JP3268777B2 - セリンプロテアーゼをコードするｄｎａ―配列とその関連対象物 - Google Patents
セリンプロテアーゼをコードするｄｎａ―配列とその関連対象物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、中性好性の顆粒球のアズール好性顆粒中及
び単球の細胞質顆粒中に局在する１種の自己抗原（プロ
テイナーゼ３）に関する。プロテイナーゼ３（PR−３）
は所謂抗細胞質抗体（ACPA、“anti−neutrophil cytop
lasm antibodies"＝ANCA又は“cytoplasmic pattern"AN
CA＝Ｃ−ANCAと同義語）の目標抗原であり、ウェゲネル
肉芽腫症（WG）に対して高い特異性を有する。更にその
抗体価の高さと病気の活性との間には密接な関係があ
る。WGは初期血管炎の同型団に属し、非常に変わり易い
病状を呈するのでその診断と治療に就いて種々の専門分
野の研究の対象になっている。従ってACPAの検出又は定
量はWGの診断決定とその経過の検査との両方にとって大
きな意義がある（Ｎlle et al.,Ann.Int.Med.111（19
89）28−40参照）。
び単球の細胞質顆粒中に局在する１種の自己抗原（プロ
テイナーゼ３）に関する。プロテイナーゼ３（PR−３）
は所謂抗細胞質抗体（ACPA、“anti−neutrophil cytop
lasm antibodies"＝ANCA又は“cytoplasmic pattern"AN
CA＝Ｃ−ANCAと同義語）の目標抗原であり、ウェゲネル
肉芽腫症（WG）に対して高い特異性を有する。更にその
抗体価の高さと病気の活性との間には密接な関係があ
る。WGは初期血管炎の同型団に属し、非常に変わり易い
病状を呈するのでその診断と治療に就いて種々の専門分
野の研究の対象になっている。従ってACPAの検出又は定
量はWGの診断決定とその経過の検査との両方にとって大
きな意義がある（Ｎlle et al.,Ann.Int.Med.111（19
89）28−40参照）。
プロテイナーゼ３は既に、健康な給血者のヒト顆粒球
から、患者の血清からの免疫グロブリンを用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーによりかなりの量精製され
た（Ｌdemann et al.,J.Exp.Med.,171（1990）357−3
62参照）。この従来技術では精製されたプロテイナーゼ
３に就いてエドマン分解法によりＮ末端の配列決定も行
われた。
から、患者の血清からの免疫グロブリンを用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーによりかなりの量精製され
た（Ｌdemann et al.,J.Exp.Med.,171（1990）357−3
62参照）。この従来技術では精製されたプロテイナーゼ
３に就いてエドマン分解法によりＮ末端の配列決定も行
われた。
しかし一方では精密な診断又は治療のために、他方で
は治療法改善の見地からの修飾のために更に大量のプロ
テイナーゼ３の取得が要望されている。
は治療法改善の見地からの修飾のために更に大量のプロ
テイナーゼ３の取得が要望されている。
本発明によれば、（読みの方向に於いて） （ａ）場合によってはセリンプロテアーゼの１個のシグ
ナルペプチドをコードする複数のコドン、 （ｂ）場合によってはセリンプロテアーゼの１個のプロ
ペプチドをコードする２個のコドン、及び （ｃ）プロセッシングしたセリンプロテアーゼをコード
する図３に示した299個のコドン（１〜299）を特徴と
し、この（ｃ）の特徴に於いて、 − 図３の１から10又は20までのコドンを他のコドンと
交換することができ、及び／又は − １から10又は20までのコドンが欠けているか或いは
付加することができる ことを特徴とする１個のsDNA（一重鎖DNA）を提供す
る。
ナルペプチドをコードする複数のコドン、 （ｂ）場合によってはセリンプロテアーゼの１個のプロ
ペプチドをコードする２個のコドン、及び （ｃ）プロセッシングしたセリンプロテアーゼをコード
する図３に示した299個のコドン（１〜299）を特徴と
し、この（ｃ）の特徴に於いて、 − 図３の１から10又は20までのコドンを他のコドンと
交換することができ、及び／又は − １から10又は20までのコドンが欠けているか或いは
付加することができる ことを特徴とする１個のsDNA（一重鎖DNA）を提供す
る。
本発明のsDNAでは、前記特徴（ｃ）に於いてプロセッ
シングしたセリンプロテアーゼをコードする5'末端に１
から10又は20までのコドンが欠けているか或いは付加す
ることができる。
シングしたセリンプロテアーゼをコードする5'末端に１
から10又は20までのコドンが欠けているか或いは付加す
ることができる。
本発明のsDNAでは、前記シグナルペプチド（−８から
−３まで）をコードするコドンに於いて、これが図３に
示したコドン又は5'末端から１個または数個のコドンだ
け短くなったDNA−配列に関するものであることを特徴
とすることができる。
−３まで）をコードするコドンに於いて、これが図３に
示したコドン又は5'末端から１個または数個のコドンだ
け短くなったDNA−配列に関するものであることを特徴
とすることができる。
本発明のsDNAでは、セリンプロテアーゼの１個のプロ
ペプチドをコードする前記の２個のコドンに於いて、こ
れが図３のアミノ酸配列の位置−２から−１に相当する
コドンに関するものでもよい。
ペプチドをコードする前記の２個のコドンに於いて、こ
れが図３のアミノ酸配列の位置−２から−１に相当する
コドンに関するものでもよい。
本発明のsDNAに於いて、図３の１個又は複数のコドン
が、同じアミノ酸をコードするコドンによって置き換え
られていてもよい。
が、同じアミノ酸をコードするコドンによって置き換え
られていてもよい。
本発明は更に、１個のcDNA（相補的DNA）を提供す
る。これは１個の相補的一重鎖を補足した本発明のsDNA
に関するものである。
る。これは１個の相補的一重鎖を補足した本発明のsDNA
