JP2022535429A - 免疫療法のための操作されたナチュラルキラー細胞と操作されたｔ細胞の組み合わせ - Google Patents

免疫療法のための操作されたナチュラルキラー細胞と操作されたｔ細胞の組み合わせ Download PDF

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Abstract

本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、キメラ抗原受容体を発現するように操作され、および／または細胞免疫療法における免疫細胞の有効性の１つ以上の態様を増大させるように遺伝子修飾された免疫細胞に関する。いくつかの実施形態は、細胞免疫療法の潜在的な副作用を減少させる遺伝子修飾に関する。いくつかの実施形態では、細胞の組み合わせを用いて、移植片対宿主効果の可能性が減少または排除された、迅速であり長期の腫瘍減少を達成する。

Description

関連案件
本出願は、２０１９年６月４日に出願された米国仮特許出願第６２／８５７，１６７号、及び２０１９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，６９７号の優先権の利益を主張し、各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、がん免疫療法のために遺伝子操作された細胞、特に遺伝子操作された免疫細胞型の組み合わせを含む方法および組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体を発現するように操作された細胞に関する。いくつかの実施形態では、さらなる操作が行われ、細胞ががん免疫療法において使用される場合に、有効性を増大させおよび／または潜在的な副作用を減少させる。
種々のがんについて、およびがん性細胞を健常な細胞から特異的に区別するために用いることができるがん性細胞がどのような特性を有するかついてさらなる知識が得られるにつれて、がん性細胞の顕著な特徴を利用する治療薬が開発中である。操作された免疫細胞を用いる免疫療法は、がんを処置する１つのアプローチである。
ＡＳＣＩＩテキストファイル中の情報の参照による組み込み
本出願は、同時に提出される次のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照することにより組み込む：ファイル名：ＮＫＴ０４３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；２０２０年６月１日に作製され、サイズは３２７ＫＢである。
免疫療法は、疾患の処置における新たな技術的進歩を提供し、免疫細胞は、疾患または損傷細胞を特異的に識別し反応する特定の標的化および／またはエフェクター分子を発現するように操作されている。これは、少なくとも部分的には、全ての細胞が影響を受ける化学療法などのより伝統的なアプローチとは対照的に、疾患または損傷細胞を特異的に標的化する可能性に起因する有望な進歩を示し、所望の転帰は、患者が生存するのに十分な健常な細胞が生存することである。１つの免疫療法アプローチは、目的の異常細胞の標的化された認識および破壊を達成するための免疫細胞におけるキメラ受容体の組換え発現である。
いくつかの実施形態では、免疫療法のための細胞は、より効果的な治療をもたらす細胞の１つ以上の特性を増大させるように遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された免疫細胞の拡大可能性、細胞傷害性および／または持続性のうちの１つ以上が増大する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はまた、腫瘍を標的とする細胞傷害性受容体を発現するように操作されている。本明細書には、いくつかの実施形態では、複数のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、がん免疫療法のための遺伝子操作されたＮＫ細胞集団が提供され、複数のＮＫ細胞は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体を発現するように操作され、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質を発現するように遺伝子編集され、減少したＣＩＳ発現は、ＣＩＳＨ遺伝子の編集を介して操作され、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然レベルのＣＩＳを発現するＮＫ細胞と比較して、増大した拡大能力、標的細胞に対する増大した細胞傷害性、および増大した持続性を示す。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体は、ＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５を発現するように操作されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＮＫ細胞の代わりにまたはＮＫ細胞に加えて、操作され、使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞は、操作された免疫細胞集団に含まれない。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、操作されたＮＫ細胞を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する受容体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体は、配列番号１４５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体は、配列番号１７４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含むかまたは本質的にそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、およびｓｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、コードされたＶＬドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞により発現されるＣＡＲは、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体断片は、コードされたタンパク質の潜在的抗原性を減少させるように、および／またはコードされたタンパク質の１つ以上の特性（例えば、標的認識および／または結合特性）を増大させるように設計されている（例えば、操作されている）。したがって、いくつかの実施形態によれば、抗ＣＤ１９抗体断片は、特定の配列を含まない。例えば、一部の実施形態によれば、抗ＣＤ１９抗体断片は、配列番号１１６によってコードされず、配列番号１０５または１０７のＶＬ領域も、配列番号１０４または１０６のＶＨ領域も含まない。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体断片は、配列番号１０８～１１５から選択される１つ以上のＣＤＲを含まない。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳの発現は、操作されていないＮＫ細胞と比較して実質的に減少する。本明細書に提供される特定の実施形態によれば、遺伝子編集は、ＣＩＳ（または本明細書に開示される他のもの）のような標的タンパク質の発現を、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９％、またはそれ以上（列挙されたものの間の任意の量を含む）減少させることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現が検出できないように、遺伝子を完全にノックアウトする。したがって、いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）は、検出可能なレベルのＣＩＳタンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルの形質転換増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦＢＲ）を発現するようにさらに遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴＧＦＢＲを発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルのベータ－２ミクロゴルブリン（Ｂ２Ｍ）を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルのＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター）を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＩＩＴＡを発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルのナチュラルキラーグループ２、メンバーＡ（ＮＫＧ２Ａ）受容体を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＮＫＧ２Ａを発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＣＢＬＢ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのＣｂｌプロトオンコジーンＢタンパク質を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣｂｌプロトオンコジーンＢタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＴＲＩＭ２９遺伝子によってコードされる、減少したレベルの三要素モチーフ含有タンパク質２９タンパク質を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴＲＩＭ２９タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＳＯＣＳ２遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカインシグナル伝達２タンパク質の抑制因子を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＳＯＣＳ２タンパク質を発現しない。実施形態に依存して、上記標的タンパク質／遺伝子の任意の組み合わせは、ＣＩＳとの組み合わせを含めて、タンパク質が検出可能なレベルで発現されないように、所望レベルに編集することができる。いくつかの実施形態では、一部の量の検出可能なタンパク質が残存し得るが、タンパク質の機能は破壊されるか、実質的に破壊されるか、排除されるか、または実質的に排除される。いくつかの実施形態では、いくつかの機能性が残存するとしても、操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）に付与された正の効果が残存し、細胞の１つ以上の抗がん側面を増大させるのに役立つ。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞をさらに遺伝子編集して、ＮＫ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）、ＮＫＧ２Ａ受容体、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３、ＫＩＲ２ＤＳ－１および／またはＫＩＲ２ＤＡ－２、ならびにそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、標的タンパク質の発現を「ノックインする」かまたは代わりに増大させるために使用される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上（列挙されたものの間の任意の量を含む）増大し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ４７を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｅを発現するようにさらに遺伝子操作されている。ノックインされた遺伝子は、ノックアウトするかまたは代わりに破壊された遺伝子のいずれかと組み合わせてノックインすることができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞集団は、遺伝子操作されたＴ細胞集団をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、実質的ではないにしても、少なくとも部分的に、非同種反応性である。いくつかの実施形態では、非同種反応性Ｔ細胞は、非同種反応性Ｔ細胞がレシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さないように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の少なくとも１つの遺伝子編集されたサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され、腫瘍マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲのうちの１つ以上である。一部の実施形態では、これらの腫瘍マーカーのうちの２つ以上の組み合わせを標的化することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、ＣＤ１９に対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９を標的化する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、コードされたタンパク質の潜在的抗原性を減少させ、および／またはコードされたタンパク質の１つ以上の特性（例えば、標的認識および／または結合特性）を増大させるように設計されている（例えば、操作されている）。したがって、いくつかの実施形態によれば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、特定の配列を含まない。例えば、いくつかの実施態様によれば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号１１６、配列番号１０５、１０７、１０４または１０６によって構成されない。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体断片は、配列番号１０８～１１５から選択される１つ以上のＣＤＲを含まない。
いくつかの実施形態では、修飾されたＴ細胞のＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲαである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のＴＣＲへの修飾により、Ｔ細胞集団の少なくとも８０％、８５％、または９０％が検出可能なレベルのＴＣＲを発現しなくなる。本明細書に開示される編集されたＮＫ細胞と同様に、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、操作されていないＴ細胞と比較して、ＣＩＳ、ＴＧＦＢＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＩＭ２９およびＳＯＣＳ２のうちの１つ以上の発現を減少させるか、またはＣＤ４７もしくはＨＬＡ－Ｅを発現させるためにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊するようにさらに遺伝子編集され、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、およびリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）から選択される。
