JPH0539300A

JPH0539300A - タンパク質およびその遺伝子

Info

Publication number: JPH0539300A
Application number: JP2324888A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Kanai; 芳之金井; Keiji Miura; 惠二三浦; Yasukazu Tanuma; 靖一田沼; Yoshikazu Kurosawa; 良和黒沢; Akira Awaya; 昭粟屋
Original assignee: Fujita Health University; Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Fujita Health University; Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1990-10-31
Filing date: 1990-11-26
Publication date: 1993-02-19

Abstract

(57)【要約】電子出願以前の出願であるので要約・選択図及び出願人の識別信号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ヒト、動物等生体に由来する、DNA 等核酸類と結合する活性を持つタンパク質及びその遺伝子、又それらを調製・製造する方法に関する。

更に本発明は、細胞のDNA等核酸類の産生異常、DNA等核酸類に対する抗体の産生異常、細胞死に伴うDNA等核酸類の漏出等々の現象を伴うヒト及び動物の各種疾患、即ちリウマチ、自己免疫疾患、免疫不全症、各種感染症、遺伝子疾患、代謝性疾患、癌等の診断及び治療に有用な前記タンパク質に対する抗体及びその製造方法に関する。

（従来技術）自己免疫疾患等の病態、病因を明らかにし、その診断・治療法の研究を行うため、自己免疫病マウス等の疾患モデル動物が重用されている。

例えばNZBマウス、NZB/WF₁マウス、MRL/lマウス、MRL/nマウス、BXSBマウス等は全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythemato sus,SLE）のモデル動物とされて、広く研究の対象となっている。

MRL/lマウスは10週齢頃から著明なリンパ節腫脹をきたし、SELに特徴的な抗二本鎖(ds)DNA抗体等、抗DNA抗体を中心とする自己抗体の異常産生が見られ、高頻度に腎炎を発症する。

Prud′hommeらは、MRL/lマウスの産生するこれらの自己抗体は、腫脹したリンパ節中に存在するＴ細胞の産生する抗原特異的ヘルパー因子 (L-BCDF)によるとの報告を行った（Prud′homme, G.T.et al:J.Exp. Med.,157,730,1983）。

これを機にL-BCDFの分子的解明のため、多くの研究グループがL-BCDF産生Ｔ細胞株の樹立を試みたが、Ｔ細胞のみにその産生の源を求めたグループは、すべてL-BCDF様分化因子産生株の樹立には成功していない。

本発明者らは、先に独自にMRL/lマウスの腫脹リンパ節全細胞集団から、抗DNA抗体産生を増強する因子を産生・放出するリンパ系株化細胞KML₁ 細胞を樹立し、特許出願した（特開昭62-870 90）。そしてKML₁細胞由来のKML₁-7細胞をSEL病態の晩期発症モデルMRL/nマウスに移植することによって、早期発症モデルMRL/lマウスと同程度の抗dsDNA抗体の増強産生を行わしめること、そしていずれのモデルでも早期にSLE病態を発症することを明らかにした（Kanai,Y.et al, Immunol.Lett.,24,49,1990）。

他方、遺伝子DNAに結合し、遺伝上方の発現を調節、制御するDNA結合タンパク質が知られてきた(Mitchell,P.J.& Tjian,R.,Science,245, 137,1989及びJohnson,P.F.& McKnigith,S． L.,Annu.Rev.Biochem.,58,799,1989)。

又、細胞の死、細胞死に於けるDNA等核酸の漏出の現象も知られてきた(apoptosis)。この場合、細胞から放出されるDNAは、ヌクレオソームを単位とする約120塩基対の倍数の大きさをしており、それはSLE患者血液中に見られるDNAの性質と一致している(Wyllie,A.H.et al,J. Pathol.,142,67,1984及びBell,D.A.et al,J. Clin.Invest.,85,1487,1990)。

又繊維芽細胞(fibroblast)において、細胞は１回分裂するとDNAは1000ヌクレオチドずつ短くなってゆくとの報告もある(Harley,C.B.et al, Nature,345,458,1990)。

（発明が解決しようとする課題）上記のようなDNAに関する種々の知見を考えて、本発明者らは、自己免疫疾患MRL/lマウス由来のKML₁-7細胞が産生・放出する抗DNA抗体産生を増強する因子（以下、「増強因子」という）は、生体で産生される過剰、あるいは当座用をなさないDNAと反応し、免疫機構を借りた何らかの処理を行う機能、役割を持つ物質ではないかと想到し、インターフェロン類が繊維芽細胞のみならずリンパ系細胞からも産生されるのと同様に、増強因子は単にリンパ系細胞のみならず、普遍的に他の臓器の細胞からも産生される物質ではないかと推定した。

そこで、まずは該増強因子タンパク質の分離・精製そして同定及びその遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにすること、さらに該遺伝子を組み換えた大腸菌等が該増強因子タンパク質を発現させることが本発明の課題であると考えた。

そして、増強因子を高度に精製すべく鋭意研究を進めた結果、高純度の増強因子を得ることのできる方法、及びそのアミノ酸配列の部分構造を決定できる手法を確立するに至り、得られたアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製し、PCRによってKML₁-7細胞のcDNAを鋳型にしてDNAプローブを作製した。

そして、KML₁-7細胞より作製したcDNAライブラリーから、本DNAプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行うことによって、陽性クローンを選別し、該増強因子をコードするDNA断片を含む全長2.2K塩基のcDNAを得、更にBluescri pt SKM13⁺にリクローニングして、DNAのシークエンシングを行った。ついで、得られた全長2.2K 塩基のcDNAを適当な発現ベクターを用いて大腸菌等に組み換え、天然の本増強因子と同等以上の活性を有する増強因子タンパク質を発現させることに成功した。また本増強因子タンパク質を動物に免疫し、抗体の作製にも到達した。

又、MRL/lマウスのリンパ系細胞以外の正常マウスの他の臓器において、増強因子が発現していることを本発明者らは見出し、ゲノムDNAから上記cDNAをプローブにして遺伝子をクローニングすることにも成功した。

更に、ヒト褐色細胞種(Pheochromocytoma) cDNAライブラリーから、MRL/lマウスよりクローニングした増強因子タンパク質遺伝子を含むDNA 断片をプローブとして用いて、ヒト型の増強因子遺伝子をクローニングし、これら増強因子タンパク質がDNA結合タンパク質であることを明らかにし、本発明を完成した。

本発明の第１の目的は、MRL/lマウスKML₁-7細胞が産生する抗DNA抗体産生を増強する増強因子を分離・精製する技術及び増強因子をコードする遺伝子のクローニングに必要な技術を提供することにある。