に関するものである。
本発明の一つの実施態様は、微生物、特に大腸菌、例
えばpGEX−2T（Pharmacia）の中にセリンプロテアーゼ
を発現するための発現ベクターに関し、この発現ベクタ
ーは本発明の１個のcDNAを特徴とする。
えばpGEX−2T（Pharmacia）の中にセリンプロテアーゼ
を発現するための発現ベクターに関し、この発現ベクタ
ーは本発明の１個のcDNAを特徴とする。
本発明のその他の実施態様は、本発明の発現ベクター
を含む微生物、特に大腸菌、並びに本発明の１個のcDNA
を特徴とする、セリンプロテアーゼを発現するための真
核細胞系に関する。
を含む微生物、特に大腸菌、並びに本発明の１個のcDNA
を特徴とする、セリンプロテアーゼを発現するための真
核細胞系に関する。
最後に本発明は、１種の本発明の微生物又は１種の本
発明の真核細胞系を用いて発現し、プロセッシングした
セリンプロテアーゼに関する。
発明の真核細胞系を用いて発現し、プロセッシングした
セリンプロテアーゼに関する。
次に前述の本発明の実施態様を図面により詳細に説明
する。ここで、 図１はPCR（Polymerase chain reaction）−生産物、 図２はプロテイナーゼ３（PR−３）のヌクレオチド配列
及びアミノ酸配列、 図３はプロテイナーゼ３をコードするcDNAのヌクレオチ
ド塩基配列とそれから導かれたタンパク質配列、 図４はPCR−生産物である。
する。ここで、 図１はPCR（Polymerase chain reaction）−生産物、 図２はプロテイナーゼ３（PR−３）のヌクレオチド配列
及びアミノ酸配列、 図３はプロテイナーゼ３をコードするcDNAのヌクレオチ
ド塩基配列とそれから導かれたタンパク質配列、 図４はPCR−生産物である。
本発明の基をなす研究において、最初の21個のＮ末端
のアミノ酸を、既に従来技術のcDNA配列から導かれた公
開されたアミノ酸配列と比較したが、その際、プロテイ
ナーゼ３はセリンプロテアーゼのグループに属し、又プ
ロテイナーゼ３は確かに一つのcDNA配列から導かれた骨
髄芽球配列（Bories et al.,Cell,59（1989）959−96
8）によく似ているが、Ｎ末端ではこの骨髄芽球の公知
の配列とは明らかに異なっていることが判明した。
のアミノ酸を、既に従来技術のcDNA配列から導かれた公
開されたアミノ酸配列と比較したが、その際、プロテイ
ナーゼ３はセリンプロテアーゼのグループに属し、又プ
ロテイナーゼ３は確かに一つのcDNA配列から導かれた骨
髄芽球配列（Bories et al.,Cell,59（1989）959−96
8）によく似ているが、Ｎ末端ではこの骨髄芽球の公知
の配列とは明らかに異なっていることが判明した。
特に本発明の基をなす研究の際に、骨髄芽球の最初の
７個のアミノ酸が、プロテイナーゼ３の本発明により決
定したアミノ酸残基15乃至21と一致していることが注目
された。更に骨髄芽球−cDNA−配列のコードしない5'末
端の公開された66個のヌクレオチド塩基がウェゲネルの
自己抗原の最初の14個のアミノ酸に対する遺伝情報を示
さないことが本発明により確認された。この理由から本
発明の基をなす研究の際に、位置−66から＋44迄の5'−
cDNA−部位（Bories et al.,Cell,59（1989）959−968
参照）をPCR−技術を用いて分析した。２個のオリゴヌ
クレオチドとTAQ−DNA−ポリメラーゼとを使用して112
個のヌクレオチド塩基の長さのｃ−DNA−断片をU937−
ｃ−DNAの全体から取り出して増幅し、M13mp18の中での
サブクローニング後に配列を決定した。こうして得られ
た5'−部位のcDNA−配列はプロテイナーゼ３のＮ末端を
コードする（図２）、 本発明により得られた5'−部位のcDNA−配列は、二つ
の位置で骨髄芽球のcDNA−配列とは異なっている（図
２）。位置45と62にはそれぞれ１個のＧがあるが、これ
が骨髄芽球−cDNA−配列では欠けており、そのため5'−
cDNA−部位の中の開いた読み枠が変化する。この新しい
読み枠はヌクレオチド塩基配列の第一の塩基に達し、プ
ロテナーゼ３のプロセッシングした、分泌した形態に対
する完全な遺伝情報の他に、タンパク質前駆体の粗面小
胞体へのトランスロケーションの際にタンパク質分解に
より除去されるシグナルペプチドの一部に対する遺伝情
報、細胞質顆粒への細胞内輸送の際に分割される、２個
のアミノ酸の長さの１個のプロペプチド、及び活性の分
泌可能の形態に於ける本酵素の機能的に重要なＮ末端に
対する遺伝情報を含有する。このアミノ酸配列決定によ
り得られた位置１乃至21のPR−３−配列と、ｃ−DNA−
配列より導かれたアミノ酸配列との比較から、本発明に
より5'−部位に就いて決定されたcDNA−配列（位置21か
ら91まで、図２参照）と骨髄芽球に対して公開されたcD
NA−配列のヌクレオチド＋25以降（Bories et al.,Cel
l,59（1989）959−968）とを組み合わせれば、プロテイ
ナーゼ３（ウェゲネルの自己抗原）に対する遺伝情報が
正しく再現されることが明らかになる（図３）。
７個のアミノ酸が、プロテイナーゼ３の本発明により決
定したアミノ酸残基15乃至21と一致していることが注目
された。更に骨髄芽球−cDNA−配列のコードしない5'末
端の公開された66個のヌクレオチド塩基がウェゲネルの
自己抗原の最初の14個のアミノ酸に対する遺伝情報を示
さないことが本発明により確認された。この理由から本
発明の基をなす研究の際に、位置−66から＋44迄の5'−
cDNA−部位（Bories et al.,Cell,59（1989）959−968
参照）をPCR−技術を用いて分析した。２個のオリゴヌ
クレオチドとTAQ−DNA−ポリメラーゼとを使用して112
個のヌクレオチド塩基の長さのｃ−DNA−断片をU937−
ｃ−DNAの全体から取り出して増幅し、M13mp18の中での
サブクローニング後に配列を決定した。こうして得られ
た5'−部位のcDNA−配列はプロテイナーゼ３のＮ末端を
コードする（図２）、 本発明により得られた5'−部位のcDNA−配列は、二つ