実施形態に依存して、発現を減少させるためのＮＫ細胞および／またはＴ細胞の遺伝子編集、および／または発現を誘導するための遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。一部の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、発現を減少させるためのＮＫ細胞および／またはＴ細胞の遺伝子編集、および／または発現を誘導するための遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、発現を減少させるためのＮＫ細胞および／またはＴ細胞の遺伝子編集、および／または発現を誘導するための遺伝子編集は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞および／または遺伝子操作されたＴ細胞は、配列番号５と少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＯＸ４０サブドメインを有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞および／または遺伝子操作されたＴ細胞は、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＣＤ３ゼータサブドメインを有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞および／または遺伝子操作されたＴ細胞は、配列番号１１と少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるｍｂＩＬ１５を有する。
また、本明細書には、本明細書に開示されるように、遺伝子操作されたＮＫ細胞集団（および／または遺伝子操作されたＴ細胞集団）を対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法が提供される。また、本明細書には、がんの処置において本明細書に開示されるように、遺伝子操作されたＮＫ細胞集団（および／または遺伝子操作されたＴ細胞集団）の使用が提供される。また、本明細書には、がんの処置のための医薬の製造において本明細書に開示されるように、遺伝子操作されたＮＫ細胞集団（および／または遺伝子操作されたＴ細胞集団）の使用が提供される。
がんを処置する方法もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞集団を対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法が提供され、（ｉ）複数のＮＫ細胞であって、複数のＮＫ細胞が、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体を発現するように操作され、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、細胞により、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質を発現するように遺伝子編集され、減少したＣＩＳ発現は、ＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子編集を介して操作され、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然レベルのＣＩＳを発現するＮＫ細胞と比較して、増大した拡大能力、標的細胞に対する増大した細胞傷害性、および増大した持続性のうちの１つ以上を示す複数のＮＫ細胞と；適宜（ｉｉ）複数のＴ細胞とを含む。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体は、ＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞はまた、膜結合ＩＬ－１５を発現するように操作されている。
いくつかの実施形態では、含まれる場合、複数のＴ細胞は、実質的に非同種反応性である。有利には、いくつかの実施形態では、非同種反応性Ｔ細胞は、非同種反応性Ｔ細胞がレシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さないように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はまた、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせから選択され得る腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されている。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体は、配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体は、配列番号１７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、ＣＤ１９に対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、ＣＤ１９に対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞（およびＮＫ細胞）によって発現されるＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドはまた、膜結合ＩＬ１５をコードする。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよびｓｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞は、操作されていないＴ細胞と比較して、ＣＩＳ、ＴＧＦＢＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＩＭ２９およびＳＯＣＳ２のうちの１つ以上の発現を減少させるため、またはＣＤ４７もしくはＨＬＡ－Ｅを発現するためにさらに遺伝子編集されている。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞は、細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊するようにさらに遺伝子編集され、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、およびリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）、ＮＫＧ２Ａ受容体、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３、ＫＩＲ２ＤＳ－１および／またはＫＩＲ２ＤＡ－２から選択される。
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０サブドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータサブドメインは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
適用される本明細書に開示される方法の実施形態に応じて、発現を減少させるためのＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞の遺伝子編集、ならびに／または発現を誘導するための遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。一部の実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、発現を減少させるためのＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞の遺伝子編集、ならびに／または発現を誘導するための遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、発現を減少させるためのＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞の遺伝子編集、ならびに／または発現を誘導するための遺伝子編集は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる。
さらに、本明細書には、複数のＮＫ細胞を含む、がん免疫療法のための操作された細胞の混合集団が提供され、複数のＮＫ細胞は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体を発現するように操作され、ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、細胞により、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質を発現するように遺伝子編集され、減少したＣＩＳ発現は、ＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子編集を介して操作され、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然レベルのＣＩＳを発現するＮＫ細胞と比較して、増大した拡大能力、標的細胞に対する増大した細胞傷害性、および増大した持続性を示し、複数のＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾を介して実質的に非同種反応性であり、Ｔ細胞集団は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、およびＥＧＦＲのうちの１つ以上から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体および／またはＣＡＲの細胞傷害性シグナル伝達複合体は、ＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞は、膜結合ＩＬ－１５を発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、配列番号１７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体は、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。
本明細書には、いくつかの実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞によるＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質の発現を減少させるために遺伝子修飾され、免疫細胞による形質転換増殖因子ベータ受容体の発現を減少させるために遺伝子修飾され、免疫細胞によるナチュラルキラーグループ２、メンバーＡ（ＮＫＧ２Ａ）の発現を減少させるために遺伝子修飾され、免疫細胞によるＣＢＬＢ遺伝子によってコードされるＣｂｌプロトオンコジーンＢタンパク質の発現を減少させるために遺伝子修飾され、免疫細胞よるＴＲＩＭ２９遺伝子によってコードされる三要素モチーフ含有タンパク質２９タンパク質の発現を減少させるために遺伝子修飾され、および／または免疫細胞よるＳＯＣＳ２遺伝子によってコードされるサイトカインシグナル伝達２タンパク質の抑制因子の発現を減少させるために遺伝子修飾され、ならびに標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されている免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、集団は、ナチュラルキラー細胞を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、集団はＴ細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９に対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のヒト化ＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、細胞への遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、修飾はＣＩＳＨに対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１５３、１５４、１５５、１５６、もしくは１５７の配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされ；修飾はＴＧＦＢＲ２に対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、もしくは１５２の配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされ；修飾はＮＫＧ２Ａに対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１５８、１５９、もしくは１６０の配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされ；修飾はＣＢＬＢに対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１６４、１６５、もしくは１６６の配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされ；修飾はＴＲＩＭ２９に対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１６７、１６８、もしくは１６９の配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされ；および／または修飾はＳＯＣＳ２に対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１７１、１７２、もしくは１７３の配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾（複数可）は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾（複数可）は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、修飾されていない免疫細胞と比較して、増加した細胞傷害性、増加した生存率、および／または増加した抗腫瘍サイトカイン放出プロファイルを示す。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、細胞のドナーでない対象に投与された場合に、細胞に対する同種反応性を減少させるためにさらに遺伝子修飾されている。