本発明の第２の目的は、MRL/lマウスKML₁-7細胞の増強因子のアミノ酸配列及び増強因子遺伝子のDNA塩基配列を明らかにし、増強因子遺伝子を構成するDNAあるいはその一部断片DNAをプローブとして、MRL/lマウスの各種臓器、更に他の自己免疫疾患マウス、自己免疫疾患動物、正常動物、健常人、SLE、MCTD等々の自己免疫疾患患者の免疫担当細胞を有する組織、リンパ系細胞、及び各種臓器、血液、体液中の増強因子ないし増強因子様物質をコードする遺伝子を検出、取得できる方法を提供することにある。

本発明の第３の目的は、各種動物の本増強因子あるいは本増強因子様因子、たとえばマウス増強因子、ヒト増強因子、ヒト増強因子様因子をコードする遺伝子を各種細胞、微生物等で発現させて、増強因子ないし増強因子様因子を量的に生産する方法を提供することにある。

本発明の第４の目的は、増強因子ないし増強因子様因子に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を調整する方法を提供することにある。

本発明の第５の目的は、マウス等動物、ヒトの増強因子、増強因子様因子を用いた、生体中の増強因子、増強因子様因子に対する抗体を測定する方法またマウス等動物、ヒトの増強因子、増強因子様因子に対する抗体を用いた増強因子、増強因子様因子の測定方法、及びマウス等動物、ヒトの増強因子遺伝子、増強因子様因子遺伝子を用いた各種疾患の診断、治療のために必要な技術を提供することにある。

（課題を解決する為の手段）本発明者らは、上記第１の目的の達成のために、先ず抗DNA IgG抗体産生増強因子（増強因子）の分離、精製を企てるべく大量のKML₁-7細胞を培養した。

KML₁-7細胞を完全培地下、フラスコ内でコンフルエントになるまで培養し、しかる後により容量の大きなフラスコ内で培養を続け、その後KML₁-7 細胞を遠心操作等で集め、ハイメディウム606等の無血清培地に浮遊させた。細胞濃度は0.5〜５× 10⁷/mlがよく、好適には１〜３×10⁷/mlがよい。

ついで、大型フラスコに本細胞を入れ、前記の細胞濃度で炭酸ガス培養器内で２〜５日間、好ましくは３日間培養を行った。その後、たとえば 3000回転、15分遠心により培養上清を集め、直ちにセリンプロテアーゼ阻害剤PMSFを0.5mMになるように加えた。

しかる後、ステリベックスフィルター等でろ過し、続いてPM-10等の限外ろ過膜で200〜250倍に濃縮した。培養上清を集めた時と同様に、遠心、無菌ろ過を行い、この段階で各フラスコの培養上清を集め、10〜20lを１バッチとして、その後の精製行程に進んだ。

即ち、後に実施例１において詳述するように、増強因子含有該培養上清をDEAE-セファデックス A-50等の陰イオン交換樹脂へ吸着させ、然る後に NaCl等の塩を加えた緩衝液で、担体に吸着した増強因子をバッチ方式にあるいはカラム操作で溶出した。又、AcA54カラム等の分子篩でゲルろ過も行った。

更に、ヘパリン等を担持したアフィニティカラムを用いて精製を進め、最後にPhenyl 5PWRP等の逆相カラムを用いたHPLCで増強因子を精製、単離することができた。精製の程度は1200〜1500倍であった。

このような方法及び当業者の利用し得る類似の方法を用いて、精製、分離りた本増強因子をSDS 加ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にて分析し、その純度を銀染色等で調べた。

又、増強因子をSDS-PAGEにかけ、得られた単一ピークをPhast Gel等にかけ等電点を調べた。

増強因子の各精製過程ごとに、精製標品をMRL/ ｌマウスの脾細胞浮遊液に加え４日間培養し、上清中の抗DNA抗体産生量を測定することにより、及び該精製標品をss DNAでプライムした正常Balb /cマウス脾細胞浮遊液に加え、５〜７日間培養し、ss DNAをコートしたSRBCをターゲットとしたプラークフォーミング細胞(PFC)を算定することにより、そのタンパク質重量あたりの比活性上昇を調べた。

第１図に示すように抗DNA抗体価は、加えた無血清培地培養上清の容量に依存して上昇した。

増強因子を得るために、５％牛胎児血清 -Dulbecco′s modified Eagle medium［DMEM］で KML₁-7細胞を培養した場合、増強因子が40％ (vol/vol)で抗DNA抗体を抑制する傾向があるのに対して、無血清培地で得た増強因子は、なお抗 DNA IgG抗体価を上昇せしめる活性があることから、無血清培地はKML₁-7細胞の大量培養による増強因子の単離精製に好適あることがわかる。

DEAE-セファデックスA-50に増強因子を吸着させる際、最初は0.3M Nacl含有緩衝液でバッチ式に溶出を行うのが好ましい。

しかる後、AcA54カラム等に増強因子をチャージし、ゲルろ過し、各画分の増強活性をPFCで調べると、第２図に示すように、増強因子は約30 KDaの分子量を示した。

ついでDEAE-セファデックスA-50カラムにかけ、増強因子を更に精製する際、第３図に示すように増強因子は0.2〜0.3M NaClの塩濃度で溶出されることがわかる。

増強因子画分を含むそれ以降の溶出画分には、 A₂₆₀の吸収が多いことから、増強因子がある種の核酸(DNA)と複合体を形成している可能性が示唆される。

増強因子を含む画分を更に濃縮、透析した後、ヘパリンセファロースカラムにチャージしたが、全A₂₈₀単位はカラムに吸着せず、通過した。

このことは、増強因子が糖タンパク質でないことを示唆するものと考えられる。次に、この活性画分をPhenyl 5PWRPにインジェクトし、HPLCを行い、第４図に示すように約50％のアセトニトリルで溶出される単一の鋭いピークを得ることができた。第４図に示すようにSDS-PAGEでは、本増強因子は約55KDaの単一分子（p55タンパク質）であることが示された。又、等電点(PI)はPhast Gel で5.8であることがわかった。前記のようにAcA5 4カラムでの本増強因子の溶出位置から、第２図に示すように本増強因子は見かけ上約30KDaの分子量であったが、前述及び後述するように本増強因子がDNAと結合することによつて、本来の分子量約55KDaの位置とは異なる所に溶出されたと考えられる。以上の精製過程をまとめて別紙表に示す。

in vitroで抗DNA抗体を選択的に上昇させる本増強因子は単純タンパク質(p55)であり、その全アミノ酸配列を決定した。本タンパク質は、Ｎ末端がブロツクされていることがわかったので、リジルエンドペプチダーゼによって得られたペプチドから、その部分的一次構造を決定するステップを踏んだ。この部分一次構造から考えられるDNA を化学合成し、これをプローブとして、それとハイブリダイズするKML₁-7細胞由来のcDNAクローンの単離を行った。

