に用いた。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ₆）δ０．７０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），０．７８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），１．１‐１．５（ｍ，２０Ｈ），２．２‐ ３．２（ｍ，１０Ｈ），４．５‐４．６（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），６．９‐７．３（ｍ，１０Ｈ），７．９２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）．（Ｇ）の製造ＣＨ₂Ｃｌ₂（３．０ｍｌ）およびＤＭＦ（０．７６ｍｌ）中の酸（Ｆ）（４００ｍｇ、０．６２３mmol）にＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ（１１４ｍｇ、０．７４8mmol）を加え、混合液を０℃に冷却してから、ＷＳＣＤＩ（１４３ｍｇ、０．７４８mmol ）および４‐メチルモルホリン（８２ｍｌ、０．７４８mmol）を加えた。混合液を０℃で１時間撹拌して、活性化されたエステルの完全形成を確実にした。塩酸ヒドロキシルアミン（６５ｍｇ、０．９３４mmol）および４‐メチルモルホリン（１０３ｍｌ、０．９３４mmol）をＤＭＦ（２．０ｍｌ）中の溶液として滴下し、混合液を１時間撹拌した。溶液をＨ₂Ｏ（７．５ｍｌ）、Ｅｔ₂Ｏ（７．５ｍｌ）およびヘキサン（７．５ｍｌ）の混合液中に注ぎ、生成物を沈殿させた。沈殿物を濾取し、固体物をヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥させて、ジアステレオマー生成物（Ｇ）（図９Ｇ）２０４ｍｇ（５０％）を得た。ジアステレオマーをＲＰＨＰＬＣにより分離して、主ジアステレオマー１６０ｍｇ（３９％）を得た。分析データは主ジアステレオマーのみについて報告した。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ₆）δ０．７１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），０．７８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１‐１．５（ｍ，１１Ｈ），１．３（ｓ，９Ｈ），２．０‐３．０（ｍ，１０Ｈ），４．６２（１Ｈ），6．７５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），６．９‐７．３（ｍ，１０Ｈ），７．８２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．９２（ｂｒｓ，１Ｈ），１０．４４（ｓ，１Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ‐ｄ₆）δ２１．５，２４．１，２５．０，２５．９，２６．０，２８．１，２８．２，２9．０，２９．４，３２．１，３７．５，４５．７，４６．１，５４．０，７７．２９，１２５．０９，１２６．２９，１２７．０６，１２７．８６，１２８．７７，１２９．０８，１３６．５７，１３７．９４，１５５．６４，１６８．２２，１７０．８７，１７２．７３；ＭＳ（陽イオンＦＡＢ）ｍ／ｚ＝６５７（〔Ｍ＋Ｈ〕⁺）．（Ｈ）の製造主ジアステレオマー（Ｇ）（１６０ｍｇ、０．２４４mmol）にＴＦＡ（２．５ｍｌ）を加え、溶液をしっかりと栓をしたフラスコ中で２０分間撹拌した。ＴＦＡを減圧下で除去し、残渣をＲＰＨＰＬＣにより精製して、凍結乾燥後にＴＦＡ塩（Ｈ）（図９Ｈ）１２５ｍｇ（７７％）を得たが、これは以下でＧＩ１９３４６３Ａと称される。¹ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ₆）δ０．７２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．７９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．１‐１．６（ｍ，１０Ｈ），２．０‐３．２（ｍ，１０Ｈ），４．６（ｍ，１Ｈ），６．８‐７．３（ｍ，１０Ｈ），７．６（ｂｒｓ，３Ｈ），７．８６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．８３（ｓ，１Ｈ），１０．