の位置で骨髄芽球のcDNA−配列とは異なっている（図
２）。位置45と62にはそれぞれ１個のＧがあるが、これ
が骨髄芽球−cDNA−配列では欠けており、そのため5'−
cDNA−部位の中の開いた読み枠が変化する。この新しい
読み枠はヌクレオチド塩基配列の第一の塩基に達し、プ
ロテナーゼ３のプロセッシングした、分泌した形態に対
する完全な遺伝情報の他に、タンパク質前駆体の粗面小
胞体へのトランスロケーションの際にタンパク質分解に
より除去されるシグナルペプチドの一部に対する遺伝情
報、細胞質顆粒への細胞内輸送の際に分割される、２個
のアミノ酸の長さの１個のプロペプチド、及び活性の分
泌可能の形態に於ける本酵素の機能的に重要なＮ末端に
対する遺伝情報を含有する。このアミノ酸配列決定によ
り得られた位置１乃至21のPR−３−配列と、ｃ−DNA−
配列より導かれたアミノ酸配列との比較から、本発明に
より5'−部位に就いて決定されたcDNA−配列（位置21か
ら91まで、図２参照）と骨髄芽球に対して公開されたcD
NA−配列のヌクレオチド＋25以降（Bories et al.,Cel
l,59（1989）959−968）とを組み合わせれば、プロテイ
ナーゼ３（ウェゲネルの自己抗原）に対する遺伝情報が
正しく再現されることが明らかになる（図３）。
プロテイナーゼ３に対する完全なcDNA−配列の記述に
より、今やPCR−技術を用いて、プロテイナーゼ３を完
全にコードするcDNAをU937−cDNAからオリゴヌクレオチ
ドプライマーJT88とJT90（5'−CCGAATTC GAGGGTTTGGAGC
CAGGCTC−3'）とを使用いて増幅し（図３）、細菌のベ
クター中でクローニングすることが可能である。5'−cD
NA−末端を適切な変異誘発により修飾した後で、本酵素
の前駆体の形態及び活性の形態を組み換えた形で量に制
限なく生産し、科学的研究並びに生医学的応用に役立て
ることができる。更にプロテイナーゼ３の断片を単独に
又は他のタンパク質を含む形で、組み換えにより生産す
ることができる。
より、今やPCR−技術を用いて、プロテイナーゼ３を完
全にコードするcDNAをU937−cDNAからオリゴヌクレオチ
ドプライマーJT88とJT90（5'−CCGAATTC GAGGGTTTGGAGC
CAGGCTC−3'）とを使用いて増幅し（図３）、細菌のベ
クター中でクローニングすることが可能である。5'−cD
NA−末端を適切な変異誘発により修飾した後で、本酵素
の前駆体の形態及び活性の形態を組み換えた形で量に制
限なく生産し、科学的研究並びに生医学的応用に役立て
ることができる。更にプロテイナーゼ３の断片を単独に
又は他のタンパク質を含む形で、組み換えにより生産す
ることができる。
最後に本発明のその他の実施態様は、抗体、特にウェ
ゲネル肉芽腫症に於ける抗体の取得及び／又は測定、又
はウェゲネル肉芽腫症又は自己免疫反応に於ける経口又
は腸管外の抗原治療に対する本発明のセリンプロテアー
ゼの応用に関し、これはセリンプロテアーゼに対する自
己抗体生成を特徴とする。
ゲネル肉芽腫症に於ける抗体の取得及び／又は測定、又
はウェゲネル肉芽腫症又は自己免疫反応に於ける経口又
は腸管外の抗原治療に対する本発明のセリンプロテアー
ゼの応用に関し、これはセリンプロテアーゼに対する自
己抗体生成を特徴とする。
本発明の上記の実施態様に対して次の点が重要であ
る。プロテイナーゼ３は中性好性の顆粒球のアズール好
性の（従って一次の）顆粒及び単球の細胞質顆粒の中に
蓄積される。しかしmRNAの翻訳とPR−３の生産は主とし
て単球と顆粒球との前段階で行われる。プロテイナーゼ
３は白血球エラスターゼ、カテプシンＧ及びその他の一
連の酵素と共に，顆粒球の刺激の後で例えば免疫複合
物、走化性因子又は細菌の成分により細胞周辺環境に放
出される。酸素ラジカルの生成、更に又中性のプロテア
ーゼの作用は組織の破壊と細胞外マトリックスの異化作
用とを引き起こす。コラーゲナーゼ、ゼラチナーゼ、カ
テプシンＧ、白血球エラスターゼ及びプロテイナーゼ３
は、細胞外マトリックスの重要な成分、コラーゲン、エ
ラスチン及びプロテオグリカンを分解することができ
る。この分解は中性好性の顆粒球のごく近くの細胞周辺
環境で行われるが、一方顆粒球プロテアーゼの有害な遠
隔作用はプラズマインヒビターにより有効に阻止され
る。α−１−プロテアーゼインヒビターによる白血球エ
ラスターゼ及びプロテイナーゼ３の不活性化は膜の近く
では行われない。これはα−１−プロテアーゼインヒビ
ターが酸素ラジカルにより失活するためであることはま
ず間違いない。動物実験に於いて、0.1mgのプロテイナ
ーゼ３をただ１回気管内に注入した後で10週間の間にそ
の動物の肺に明瞭な広汎性の水疱性肺気腫の生成が認め
られた。Kao et al.,J.Clin.Invest.,82（1988）1963−
1973参照。PR−３のこの影響は白血球エラスターゼの作
用より重大である。その他の数多くの研究の結果、白血
球のエラスチン分解活性が肺気腫、急性肺ショック症
候、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、敗血症、その他の
炎症性疾患に於いて一つの重要な病原性因子であるとい
う結論はまず間違いないと思われる。このような病状に
於ける中性好性の顆粒球からのプロテイナーゼ３の遊離
は、血漿及びその他の生物学的体液、例えば関節浸出物
中のPR−３又はPR−３インヒビター複合物の濃度の測定
によって判断することができる。こうして患者の炎症性
反応の強度が測定でき、今後の抗酵素療法に対する指標
を得ることができよう。
る。プロテイナーゼ３は中性好性の顆粒球のアズール好
性の（従って一次の）顆粒及び単球の細胞質顆粒の中に
蓄積される。しかしmRNAの翻訳とPR−３の生産は主とし
て単球と顆粒球との前段階で行われる。プロテイナーゼ
３は白血球エラスターゼ、カテプシンＧ及びその他の一
連の酵素と共に，顆粒球の刺激の後で例えば免疫複合
物、走化性因子又は細菌の成分により細胞周辺環境に放
出される。酸素ラジカルの生成、更に又中性のプロテア