即ち、HPLCを用いて精製し、更に乾燥させたタンパク質標品を8M尿素に溶解し、ついでトリス-H C1(pH9.0)緩衝液を加え、しかる後Achromobac ter protease I 即ち、リジルエンドペプチダーゼで一夜分解後、その分解物をsynchropack RP-8カラムを用いてHPLCにより分離した。

得られた２つのペプチド断片について、 Applied Biosystem 470A on-line 120A PTHアミノ酸アナライザーでアミノ酸配列を決定した。

ペプチド断片１はQFEHLDPQNQETFEAIDLEL、ペプチド断片２はLSQELDFVSHNVRTKであった。

この20アミノ酸残基からなるペプチド断片１について、その両端に位置する７アミノ酸(QFEHLDP 及びEAIDLEL)をコートできる20塩基からなる２種類のプライマー（Ｎ及びＣ）を合成した。

これらは、プライマーN:5′CA(AG)TT(TC)GA(AG)CA(TC)CT (CG)GA(TC)CC3′ プライマーC:5′AG(CT)TC(CG)AG(GA)TC(GA)CT (GA)GC(CT)TC3′ である。上記の２種の塩基配列において、（）内は２つの塩基の何れか一方を示し、たとえば (AG)、(TC)）等はそれぞれＡまたはG、T又はＣであることを示す。

KML₁-7細胞より調製したmRNAより逆転写酵素で cDNAを作製し、そのcDNAを鋳型としてプライマーＮ及びＣを用いてPCR法にて増幅した。アクリルアミドゲルで分離後、60塩基近傍を分取し、再び PCR 法で増幅させた。ポリヌクレオチドキナーゼと［γ^-32p］ATPで末端を標識し、アクリルアミドゲルで分離し、59塩基対の部分を単離した。再再度PCR法で59塩基対の部分を増幅させた。

尚、プライマーとしては、プライマーとしての機能を損なわない範囲で、これらのプライマーの塩基配列の一部を変換した塩基配列、若干の塩基を増減させた塩基配列、あるいはそれらの組み合わせからなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも本発明に含まれる。

又、ペプチド断片１由来のプライマー及びペプチド断片２由来のプライマーを用いてPCRを行い、遺伝子を増幅することもできる。

次に増幅されたPCR産物をBluescript SKM13⁺ ベクターにクローン化した。DNA塩基配列を決定したところフラグメント１に相当するアミノ酸をコードできるDNAが確認された（２カ所、第５図の146番目のアミノ酸がＨであり、ＥとＨの discrepancyが存在した。及びあとの塩基配列決定の際に、151番目のアミノ酸がＲであり、ＩとＲのdiscrepancyが存在することが示された。）。この59塩基からなるオリゴヌクレオチドを合成し、末端を³²pで標識してそれをプローブにしてKML₁-7mRNAに対してノザンハイブリダイゼーションを行うと、2.2K塩基のところにバンドが同定された。

この59塩基は 5′AG(CT)TC(CG)AG(GA)TC(GA)AT(GA)GC(CT)TCA AACGTGTGCTGGTTCTGAGG(GA)TC(CG)AG(GA) TG(CT)TC(GA)AA(CT)TG3′あるいは 5′AG(CT)TC(GG)AG(GA)TC(GA)CT(GA)GC(CT)TCA AACGTGTGCTGGTTCTGAGG(GA)TC(CG)AG(GA) TG(CT)TC(GA)AA(CT)TG3′あるいは 5′AG(CT)TC(CG)AG(GA)TC(GA)CG(GA)GC(CT)TCA AACGTGTGCTGGTTCTGAGG(GA)TC(CG)AG(GA) TG(CT)TC(GA)AA(CT)TG3′ である。

他方、KML₁-7細胞から常法により調製したmRNA より、cDNA合成キット（例えばAmersham社製、 Pharmaxia社製，Bethesda Research社製、Boehringer-M
annheim社製等）を用いて、cDNAライブラリーを作製しておき、上記59塩基のDNA断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーシヨンでクーロンを選別、単離した。更に上記と同様にBluescript SKM13⁺でリクローニングを行い（SK-cDNA），DNAの塩基配列を決定した。

第５図に一部の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。

第５図のアミノ酸配列中にペプチド断片１及び２に相当する構造が見られる。第５図に示す塩基配列は、下流側に３′末端にポリＡ部分を含む全長2156塩基からなる塩基配列である。その中にA TGに始まり、TAAで終わる455アミノ酸をコードできるオープンリーディングフレーム(open readin g frame)が存在した。この455アミノ酸からなる単純蛋白質には、Ｎ末端に疎水性アミノ酸に富んだリーダーペプチドと考えられる領域が存在した。その根拠は、リーダーペプチドに見られる共通性がPerlmanらの論文(D.Perlmand et al:J. Mol.Biol.,167,391-409,1983），Blobelらの論文(G.Blobel et al:J.Cell.Biol.,67,8 35-851,1975)，Walterらの論文(P.Walter et al:J.Cell.Biol.,91,545-550および551-56 5,1981)等から次のように列挙でき、それら条件が本増強因子p55にもきわめてよく該当すると考え得るからである。即ち共通性として１リーダーペプチドの中央部分に12個前後のアミノ酸からなる疎水性コアが存在する。

２疎水性コアの直前に正に荷電したアミノ酸 (LysまたはArg)が存在する。

３コア部分に続いてβ−ｔｕｒｎを決定する配列がある。

４リーダーペプチドのＣ末端には側鎖の短いアミノ酸(Ala,Gly,Ser,Cys,Thr)が存在する。

等があり、p55について見ると MPTSVPRGAPFLLLPPLMLSAVLA VPVDRであり、疎水正コア切断部位これら４つの条件を満たすと判断できる。

本増強因子p55は26番目のバリン(V)をＮ末端とする430残基のアミノ酸が分泌されるタンパク質と考えられる。このバリンを１番とした時、3 21番目から363番目にかけて７個のロイシン(L) が７アミノ酸ごとに繰り返されるロイシンジッパー構造が観察される。ついで本増強因子タンパク質の性質を明らかにするために大腸菌等で遺伝子発現により、タンパク質の生産を行った。Ｎ末端付近に相当するプライマー 85′ＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＧＴＧＧＡ
ＣＣＧＣ３′あるいは 5′GCTGTGCTGGCAGTGCCCGTGGACCGC3′あるいは 5′GTGCCCGTGGACCGCGCAGCACCTCCT3′などを用いるとよい。）とBluescript SKM13⁺中のT7RNAポリメラーゼプライマー(5′AATACGACTCACTATAG3′）とを用いて、上記SX-cDNAを鋳型にしてPCRを行ない、増幅されたDNAをNcoIで消化後、アガロースゲル電気泳動で上記2.2K塩基のDNA断片を得た。これをLe rnerによって開発されたベクターλLcl(Lerner vctor λ Lcl;Science,246,1275-1280,19 89参照）に挿入し、大腸菌にトランスフォームした。