また、本明細書には、がん免疫療法のための混合集団が提供され、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、およびＴＣＲδから選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットに対する少なくとも１つの修飾を介して実質的に非同種反応性であるＴ細胞集団を含み、それにより、ＴＣＲは、免疫細胞の混合集団が投与されたレシピエント対象のＴ細胞間で主要組織適合遺伝子複合体の差異を認識せず、Ｔ細胞集団は、腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され、腫瘍マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ受容体を発現するように操作され、ならびに細胞外リガンド結合ドメインは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたＴＣＲサブユニットはＴＣＲαである。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、それらが減少したレベルのＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩ分子を発現し、それにより、ＮＫ細胞およびＴ細胞が同種異系であるレシピエント対象の免疫系からの減少した免疫応答を誘導するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩ分子は、ベータ－ミクログロブリンおよび／またはＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター）である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊する修飾をさらに含む。実施形態に依存して、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）、ＮＫＧ２Ａ受容体、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３、ＫＩＲ２ＤＳ－１および／またはＫＩＲ２ＤＡ－２、ならびにそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞は、ＣＩＳの発現および／または機能を減少させるかまたは実質的に排除するようにさらに修飾されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５を発現するようにさらに操作されている。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞により発現されるＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はまた、膜結合ＩＬ１５を発現する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、ＣＡＲをコードする同じポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよびｓｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、コードされたＶＬドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一部の実施形態では、ＯＸ４０サブドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータサブドメインは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞により発現されるＣＡＲは、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞により発現されるキメラ受容体は、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ１５（キメラ受容体をコードする同じポリヌクレオチドによってコードされてもよい）を発現するようにさらに操作されている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾により、Ｔ細胞集団の少なくとも８０％が検出可能なレベルのＴＣＲを発現しなくなるが、Ｔ細胞集団の少なくとも７０％が検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｂ２Ｍ表面タンパク質、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）、形質転換増殖因子ベータ受容体、ナチュラルキラーグループ２、メンバーＡ（ＮＫＧ２Ａ）受容体、ＣＢＬＢ遺伝子によってコードされるＣｂｌプロトオンコジーンＢタンパク質、ＴＲＩＭ２９遺伝子によってコードされる三要素モチーフ含有タンパク質２９タンパク質、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によるＳＯＣＳ２遺伝子によってコードされるサイトカインシグナル伝達２タンパク質の抑制因子のうちの１つ以上の発現を減少させるようにさらに修飾されている。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、これらの標的タンパク質のいずれかの発現を、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９％、またはそれ以上（列挙されたものの間の任意の量を含む）減少させることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現が検出できないように、遺伝子を完全にノックアウトする。いくつかの実施形態では、標的タンパク質発現は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上（列挙されたものの間の任意の量を含む）増大し得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、ＣＤ４７を発現するようにさらに遺伝子編集されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｅを発現するようにさらに遺伝子操作されている。ノックインされる任意の遺伝子は、ノックアウトするかまたは代わりに破壊された遺伝子のいずれかと組み合わせてノックインすることができる。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾（複数可）、またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞のさらなる修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲへの修飾（複数可）、またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞のさらなる修飾は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾（複数可）、またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞のさらなる修飾は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる。
また、本明細書には、がん免疫療法のための免疫細胞の混合集団が提供され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾に起因して実質的に非同種反応性であるＴ細胞集団であって、それにより、非同種反応性Ｔ細胞は、レシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さず、Ｔ細胞集団は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせから選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されているＴ細胞集団と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団であって、ＮＫ細胞集団は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ受容体を発現するように操作され、細胞外リガンド結合ドメインは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有するＮＫ細胞集団とを含む。
また、本明細書には、本開示による免疫細胞の混合集団を対象に投与することを含む、移植片対宿主疾患を誘導することなく対象においてがんを処置する方法が提供される。本明細書には、がんの処置における本開示による免疫細胞の混合集団の使用が提供される。本明細書には、がんを処置するための医薬の製造における本開示による免疫細胞の混合集団の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の混合集団の少なくとも第１の用量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するための方法が提供され、細胞の混合集団は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせから選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された実質的に非同種反応性のＴ細胞集団、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ受容体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団とを含み、細胞外リガンド結合ドメインは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する。
いくつかの実施形態では、非同種反応性Ｔ細胞は、非同種反応性Ｔ細胞がレシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さないように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、ＣＤ１９に対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞により発現されるＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドはまた、膜結合ＩＬ１５をコードする。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよびｓｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、ＶＬドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むか、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞により発現されるＣＡＲは、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞によって発現されるキメラ受容体は、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドはまた、膜結合ＩＬ１５をコードする。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１７４と少なくとも９５％８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび／またはキメラ受容体のＯＸ４０サブドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび／またはキメラ受容体のＣＤ３ゼータサブドメインは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって発現されるｍｂＩＬ１５は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、がん免疫療法のための免疫細胞の混合集団が提供され、混合集団は、腫瘍抗原に対する指向性を有するＣＡＲを発現するＴ細胞集団であって、Ｔ細胞が実質的に非同種反応性であるように遺伝子修飾されたＴ細胞集団と、同じ腫瘍抗原に対する指向性を有するＣＡＲを発現するＮＫ細胞集団とを含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法のための免疫細胞の混合集団が提供され、混合集団は、腫瘍抗原に対する指向性を有するＣＡＲを発現するＴ細胞集団であって、Ｔ細胞が実質的に非同種反応性であるように遺伝子修飾されたＴ細胞集団と、さらなる腫瘍抗原に対する指向性を有するＣＡＲを発現するＮＫ細胞集団とを含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法のための免疫細胞の混合集団が提供され、混合集団は、実質的に非同種反応性であるＴ細胞集団と、腫瘍リガンドを標的化するキメラ受容体を発現するＮＫ細胞集団とを含む。
いくつかの実施形態では、非同種反応性Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾を含み、それにより、ＴＣＲは、免疫細胞の混合集団が投与された対象のＴ細胞間で主要組織適合性複合体の差異を認識することなく抗原を認識する。いくつかの実施形態では、非同種反応性Ｔ細胞集団は、腫瘍マーカー（例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍抗原）に対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されている。実施形態に依存して、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６（ただし、他のクラウジンではない）、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲのうちの１つ以上を標的化するように操作することができる。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ受容体を発現するように操作され、細胞外リガンド結合ドメインは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞はまた、ＣＡＲを発現するように操作され得、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６（ただし、他のクラウジンではない）、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ（またはＴ細胞とＮＫ細胞の両方が目的の同じ抗原を標的化するような任意の他の抗原）のうちの１つ以上を標的化するように操作され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊する突然変異を含む。例えば、Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１およびそれらの組み合わせから選択される免疫チェックポイントタンパク質に関して突然変異され得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４へのＢ７－１／Ｂ７－２の遮断はまた、不活性状態に維持されているＴ細胞を減少させるために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、それらがミスマッチしたかまたは突然変異したＣＴＬＡ４を発現するように改変されるが、いくつかの実施形態では、外因性物質を用いて、例えば、抗原提示細胞に結合し、および／または代わりに抗原提示細胞上のＢ７－１／Ｂ７－２のＣＴＬＡ４と相互作用する能力を阻害することができる。同様に、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞を修飾して、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤の発現を破壊することができる。いくつかの実施形態では、例えば、ＣＤＴＬＡ４またはＰＤ－１は、このようなチェックポイント阻害剤のＮＫ細胞傷害性応答を減少させる能力を低下させるために修飾され、例えば、突然変異される。