４４（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（陽イオンＦＡＢ）ｍ／ｚ＝５５７（〔Ｍ＋Ｈ〕⁺）．（Ｉ）の製造ＧＩ１９３４６３Ａのビオチン誘導体（図９Ｉ）を下記のように製造した。ＧＩ１９３４６３Ａ（２０ｍｇ）をジメチルホルムアミド０．６ｍｌに溶解し、トリエチルアミン９μｌおよび免疫学的に純粋なＮＨＳ‐ＳＳビオチン（Pier ce）９ｍｇで処理した。室温で一夜撹拌した後、水２ｍｌを加え、得られた固体物を集め、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）によりジクロロメタン中１０％メタノールで溶出させて精製し、最終生成物３ｍｇを得た。８．例：部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの基質特異性実験は部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの基質特異性を調べるために行った。部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎを、下記のようにコンバーターゼ活性を含むミクロソームフラクションから作製した。 Mono Mac６細胞（Ziegler-Heitbrook et al.,1988,Int.J.Cancer,41:456-461 ）を、１０％牛胎児血清、０．１％プルロニック、ペニシリン／ストレプトマイシン（各々５０単位／ｍｌ）およびＬ‐グルタミン（２ｍＭ）を含有したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。細胞（８．２×１０¹⁰）を沈降させ、０．２５Ｍスクロースおよび２ｍＭＭｇＣｌ₂を含有した５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．５で洗浄し、沈降させた。ペレット（２６０ｍｌ）を、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭＡＥＢＳＦ、１０μＭＥ‐６４、１０μＭロイペプチン、１μＭペプスタチン、１０μＭホスホルアミドンおよび５０μＭＤＣＩ）を含有した冷洗浄緩衝液で６００ｍｌまで再懸濁した。懸濁液を４℃で撹拌しながらキャビテーター中１０００ｐｓｉＮ₂下で３０分間加圧した。圧力を１〜２分間放出させて、溶解物の約９０％を集めた。細胞破壊は、トリパンブルー排除により調べると、８０％より多かった。破壊された細胞の懸濁液をＧＳ‐３ローターで１０分間かけて３５００ｒｐｍで沈降させた。上澄（４００ｍｌ）をＴＦＡ２０．２５ローターで４５分間にわたり４℃にて２０，０００ｒｐｍで遠心した。得られたペレット（５０ｍｌ）を、０．２ＭＮａＣｌ、１．２％ＮＰ‐４０および上記のような但しＤＣＩなしのプロテアーゼインヒビターを含有したｐＨ７．５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で、dounceホモゲナイズして、４℃で３０分間撹拌することにより、全容量７５０ｍｌまで再懸濁した。次いで再懸濁された物質をＴＦＡ２０．２５ローターで４５分間にわたり４℃にて２０，０００ｒｐｍで遠心した。得られたペレットを１０ｍｌ未満の容量を有していた。上澄（約７５０ｍｌ）を、０．２ＭＮａＣｌおよび１％ＮＰ‐４０を含有したｐＨ７．５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で既に平衡化された、１００ｍｌ充填ｃｏｎＡ‐セファロース（Pharmacia）を含有するカラムに、１０ml/minで通した。担持カラムを平衡緩衝液２００ｍｌ、その後ＮａＣｌなしの同緩衝液８００ｍｌで洗浄した。物質をｃｏｎＡカラムに４℃で一夜留めた。タンパク質を、１％ＮＰ−４０、０．２５Ｍメチル‐α‐Ｄ‐マンノピラノシドおよび上記のような但しＤＣＩなしのプロテアーゼインヒビターを含有したｐＨ７．５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液８５０ｍｌを１０ml/minでカラムに通すことにより、ｃｏｎＡカラムから溶出させた。溶離液を集め、１％ＮＰ‐４０を含有したｐＨ７．５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で既に平衡化された、２ｍｌ充填POROS^TMHQ陰イオン交換剤を含有するカラムに、５ml/minで通した。カラムを平衡緩衝液１０ｍｌで洗浄した。充填層の緩衝液レベルをマトリックスをちょうどカバーするまで下げ、導入管を０．