Lerner vector λ Lclには、Pel Bリーダーペプチドがあり、そのＣ末端にNcoI切断部位があるる。p55のリーダーペプチドのＣ末端はPel Bのものとは違うため、23残基目のVal 24残基目の LeuをそれぞれAla,Metで、しかもNcoI切断部位になるような塩基配列にして、合成プライマー(N-term 27mer)を作成した。N-term 27merとT7 プライマー（シークエンスを使うもの）を用い、 Bluescript SKM13⁺にp55cDNAがクローニングされているDNA(10ng)を鋳型にして、PCR(94℃ １分，55℃２分，72℃ ３分を20サイクル）で増幅後Nc o Iで切断し、約1.9kbの断片をλLclのNco I 切断部位にクローニングした。これにより発現した産物のＮ末端は、順にVal,Pro,Valであることが確かめられた。第５図に、このをPCR用いた p55cDNAのLerner vectorへのリクローニングの方策を示す。本増強因子タンパク質を大腸菌以外の酵母、枯草金当の微生物、あるいは動物細胞で発現させる場合には、それに応じたベクターを、用いる必要がある。大腸菌で本増強因子タンパク質を生産することに本発明者らは成功し、本発明を完成した。

本発明によつてマウスより分離、精製され、更に大腸菌等で遺伝子発現された本増強因子タンパク質は次のような性質を持っていることが明らかにされた。

KML₁-7細胞培養中に培養液に出現する DNA(K-DNA)に結合し、ゲルシフトを起こす性質がある。

MRL/lマウス、脾臓のＢ細胞画分に直接働き細胞増殖活性を上げる。

MRL/lマウス脾臓のＢ細胞画分に直接働き、 IgG型の抗DNA抗体誘導を促進する。

抗DNA抗体とK-DNAの結合をcompetitiveに阻害する。

そこで本増強因子p55タンパク質は、DNA結合能を有し、MRL/lマウス中で抗DNA抗体誘導を促進する性質があるという意味で、Iupus-accelera ting DNA binding protein (LAD)と名づけた。

なお大腸菌で生産された本増強因子p55のアミノ酸配列を、シアノジェンブロマイド(BrCN)による切断個所など４個所につき決定したところ、DN A塩基配列から予想されるアミノ酸はその結果と一致することが確認された。

即ちシアノジェンブロマイドによるp55の加水分解は、70％のギ酸中1mlに20mgのシアノジェンブロマイドを含む溶液中に、p55を溶解し、37℃ で一夜反応させる。次にこの反応物を乾固し、そのペレットを水に溶解し、しかる後SDS-PAGEを行なった。この際TEFCO WIDE PAGE miniなどの装置を用いることができる。さらに反応産物中の各切断断片をPaul Matsudairaの方法(J.Biol.Chem .,262,10035-10038)に従い、ウェスタンブロッティングを行ない、ついで前記のApplied Biosys tem 470A on-line 120A PTHアミノ酸アナライザーでアミノ酸配列を決定した（第５図）。

他方p55のＣ末端付近のアミノ酸配列も決定した。即ちp55を8M尿素に溶解し、TPCK処理トリプシンを加え、37℃で一夜加水分解し、しかる後反応液に100mMのジイソプロピルフルオロホスフェートを加え、更に10％の酢酸を加えた。ついでこの反応液をアンヒドロトリプシンアガロースカラム（タカラ社製）にかけ加水分解ペプチド断片を分離した。非吸着画分をブロッティング装置 (Marysol KS-8451)で、20V ４時間、４℃，PVDF メンブイレイン（Millipore^R社製）にブロットした。非吸着画分にはＣ末端の最初のペプチド断片だけではなく、他に２つのペプチド断片が混在していることがわかった。シークエンシングを行うと、前記のロイシンジッパーよりＣ末端側の３つのペプチド断片の存在が確認でき、塩基配列から推定されるアミノ酸配列と一致することが明らかになった（第５図）。

LAD mRNAは、KML₁-7細胞内で発現し、LADタンパク質が分泌されているが、このLDA遺伝子の発現は、Balb/c正常マウスの腎臓でも起こっていることを発明者らは予期していたとおり見出した。

また脾臓では本LAD蛋白質は少量の発現が見られた。

これらの知見から、MRL/lマウスにおいてはS LEと直接関係していると考えられる本LDAタンパク質は、正常マウスでは、何らかのapoptosis等細胞死で生ずるDNAの免疫系による処理に関与していることをが推察される。

更にマウスから単離されたp55タンパク質cDNA クローンをプローブにして、ヒト褐色細胞腫(phe ochromocytoma)のcDNAライブラリーをスクリーニングしてヒトLAD遺伝子のcDNAクローンも得、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。その構造はマウスと非常に相同性が高いことが本発明によって明らかにされた（第７及び８図）。

即ちヒトのp55タンパク質遺伝子を含む第24番目の塩基から第1596番目の塩基までのDNA断片の塩基配列と、マウスp55LADタンパク質遺伝子を含む第３番目の塩基から第1553番目の塩基までの DNA断片の塩基配列とは約90％の高い相同性があることが明らかにされた。またヒトp55タンパク質とマウスp55タンパク質の上記塩基配列に対応するアミノ酸配列は、ヒトでは460アミノ酸残基よりなり、マウスでは455アミノ酸基よりなること、ヒト−マウスのそのアミノ酸残基相同性 (percent identity)は約87％、またそのアミノ酸残基相似性(percent similarity)は約93％であることが確認された。

本発明により、マウスより分離、精製されあるいはその遺伝子がクローニングされ、さらに大腸菌等で発現・生産され、アミノ酸配列が明らかにされた本増強因子タンパク質（LAD）は、このタンパク質を抗原として、生体中に産生・存在する本増強因子に対する抗体を測定するための、測定用抗原タンパク質として使用できる。またポリクローナル抗体、モノクローナル抗体作製用の抗原として利用できる。そしてこれらポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いて、RIA,EIA, あるいはFIA等の測定系によって、例えば自己免疫疾患患者および動物の血中、組織中の本増強因子タンパク質の定量を行うことができ、それによって各種疾患の病態を把握、診断することが可能となる。また自己免疫疾患患者および動物等の治療に、本ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は適応できる。