いくつかの実施形態では、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３、ＣＤ２２３）は、ＮＫ細胞（および／またはＴ細胞）において破壊される。いくつかの実施形態では、阻害ＮＫＧ２Ａ受容体は、例えば、抗体によって突然変異されるか、ノックアウトされるか、または阻害される。モナリズマブは、非限定的な例として、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａ受容体による阻害シグナル伝達を破壊するために使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上の１つ以上のキラー阻害受容体（ＫＩＲ）は、（例えば、遺伝子修飾を介して）破壊されおよび／また遮断される。例えば、いくつかの実施形態では、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３、ＫＩＲ２ＤＳ－１および／またはＫＩＲ２ＤＡ－２のうちの１つ以上は、破壊されるかまたは遮断され、それによってＨＬＡ－Ｃ ＭＨＣ分子へのそれらの結合を妨げる。さらに、いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３は、修飾され、突然変異され（例えば、遺伝子編集を介して）、または代わりに機能的に破壊されて（例えば、抗体によって遮断されて）、それにより、リガンド結合時の免疫細胞の応答を抑制するその正常な機能が破壊される。いくつかのこのような実施形態では、ＴＩＭ３の発現または機能の破壊（例えば、ＣＲＩＳＰｒまたは本明細書に開示される他の方法による）、適宜１つ以上の免疫チェックポイントモジュレーターの破壊と組み合わせて、投与されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞は増大した抗腫瘍活性を有する。Ｔｉｍ－３はガレクチン－９分泌に関与し、後者はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む細胞傷害性リンパ系細胞の抗がん活性を損なうように機能する。ＴＩＭ３はまた可溶性形態で発現され、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の分泌を妨げる。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３、発現、分泌、または経路機能性の破壊は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性の増大を提供する。
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＴＭ３とも呼ばれる）は、修飾され、突然変異され（例えば、遺伝子編集を介して）、または代わりに機能的に破壊され（例えば、抗体によって遮断される）、それにより、リガンド結合時の免疫細胞の応答を抑制するその正常な機能が破壊される。ＣＤ１５５はＴＩＧＩＴのリガンドである。いくつかのの実施形態では、ＴＩＧＩＴ発現は、減少するかまたはノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴは、非活性化リガンドによって遮断されるか、またはその活性が、ＣＤ１５５の競合的阻害剤を介して減少する（その阻害剤はＴＩＧＩＴを活性化しない）。ＴＩＧＩＴは、阻害ＩＴＩＭモチーフを含み、いくつかの実施形態では、例えば、ＣＲＩＳＰｒを用いた遺伝子編集、または本明細書に開示された他の方法を介して切り出される。このような実施形態では、ＴＩＧＩＴの機能は減少し、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性の増大を可能にする。
いくつかの実施形態では、アデノシン受容体Ａ１は、修飾され、突然変異され（例えば、遺伝子編集を介して）、または代わりに機能的に破壊され（例えば、抗体によって遮断される）、それにより、リガンド結合時の免疫細胞の応答を抑制するその正常な機能が破壊される。アデノシンシグナル伝達は、免疫抑制代謝産物としてその機能の結果として、腫瘍免疫に関与する。したがって、いくつかの実施形態では、アデノシン受容体Ａ１発現は、減少するかまたはノックアウトされる。いくつかの実施形態では、アデノシン受容体Ａ１は、非活性化リガンドによって遮断されるか、またはその活性が、アデノシンの競合的阻害剤を介して減少する（その阻害剤は、アデノシンシグナル伝達経路を活性化しない）。いくつかの実施形態では、アデノシン受容体は、例えば、ＣＲＩＳＰｒを用いた遺伝子編集、または本明細書に開示される他の方法によって修飾され、その機能または発現を減少させ、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性の増大を可能にする。
いくつかの実施形態では、修飾されたＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、およびＴＣＲδから選択される。いくつかの実施形態では、修飾されたＴＣＲサブユニットはＴＣＲαである。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して行われる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われる。例えば、Ｃａｓは、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現の破壊は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現の破壊は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ（および適宜ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）の組み合わせは、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞のいずれかまたはその両方を修飾するために使用される。
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞、非同種反応性Ｔ細胞のいずれか、またはその両方は、膜結合ＩＬ－１５を発現するようにさらに操作されている。
有利には、混合細胞集団は、本明細書に提供される方法において有用であり、対象におけるがんは、移植片対宿主疾患を誘導することなく処置することができる。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＲを発現する非同種反応性Ｔ細胞とキメラ受容体を発現する操作されたＮＫ細胞の混合集団を対象に投与することを含む。また、がんの処置において、および／またはがんの処置のための薬剤の製造において、ＣＡＲを発現する非同種反応性Ｔ細胞とキメラ受容体を発現する操作されたＮＫ細胞の混合集団の使用が提供される。なおさらなる実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、それらを受け取る対象に関して同種異系である。いくつかの実施形態では、このような組み合わせは、同じ標的抗原に対する指向性を有するＮＫ細胞およびＴ細胞を伴う。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞とＴ細胞（例えば、非同種反応性Ｔ細胞）の両方は、それらを受け取る対象に関して同種異系であり、同じ抗原、例えば、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲを発現するように操作されている。一部の実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、別のマーカー、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６（ただし、他のクラウジンではない）、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ（またはＴ細胞とＮＫ細胞の両方が目的の同じ抗原を標的化するような任意の他の抗原）を発現する標的細胞の両方に構成される。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾により、Ｔ細胞集団の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が検出可能なレベルのＴＣＲを発現しなくなり、一方、同時にＴ細胞集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％がＣＡＲの検出可能なレベルを発現する。したがって、これらの細胞は、主として非同種反応性であり、抗腫瘍指向性ＣＡＲで作動可能化される。さらに、いくつかの実施形態では、同種異系Ｔ細胞からの免疫反応を制限するのに役立ち、少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質またはＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、非自己ＮＫ細胞に対して同種異系宿主が発生し得る免疫応答を減少させるように遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、それらが１つ以上のＭＣＨクラスＩおよび／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の減少した発現を示すように操作されている。いくつかの実施形態では、ベータ－ミクログロブリンの発現は、ＣＤ１９（または本明細書に開示される任意の他の抗原）などの腫瘍抗原に対する指向性を有するＣＡＲを発現する（または発現するように修飾されている）ＮＫ細胞の少なくとも一部において、実質的に、有意に、または完全に減少する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター）の発現は、ＣＤ１９（または本明細書に開示される任意の他の抗原）などの腫瘍抗原に対する指向性を有するＣＡＲを発現する（または発現するように修飾されている）ＮＫ細胞の少なくとも一部において、実質的に、有意に、または完全に減少する。いくつかの実施形態では、このような遺伝子修飾されたＮＫ細胞は、ＣＲＩＳＰｒ－Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、ＲＮＡｉまたは他の遺伝子編集技術を用いて生成される。本明細書で検討されるように、いくつかの実施形態では、同種異系性が減少したＮＫ細胞は、非同種反応性Ｔ細胞と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、修飾されたＮＫ細胞において、レシピエントの内因性先天性免疫細胞による検出を回避するのに役立つＣＤ４７を発現するように修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は同様の様式で修飾されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方は、レシピエントにおけるＮＫおよび／またはＴ細胞の持続性に役立ち、したがって、抗腫瘍効果を増大させるＣＤ４７を発現するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、修飾されたＮＫ細胞において、レシピエントの内因性先天性免疫細胞による検出を回避するのに役立つＨＬＡ－Ｇを発現するように修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は同様の様式で修飾されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方は、レシピエントにおけるＮＫおよび／またはＴ細胞の持続性に役立ち、したがって、抗腫瘍効果を増大させるＨＬＡ－Ｇを発現するように修飾されている。いくつかの実施形態では、同種反応性が減少し、同じ抗原に対してＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞およびＮＫ細胞は、同種異系患者におけるがんを処置するために使用される。
いくつかの実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞による形質転換増殖因子ベータ受容体の発現を減少させるように遺伝子修飾され、標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された免疫細胞集団を含む。さらなる実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞によりナチュラルキラーグループ２、メンバーＡ（ＮＫＧ２Ａ）受容体の発現を減少させるように遺伝子修飾され、標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された免疫細胞集団を含む。さらなる実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞によるＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質の発現を減少させるように遺伝子修飾され、標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された免疫細胞集団を含む。ＣＩＳＨは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性における阻害チェックポイントである。さらなる実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞によるＣＢＬＢ遺伝子によってコードされるＣｂｌプロトオンコジーンＢタンパク質の発現を減少させるように遺伝子修飾され、標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された免疫細胞集団を含む。ＣＢＬＢはＥ３ユビキチンリガーゼであり、ＮＫ細胞活性化の負の調節因子である。さらなる実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞によりＴＲＩＭ２９遺伝子によってコードされる三要素モチーフ含有タンパク質２９タンパク質の発現を減少させるように遺伝子修飾され、標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された免疫細胞集団を含む。ＴＲＩＭ２９はＥ３ユビキチンリガーゼであり、活性化後のＮＫ細胞機能の負の調節因子である。さらなる実施形態では、がん免疫療法のための遺伝子改変された免疫細胞集団が提供され、免疫細胞によりＳＯＣＳ２遺伝子によってコードされるサイトカインシグナル伝達２タンパク質の抑制因子の発現を減少させるように遺伝子修飾され、標的腫瘍細胞上に存在する腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された免疫細胞集団を含む。ＳＯＣＳ２はＮＫ細胞機能の負の調節因子である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞集団は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞などのさらなる免疫細胞がまた含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に対する指向性を有する。一部のこのような実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のヒト化ＣＤＲ配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１２３に対する指向性を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、１を超える標的に対する指向性を有する１を超えるＣＡＲを発現するように操作されている。場合により、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の混合集団が使用され、Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、各々、実施形態に依存して、同一のがんマーカーに対する指向性を有し得るかまたは指向性を有し得ない、少なくとも１つのＣＡＲを発現することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する指向性を有するＣＡＲを発現する。