５ＭＮａＣｌ、１％ＮＰ‐４０および上記のような但しＤＣＩなしのプロテアーゼインヒビターを含有したｐＨ７．５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（高塩緩衝液）でフラッシングした。数ｍｌの高塩緩衝液を層カラムの上に手で担持させ、導入管を再接合した。高塩緩衝液をカラムに１ml/minで通過させ、１ｍｌフラクションを集めた。異なる色を有したフラクション２および３は、プールしてみると、１５．４mg/mlタンパク質（Micro BCAキット，BioRad）と顕著なＴＮＦα‐ｃｏｎ活性を含有していた。ＮＰ‐４０からの界面活性剤をドデシルマルトシド（ｄｄｍ）に交換するために、酵素をｐＨ７．５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１％ｄｄｍおよびプロテアーゼインヒビターでの透析により脱塩した。次いで酵素を２００μｌ POROS^TMＨＱカラムに担持させ、０．５ＭＮａＣｌを含有した上記緩衝液で溶出させた。コンバーターゼ活性を含むフラクションを基質マッピング実験に用いた。下記基質でＰ１’（Ｖａｌ）またはＰ２’（Ａｒｇ）に置換を有する合成ペプチドを製造した（配列番号１６）：ビオチン-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Lys-(DNP)‐ＮＨ₂ P4 P3 P2 P1 P1’P2’P3’P4’P5’ １０００のペプチドを、Ｆｍｏｃ固相戦略（Atherton et al.,1989,Solid pha se synthesis:a practical approach,IRL Press,Oxford）により、１０のペプチドにつき１００のプールでアセンブリーした。アセンブリーは、手動および自動合成技術の組合せにより、Rink Amide樹脂（NovaBiochem,ｌｏｔｎｏ．Ａ１２６９７，ｃａｔ．ｎｏ．０１‐６４‐００１３，０．４６mmol/g）５ｇで行った。Ｃ末端からＰ３’（Ｓｅｒ）へのアセンブリーは、反応シェーカーでバッチ式に行った。樹脂は、２０の反応容器への分割、Ｐ２’のカップリング、アセンブリーの完了のため２つの９６反応容器ブロックへの入替えおよび分割と、その後 Advanced ChemTech 496 MOSで開裂のために、Advanced ChemTech 357 MPSに移した。一部の基質を取出し、各基質について1μＭの最終濃度まで酵素調製物に加えた。蛍光基質ＮＢＤ‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ（ＤＭＣ）‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐ＮＨ₂（配列番号１７）（１０μＭ）を加えて、３７０ｎｍ（励起）、４６０ｎｍ（放射）で蛍光をモニターすることにより反応を追跡した。加えて、基質の開裂は、１μＭで含有された標準基質ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐ Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号１６）と比較した。基質を酵素調製物と共に３７℃で０．５〜４時間インキュベートし、反応を等容量の１％ＨＦＢＡを加えることにより停止させた。サンプルをPOROS^TMアビジンカラムに通して、生成物をＬＣ／ＭＳに付し、反応混合物で放出された成分の相対的強度を調べた。Ｐ１’よびＰ２’で改変されたペプチドの相対的反応性は下記表１に示されている。表１部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎの基質特異性基質相対V/K ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号１８）１ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐フェニルｇｌｙ‐Ａｌａ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐Ｎ₂（配列番号１９）１．７ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐ＨｏｍｏＰｈｅ‐Ａｌａ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号２０）１．６ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐フェニルｇｌｙ‐Ａｒｇ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号２１）１．５ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐３‐（３‐ピリジル）‐０．５Ａｌａ‐Ｈｉｓ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号２２）ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐ＮｏｒＬｅｕ‐Ａｒｇ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号２３）１．３ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐ＮｏｒＬｅｕ‐Ａｌａ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｌｙｓ‐（ＤＮＰ）‐ＮＨ₂（配列番号２４）０．７データからわかるように、Ｐ１’またはＰ２’で天然または非天然アミノ酸と置換された基質は、部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎにより認識および開裂されている。第二組の実験は、部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎのタンパク質分解能力に対する基質鎖長の影響を調べるために行った。下記表２に掲載されたＤＮＰ標識基質をZeneca/Cambridge Research Biochemicalsから得た。個別の反応では、１０μ Ｍ濃度の基質を、１０μＭロイペプチンを含有したＲＢ緩衝液（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、５μＭＺｎＣｌ₂および２ｍＭＣａＣｌ₂）中で、ミクロソーム酵素調製物と反応させた。試験反応で生じた生成物がＴＮＦα‐ｃｏｎ活性の結果として生成されたことを保証するために、コントロール反応をＴＮＦα‐ｃｏｎのヒドロキサメートインヒビター（ＧＩ１２９４７１Ｘ）１０μＭと共にランさせた。サンプルを３７℃で０．５〜４時間ランさせ、等容量の１％ＨＦＢＡを加えて反応停止させた。サンプルを２２〜３６％アセトニトリルの０．１％ＨＦＢＡ水／アセトニトリル勾配でＣ１８ Vydacカラムによるクロマトグラフィーに付した。生成物は３８０ｎＭで吸光度を測定することによりモニターした。様々なサイズの基質に関する相対活性Ｖ／Ｋは下記表２に示されている。結果は、Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕが除去されていると、ペプチドが基質として働かないが、カルボキシ末端の切欠は開裂能の実質的喪失なしにＰ４’で生じうることを示している。表２部分精製ヒトＴＮＦα‐ｃｏｎによる様々なサイズの基質の開裂基質相対V/K ビオチン‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐ＮＨ（配列番号２５）１ビオチン‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐ＮＨ₂（配列番号２６）０．６ビオチン‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐ＮＨ（配列番号２７）０．５ビオチン‐Ｓｅｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐ Ｓｅｒ‐ＮＨ₂（配列番号２８）０．６ビオチン‐Ｐｒｏ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐ＮＨ₂（配列番号２９）１．５ビオチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐ＮＨ₂（配列番号３０）１ビオチン‐Ａｌａ‐Ｇｌｎ‐Ａｌａ‐Ｖａｌ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｓｅｒ ‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐ＮＨ₂（配列番号３１）代謝なし上記で引用されたすべての特許、特許出願および文献は、それら全体について、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。本発明は記載された具体的態様によりその範囲が制限されることはなく、それは本発明の個別面の単なる説明とみなされる。