更に本発明によって、マウスLADと相同性の高いヒトのタンパク質も同定された。このヒトタンパク質を用いて、ウマウサギ等のポリクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体、更にヒト型のモノクローナル抗体を取得することにより、ヒトの自己免疫疾患、免疫不全症、代謝性疾患、遺伝疾患、癌等の診断、治療を行うことができる。

一方また本発明によってマウスおよびヒトから単離された、p55タンパク質遺伝子DNA断片またはその一部のDNA断片、あるいはp55タンパク質遺伝子を含むより大きなDNA断片をプローブとして用い、ヒト及び各種動植物、微生物類のp55タンパク質と同様の機能を有するか又は有しないタンパク質類をコードする遺伝子DNA断片、あるいは該遺伝子を含むより大きなDNA断片を、ハイブリダイゼーシヨン法により単離することが可能となった。

更にまた、本発明によつて明らかにされたヒト及びマウスのp55タンパク質遺伝子の塩基配列の任意の一部を選択して、PCR用のDNAプライマーを合成して、該プライマーを用いて未知の、各種動植物、微生物類の遺伝子を増幅合成、単離することも可能となった。これらの技術も本発明の範囲に包含される。

以下本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

（実施例１） (a)ＫＭＬ_１−７細胞培養上清の大量採取先ず25cm²フラスコ（コーニング、25100）にて完全培地５％牛胎児血清(fetal bovine serum,以下FBS)、2mMグルタミン、10mMヘペス、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/ml、 50μM2-ME（メリカプトエタノール）を含む Dulbecco′s modified Eagle medium ［DMEM］） (FBS-DMEM)下で，KML₁-7細胞を培養し、コンフルエント（〜10⁶/ml）とした。次に、75cm²フラスコ（コーニング、25110）で拡大培養した。ついでKML₁-7細胞を遠心にて集め、無血清培地（ハイメディム606、コージン）に浮遊させた（４× 10⁶cells/32ml）。次に60mlのハイメディウムを含む大型フラスコ（156502，ヌンク）に各々 1ml(1.25×10⁷cells)を浮遊させ、CO₂インキュベーター（５％ CO₂,37℃）中で３日間培養した。

次に3,000回転、15分の遠心で培養上清を集め、直ちにセリンプロテアーゼ阻害剤PMSFを0.5mM になるように加えた後、ステリベックスフィルター（0.22ミクロン）にてろ過し、続いて限外ろ過膜、PM-10を用いて約200〜250倍に濃縮した。

培養上清を集めたときと同様に遠心・無菌ろ過を行ない、この段階で幾つかのバッチを集め、次の精製ステップに進んだ。

(b)ゲルろ過法によるDNA抗体産生増強因子の分離 100〜150倍に濃縮した培養上清2mlを2.0×55 cmのAcA₅₄カラム［(50mM Tris/100mM NaCl緩衝液）(pH8.0)…以下Ａ液と略記する）にて平衡化したもの］にかけ２mlｌずつ採取し、増強活性画分の溶出部位を決定した。

(c)陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる増強因子の分離先ずDEAE-sephadex A-50をＡ液にて平衡化した後、１×14cmのカラムを作製し、これに(b)で得られた活性画分をチャージし、Ａ液にてカラムを洗浄し、A₂₈₀が0.1以下になった時点で、増強活性画分をＡ液中のNaClが100mMから600mMになるように濃度勾配をかけて分離、溶出した。

(d)増強因子のヘパリンカラム処理 (c)にて得られた増強物質を含む画分をＡ液にて活性化したヘパリンカラム(1×10cm)にチャージし、増強物質のヘパリンへの吸着性の有無をA₂₈₀ によって調べた。

(e)増強因子のHPLCによる分離精製 0.05％トリフルオロ酢酸と７％のアセトニトリルを含む溶液にて逆相カラムPhenyl 5PWRPを平衡化した後、(d)にて行ったヘパリンカラム処理増強物資をインジェクトした後、７％アセトニトリルで溶出後、70％までのアセトニトリル濃度勾配にて増強物質の単離を行なった。

(f)SDS-PAGE (e)によって得られた単一ピークをSDS加12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にて分析し、その純度を銀染色にて調べた。

(g)等電点分画 (e)で得られた単一ピークPhast Gel (IEF ３〜９Gel set）にかけ等電点を調べた。

(h)増強因子活性測定のための反応系 (1)(2)MRL/lマウス脾細胞浮遊液を用いる反応系４〜６月齢のMRL/lマウスの脾細胞をHank′s Balanced Salt Solution（以下HBSSと略記する。）中で単一浮遊細胞とした後、5%FBS-DMEMにて２×10⁶cells/mlに調製し、増強因子を含む検体を加え48穴のクラスターデッシュで４日間培養し、その上清中の抗DNA抗体を以下に述べる方法にて測定した。

(2)(2)正常マウスの脾細胞浮遊液を用いる反応系雌10週齢のBALB/cをあらかじめssDNAでプライムし、５〜７日後に脾細胞をHBSSで単一浮遊細胞とし、(h)-(l)と同様に培養した後、ssDNAをコートしたSRBCターゲットとしたプラークフォーミング細胞（以下PECと略記する。）（後述）を算定した。

(i)増強活性測定法 ELISA法イムロンNo.1ポリスチレン製の96穴のプレートを16時間殺菌燈にさらした後、直ちに１μｇ／ｍｌの一本鎖（ss）DNA（仔牛胸線由来）を50μl加え、室温で２時間孵置した。次に５％ FBSを0.05％のTween 20を含むTris緩衝液（25mM Tris, 140mM NaCl,pH7.4）にてDNAの未吸着部位を遮断し、抗原付着プレートとした。(h)-(l)で得られた培養上清を非働化した後、抗原付着プレートに 50μlを加え、型の如く抗原に結合した抗体をクラス別にアルカリフォスファターゼ標準二次抗体で測定した。

(2)PFC クロミウムクロライド法でSRBCにssDNAをコートし、カニンガムの方法で抗ssDNAPFCを算定した。この系で最大PFCの50%を与える増強活性を１単位とし、検体の活性を綜合単位で表示した。

（実施例２） (a)増強因子タンパク質のアミノ酸配列シークエンシング HPLCを用いて精製し、更に乾燥させたp55タンパク質標品７μｇを、50μlの８Ｍ尿素に溶解し、 37℃で15分保温し、ついで50mMのトリス-HCL緩衝液(PH9.0)150μlを加え、しかる後 Achromobacter proteaseI即ち、リジルエンドペプチダーゼ(Masaki,T.et al;Argic.Biol. Chem.,42,1443,1978)を10ng加え37℃で一夜分解した。その分解物をSynchropack RP-8カラムを用いてHPLC(Waters 490)を行い、トロフルオロ酢酸−アセトニトリル（0-60％の濃度勾配）系で分離した。得られた２つのペプチド断片について、Applied Biosystem 470A on-line 120A PTHアミノ酸アナライザーでアミノ酸配列を決定した。