ーゼの作用は組織の破壊と細胞外マトリックスの異化作
用とを引き起こす。コラーゲナーゼ、ゼラチナーゼ、カ
テプシンＧ、白血球エラスターゼ及びプロテイナーゼ３
は、細胞外マトリックスの重要な成分、コラーゲン、エ
ラスチン及びプロテオグリカンを分解することができ
る。この分解は中性好性の顆粒球のごく近くの細胞周辺
環境で行われるが、一方顆粒球プロテアーゼの有害な遠
隔作用はプラズマインヒビターにより有効に阻止され
る。α−１−プロテアーゼインヒビターによる白血球エ
ラスターゼ及びプロテイナーゼ３の不活性化は膜の近く
では行われない。これはα−１−プロテアーゼインヒビ
ターが酸素ラジカルにより失活するためであることはま
ず間違いない。動物実験に於いて、0.1mgのプロテイナ
ーゼ３をただ１回気管内に注入した後で10週間の間にそ
の動物の肺に明瞭な広汎性の水疱性肺気腫の生成が認め
られた。Kao et al.,J.Clin.Invest.,82（1988）1963−
1973参照。PR−３のこの影響は白血球エラスターゼの作
用より重大である。その他の数多くの研究の結果、白血
球のエラスチン分解活性が肺気腫、急性肺ショック症
候、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、敗血症、その他の
炎症性疾患に於いて一つの重要な病原性因子であるとい
う結論はまず間違いないと思われる。このような病状に
於ける中性好性の顆粒球からのプロテイナーゼ３の遊離
は、血漿及びその他の生物学的体液、例えば関節浸出物
中のPR−３又はPR−３インヒビター複合物の濃度の測定
によって判断することができる。こうして患者の炎症性
反応の強度が測定でき、今後の抗酵素療法に対する指標
を得ることができよう。
実施例１ プロテイナーゼ３の精製、生化学的特性とＮ末端の配列
決定 ａ） ウェゲネル肉芽腫症患者の血清からのプロテイナ
ーゼ３特異性自己抗体の分離とアフィニティーカラムの
作製 他の自己抗体の場合の手法と同じように、ACPA−抗原
の精製に患者の血清からの自己抗体を使用した。それに
は、間接蛍光抗体法に於いて典型的なACPAの模様を示し
たが他の自己抗体は検出されなかった患者の血清を選
び、この血清60mからの免疫グロプリンを硫安沈殿
（最終濃度33％飽和）により濃縮した。沈澱した免疫グ
ロブリンをPBS（リン酸緩衝溶液）を用いて透析し、メ
ーカーの説明書に従って5mgタンパク質/mゲルによりC
NBr−活性化セファロース4B（Pharmacia）に固定した。
残った活性の結合箇所は0.2Mのグリシン（pH8）により
ブロックした。続いてこのゲルをカップリング緩衝液
（炭酸水素ナトリウム0.1M、NaCl 0.5M、pH8.3）と酢酸
緩衝液0.1M（NaCl 0.5M、pH4）とにより交互に５回洗浄
し、更にアジ化ナトリウム0.02％を加えたPBSによりす
すいだ。この親和性ゲルの60mを400×16mmのカラムに
充填し、４℃に保持した。
決定 ａ） ウェゲネル肉芽腫症患者の血清からのプロテイナ
ーゼ３特異性自己抗体の分離とアフィニティーカラムの
作製 他の自己抗体の場合の手法と同じように、ACPA−抗原
の精製に患者の血清からの自己抗体を使用した。それに
は、間接蛍光抗体法に於いて典型的なACPAの模様を示し
たが他の自己抗体は検出されなかった患者の血清を選
び、この血清60mからの免疫グロプリンを硫安沈殿
（最終濃度33％飽和）により濃縮した。沈澱した免疫グ
ロブリンをPBS（リン酸緩衝溶液）を用いて透析し、メ
ーカーの説明書に従って5mgタンパク質/mゲルによりC
NBr−活性化セファロース4B（Pharmacia）に固定した。
残った活性の結合箇所は0.2Mのグリシン（pH8）により
ブロックした。続いてこのゲルをカップリング緩衝液
（炭酸水素ナトリウム0.1M、NaCl 0.5M、pH8.3）と酢酸
緩衝液0.1M（NaCl 0.5M、pH4）とにより交互に５回洗浄
し、更にアジ化ナトリウム0.02％を加えたPBSによりす
すいだ。この親和性ゲルの60mを400×16mmのカラムに
充填し、４℃に保持した。
ｂ） プロテイナーゼ３のアフィニティー精製 顆粒球を健康な給血者の血液から分離し（Ｌdemann
et al.,J.Immunol.Methods 114,167−174,1988）、塩
化マグネシウム0.5mMと塩化カルシウム0.9mMとを加えた
PBSにより４×106細胞/mに調節した。次に顆粒球を、
脱顆粒を誘発するために、ホルボールミリステートアセ
テート（Sigma）１μg/mにより37℃で30分刺激した。
500xgで遠心して細胞を分離し、遊離したACPA抗原を含
む脱顆粒の上清を無菌濾過により浄化した。
et al.,J.Immunol.Methods 114,167−174,1988）、塩
化マグネシウム0.5mMと塩化カルシウム0.9mMとを加えた
PBSにより４×106細胞/mに調節した。次に顆粒球を、
脱顆粒を誘発するために、ホルボールミリステートアセ
テート（Sigma）１μg/mにより37℃で30分刺激した。
500xgで遠心して細胞を分離し、遊離したACPA抗原を含
む脱顆粒の上清を無菌濾過により浄化した。
ACPA抗原を精製するため、10倍に濃縮した脱顆粒の上
清30mを送液速度20m/hでアフィニティーカラムに３
回通した。RBS（カラム容積の約20倍）で洗浄後、結合
した抗原をpH6乃至pH3.5の間でpH0.5単位の段階のpH−
勾配を用いて溶出した。このpH−勾配はNaCl 0.5Mを含
む酢酸ナトリウム緩衝液0.1Mを用いて作製した。抗原は
pH4.0と3.5との間で溶出し、これをアジ化ナトリウム0.
02％を加えたPBSを用いて透析した。
清30mを送液速度20m/hでアフィニティーカラムに３
回通した。RBS（カラム容積の約20倍）で洗浄後、結合
した抗原をpH6乃至pH3.5の間でpH0.5単位の段階のpH−
勾配を用いて溶出した。このpH−勾配はNaCl 0.5Mを含
む酢酸ナトリウム緩衝液0.1Mを用いて作製した。抗原は
pH4.0と3.5との間で溶出し、これをアジ化ナトリウム0.