上記で検討したように、いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＲＩＳＰｒに基づくアプローチを用いて編集されている。いくつかの実施形態では、修飾は、ＴＧＦＢＲ２に対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、もしくは１５２の配列、または配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、もしくは１５２の配列を含む配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。いくつかの実施形態では、修飾は、ＮＫＧ２Ａに対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、配列番号１５８、１５９、もしくは１６０の配列、または配列番号１５８、１５９、もしくは１６０の配列を含む配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＩＳＨに対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１５３、１５４、１５５、１５６、もしくは１５７の配列、または配列番号１５３、１５４、１５５、１５６、もしくは１５７の配列を含む配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＢＬＢに対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１６４、１６５もしくは１６６の配列、または配列番号１６４、１６５、もしくは１６６の配列を含む配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。いくつかの実施形態では、修飾はＴＲＩＭ２９に対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１６７、１６８、もしくは１６９の配列、または配列番号１６７、１６８、もしくは１６９の配列を含む配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。いくつかの実施形態では、修飾はＳＯＣＳ２に対するものであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１７１、１７２、もしくは１７３の配列、または配列番号１７１、１７２、もしくは１７３の配列を含む配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含むものから選択される１つ以上のガイドＲＮＡによってガイドされる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、同種移植に適した操作されたＴ細胞を生成する方法が提供され、方法は、Ｔ細胞に、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、Ｔ細胞受容体遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、およびＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを含み、ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体、および（ｉｖ）膜結合ＩＬ１５を含み、ＣＡＲをコードする核酸は、左右の相同アームによってＴ細胞受容体遺伝子座に隣接され、（ｂ）培養において操作されたＴ細胞を拡大する。
また、同種移植に適した操作されたＴ細胞についてのさらなる方法が提供され、方法は、ＴＣＲの少なくとも１つのサブユニットの発現を破壊するために、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、およびＴ細胞受容体遺伝子を標的化するｇＲＮＡをＴ細胞にデリバリーし、ＣＡＲをコードする核酸を含む核酸ベクターをＴ細胞にデリバリーし、ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体、および（ｉｖ）膜結合ＩＬ１５を含み、培養において操作されたＴ細胞を拡大することを含む。
さらに、方法、例えば、同種移植に適した操作されたＴ細胞を生成する方法が提供され、方法は、ＴＣＲの少なくとも１つのサブユニットの発現を破壊するために、Ｔ細胞受容体遺伝子の標的領域において標的化された二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるヌクレアーゼをＴ細胞にデリバリーし、ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターをＴ細胞にデリバリーし、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、およびＥＧＦＲのうちの１つ以上を認識する抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体、ならびに（ｉｖ）膜結合ＩＬ１５を含み、培養において操作されたＴ細胞を拡大することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、免疫チェックポイントタンパク質をコードする少なくとも第１の遺伝子を不活性化することによって、Ｔ細胞を修飾することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント遺伝子は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、および２Ｂ４からなる群から選択される。
がんを処置する方法が提供され、方法は、本明細書に開示される実施形態に従い、同種異系移植に適したＴ細胞を生成し、Ｔ細胞はドナー由来であり、同じドナーから拡大させたＮＫ細胞集団に形質導入して、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化キメラ受容体を発現させ、操作されたＮＫ細胞集団を生成し、Ｔ細胞および／または操作されたＮＫ細胞集団をさらに拡大してもよく、同種異系移植に適したＴ細胞を操作されたＮＫ細胞集団と組み合わせ、合わせたＮＫ細胞およびＴ細胞集団を、ドナーに関して同種異系である対象に投与することを含む。
がんを処置する方法が提供され、方法は、本明細書に開示される実施形態に従い、同種異系移植に適したＴ細胞を生成し、Ｔ細胞はドナー由来であり、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６（ただし、他のクラウジンではない）、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、またはＥＧＦＲに対する指向性を有するＣＡＲを発現するように修飾され、同じドナーから拡大させたＮＫ細胞集団に形質導入して、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６（ただし、他のクラウジンではない）、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、またはＥＧＦＲに対する指向性を有するＣＡＲを発現させ、操作されたＮＫ細胞集団を生成し、Ｔ細胞および／または操作されたＮＫ細胞集団をさらに拡大してもよく、同種異系移植に適したＴ細胞を操作されたＮＫ細胞集団と組み合わせ、合わせたＮＫ細胞およびＴ細胞集団を、ドナーに関して同種異系である対象に投与することを含む。
がんの対象を処置するためのさらなる方法もまた提供され、方法は、本明細書に開示される実施形態に従い、同種異系移植に適したＴ細胞を生成し、Ｔ細胞は第１のドナー由来であり、第２のドナーから拡大させたＮＫ細胞集団に形質導入して、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む活性化キメラ受容体を発現させ、操作されたＮＫ細胞集団を生成し、Ｔ細胞および／または操作されたＮＫ細胞集団をさらに拡大してもよく、同種異系移植に適したＴ細胞を操作されたＮＫ細胞集団と組み合わせ、合わせたＮＫ細胞およびＴ細胞集団を、第１および第２のドナーに関して同種異系である対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書には、ＣＤ１９指向性キメラ受容体を発現する免疫細胞、およびさらには免疫細胞集団が提供され、キメラ受容体は、細胞外抗ＣＤ１９結合部分、ヒンジおよび／または膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。また、本明細書には、ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体、細胞外抗ＣＤ１９結合部分、ヒンジおよび／または膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド（ならびに、これを用いて細胞をトランスフェクトするためのベクター）が提供される。
また、本明細書には、いくつかの実施形態では、ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、キメラ抗原受容体は、細胞外抗ＣＤ１９結合部分を含み、抗ＣＤ１９結合部分は、ｓｃＦｖ、ヒンジ、ヒンジはＣＤ８アルファヒンジであり、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータＩＴＡＭを含む、を含む。
本明細書には、いくつかの実施形態では、ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、キメラ抗原受容体は細胞外抗ＣＤ１９結合部分、抗ＣＤ１９結合部分は、ｓｃＦｖの可変重鎖またはｓｃＦｖの可変軽鎖を含み、ヒンジはＣＤ８アルファヒンジであり、膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインはＣＤ８アルファ膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータＩＴＡＭを含む、を含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８アルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含むかまたはそれをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むかまたはそれをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインを含むかまたはさらにそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むかまたはそれをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳ、ＣＤ７０、ＣＤ１６１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、およびそれらの組み合わせから選択されるドメインを含むかまたはそれをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、切断された上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲｔは、可溶性因子として細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲｔは膜結合形態で発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、膜結合インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする。また、本明細書には、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞（例えば、ＮＫもしくはＴ細胞、またはそれらの混合物）が提供される。さらに、本明細書に開示されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を、がんを有する対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんの処置において、および／またはがんの処置のための薬剤の製造において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの使用が提供される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、配列番号３３または３２のＶＨおよび／またはＶＬ配列に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号３３および／または３２のＶＨおよびＶＬ配列は、ヒト化キャンペーンの対象であり、したがって、ヒト対象に投与した場合、より容易に発現されおよび／またはより免疫原性が低い。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、ＣＤ１９を標的化するｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖは、配列番号３５の配列または配列番号３５と少なくとも９５％同一の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、ＣＤ１９を標的化するｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖは、配列番号３６の配列または配列番号３６と少なくとも９５％同一の配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）を含む。実施形態に応じて、ＬＣ ＣＤＲおよびＨＣ ＣＤＲの種々の組み合わせが使用される。