機能的に同等の組成物および方法も本発明の範囲内に属する。確かに、本発明の様々な修正が、ここに示されて記載されたものに加えて、上記記載および添付図面から分子生物学、医学または関連した分野の業者にとり明らかであろう。このような修正も、添付された請求の範囲内に属するとみなされる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年５月２６日（１９９８．５．２６）【補正内容】請求の範囲１．生物活性ＴＮＦα‐コンバーターゼをコードし、かつ図１に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、単離ＤＮＡ配列。２．請求項１に記載されたＤＮＡ配列（配列番号１）と相補的なＤＮＡ配列と、高度厳密または中度厳密条件下でハイブリッド形成することができる、単離ＤＮＡ。３．請求項１に記載されたＤＮＡを含んでなる、組換えＤＮＡ発現ベクター。４．ＤＮＡが、宿主においてＤＮＡの発現をコントロールする調節配列と機能的に関連している、請求項３に記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。５．選択マーカーまたはリポーター遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を更に含んでいる、請求項４に記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。６．請求項３に記載された組換えＤＮＡ発現ベクターを含有する宿主細胞。７．生物活性ＴＮＦα‐コンバーターゼを発現する、請求項６に記載の宿主細胞。８．図１に示されたアミノ酸配列（配列番号２）を有する、実質的に純粋なＴＮＦα‐コンバーターゼ。９．異種タンパク質またはペプチド配列と結合されたＴＮＦα‐コンバーターゼを含んでなる融合タンパク質であって、ＴＮＦα‐コンバーターゼが図１に示されたアミノ酸配列（配列番号２）を有する、融合タンパク質。１０．生物活性ＴＮＦα‐コンバーターゼの産生に導く条件下で請求項６に記載された宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＮＦα‐コンバーターゼを回収することを含む、組換えＴＮＦα‐コンバーターゼの単離方法。１１．請求項１０に記載された方法により作製された、組換えＴＮＦα‐コンバーターゼ。１２．ＴＮＦα‐コンバーターゼをコードする核酸であって、ＴＮＦα‐コンバーターゼが図１に示されたアミノ酸配列（配列番号２）を有する、核酸。１３．ＴＮＦα‐コンバーターゼと結合しうる化合物の単離法であって、（ａ）固相マトリックスへの接合によりＴＮＦα‐コンバーターゼまたはその一部を固定し、（ｂ）固定されたＴＮＦα‐コンバーターゼに化合物を結合させる条件下で、（ａ）のＴＮＦα−コンバーターゼ‐固相マトリックス複合体を、化合物を含んだ物質と接触させ、（ｃ）固相マトリックスから未結合物質を除去し、（ｄ）ＴＮＦα‐コンバーターゼと結合した化合物の存在を検出し、（ｅ）結合した化合物をＴＮＦα‐コンバーターゼから溶出させ、および（ｆ）溶出した化合物を集める、ことを含む方法。１４．請求項１３に記載された方法により単離された、ＴＮＦα‐コンバーターゼと結合できる化合物。１５．ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性を阻害する、請求項１４に記載の化合物。１６．ＴＮＦα‐コンバーターゼの作製法であって、（ａ）請求項１に記載されたＤＮＡ配列（配列番号１）を含んだ組換えＤＮＡ発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、（ｂ）ＤＮＡ配列の発現およびＴＮＦα‐コンバーターゼの産生に導く条件下において培地で工程（ａ）の細胞を培養し、および（ｃ）ＴＮＦα‐コンバーターゼを単離することを含む方法。１７．ＴＮＦα‐コンバーターゼが（ａ）ＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体を形成するような、インヒビター‐ビオチン部分へのＴＮＦα‐コンバーターゼの結合に導く条件下で、ビオチン部分を更に含んだＴＮＦα‐コンバーターゼインヒビターとＴＮＦα‐コンバーターゼを接触させ、（ｂ）ストレプトアビジンへのＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体の結合に導く条件下で、（ａ）のＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体を固相マトリックスに結合されたストレプトアビジンと接触させ、（ｃ）未結合物質を除去し、および（ｄ）ＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体をストレプトアビジンから溶出させるか、またはＴＮＦα‐コンバーターゼをインヒビター ‐ビオチン複合体から溶出させることにより単離される、請求項１６に記載の方法。