(b)PCR増幅用プライマーの合成ペプチド１について、その両端に位置する７アミノ酸(QFEHLDP及びEAIDLEL)をコードできる20塩基からなる２種類のプライマーＮ及びＣを公知の常法を用いて合成した。

プライマーN:5′CA(AG)TT(TC)GA(AG)CA(TC)CT (CG)GA(TC)CC3′ プライマーC:5′AG(CT)TC(CG)AG(GA)TC(GA)CT (GA)GC(CT)TC3′ (c)KML₁-7細胞のcDNAライブラリー作製 KML₁-7細胞よりChirguinらの方法(Chirguin,J. J.et al; Biochemistry,18,5294,1979)に従い、全RNAをグアニジンイソチオシアナートーセシウムクロリドを使った方法で調製した。

poly(A)⁺RNAはAviv & Lederの方法(Abib,H et al;J.Mol.Biol.,134,743,1972)に従って oligo(dT)セルロースカラムを数回通して精製した。poly(A)⁺RNA0.5μｇ、５×MMLV緩衝液(0.25M トリス−塩酸、pH8.3,0.375M塩化カリウム、15mM 塩化マグネシウム、50mMジチオスレイトール）、 10mMdNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)及びoligo(dT) プライマーを水に加え、Strata Gene cDNA合成キットを用いてcDNAを合成した。このcDNAを分別してλgt11アームにライゲーションした。cDNAと λgt11アームからラムダファージパッケージング抽出液（ギガパックゴールドII−ストラタジーン社製）を使用してリコンビナントファージのライブラリーを作製した。

(d)PCR増幅 Perkin Elmer Cetus社のDNA Thermal Cyclerを使用して、PCRを行った。増幅条件はdenatureに 94℃１分→annealingに37℃２分→extensionに 72℃30秒で40サイクル行い、反応液にエタノールを加え増幅DNAを沈殿させた。

(e)DNAの精製 (d)得たDNAをバッファーにとかし、10％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけ (PAGE)、60塩基近傍のゲルを切り出し、200μl のTE緩衝液を加え、時々振とうしDNAを溶出させた。

(f)再PCR (e)で得たDNAを再度、(d)と同様にしてPCR 増幅した。

(g)DNAの精製 (e)と同様にPAGEを行い、(e)同様60塩基近傍のゲルを切り出し、200μlのTE緩衝液を加え、 DNAを溶出させた。そしてフェノールとエーテルで処理し、その後DNAをエタノールで沈とのせた。このエタノールペレットを10μlのTE緩衝液に溶解し、ポリヌクレオチドキナーゼと［γ^-32p]ATPでDNA末端を標識化した。

ついでシークエンスゲルでPAGEを行い、59塩基対のゲル部分を単離し、200μlのTE緩衝液に溶出した。

(h)再再度PCR (g)で得たDNA溶液を用いて、再再度PCRを行った。

(i)DNAプローブの精製 (h)で得たPCR産物をPAGEで分離し、主要バンドを400μlのTE緩衝液に溶出した。(g)と同様にフェノールとエーテルで処理し、その後DNAをエタノールで沈殿させた。DNAペレットを10μl のTE緩衝液に溶かした。

(j)DNAプローブの塩基配列決定 (i)で得たDNAを常法によりBluescript SKM13⁺にligateして、一本鎖DNAを調製し、ジデオキシ法でシークエンシングを行った。

(k)アマーシャムcDNA合成キットによるcDNAライブラリー作製 (c)で得たPoly(A)⁺RNA5μｇを逆転写酵素により、第1cDNAを合成した。ついでDNAポリメラーゼIとRNaseHを用いて第２２cDNAを合成した。

そしてT₄DNAポリメラーゼで処理し、さらに EcoRIメチラーゼで処理した。EcoRIリンカーを cDNAにligateし、その後EcoRIで水解した。この cDNAをセファデックスG-150でゲルろ過して分別しλgt10アームにライゲーションした。ついでラムダファージパッケージング抽出液を使用してリコンビナントファージライブラリーを作製した。

(1)59塩基プローブによるプラークハイブリダイゼーション (j)の結果に基づき、5′AG(CT)TC(CG)AG(GA)TC (GA)AT(GA)GC(CT)TCAAACGTGTGCTGGTTCTGAGG(GA)T C(CG)AG(GA)TG(CT)TC(GA)AA(CT)TG3′の配列をもつDNAプローブを合成した。

(k)で得たcDNAライブラリーから、このプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを選別し、増殖させ、 Bluescript SKM13⁺にリクローニングし (SK-cDNA）、DNAのシークエンシングを行った。

そして３′末端にポリＡ部分を含む2159塩基の配列が決定された。図５に塩基配列を示すが、ATGに始まり、TAAで終る455アミノ酸をコードできる open readeing frameが存在することが明らかになった。対応するアミノ酸配列も示す。

（実施例３）本増強因子タンパク質(p55,LAD)の大腸菌での生産 (a)実施例２の(1)で得たSK-cDNAを鋳型として、p55タンパク質のＮ末端付近に相当する27 merのオリゴヌクオレチド（第６図）をプライマーとして合成し、これとBluescript SKM13⁺中の T7 RNAポリメラーゼプライマー（５′ＡＡＴＡＣＧＡＣ
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３′）とを組合わせPCRを行なった。94℃１分→55℃２分→72℃３分の反応を20サイクル行い、PCR産物を得た。これをフェノールとエーテルで処理し、次にエタノールでDNAを沈殿させた。DNAペレットを20μlのTE緩衝液に溶かし、Ncolで消化後、アガロース電気泳動を行ない、2.2K塩基のバンドを切り出し、10μlのTE緩衝液に溶出した。この2.2KのDNA断片をLernerベクターλLclにligateし、大腸菌XL1-blueにトランスフォームした。この大腸菌Mp55 cDNA(XL1- blue/λLcl-cDNA）［通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、ブタペスト条約に基いて寄託されている（寄託番号：FERMBP-3170寄託日：平成２年11月22日）。］をLB-Amp培地（アンピシリンを50mg/μl含有）中、30℃で培養、増殖させた。

培養液の650nmにおけるO.D.が0.5の時に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (IPTG)を最終濃度が1mMになるように培養液に加え、更に４時間培養を続けた。ついで４℃で 5000G,10分遠心し、集菌して得られた菌体ペレットを0.2Mトリス-HC1,pH8.0,0.5mM EDTAおよび0.5M庶糖を含むTES緩衝液（もとの培養液１lあたり20ml量）に再度懸濁した。ついでこの菌体懸濁液に、水で１：４に希釈したTES緩衝液を加えて浸透圧破壊し、氷上で30分静置した。その後、この懸濁液を10,000G 10分遠心し、上清を分取した。この上清は、もとの培養液１ lあたり、本増強因子p55タンパク質10mgが含有されていた。