例えば、一実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤ２、およびＨＣ、ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、他の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号３７の配列、または配列番号３７の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号３８の配列、または配列番号３８の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号３９の配列、または配列番号３９の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４０の配列、または配列番号４０の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４１、４２、もしくは４３の配列、または配列番号４１、４２、もしくは４３の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号４４の配列、または配列番号４４の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＨＬ）を含む抗ＣＤ１９結合部分も提供され、ＶＬ領域は、第１、第２および第３の相補性決定領域（それぞれＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３）を含み、ＶＨ領域は第１、第２および第３の相補性決定領域（それぞれＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号４５、４６、４７、もしくは４８の配列、または配列番号４５、４６、４７、もしくは４８の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４９、５０、５１もしくは５２の配列、または配列番号４９、５０、５１もしくは５２の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む抗ＣＤ１９結合部分も提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号５３の配列、または配列番号５３の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号５４の配列、または配列番号５４の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号５５の配列、または配列番号５５の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号５６の配列、または配列番号５６の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号５７の配列、または配列番号５７の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号５８の配列、または配列番号５８の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０サブドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータサブドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０サブドメインは、配列番号６のアミノ酸配列（または配列番号６の配列と少なくとも約９５％相同な配列）を含み、ＣＤ３ゼータサブドメインは、配列番号８のアミノ酸配列（または配列番号８の配列と少なくとも約９５％相同な配列）を含む。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ａヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａヒンジドメインは、配列番号２のアミノ酸配列（または配列番号２の配列と少なくとも約９５％相同な配列）を含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はまた、膜結合インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体の細胞外ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫＧ２Ｄ受容体の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞傷害性シグナル伝達複合体、および適宜ｍｂＩＬ１５を含む第２のキメラ受容体を発現する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ受容体の細胞外ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６の配列と少なくとも約９５％相同な配列を含むＮＫＧ２Ｄの機能的断片を含む。種々の実施形態では、本明細書に開示されるキメラ抗原受容体および／またはキメラ受容体を発現するように操作されている免疫細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞が使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫおよびＴ細胞（および／または他の免疫細胞）の組み合わせが使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書には、本明細書に開示されるＣＤ１９を標的化する操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法が提供される。また、本明細書には、がんの処置のために、本明細書に開示されるＣＤ１９を標的化する免疫細胞の使用が提供される。同様に、本明細書には、がんの処置のための薬剤の調製における、本明細書に開示されるＣＤ１９を標的化する免疫細胞の使用が提供される。いくつかの実施形態では、処置されるがんは、急性リンパ性白血病である。
本明細書に記載される方法および組成物の一部の実施形態は、免疫細胞に関する。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞外抗ＣＤ１９部分、ヒンジおよび／または膜貫通ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９指向性キメラ受容体を発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ａヒンジドメインを含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、Ｉｇ４ ＳＨドメインを含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３膜貫通ドメインを含む。
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１６ ＩＣシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータまたはＣＤ３ζ ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ｍｂＩＬ－１５シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、２Ａ切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ｍＩＬ－１５シグナル伝達ドメインは、２Ａ切断ドメインによって、ＣＤ１９指向性キメラ受容体の残りまたは別の部分から分離される。
一部の実施形態は、本明細書に記載される免疫細胞を、必要とする対象に投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、対象はがんを有する。一部の実施形態では、投与は、がんを処置し、阻害し、またはその進行を妨げる。
図１は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体の非限定的な例を示す。
図２は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体のさらなる非限定的な例を示す。
図３は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体のさらなる非限定的な例を示す。
図４は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体のさらなる非限定的な例を示す。
図５は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体のさらなる非限定的な例を示す。
図６は、腫瘍マーカーの非限定的な例に対する指向性を有する腫瘍指向性キメラ抗原受容体の非限定的な例を示す。 同上。
図７は、腫瘍マーカーの非限定的な例に対する指向性を有する腫瘍指向性キメラ抗原受容体のさらなる非限定的な例を示す。
図８Ａ～８Ｉは、本明細書に開示される遺伝子編集技術を介して改変される種々の経路を概略的に示す。図８Ａは、腫瘍微小環境における腫瘍細胞によるＴＧＦ－ベータ放出の阻害効果の概略図を示す。図８Ｂは、ＩＬ－１５機能に対するＣＩＳ／ＣＩＳＨの負の調節経路の概略図を示す。図８Ｃは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による、併用療法において使用するための、操作された非同種反応性Ｔ細胞および操作されたＮＫ細胞を生成するための非限定的な概略的プロセスの流れを示す。図８Ｄは、移植片対宿主病をもたらし得るシグナル伝達経路の概略図を示す。図８Ｅは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態が、移植片対宿主病を減少および／または排除する方法の概略図を示す。図８Ｆは、宿主対移植片拒絶をもたらし得るシグナル伝達経路の概略図を示す。図８Ｇは、宿主対移植片拒絶を減少および／または排除することができる、本明細書に開示されるいくつかのの実施形態の概略図を示す。図８Ｈは、編集された免疫細胞が、混合細胞産物中の他の編集された免疫細胞に対してどのように作用し得るかの概略図を示す。図８Ｉは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態が、編集された免疫細胞に対する宿主免疫効果を減少および／または排除することができる方法の概略図を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図９Ａ～９Ｇは、ＮＫ細胞によるＴＧＦＢ２Ｒの発現を減少させるための種々のガイドＲＮＡの使用に関するフローサイトメトリーデータを示す。図９Ａは、対照データを示す。図９ＢはガイドＲＮＡ１の使用から得られたデータを示し；図９ＣはガイドＲＮＡ２の使用から得られたデータを示し；図９ＤはガイドＲＮＡ３の使用から得られたデータを示し；図９ＥはガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ２の使用から得られたデータを示し；図９ＦはガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ３の使用から得られたデータを示し；図９ＧはガイドＲＮＡ２およびガイドＲＮＡ３の使用から得られたデータを示す。発現は、指示されたガイドＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの７日後に評価された。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１０Ａ～１０Ｇは、種々のガイドＲＮＡによるエレクトロポレーションに応答するＮＫ細胞によるＴＧＦＢ２Ｒの発現の減少に関する次世代配列データを示す。図１０Ａは、対照データを示す。図１０ＢはガイドＲＮＡ１の使用から得られたデータを示し；図１０ＣはガイドＲＮＡ２の使用から得られたデータを示し；図１０ＤはガイドＲＮＡ３の使用から得られたデータを示し；図１０ＥはガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ２の使用から得られたデータを示し；図１０ＦはガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ３の使用から得られたデータを示し；図１０ＧはガイドＲＮＡ２およびガイドＲＮＡ３の使用から得られたデータを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１１Ａ～１１Ｄは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９によるＴＧＦＢ２Ｒ発現のノックダウン後のＴＧＦｂの存在下または非存在下における腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を比較するデータを示す。図１１Ａは、ガイドＲＮＡ１および２を用いたＴＧＦＢ２Ｒノックダウン後の細胞傷害性の変化を示す。図１１Ｂは、ガイドＲＮＡ１および３を用いたＴＧＦＢ２Ｒノックダウン後の細胞傷害性の変化を示す。図１１Ｃは、ガイドＲＮＡ２および３を用いたＴＧＦＢ２Ｒノックダウン後の細胞傷害性の変化を示す。図１１Ｄは、模擬ＴＧＦＢＲ２ノックダウンに関するデータを示す。 同上。 同上。 同上。
図１２Ａ～１２Ｆは、さらなるガイドＲＮＡによるＴＧＦＢ２Ｒの減少した発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。図１２Ａは、ＴＧＦＢ２Ｒを発現する同じ細胞の染色されていない対照を示す。図１２Ｂは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集エレメントを用いたエレクトロポレーションの非存在下で、ＴＧＦＢ２Ｒを発現するＮＫ細胞についての陽性対照データを示す。図１２Ｃは、ガイドＲＮＡ４を使用した場合のＴＧＦＢ２Ｒ発現のノックダウンを示す。図１２Ｄは、ガイドＲＮＡ５を使用した場合のＴＧＦＢ２Ｒ発現のノックダウンを示す。図１２Ｅは、ガイドＲＮＡ６を使用した場合のＴＧＦＢ２Ｒ発現のノックダウンを示す。図１２Ｆは、ガイドＲＮＡ２および３の１：１の比率を使用した場合のＴＧＦＢ２Ｒ発現のノックダウンを示す。ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集エレメントを用いたエレクトロポレーションの４日後にデータを収集した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１３Ａ～１３Ｆは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９を介したＴＧＦＢ２Ｒのノックダウンに供した場合のＮＫ細胞によるキメラ抗原受容体（ここでは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＮＫ１９－１）の発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。図１３Ａは、ＮＫ１９－１を発現するように操作されていないＮＫ細胞についての陰性対照を示す。図１３Ｂは、ＮＫ１９－１を発現するように操作されたが、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集エレメントでエレクトロポレーションされなかったＮＫ細胞についての陽性対照データを示す。図１３Ｃは、ＴＧＦＢ２Ｒ発現をノックダウンするためにガイドＲＮＡ４を用いたエレクトロポレーションに供されたＮＫ細胞におけるＮＫ１９－１発現に関するデータを示す。図１３Ｄは、ガイドＲＮＡ５を用いたエレクトロポレーションに供して、ＴＧＦＢ２Ｒ発現をノックダウンさせたＮＫ細胞におけるＮＫ１９－１発現に関するデータを示す。図１３Ｅは、ガイドＲＮＡ６を用いたエレクトロポレーションに供して、ＴＧＦＢ２Ｒ発現をノックダウンさせたＮＫ細胞におけるＮＫ１９－１発現に関するデータを示す。図１３Ｆは、ガイドＲＮＡ２および３を用いたエレクトロポレーションに供して、ＴＧＦＢ２Ｒ発現をノックダウンさせたＮＫ細胞におけるＮＫ１９－１発現に関するデータを示す。ＮＫ１９－１をコードするベクターを用いて、形質導入の４日後にデータを収集した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１４Ａ～１４Ｄは、ＴＧＦＢ２Ｒ発現の単一ガイドＲＮＡノックダウンの結果としての、ＴＧＦｂ阻害に対するＣＡＲ（ここでは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＮＫ１９－１）の非限定的な例を発現するＮＫ細胞の抵抗性に関するデータを示す。図１４Ａは、腫瘍微小環境を再現するために、ＮＫ細胞をＴＧＦベータ中のＮａｌｍ６細胞とともに培養したＮａｌｍ６腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１４Ｂおよび１４Ｃは、ＴＧＦＢ２受容体がノックアウトされなかった対照データ（１４Ｃ）を示し、図１４Ｃは、選択された曲線をより明確に示すために、１４Ａから抽出された選択されたデータ曲線を示す。図１４Ｄは、ＮＫ細胞の処理の概略図を示す。ＮＫ細胞を、０日目にＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９および単一ガイドＲＮＡを用いたエレクトロポレーションに供し、高ＩＬ－２培地中で１日間培養し、続いて、フィーダー細胞（例えば、４－１ＢＢＬおよび／またはｍｂＩＬ１５を発現する修飾されたＫ５６２細胞）とともに低ＩＬ－２培養を行った。７日目に、ＮＫ細胞に、ＮＫ１９－１ ＣＡＲコンストラクトをコードするウイルスを用いて形質導入した。１４日目に、得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。 同上。 同上。 同上。