02％を加えたPBSを用いて透析した。
ｃ） プロテイナーゼ３のＮ末端の配列決定 アフィニティー精製した抗原（PR−３）をPhastSyste
m（Pharmacia）を用いて電気泳動法により分離した。そ
れにはSDS−PAGE（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）を非還元条件で20％のアクリルアミドゲル中で実施
した。次に標準の方法（『セミドライブロッティン
グ』）によりポリ二フッ化ビニリデン膜への電気泳動転
移を行った。WG患者のACPAが陽性の血清による抗原ブロ
ット法を用いて、ACPA−目標抗原の位置を38kDの相対分
子量の範囲に局在化した。これと平行してブロット膜を
クーマシーブルーで染めて、抗原を含むバンドを切り取
った。続いてプロテイナーゼ３を直接、気相配列決定装
置の膜の上に置いてエドマン分解法によりそのＮ末端の
配列を決定した。その際次の21個のＮ末端のアミノ酸が
得られた:I−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｓ
−Ｒ−Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｑ−Ｍ−Ｒ。
m（Pharmacia）を用いて電気泳動法により分離した。そ
れにはSDS−PAGE（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）を非還元条件で20％のアクリルアミドゲル中で実施
した。次に標準の方法（『セミドライブロッティン
グ』）によりポリ二フッ化ビニリデン膜への電気泳動転
移を行った。WG患者のACPAが陽性の血清による抗原ブロ
ット法を用いて、ACPA−目標抗原の位置を38kDの相対分
子量の範囲に局在化した。これと平行してブロット膜を
クーマシーブルーで染めて、抗原を含むバンドを切り取
った。続いてプロテイナーゼ３を直接、気相配列決定装
置の膜の上に置いてエドマン分解法によりそのＮ末端の
配列を決定した。その際次の21個のＮ末端のアミノ酸が
得られた:I−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｑ−Ｐ−Ｈ−Ｓ
−Ｒ−Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｑ−Ｍ−Ｒ。
ｄ） 精製したプロテイナーゼ３の生物学的活性 プロテイナーゼ３の酵素活性を検討するために、先ず
比較的非特異性の基質であるα−酢酸ナフチルを用い、
その際遊離するα−ナフトールを分光光度計により520n
mで測定した。この基質の場合最適なpHの範囲は6.75と
7.25との間であり、これはPR−３が中性のプロテアーゼ
であることを裏付ける。PR−３の酵素活性を、セリンプ
ロテアーゼに対して特異性を有するインヒビター、ジイ
ソプロピルフルオロリン酸とフェニルメチルスルホニル
フルオリドとによって阻止することができた。誘導され
たアミノ酸配列から判るように、更に典型的な三つの組
触媒を形成するアミノ酸（His−44,Asp−91,Ser−176）
が存在する。ヒト白血球エラスターゼ（HLE）（Suc−Al
a−Ala−Ala−pNA,Suc−Ala−Ala−Val−pNA,MeO−Suc
−Ala−Ala−Pro−Val−pNA）、カテプシンＧ（Suc−Al
a−Ala−Pro−Phe−pNA）、及びトリプシン（Tosyl−Ar
g−Me−thylester）に対して特異性のあるペプチド基質
はPR−３によっては分割されない。この点から、PR−３
標品が公知の顆粒球プロテアーゼの混入物を含まず、又
プロテイナーゼ３が新しい中性のセリンプロテアーゼで
あることが確認される。
比較的非特異性の基質であるα−酢酸ナフチルを用い、
その際遊離するα−ナフトールを分光光度計により520n
mで測定した。この基質の場合最適なpHの範囲は6.75と
7.25との間であり、これはPR−３が中性のプロテアーゼ
であることを裏付ける。PR−３の酵素活性を、セリンプ
ロテアーゼに対して特異性を有するインヒビター、ジイ
ソプロピルフルオロリン酸とフェニルメチルスルホニル
フルオリドとによって阻止することができた。誘導され
たアミノ酸配列から判るように、更に典型的な三つの組
触媒を形成するアミノ酸（His−44,Asp−91,Ser−176）
が存在する。ヒト白血球エラスターゼ（HLE）（Suc−Al
a−Ala−Ala−pNA,Suc−Ala−Ala−Val−pNA,MeO−Suc
−Ala−Ala−Pro−Val−pNA）、カテプシンＧ（Suc−Al
a−Ala−Pro−Phe−pNA）、及びトリプシン（Tosyl−Ar
g−Me−thylester）に対して特異性のあるペプチド基質
はPR−３によっては分割されない。この点から、PR−３
標品が公知の顆粒球プロテアーゼの混入物を含まず、又
プロテイナーゼ３が新しい中性のセリンプロテアーゼで
あることが確認される。
PR−３が生物学的に重要な基質であるエラスチンを分
割できるかどうかを調べるため、又その際に尚存在して
いるかもしれない痕跡の不純物を除くために、PR−３を
前述のようにSDS−PAGEにより非還元性条件で分離し
た。次に電気泳動ゲルを、メーカーの説明書通りに蛍光
標識を付けた微粉末のエラスチン（Elastin Products C
ompany）を注いだアガロースプレートの上に直接置い
た。37℃で16時間のインキュベート期間後にプロテイナ
ーゼ３のバンドの範囲でエラスチン粒子の著しい分解が
見られた。即ちプロテイナーゼ３はエラスチン分解活性
を有する。
割できるかどうかを調べるため、又その際に尚存在して
いるかもしれない痕跡の不純物を除くために、PR−３を
前述のようにSDS−PAGEにより非還元性条件で分離し
た。次に電気泳動ゲルを、メーカーの説明書通りに蛍光
標識を付けた微粉末のエラスチン（Elastin Products C
ompany）を注いだアガロースプレートの上に直接置い
た。37℃で16時間のインキュベート期間後にプロテイナ
ーゼ３のバンドの範囲でエラスチン粒子の著しい分解が
見られた。即ちプロテイナーゼ３はエラスチン分解活性
を有する。
プロテイナーゼ３のエラスチン分解活性に対する酵素
インヒビターの影響を調べるために、エラスチンプレー
トに孔をあけ、ここにインヒビター付き又はインヒビタ