(b)本増強因子p55のアミノ酸配列の確認のための一部シークエンシング………シアノジェンブロマイドによる切断乾固したp55タンパク質10μｇを70％のギ酸１ ml中に20mgのシアノジェンブロマイドを含む溶液50mlに溶解し、37℃で一夜反応させた。次にこの反応物を乾固し、そのペレットを10μlの水に溶解し、しかる後SDS-PAGEをTEFCO WIDE PAGE miniを用いて行なった。前記のPaul Matsudaira の方法に従い、ウェスタンブロッティングを行ない、更にApplied Biosystem 470A on-line 120APTHにア
ミノ酸アナライザーでアミノ酸配列を決定した（第５図）。

(c)p55のトリプシン分解によるアミノ酸配列確認 p55乾燥原末100μｇを8Mの尿素溶液25μlに溶解し、37℃で15分溶解した。これに0.1M NH₄HCO₃ 溶液75μlを加え、更にTPCK処理トリプシン１ μｇを加え、37℃で一夜加水分解した。その後この反応液に100mMのジイソプロピルフルオロホスフェート１μlを加え、更に10％の酢酸５μlを加えた。ついでこの反応液を１mlの量のアンヒドロトリプシンアガロースカラム（タカラ社製）にかけ、加水分解ペプチド断片を分離した。非吸着画分をブロッティング装置（Marysol KS- 8451）で，４℃，20Ｖ，４時間，PVDFメンブレイン（Millipore^R社）にブロットした。非吸着画分にはＣ末端の最初のペプチド断片だけでなく、他に２つのペプチド断片が混在していることがわかった。シークエンシングを行なうと、前記のロイシンジッパーよりＣ末端側の３つのペプチド断片の存在が確認でき、塩基配列から推定されるアミノ酸配列と一致することが明らかになった（第５図）。

（実施例４）実施例２および３で得たp55タンパク質 300μｇを500mMトリス-HCl,100mM Naclおよび 0.5mM PMSFを含むpH8.0の緩衝液0.5mlに溶解し、これと同量のフロイントの完全アジュバントを混ぜ合わせ、water in oilの状態になるまで充分混和した。ニュージーランド白色雌性ウサギ後肢の四指の足蹠計８ケ所に、このエマルジョンを計1ml膨疹を形成するように注射し、免疫した。

３週間後に、フロイントの不完全アジュバントを含む同量の抗原エマルジョンを背部４ケ所に注射した。10日後に採血し、抗体価を測定した。その後全採血し、抗血清を得た。p55タンパク質に対するポリクローナル抗体を含む本抗血清は、KML₁ -7細胞培養上清の抗DNA抗体産生増強作用を完全に阻止した。また、細胞をよく染色した。

（実施例５）実施例２および３で得たp55タンパク質とフロイントの完全アジュバンドとを実施例４と同様にして、等量ずつ混ぜ合わせ、Lewisラットに免疫し、脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製し、しかる後 p55に対するモノクローナル抗体を得た。

（実施例６）実施例２の(1)で得た2.2K塩基のcDNAの塩酸配列をもとに、実施例３の(a)で作製した2.2KのDNA 断片をプローブとして、同じく正常Balb/cマウス腎臓のゲノムDNAをスクリーニングした。そしてこの正常Balb/cマウスからも、本プローブとハイブリダイズする遺伝子をクローニングすることができた。

（実施例７）実施例２の(1)で得た２．２Ｋ塩基のcDNAの塩酸配列をもとに、実施例３の(a)で作製した2.2Kの DNA断片をプローブとして、ヒト褐色細胞腫 (Pheochromocytoma)のcDNAライブラリーをスクリーニングした。マウスp55タンパク質に対応するヒトLADをコードするヒトcDNAクローンを得た。その塩基配列を決定したところ、マウスcDNA と相同性がきわめて高く、また対応するアミノ酸配列の相同性もきわめて高かった（第７及び８図）。

以上の記載中及び図面におけるアミノ酸配列でのアルファベットは、以下のアミノ酸をそれぞれ示す。

A:Ala C:Cys D:Asp E:Glu F:Phe G:Gly H:His I:Ile K:Lys L:Leu M:Met N:Asn P:Pro Q:Gln R:Arg S:Ser T:Thr V:Val W:Trp Y:Tyr （発明の効果）本発明によって、抗DNA抗体産生を増強する DNA結合タンパク質の存在を、単にMRL/lマウス KML₁-7細胞からだけでなく、広く自己免疫疾患動物のみならず正常動物の組織・細胞内に存在することが明らかにされた。更に本増強因子をコードする遺伝子がクローニングされ、大腸菌等に組み換えられ、遺伝子発現が行われ、増強因子タンパク質を生産することが可能となった。そしてこのタンパク質を抗原として用い、生体中に産生・存在する本増強因子に対する抗体を測定することが可能となった。またこのタンパク質を抗原として動物に免疫することにより、あるいはinvitroでポリクロナール抗体、モノクロナール抗体の製造も可能となり、これらの抗体を用いて前記DNA結合タンパク質の定量を行うことが可能となった。