図１５Ａ～１５Ｄは、初代およびＮＫ１９－１を発現するＮＫ細胞によるサイトカイン分泌の増大に関するデータを示す。図１５Ａは、ＩＦＮガンマの分泌に関するデータを示す。図１５Ｂは、ＧＭ－ＣＳＦの分泌に関するデータを示す。図１５ＣはグランザイムＢの分泌に関するデータを示す。図１５ＤはＴＮＦ－アルファの分泌に関するデータを示す。 同上。 同上。 同上。
図１６Ａ～１６Ｄは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９の使用によるＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトに関するデータを示す。図１６Ａは、模擬遺伝子編集プロトコルに供されたＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａの発現を示す。図１６Ｂは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ１を用いた編集後のＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａ発現を示す。図１６Ｃは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ２を用いた編集後のＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａ発現を示す。図１６Ｄは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ３を用いた編集後のＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａ発現を示す。 同上。 同上。 同上。
図１７Ａ～１７Ｂは、（模擬細胞と比較して）ノックアウトＮＫＧ２Ａ発現を有するＮＫ細胞の細胞傷害性に関するデータを示す。図１７Ａは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集エレメントを用いたエレクトロポレーションの７日後におけるＲＥＨ細胞に対するＮＫＧ２Ａ編集されたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１７Ｂは、ＲＥＨ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現の程度に関するフローサイトメトリーデータを示す。 同上。
図１８は、模擬ＮＫ細胞、またはヒトにおけるＣＩＳをコードするＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子編集により、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）発現がノックアウトされたＮＫ細胞の細胞傷害性に関するデータを示す。ＣＩＳは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性における阻害チェックポイントである。ＲＥＨ腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集エレメントを用いたエレクトロポレーションの７日後に測定された。
図１９Ａ～１９Ｅは、ＮＫ細胞によるキメラ抗原受容体コンストラクト（ここでは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＮＫ１９－１）の非限定的な例の発現に対するＣＩＳＨノックアウトの影響に関するデータを示す。図１９Ａは、対照（未処理）ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ発現（検出目的でこのコンストラクトに含まれるＦＬＡＧ発現によって測定され、一方、ＣＡＲのさらなる実施形態は、タグを含まない）を示す。図１９Ｂは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ１を用いたＣＩＳＨノックダウンに供されたＮＫ細胞における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。図１９Ｃは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ２を用いたＣＩＳＨノックダウンに供されたＮＫ細胞における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。図１９Ｄは、模擬遺伝子編集条件（エレクトロポレーションのみ）に供されたＮＫ細胞における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。図１９Ｅは、３５ｋＤａでＣＩＳタンパク質バンドの消失を示すウエスタンブロットを示し、ＣＩＳＨ遺伝子のノックアウトを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２０Ａ～２０Ｂは、Ｎａｌｍ６腫瘍細胞に対してＣＡＲを発現するように遺伝子編集を介した修飾されたおよび／または操作されたドナーＮＫ細胞を用いた細胞傷害性アッセイからのデータを示す。図２０Ａは、指示されたＣＡＲコンストラクトの形質導入の７日後に収集されたデータを用いた、１：２エフェクター：標的比での一重チャレンジアッセイからのデータを示す。図２０Ｂは、二重チャレンジモデルからのデータを示し、対照、編集、および／または編集／操作されたＮＫ細胞に２つの時点でＮａｌｍ６腫瘍細胞を用いてチャレンジを行った。 同上。
図２１Ａ～２１Ｂは、培養における長期にわたるＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞生存および細胞傷害性に関連したデータを示す。図２１Ａは、ＮＫ細胞を指示されたように処理した場合の、経時的なＮＫ細胞生存データを示す。図２１Ｂは、１００日間培養した後の腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性データを示す。 同上。
図２２Ａ～２２Ｅは、指示された対照、遺伝子編集、またはＣＡＲ状態を発現させるための遺伝子編集＋操作により処理されたＮＫ細胞によるサイトカイン放出データを示す。図２２Ａは、インターフェロンガンマ放出に関するデータを示す。図２２Ｂは、腫瘍壊死因子アルファ放出に関するデータを示す。図２２Ｃは、ＧＭ－ＣＳＦ放出に関するデータを示す。図２２Ｄは、グランザイムＢ放出に関するデータを示す。図２２Ｅは、パーフォリン放出に関するデータを示す。 同上。 同上。
図２３Ａ～２３Ｃは、ＣｂｌプロトオンコジーンＢ（ＣＢＬＢ）または三要素モチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）発現のいずれかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によってノックアウトされた、模擬ＮＫ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイからのデータを示す。図２３Ａは、３つの異なるＣＢＬＢ ｇＲＮＡ、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ５、または擬似ＮＫ細胞でノックアウトされたＮＫ細胞に関する細胞傷害性データを示す。図２３Ｂは、３つの異なるＴＲＩＭ１９ ｇＲＮＡ、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ５、または擬似ＮＫ細胞でノックアウトされたＮＫ細胞に関する細胞傷害性データを示す。図２３Ｃは、エレクトロポレーションおよび細胞傷害性アッセイのタイムラインを示す。 同上。 同上。
図２４Ａ～２４Ｃは、サイトカインシグナル伝達２（ＳＯＣＳ２）の抑制因子またはＣＩＳＨ発現のいずれかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によってノックアウトされた、模擬ＮＫ細胞またはＮＫ細胞の経時的な細胞傷害性アッセイからのデータを示す。図２４Ａは、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションシステムを用いて、３つの異なるＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡ、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ２、またはＣＤ４５ ｇＲＮＡでノックアウトされたＮＫ細胞の経時的な細胞傷害性データを示す。図２４Ｂは、Ｌｏｎｚａエレクトロポレーションシステムを用いて、３つの異なるＳＯＣｓ２ ｇＲＮＡ、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ２またはＣＤ４５ ｇＲＮＡでノックアウトされたＮＫ細胞に関する経時的な細胞傷害性データを示す。図２４Ｃは、エレクトロポレーションおよび細胞傷害性アッセイのタイムラインを示す。 同上。 同上。
本明細書に提供される方法および組成物の一部の実施形態は、免疫療法における使用のための操作された免疫細胞およびその組み合わせに関する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、例えば、細胞傷害性誘導性受容体複合体を発現するために、複数の方法で操作される。本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害性受容体複合体」は、その通常の意味を与えられるものとし、（特に断らない限り）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ受容体（ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体の場合、活性化キメラ受容体とも呼ばれる）に言及するものとする。いくつかの実施形態では、細胞は、非腫瘍組織に対する細胞の反応性の修飾を達成するようにさらに操作される。いくつかの実施形態は、得られたＴ細胞が減少および／または排除した同種反応性を有するような、種々の遺伝子工学的方法を介するＴ細胞の修飾に関する。このような非同種反応性Ｔ細胞はまた、非同種反応性Ｔ細胞が腫瘍細胞に対して細胞傷害効果を付与することを可能にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はまた、都市誘導性受容体複合体（例えば、キメラ抗原受容体またはキメラ受容体）を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、これらの操作された免疫細胞型の組み合わせが免疫療法において使用され、迅速（ＮＫ細胞ベース）と持続性（Ｔ細胞ベース）の抗腫瘍効果の両方がもたらされるが、いずれも有利には移植片対宿主疾患をほとんどまたは全く有さない。いくつかの実施形態は、免疫療法における組成物または細胞の使用方法を含む。
用語「抗がん効果」とは、限定されないが、腫瘍容量の低下、がん細胞数の低下、転移数の低下、平均寿命の増加、がん細胞増殖の低下、がん細胞生存の低下、および／またはがん性状態に関連する種々の生理学的症状の軽快を含む、種々の手段によって発現し得る生物学的効果を指す。
細胞型
本明細書に提供される方法および組成物の一部の実施形態は、免疫細胞などの細胞を指す例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞は、ＣＤ１９指向性キメラ受容体などのキメラ受容体を含むように操作され得るか、または本明細書に記載されるように、上記キメラ受容体をコードする核酸を含むように操作され得る。さらなる実施形態は、本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄキメラ受容体複合体などの別の細胞傷害性受容体複合体を発現させるために、第２のセットの細胞を操作することに関する。さらに追加の実施形態は、レシピエント細胞（移植片対宿主病）に対して同種反応性であるドナーＴ細胞の能力を減少させ、破壊し、最小化しおよび／または排除するためのＴ細胞（例えば、ドナーＴ細胞）のさらなる遺伝子操作に関する。
伝統的な抗がん療法は、外科的アプローチ、放射線療法、化学療法、またはこれらの方法の組み合わせに依存していた。研究によってある種のがんのメカニズムの一部についての理解が深まるにつれて、この知見は標的化されたがん治療法の開発に利用された。標的療法は、がん細胞、またはがんの増殖を支持する細胞（血管細胞など）に見出される特定の遺伝子またはタンパク質を標的とする特定の薬物を用いて、がん細胞の増殖を抑制または阻止するがん処置である。より最近では、遺伝子工学によって、免疫系の特定の側面を利用してがんと戦うアプローチを開発することが可能になってきた。いくつか場合では、患者自身の免疫細胞を修飾して、その患者のがんタイプを特異的に根絶する。以下により詳細に記載されるように、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ細胞）、またはそれらの組み合わせなどの種々のタイプの免疫細胞を使用することができる。
がん免疫療法を容易にするために、標的結合部分（例えば、リガンドの細胞外結合剤、またはがん細胞により発現される腫瘍マーカー指向性キメラ受容体）および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびベクターが本明細書において提供される。例えば、一部の実施形態は、がんに対する免疫細胞の標的化を促進し、がん細胞における細胞傷害効果を発揮するために、とりわけ、例えば、腫瘍マーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲに対する指向性を有するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクターを含む。また、このようなＣＡＲを発現する操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が提供される。また、本明細書には、いくつかの実施形態では、２つ以上のサブドメインを含む細胞外ドメインを含むコンストラクトをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびベクターも提供され、例えば、第１のＣＤ１９標的化サブドメインは、本明細書に開示されるＣＤ１９結合部分を含み、および第２のサブドメインは、Ｃ型レクチン様受容体および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む。また、このような二重特異性コンストラクトを発現する操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が提供される。がんを処置する方法、およびがん免疫療法のためのこのような細胞の他の使用がまた、本明細書に提供される。