１８．哺乳動物被治療体でＴＮＦαのレベルを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性を調節するそれらの能力について化合物を試験することを含む方法。１９．ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性が、ＴＮＦα前駆体、ＴＮＦα または合成基質への検出可能な結合、ＴＮＦα前駆体から成熟ＴＮＦαへの変換、および合成基質の開裂からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。２０．哺乳動物被治療体の血清または組織で高レベルのＴＮＦαにより特徴付けられる疾患または症状の治療方法であって、上記治療の必要な哺乳動物被治療体に、ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性を調節する化合物の有効量を投与することを含む方法。２１．疾患または症状が、全身性炎症応答症候群、再潅流損傷、心血管疾患、感染疾患、産科障害、婦人科障害、炎症疾患、自己免疫、アレルギー疾患、アトピー疾患、悪性疾患、移植合併症からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。２２．疾患または症状が、敗血症性ショック、悪液質、エイズ、移植片対宿主疾患、大脳マラリア、クローン病、糖尿病、炎症性腸疾患、骨粗製症、再狭窄、乾癖、梗塞、リウマチ様関節炎、黄斑変性、骨関節炎および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。２３．疾患または症状が虚血現象に起因する梗塞である、請求項２０に記載の方法。２４．ＴＮＦα‐コンバーターゼを阻害する化合物と薬学上許容されるキャリアとを含んでなる、医薬組成物。２５．図１に示されたアミノ酸配列（配列番号２）を有するＴＮＦα‐コンバーターゼをコードするヌクレオチドの一部と相補的なアンチセンス配列を含んでなるオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス配列が細胞でＴＮＦα‐コンバーターゼヌクレオチドの転写または翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチド。２６．図１に示されたアミノ酸配列（配列番号２）を有するＴＮＦα‐コンバーターゼまたはその一部と、ＴＮＦα‐コンバーターゼの活性を調節しうる治療剤とを含んでなる、複合剤。２７．図８に示された化学構造を有する、ＴＮＦα‐コンバーターゼのインヒビター。２８．Ｒがビオチン部分を含んでいる、請求項２７に記載のインヒビター。２９．Ｒが‐（ＣＨ₂）_n‐ビオチン（ｎ＝０〜１０）、‐（ＣＨ₂）_n‐ イミノビオチン（ｎ＝０〜１０）、‐（ＣＨ₂）_n‐Ｓ‐Ｓ‐（ＣＨ₂）_n−ビオチン（ｎ＝０〜１０）および‐（ＣＨ₂）n‐Ｓ‐Ｓ‐（ＣＨ₂）_n‐イミノビオチン（ｎ＝０〜１０）からなる群より選択される、請求項２８に記載のインヒビター。３０．ＴＮＦα‐コンバーターゼ複合体を形成するような、ＴＮＦα‐コンバーターゼのインヒビターへの結合を導く条件下で、ＴＮＦα‐コンバーターゼを含んだ調製物を請求項２７に記載されたインヒビターと接触させ、ＴＮＦα‐ コンバーターゼ複合体を単離することを含む、ＴＮＦα‐コンバーターゼの単離方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１５ 17/00 ６１７ 17/06 ６１７Ｅ 19/10 ６１９Ｅ 25/00 ６２５Ｂ 29/00 ６２９ 31/02 ６３１Ｂ 31/18 ６３１Ｍ 31/00 ６３１ 33/06 ６３３Ｆ 37/08 ６３７Ｅ 43/00 ６４３Ａ６１Ｋ 45/00 ６４３ＤＣ０７Ｋ 19/00 45/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 5/10 1/21 9/64 9/64 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ジェイムズ、デイビッド、ベクヘラーアメリカ合衆国ノースカロライナ州、リサーチ、トライアングル、パーク、ファイブ、ムーア、ドライブグラクソ、ウェルカム、インコーポレーテッド内 (72)発明者マーシャ、エル．