このようにしてかつ自己免疫疾患患者及び動物等の病態の把握、診断、更には治療に本p55タンパク質あるいはこれに対する抗体を使用することができることになる。

特に、モノクロナール抗体は、ヒトの自己免疫性疾患、免疫不全症、代謝性疾患、遺伝疾患、癌等の診断、治療に応用できる。

このように、本願発明は、単に生物科学、基礎医学上の基礎的研究に資するだけでなく、臨床医学上の診断、治療にも利用できる点で、本発明の意義は画期的である。

【図面の簡単な説明】

第１図：先願KML₁-7細胞の無血清培地培養上清の添加容量と抗DNA抗体産性増強活性との関係を示すグラフである。第２図： AcA54カラムに本増強因子含有画分をチャージし、ゲルろ過により更に精製を進めた際の各画分の増強因子によるPFC活性を示すグラフである。第３図：第２図に示す本増強因子含有画分をDEAE-セファデックスA-50カラムにかけ、更にNaClを含む緩衝液により溶出する際の、各画分のNaClの濃度とPFC活性ならびにタンパク質濃度および核酸濃度との関係を示すグラフである。第４図：第３図に示す本増強因子含有画分をPhenyl 5 PWRPにインジェクトし、HPLCを行い、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮぴえか溶出する際、本増強因子の溶出位置と各画分のアセトニトリルの濃度を示すグラフ、及び本増強因子の分子量を求めた電気泳動パターンを示す。第５図：本願発明の実施例において得られた本増強因子をコードするマウス遺伝子を含むDNA断片の塩基配列及びこれに対応するアミノ酸配列を示す。第６図：本増強因子p55cDNAのPCRを用いたLerner vectorへのリクローニングの方策を示す。第７図：本願発明の実施例において得られた本増強因子をコードするヒト遺伝子を含むDNA断片の塩基配列（上段）とマウス遺伝子を含むDNA断片の塩基配列（下段）との比較図である。図中(Q)は共通であることを示す。第８図：本増強因子のヒトアミノ酸配列（上段）とマウスアミノ酸配列（下段）との比較図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＤＮ 8413−4ＣＡＤＵＮ 8413−4ＣＣ１２Ｎ 5/20 15/06 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 8214−4ＢＣ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｍ 8310−2ＪＤ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8828−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者三浦惠二愛知県名古屋市緑区太子１丁目141 (72)発明者田沼靖一東京都八王子市小門町１―10 (72)発明者黒沢良和愛知県名古屋市名東区扇町１―39 (72)発明者粟屋昭神奈川県横浜市戸塚区矢部町1541

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生体組織・細胞由来であり、抗DNA抗
体産生を増強し、かつDNAと結合するタンパク質。
【請求項２】生体組織・細胞が、自己免疫疾患動物の
組織・細胞であることを特徴とする特許請求の範囲(1) 記載のDNA結合タンパク質。
【請求項３】生体組織・細胞がヒト及びマウスの臓
器、臓器由来細胞あるいはリンパ系細胞であることを特徴とする特許請求の範囲(2)記載のDNA結合タンパク質。
【請求項４】生体組織・細胞が、MRL/lマウスのリン
パ系細胞由来のKLM₁-7細胞株であることを特徴とする特許請求の範囲(3)記載のDNA結合タンパク質。
【請求項５】 DNA結合タンパク質がMRL/lマウスのリン
パ系細胞のKLM₁-7細胞株由来の抗DNA抗体生産生増強因子であるタンパク質と相同性の高いヒト由来であることを特徴とする特許請求の範囲(3)記載のDN A結合タンパク質。
【請求項６】生体組織・細胞由来であり、抗DNA抗体
産生を増強し、DNAと結合するタンパク質のアミノ酸配列に対応してコードする塩基配列を有する遺伝子。
【請求項７】特許請求の範囲(6)記載の遺伝子を含むD
NA断片。
【請求項８】中に含まれている遺伝子が特許請求の範
囲(4) 記載のマウス由来のDNA結合タンパク質をコードすることを特徴とする特許請求の範囲(7)のDNA断片。
【請求項９】中に含まれている遺伝子が特許請求の範
囲(5) 記載のヒト由来のDNA結合タンパク質をコードすすることを特徴とする特許請求の範囲(7)のDNA断片。
【請求項１０】 KML₁-7細胞株を血清存在下、コンフル
エントになるまで培養した後、無血清培地で大量に培養した培養上清を濃縮し、陰イオン交換樹脂に吸着し、0.2M以上の食塩を加えて、溶出される画分を精製することを特徴とする特許請求の範囲(1)記載のDNA結合タンパク質の製造方法。
【請求項１１】特許請求の範囲(7)記載のDNA断片をプ
ローブとして用い、プラークハイブリダイゼーションを行った結果、これに対して、ハイブリダイズしてくることによって得られる対象となる遺伝子を含むDNA断片。
【請求項１２】特許請求の範囲(7)記載のDNA断片をプ
ローブとして用い、プラークハイブリダイゼーションを行なった結果、これに対して、ハイブリダイズしてくることを利用することによる対象となる遺伝子を含むDNA断片を製造する方法。
【請求項１３】プローブとして特許請求の範囲(8)記
載のDNA 断片を選択し、特許請求の範囲(5)記載のヒト由来のDNA結合タンパク質をコードする特許請求の範囲(9)記載のDNA断片を得る特許請求の範囲(12)記載の製造方法。
【請求項１４】プローブとして特許請求の範囲(9)記
載のDNA 断片を選択し、特許請求の範囲(4)記載のマウス由来のDNA結合タンパク質をコードする特許請求の範囲(8)記載のDNA断片を得る特許請求の範囲(12)記載の製造方法。
【請求項１５】特許請求の範囲(6)記載の遺伝子をプ
ローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行うことによつて対象となる遺伝子をクローニングする方法。
【請求項１６】特許請求の範囲(6)記載の遺伝子とし
て特許請求の範囲(5)記載のヒト由来のDNA結合タンパク質をコードする遺伝子を選択することを特徴とする特許請求の範囲(15)記載の方法。
【請求項１７】特許請求の範囲(6)記載の遺伝子とし
て特許請求の範囲(4)記載のマウス由来のDNA結合タンパク質をコードする遺伝子を選択することを特徴とする特許請求の範囲(15)記載の方法。
【請求項１８】特許請求の範囲(4)記載のDNA結合タン
パク質をコードする特許請求の範囲(6)記載の遺伝子又は特許請求の範囲(7)記載のDNA断片を組み換えた各種の細胞、大腸菌、酵母などの微生物において発現させることを特徴とする特許請求の範囲(4)記載のDNA結合タンパク質を製造する方法。
【請求項１９】特許請求の範囲(1)記載のDNA結合タン
パク質を抗原として用い、これによって生体中に存在する該DNA結合タンパク質に対する抗体の存在量を測定する方法。
【請求項２０】特許請求の範囲(1)記載のDNA結合タン
パク質を抗原として動物に免疫することによってえられる害動物の抗体。
【請求項２１】 DNA結合タンパク質として特許請求の
範囲 (4)、又は同(5)記載のDNA結合タンパク質を選択することを特徴とする特許請求の範囲(20)記載の抗体。
【請求項２２】抗体がポリクロナール抗体であること
を特徴とする特許請求の範囲(20)記載の抗体。
【請求項２３】抗体がモノクロナール抗体であること
を特徴とする特許請求の範囲(20)記載の抗体。
【請求項２４】特許請求の範囲(1)記載のDNA結合タン
パクを抗原として動物に免疫にすることによって得られる該動物の抗体調製・製造方法。
【請求項２５】特許請求の範囲(20)記載の抗体を用い
て、RI A,EIA又はFIA等の測定を行うことによって、動物の血液、体液、組織におけるDNA結合タンパク質の量を測定する方法。
【請求項２６】抗体としてポリクロナール抗体又はモ
ノクロナール抗体を選択することを特徴とする特許請求の範囲(25)記載の測定方法。
【請求項２７】特許請求の範囲(20)記載の抗体を用い
た特許請求の範囲(1)記載のDNA結合タンパク質の過剰生成に伴う疾患に対する治療剤。