ーなしのPR−３を充填し、前述のようにインキュベート
した。エラスチンの分割は孔の周囲の溶解ゾーンとして
認められ、溶解ゾーンの面積の測定から分割の程度を大
まかに定量できる。生物学的に重要なヒトの酵素インヒ
ビターα−１−プロテアーゼインヒビターをPR−３に添
加した所、PR−３のエラスチン分解活性が完全に阻止さ
れた。PR−３に対する自己抗体（ACPA）の作用を同じよ
うな方法で検討した。血清のプロテアーゼインヒビター
の干渉を防ぐために、タンパク質Ｇ−クロマトグラフィ
ーを用いて免疫グロブリン（IgG）−分画を患者の血清
から分離し、この患者のIgGをPR−３と共に室温で１時
間インキュベートした。続いて反応混合物をエラスチン
プレートに満たした。ウェゲネル肉芽腫症患者の殆ど全
ての場合その免疫グロブリンはプロテイナーゼ３のエラ
スチン分解活性を阻止した。
インヒビターの影響を調べるために、エラスチンプレー
トに孔をあけ、ここにインヒビター付き又はインヒビタ
ーなしのPR−３を充填し、前述のようにインキュベート
した。エラスチンの分割は孔の周囲の溶解ゾーンとして
認められ、溶解ゾーンの面積の測定から分割の程度を大
まかに定量できる。生物学的に重要なヒトの酵素インヒ
ビターα−１−プロテアーゼインヒビターをPR−３に添
加した所、PR−３のエラスチン分解活性が完全に阻止さ
れた。PR−３に対する自己抗体（ACPA）の作用を同じよ
うな方法で検討した。血清のプロテアーゼインヒビター
の干渉を防ぐために、タンパク質Ｇ−クロマトグラフィ
ーを用いて免疫グロブリン（IgG）−分画を患者の血清
から分離し、この患者のIgGをPR−３と共に室温で１時
間インキュベートした。続いて反応混合物をエラスチン
プレートに満たした。ウェゲネル肉芽腫症患者の殆ど全
ての場合その免疫グロブリンはプロテイナーゼ３のエラ
スチン分解活性を阻止した。
実施例２ ａ） ポリメラーゼ連鎖反応用の合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーの作製 プロテイナーゼ３のcDNA−配列が骨髄芽球の公知のcD
NA−配列（Bories et al.,Cell 59,959−968,1989）に
非常によく似ているが、幾つかの位置で相違していると
いう前提のもとに、先ず骨髄芽球の5'−cDNA−配列を精
密に分析に、これを両方のオリゴヌクレオチドJT85及び
JT88並びに熱安定性TAQ−DNA−ポリメラーゼを用いてU9
37−細胞系統の全相補的DNAから増幅した。オリゴヌク
レオチドJT88（28mer）は配列5'−CCGAATTC TGAGCGGTGC
TGCCCGAGCT−3'を有し、９番目の塩基以降が骨髄芽球の
配列の位置−66乃至−47と同一である（Bories et al.,
Cell 59,959−968,1989）。JT85の方は配列5'−CCGAATT
CAGAAGTGGCTGCCCGGGTT−3'を有し、８番目の塩基以降が
骨髄芽球のcDNA−配列の位置＋25乃至＋44の相補的塩基
鎖と同一である。オリゴヌクレオチドJT90は配列5'−CC
GAATTC GAGGGTTTGGAGCCAGGCTC−3'を有し、９番目の塩
基以降がPR−３−cDNA−配列（図３）の位置749乃至768
の相補的塩基鎖と同一である。5'−末端に追加された７
又は８個のヌクレオチド塩基はEco R I−制限部位を含
んでおり、制限酵素Eco R Iによる消化後の増幅したcDN
Aのサブクローニングを容易にする。
ドプライマーの作製 プロテイナーゼ３のcDNA−配列が骨髄芽球の公知のcD
NA−配列（Bories et al.,Cell 59,959−968,1989）に
非常によく似ているが、幾つかの位置で相違していると
いう前提のもとに、先ず骨髄芽球の5'−cDNA−配列を精
密に分析に、これを両方のオリゴヌクレオチドJT85及び
JT88並びに熱安定性TAQ−DNA−ポリメラーゼを用いてU9
37−細胞系統の全相補的DNAから増幅した。オリゴヌク
レオチドJT88（28mer）は配列5'−CCGAATTC TGAGCGGTGC
TGCCCGAGCT−3'を有し、９番目の塩基以降が骨髄芽球の
配列の位置−66乃至−47と同一である（Bories et al.,
Cell 59,959−968,1989）。JT85の方は配列5'−CCGAATT
CAGAAGTGGCTGCCCGGGTT−3'を有し、８番目の塩基以降が
骨髄芽球のcDNA−配列の位置＋25乃至＋44の相補的塩基
鎖と同一である。オリゴヌクレオチドJT90は配列5'−CC
GAATTC GAGGGTTTGGAGCCAGGCTC−3'を有し、９番目の塩
基以降がPR−３−cDNA−配列（図３）の位置749乃至768
の相補的塩基鎖と同一である。5'−末端に追加された７
又は８個のヌクレオチド塩基はEco R I−制限部位を含
んでおり、制限酵素Eco R Iによる消化後の増幅したcDN
Aのサブクローニングを容易にする。
ｂ） U937mRNAからのcDNAの合成 U937細胞からの全mRNAをStratagene社のRNA−分離用
薬品キットの説明書に従って分離し、これがオリゴ（d
T）−セルロースのアフィニティークロマトグラフィー
によりポリ（A+）−RNAを取得した。cDNAの第一の鎖
は、逆転写酵素を用いてトリの骨髄芽球腫ウイルス（AM
V）及び鎖の長さ12〜18のオリゴ（dT）−プライマーか
ら、酵素と共に納入されたBRL−社の緩衝システムの中
で合成した。鋳型−RNAをアルカリ処理により加水分解
し、次に一重鎖cDNAを精製し沈殿した。このcDNAの約20
ngをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に使用した。
薬品キットの説明書に従って分離し、これがオリゴ（d
T）−セルロースのアフィニティークロマトグラフィー
によりポリ（A+）−RNAを取得した。cDNAの第一の鎖
は、逆転写酵素を用いてトリの骨髄芽球腫ウイルス（AM
V）及び鎖の長さ12〜18のオリゴ（dT）−プライマーか
ら、酵素と共に納入されたBRL−社の緩衝システムの中
で合成した。鋳型−RNAをアルカリ処理により加水分解
し、次に一重鎖cDNAを精製し沈殿した。このcDNAの約20
ngをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に使用した。
ｃ） オリゴヌクレオチドJT85及びJT88を使用したPCR PCR−技術をPerkin−Elmer社の作業説明書に従って同
社推薦の緩衝システムを用いて実施した。デオキシヌク
レオチドの濃度はそれぞれ200μＭ、両方の合成オリゴ
ヌクレオチドの濃度は0.2μＭであった。マグネシウム
の濃度は当初1.5mM,1.7mM,1.9mMの３種類とした。次の
温度プログラムにより上記の目的を達することができ
た:93℃でDNAの変性２分間、59℃でプライマーのハイブ
リッド形成２分間、72℃で耐熱性TAQ−DNA−ポリメラー
ゼによる重合３分間。この前述の反応（１回の反応サイ
クル）を27回繰り返した。各サイクルに於いて目的のDN
A−断片の量が倍になる。得られた生産物を2Mの酢酸ア
ンモニウム中で、線状アクリルアミドの存在下で３回沈
殿して精製した。
社推薦の緩衝システムを用いて実施した。デオキシヌク
レオチドの濃度はそれぞれ200μＭ、両方の合成オリゴ
ヌクレオチドの濃度は0.2μＭであった。マグネシウム
の濃度は当初1.5mM,1.7mM,1.9mMの３種類とした。次の
温度プログラムにより上記の目的を達することができ
た:93℃でDNAの変性２分間、59℃でプライマーのハイブ
リッド形成２分間、72℃で耐熱性TAQ−DNA−ポリメラー
ゼによる重合３分間。この前述の反応（１回の反応サイ
クル）を27回繰り返した。各サイクルに於いて目的のDN
A−断片の量が倍になる。得られた生産物を2Mの酢酸ア
ンモニウム中で、線状アクリルアミドの存在下で３回沈
殿して精製した。
ｄ） オリゴヌクレオチドJT88及びJT90を使用したPCR プロテイナーゼ３のコードする部位のクローニングに
両方のオリゴヌクレオチドJT88及びJT90を使用した。反
応条件はｃ）とほぼ同様であったが、プライマーのハイ
ブリッド形成を55℃で行い、マグネシウム濃度が1.7mM
で、増幅サイクルを25回繰り返した点が異なっていた。
増幅した反応生成物は、5'−部位に追加した両方のヌク
レオチドとPCR−プライマーの両端の18個のヌクレオチ
ドを考慮すればその全体の長さは784個の塩基対である
（図４参照）。Eco R Iによる制限消化後に、PCR−生産
物をアガロースゲル電気泳動（1.2％）により分離し、
ゲルから溶出した。このcDNAを、Eco R Iで切断した脱
リン酸したベクター、M13mp18/BAP（Pharmacia）の中で
サブクローニングした。
両方のオリゴヌクレオチドJT88及びJT90を使用した。反
応条件はｃ）とほぼ同様であったが、プライマーのハイ
ブリッド形成を55℃で行い、マグネシウム濃度が1.7mM
で、増幅サイクルを25回繰り返した点が異なっていた。
増幅した反応生成物は、5'−部位に追加した両方のヌク
レオチドとPCR−プライマーの両端の18個のヌクレオチ
ドを考慮すればその全体の長さは784個の塩基対である
（図４参照）。Eco R Iによる制限消化後に、PCR−生産
物をアガロースゲル電気泳動（1.2％）により分離し、
ゲルから溶出した。このcDNAを、Eco R Iで切断した脱
リン酸したベクター、M13mp18/BAP（Pharmacia）の中で
サブクローニングした。
ｅ） cDNAの塩基配列決定 ヌクレオチドの配列はSequenase−Kit（United State
s Bio−chemical Corporation）の記載に従って決定し
た。プロテイナーゼ３の5'−末端のヌクレオチド塩基配
列（ｃ）参照）は数回、種々のクローンに於いて決定し
た。個々のcDNA−クローンに於ける不均一性又は多型性
は認められなかった（図２）。
s Bio−chemical Corporation）の記載に従って決定し
た。プロテイナーゼ３の5'−末端のヌクレオチド塩基配
列（ｃ）参照）は数回、種々のクローンに於いて決定し
た。個々のcDNA−クローンに於ける不均一性又は多型性
は認められなかった（図２）。
個々の沈殿の際に生ずる可能性のあるクローニング又
は増幅の人工産物を排除するために、現在プロテイナー
ゼ３用の完全なcDNA−挿入を備えた各種のM13−クロー
ン（仕様書ｄにより作製）の配列を、プロテイナーゼ３
配列（図３）から導いたオリゴヌクレオチドを用いて決
定中である。
は増幅の人工産物を排除するために、現在プロテイナー
ゼ３用の完全なcDNA−挿入を備えた各種のM13−クロー
ン（仕様書ｄにより作製）の配列を、プロテイナーゼ３
配列（図３）から導いたオリゴヌクレオチドを用いて決
定中である。
図１は、両方のオリゴヌクレオチドJT88及びJT90と全
U937 cDNAとを用いて種々のマグネシウム濃度（図の上
縁がmM）で増幅したPCR−生産物を示す。増幅したcDNA
−断片の長さは全体で127個の塩基対である。
U937 cDNAとを用いて種々のマグネシウム濃度（図の上
縁がmM）で増幅したPCR−生産物を示す。増幅したcDNA
−断片の長さは全体で127個の塩基対である。
図２はウェゲネル肉芽腫症に於ける自己抗体の目標抗
原であるプロテイナーゼ３（PR−３）のヌクレオチド及
びアミノ酸の配列である。PR−３とヒト白血球エラスタ
ーゼ（HLE）とをヌクレオチド配列の下の２行目と３行
目で比較してある。HLE−配列とPR−３−配列とをよく
比較できるようにHLE−配列に３個の空所（−）を挿入
した。PR−３−配列の番号付けは精製したプロテイナー
ゼ３のアミノ酸配列（アミノ酸配列の下線を付けた部
分）に於いて見出された第一のアミノ酸から始めた。全
体で21個のアミノ酸がタンパク質の段階で決定された。
図示したcDNAは、PCR−増幅によりオリゴヌクレオチドJ
T85及びJT88（ヌクレオチド配列下線付き）を用いてク
ローニングして配列を決定した。cDNA−配列の上側の２
個の矢印は、骨髄芽球の公知のcDNA−配列には欠けてい
る両方のヌクレオチドを示す。又両方のタンパク質配列
の下の矢印は酵素シグナルペプチダーゼ用の分割の位置
である。それに続く両方のアミノ酸Ala−Gluが白血球エ
ラスターゼの場合のように１個の短いプロペプチドを形
成する。プロテイナーゼ３の活性形態は細胞内生合成の
際のシグナルペプチドとプロペプチドとの分割によって
生成する。
原であるプロテイナーゼ３（PR−３）のヌクレオチド及