モスアメリカ合衆国ノースカロライナ州、リサーチ、トライアングル、パーク、ファイブ、ムーア、ドライブグラクソ、ウェルカム、インコーポレーテッド内 (72)発明者フランク、ジェイ．ショーネンアメリカ合衆国ノースカロライナ州、リサーチ、トライアングル、パーク、ファイブ、ムーア、ドライブグラクソ、ウェルカム、インコーポレーテッド内 (72)発明者ウォーレン、ジェイ．ロックアメリカ合衆国ノースカロライナ州、リサーチ、トライアングル、パーク、ファイブ、ムーア、ドライブグラクソ、ウェルカム、インコーポレーテッド内 (72)発明者ウェン―ジイ、チェンアメリカ合衆国ノースカロライナ州、リサーチ、トライアングル、パーク、ファイブ、ムーア、ドライブグラクソ、ウェルカム、インコーポレーテッド内 (72)発明者ジョン、アール．ディッドスバリーアメリカ合衆国ノースカロライナ州、リサーチ、トライアングル、パーク、ファイブ、ムーア、ドライブグラクソ、ウェルカム、インコーポレーテッド内 (72)発明者ショウ―リャン、キャサリーン、ジンアメリカ合衆国カリフォルニア州、スタンフォード、パスツーツ、ドライブ、300、スタンフォード、ユニバーシティ、デパートメント、オブ、ジノッブ内

Claims

【特許請求の範囲】１．生物活性ＴＮＦα‐コンバーターゼをコードする単離ＤＮＡ配列。２．ＴＮＦα‐コンバーターゼが哺乳動物由来である、請求項１に記載の単離ＤＮＡ配列。３．ＴＮＦα‐コンバーターゼがヒト由来である、請求項２に記載の単離ＤＮＡ配列。４．図１に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、請求項３に記載の単離ＤＮＡ。５．請求項１に記載されたＤＮＡ配列（配列番号１）と相補的なＤＮＡ配列と、高度厳密または中度厳密条件下でハイブリッド形成することができる、単離ＤＮＡ。６．請求項１に記載されたＤＮＡを含んでなる、組換えＤＮＡ発現ベクター。７．ＤＮＡが、宿主においてＤＮＡの発現をコントロールする調節配列と機能的に関連している、請求項６に記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。８．選択マーカーまたはリポーター遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を更に含んでいる、請求項７に記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。９．請求項６に記載された組換えＤＮＡ発現ベクターを含有する宿主細胞。１０．生物活性ＴＮＦα‐コンバーターゼを発現する、請求項９に記載の宿主細胞。１１．実質的に純粋な哺乳動物ＴＮＦα‐コンバーターゼ。１２．哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の実質的に純粋なＴＮＦα ‐コンバーターゼ。１３．哺乳動物がブタである、請求項１１に記載の実質的に純粋なＴＮＦα ‐コンバーターゼ。１４．図１に示されたアミノ酸配列（配列番号２）を有する、実質的に純粋なＴＮＦα‐コンバーターゼ。１５．異種タンパク質またはペプチド配列と結合されたＴＮＦα‐コンバーターゼを含んでなる、融合タンパク質。１６．生物活性ＴＮＦα‐コンバーターゼの産生に導く条件下で請求項９に記載された宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＮＦα‐コンバーターゼを回収することを含む、組換えＴＮＦα‐コンバーターゼの単離方法。１７．請求項１６に記載された方法により作製された、組換えＴＮＦα‐コンバーターゼ。１８．ＴＮＦα‐コンバーターゼと結合しうる化合物の単離法であって、（ａ）固相マトリックスへの接合によりＴＮＦα‐コンバーターゼまたはその一部を固定させ、（ｂ）固定されたＴＮＦα‐コンバーターゼに化合物を結合させる条件下で、（ａ）のＴＮＦα‐コンバーターゼ‐固相マトリックス複合体を、化合物を含んだ物質と接触させ、（ｃ）固相マトリックスから未結合物質を除去し、（ｄ）ＴＮＦα‐コンバーターゼと結合した化合物の存在を検出し、（ｅ）結合した化合物をＴＮＦα‐コンバーターゼから溶出させ、および（ｆ）溶出した化合物を集める、ことを含む方法。１９．請求項１８に記載された方法により単離された、ＴＮＦα‐コンバーターゼと結合できる化合物。２０．ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性を阻害する、請求項１９に記載の化合物。２１．ＴＮＦα‐コンバーターゼの作製法であって、（ａ）請求項１に記載されたＤＮＡ配列（配列番号１）を含んだ組換えＤＮＡ発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、（ｂ）ＤＮＡ配列の発現およびＴＮＦα‐コンバーターゼの産生に導く条件下において培地で工程（ａ）の細胞を培養し、および（ｃ）ＴＮＦα‐コンバーターゼを単離することを含む方法。２２．ＴＮＦα‐コンバーターゼが（ａ）ＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体を形成するような、インヒビター‐ビオチン部分へのＴＮＦα‐コンバーターゼの結合に導く条件下で、ビオチン部分を更に含んだＴＮＦα‐コンバーターゼインヒビターとＴＮＦα‐コンバーターゼを接触させ、（ｂ）ストレプトアビジンへのＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体の結合に導く条件下で、（ａ）のＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体を固相マトリックスに結合されたストレプトアビジンと接触させ、（ｃ）未結合物質を除去し、および（ｄ）ＴＮＦα‐コンバーターゼ‐インヒビター‐ビオチン複合体をストレプトアビジンから溶出させるか、またはＴＮＦα‐コンバーターゼをインヒビター ‐ビオチン複合体から溶出させることにより単離される、請求項２１に記載の方法。２３．哺乳動物被治療体でＴＮＦαのレベルを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性を調節するそれらの能力について化合物を試験することを含む方法。２４．ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性が、ＴＮＦα前駆体、ＴＮＦα または合成基質への検出可能な結合、ＴＮＦα前駆体から成熟ＴＮＦαへの変換、および合成基質の開裂からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。２５．哺乳動物被治療体の血清または組織で高レベルのＴＮＦαにより特徴付けられる疾患または症状の治療方法であって、上記治療の必要な哺乳動物被治療体に、ＴＮＦα‐コンバーターゼの生物活性を調節する化合物の有効量を投与することを含む方法。２６．疾患または症状が、全身性炎症応答症候群、再潅流損傷、心血管疾患、感染疾患、産科障害、婦人科障害、炎症疾患、自己免疫、アレルギー疾患、アトピー疾患、悪性疾患、移植合併症からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。２７．疾患または症状が、敗血症性ショック、悪液質、エイズ、移植片対宿主疾患、大脳マラリア、クローン病、糖尿病、炎症性腸疾患、骨粗鬆症、再狭窄、乾癬、梗塞、リウマチ様関節炎、黄斑変性、骨関節炎および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。２８．疾患または症状が虚血現象に起因する梗塞である、請求項２５に記載の方法。２９．ＴＮＦα‐コンバーターゼを阻害する化合物と薬学上許容されるキャリアとを含んでなる、医薬組成物。３０．ＴＮＦα‐コンバーターゼコード配列の一部と相補的なアンチセンス配列をコードして、細胞でＴＮＦα‐コンバーターゼコード配列の転写または翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチド。３１．図１に示されたアミノ酸配列（配列番号１）を有するＴＮＦα‐コンバーターゼまたはその一部と、ＴＮＦα‐コンバーターゼの活性を調節しうる治療剤とを含んでなる、複合剤。３２．図８に示された化学構造を有する、ＴＮＦα‐コンバーターゼのインヒビター。３３．Ｒがビオチン部分を含んでいる、請求項３２に記載のインヒビター。３４．Ｒが‐（ＣＨ₂）_n‐ビオチン（ｎ＝０〜１０）、‐（ＣＨ₂）_n‐イミノビオチン（ｎ＝０〜１０）、‐（ＣＨ₂）_n‐Ｓ‐Ｓ‐（ＣＨ₂）_n‐ビオチン（ｎ＝０〜１０）および‐（ＣＨ₂）_n‐Ｓ‐Ｓ‐（ＣＨ₂）_n‐イミノビオチン（ｎ＝０〜１０）からなる群より選択される、請求項３３に記載のインヒビター。３５．ＴＮＦα‐コンバーターゼ複合体を形成するようなＴＮＦα‐コンバーターゼのインヒビターへの結合を導く条件下で、ＴＮＦα‐コンバーターゼを含んだ調製物を請求項３２に記載されたインヒビターと接触させ、ＴＮＦα‐コンバーターゼ複合体を単離することを含む、ＴＮＦα‐コンバーターゼの単離方法。