びアミノ酸の配列である。PR−３とヒト白血球エラスタ
ーゼ（HLE）とをヌクレオチド配列の下の２行目と３行
目で比較してある。HLE−配列とPR−３−配列とをよく
比較できるようにHLE−配列に３個の空所（−）を挿入
した。PR−３−配列の番号付けは精製したプロテイナー
ゼ３のアミノ酸配列（アミノ酸配列の下線を付けた部
分）に於いて見出された第一のアミノ酸から始めた。全
体で21個のアミノ酸がタンパク質の段階で決定された。
図示したcDNAは、PCR−増幅によりオリゴヌクレオチドJ
T85及びJT88（ヌクレオチド配列下線付き）を用いてク
ローニングして配列を決定した。cDNA−配列の上側の２
個の矢印は、骨髄芽球の公知のcDNA−配列には欠けてい
る両方のヌクレオチドを示す。又両方のタンパク質配列
の下の矢印は酵素シグナルペプチダーゼ用の分割の位置
である。それに続く両方のアミノ酸Ala−Gluが白血球エ
ラスターゼの場合のように１個の短いプロペプチドを形
成する。プロテイナーゼ３の活性形態は細胞内生合成の
際のシグナルペプチドとプロペプチドとの分割によって
生成する。
図３はプロテイナーゼ３をコードするcDNAのヌクレオ
チド塩基配列とそれから導かれたタンパク質配列であ
る。最初の６個の翻訳されたアミノ酸がシグナルペプチ
ドの一部を形成し、それに続く両方のアミノ酸がプロペ
プチド（番号−８〜−１）を形成する。それに続くアミ
ノ酸（１〜229）が顆粒状に蓄積された活性化プロテイ
ナーゼ３の完全なタンパク質配列を表す。
チド塩基配列とそれから導かれたタンパク質配列であ
る。最初の６個の翻訳されたアミノ酸がシグナルペプチ
ドの一部を形成し、それに続く両方のアミノ酸がプロペ
プチド（番号−８〜−１）を形成する。それに続くアミ
ノ酸（１〜229）が顆粒状に蓄積された活性化プロテイ
ナーゼ３の完全なタンパク質配列を表す。
図４は、両方のオリゴヌクレオチドJT88及びJT90を使
用した全U937 cDNAからマグネシウム濃度1.7mMに於いて
増幅いたPCR−生産品（左の痕跡）を示し、その右は分
子量の指標でその大きさは塩基対で示してある。増幅し
たcDNA−断片の長さは、5'−末端に付属したEco R I制
限部位を含めて784個の塩基対である。この断片はアガ
ロースゲルから溶出されEco R Iによる制限消化後M13mp
18中でサブクローニングされた。これはプロテイナーゼ
３の分泌した活性の形態に対する全ての遺伝情報を含
む。
用した全U937 cDNAからマグネシウム濃度1.7mMに於いて
増幅いたPCR−生産品（左の痕跡）を示し、その右は分
子量の指標でその大きさは塩基対で示してある。増幅し
たcDNA−断片の長さは、5'−末端に付属したEco R I制
限部位を含めて784個の塩基対である。この断片はアガ
ロースゲルから溶出されEco R Iによる制限消化後M13mp
18中でサブクローニングされた。これはプロテイナーゼ
３の分泌した活性の形態に対する全ての遺伝情報を含
む。
フロントページの続き (72)発明者 イェンヌ，ディーター・エー スイス国 セ・アッシュ―1066 エパレ ンジュ、シェマン・デ・ボヴェレス 155 (72)発明者 チョップ，ユルク スイス国 セ・アッシュ―1066 エパレ ンジュ、シェマン・デ・ボヴェレス 155 (72)発明者 ルーデマン，イェンス スイス国 セ・アッシュ―1066 エパレ ンジュ、シェマン・デ・ボヴェレス 155 (72)発明者 ウテヒト，ベルト スイス国 セ・アッシュ―1066 エパレ ンジュ、シェマン・デ・ボヴェレス 155 (72)発明者 グロス，ヴォルフガング・エル スイス国 セ・アッシュ―1066 エパレ ンジュ、シェマン・デ・ボヴェレス 155 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/57 - 15/59 C12N 9/48 - 9/76 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｐ ＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／Ｇｅｎｅｓｅ ｑ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】セリンプロテアーゼ活性を備えた１個の酵
素をコードし、且つ（読みの方向に於いて） （ａ）場合によってはセリンプロテアーゼの１個のシグ
ナルペプチドをコードする複数のコドン、 （ｂ）場合によってはセリンプロテアーゼの１個のプロ
ペプチドをコードする２個のコドン、 （ｃ）セリンプロテアーゼを備えた前記プロセッシング
した酵素をコードする下記表１に示した229個のコドン
（１〜229）を特徴とし、 この（ｃ）の特徴に於いて、 − １個又は複数のコドンを、同じアミノ酸をコードす
るコドンによって置き換えることができ、又は − 表１の１から10又は20までのコドンを他のコドンと
交換することができ、及び／又は − １から10又は20までのコドンが欠けているか或いは
付加することができる ことを特徴とするsDNA。 【表１】 - 【請求項２】前記請求項１記載の特徴（ｃ）においてセ
リンプロテアーゼ活性を備えた前記プロセッシングした
酵素をコードする5'末端に１から10又は20までのコドン
が欠けているか或いは付加することができることを特徴
とするセリンプロテアーゼのsDNA。 - 【請求項３】前記シグナルペプチド（−８から−３ま
で）をコードするコドンに於いて、これが請求項１の表
１に示したコドン又は5'末端に１から１個または数個の
コドンだけ短くなったDNA−配列に関するものであるこ
とを特徴とする請求項１又は２のsDNA。 - 【請求項４】セリンプロテアーゼの１個のプロペプチド
をコードする前記の２個のコドンに於いて、これが請求
項１の表１のアミノ酸配列の位置−２から−１に相当す
るコドンに関するものであることを特徴とする前記請求
項１〜３の何れか１項のsDNA。 - 【請求項５】１個の相補的一重鎖を補足した、前記請求
項１〜４の何れか１項のsDNA（cDNA）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4019984 | 1990-06-22 | ||
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