また、がん免疫療法を容易にするために、標的結合部分（例えば、がん細胞により発現されるリガンドの細胞外結合剤）および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびベクターが本明細書において提供される。例えば、一部の実施形態は、がんへの免疫細胞の標的化を促進し、がん細胞に細胞傷害効果を及ぼすために、とりわけ、腫瘍マーカー、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６に対する指向性を有するＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインを含む活性化キメラ受容体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはベクターを含む。また、このようなキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が提供される。また、本明細書には、いくつかの実施形態では、２つ以上のサブドメイン、例えば、第１および第２のリガンド結合受容体および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞外ドメインを含むコンストラクトをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびベクターが提供される。また、このような二重特異性コンストラクトを発現する操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）（いくつかの実施形態では、第１および第２のリガンド結合ドメインは、同じリガンドを標的とする）が提供される。がんを処置する方法、およびがん免疫療法のためのこのような細胞の他の使用もまた、本明細書に提供される。
免疫療法のための操作された細胞
いくつかの実施形態では、免疫系の細胞は、腫瘍細胞などの標的細胞に対して増大した細胞傷害効果を有するように操作される。例えば、免疫系の細胞は、本明細書に記載されるように、腫瘍指向性キメラ受容体および／または腫瘍指向性ＣＡＲを含むように操作され得る。いくつかの実施形態では、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）は、それらの本来の機能は、異常な細胞の増殖および感染症に対して身体を防御することであるため使用される。ヒト免疫系において特定の役割を果たす種々のタイプの白血球が存在し、したがって、本明細書に開示される細胞の操作のための好ましい出発点である。白血球には、顆粒球および無顆粒球（それぞれ細胞質中の顆粒の存在または非存在）がある。顆粒球には、好塩基球、好酸球、好中球、および肥満細胞が含まれる。無顆粒球には、リンパ球および単球が含まれる。以下の細胞または他の、明細書に記載される細胞などの細胞は、キメラ受容体、例えば、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体、および／またはＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ、またはキメラ受容体もしくはＣＡＲをコードする核酸を含むように操作することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを共発現するように操作されてもよい。以下でより詳細に検討されるように、いくつかの実施形態では、細胞、特にＴ細胞は、細胞の同種反応性を減少および／または排除するために、さらに遺伝子修飾される。
免疫療法のための単球
単球は白血球の亜型である。単球は、マクロファージおよび骨髄系樹状細胞に分化することができる。単球は適応免疫系と関連しており、食作用、抗原提示、サイトカイン産生の主要な機能を担っている。食作用とは、細胞物質、または細胞全体を取り込んだ後、取り込まれた細胞物質を消化して破壊するプロセスである。いくつかの実施形態では、単球は、本明細書に開示されるように、１つ以上のさらなる操作された細胞と関連して使用される。本明細書に記載される方法および組成物の一部の実施形態は、腫瘍指向性ＣＡＲ、または腫瘍指向性ＣＡＲをコードする核酸を含む単球に関する。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、とりわけ、腫瘍マーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、および膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的化するＣＡＲを発現するように操作された単球を指す。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞上のリガンド、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６（とりわけ）、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的化する活性化キメラ受容体を発現するように操作された単球に関する。
免疫療法のためのリンパ球
リンパ球は、白血球の他の一次サブタイプであり、Ｔ細胞（細胞媒介性、細胞傷害性適応免疫）、ナチュラルキラー細胞（細胞媒介性、細胞傷害性先天性免疫）、およびＢ細胞（体液性、抗体駆動性適応免疫）を含む。Ｂ細胞は、本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従って操作されるが、いくつかの実施形態はまた、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞（Ｔ細胞とＮＫ細胞の混合物が、一部の実施形態では、同じドナー由来または異なるドナー由来のいずれかで使用される）に関連する。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態は、とりわけ、腫瘍マーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、および膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的化するＣＡＲを発現するように操作されたリンパ球に関する。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞上のリガンド、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６（とりわけ）、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的化する活性化キメラ受容体を発現するように操作されたリンパ球に関する。
免疫療法のためのＴ細胞
Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在に基づいて、他のリンパ球サブタイプ（例えば、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）と区別することができる。Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変Ｔ細胞およびガンマデルタＴ細胞を含む種々のサブタイプに分けられる。一部の実施形態では、特異的サブタイプのＴ細胞を操作する。一部の実施形態では、Ｔ細胞サブタイプの混合プールを操作する。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されるＴ細胞タイプの特異的選択は存在しない。いくつかの実施形態では、サイトカイン刺激の使用などの特異的技術を使用して、特異的マーカープロファイルを有するＴ細胞の拡大／収集を増大させる。例えば、いくつかの実施形態では、特定のヒトＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、刺激分子としてのＣＤ３および／またはＣＤ２８の使用によって達成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、細胞傷害性受容体複合体および／またはホーミング部分を発現するＴ細胞の治療上有効量を投与することを含む、がんまたは感染症を処置または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は自己細胞であり、一方、一部の実施形態では、Ｔ細胞は同種異系細胞である。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、とりわけ、腫瘍マーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、および膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的とするＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞に関する。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞上のリガンドを標的化する活性化キメラ受容体、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６（とりわけ）、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを発現するように操作されたＴ細胞に関する。
免疫療法のためのＮＫ細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、細胞傷害性受容体複合体および／またはホーミング部分を発現する治療上有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、がんまたは感染症を処置または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は自家細胞であり、一方、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の天然の細胞傷害性ポテンシャルが比較的高いため、ＮＫ細胞が好ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された細胞が、ＮＫ細胞の細胞傷害活性をさらに上方制御することができ、標的細胞（例えば、腫瘍または他の疾患細胞）に対してさらに効果的な活性をもたらすことが予想外に有益である。本明細書に記載される方法および組成物のいくつかの実施形態は、とりわけ、腫瘍マーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的とするＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞に関する。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞上のリガンドを標的とする活性化キメラ受容体、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６（とりわけ）、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを発現するように操作されたＮＫ細胞に関する。
がん免疫療法のための造血幹細胞
一部の実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、本明細書に開示される免疫療法の方法において使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、ホーミング部分および／または細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。ＨＳＣは、いくつかの実施形態では、長期間の血球産生のために生着するそれらの能力を利用するために使用され、例えば、がんの寛解と戦うために、標的化された抗がんエフェクター細胞の持続的な供給源をもたらし得る。いくつかの実施形態では、この継続的な産生は、例えば、腫瘍微小環境による他の細胞型のアネルギーまたは消耗を相殺するのを助ける。いくつかの実施形態では、同種異系ＨＳＣが使用されるが、一方、いくつかの実施形態では、自家ＨＳＣが使用される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、本明細書に開示される１つ以上のさらなる操作された細胞型と組み合わせて使用される。本明細書に記載される方法および組成物の一部の実施形態は、とりわけ、腫瘍マーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的とするＣＡＲを発現するように操作された造血幹細胞などの幹細胞に関する。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞上のリガンド、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６（とりわけ）、および適宜膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）共刺激ドメインを標的とする活性化キメラ受容体を発現するように操作された造血幹細胞に関する。
免疫細胞の遺伝子操作
上記で検討したように、種々の細胞型を細胞免疫療法に利用することができる。さらに、以下により詳細に説明され、実施例において示されるように、遺伝的修飾は、これらの細胞に対して、それらの有効性（例えば、細胞傷害性）および／または持続性（例えば、活性寿命）のうちの１つ以上の側面を増大させるために行うことができる。本明細書において検討されるように、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、免疫療法のために使用される。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の遺伝子編集は、有利には、編集されたＮＫ細胞に、腫瘍微小環境において生成される種々の阻害シグナルに抵抗および／または克服する能力を付与することができる。腫瘍は、免疫細胞の抗腫瘍効果を減少させることを意図する種々のシグナル伝達分子を生成することが公知である。以下により詳細に検討するように、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の遺伝子編集は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫとＴ細胞の組み合わせ、または本明細書で提供される任意の編集／操作された免疫細胞におけるこの腫瘍微小環境抑制効果を制限する。以下に検討するように、いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、例えば、タンパク質をコードする基礎遺伝子を破壊することによって、標的タンパク質の発現を減少またはノックアウトするために採用される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、標的タンパク質の発現を約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９％、またはそれ以上（列挙されたものの間の任意の量を含む）減少させることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現が検出できないように、遺伝子を完全にノックアウトする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、標的タンパク質の発現を「ノックイン」または代わりに増大させるために使用される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の発現は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上（列挙されたものの間の任意の量を含む）増大し得る。
非限定的な例として、ＴＧＦ－ベータは、腫瘍微小環境内で免疫抑制をもたらす腫瘍細胞によって放出されるこのようなサイトカインの１つである。免疫抑制は、免疫細胞、たとえ操作されたＣＡＲ－免疫細胞であっても、腫瘍細胞を破壊する能力を減少させ、それによって腫瘍の進行を可能にする。いくつかの実施形態では、以下に詳細に検討されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、遺伝子編集を介して破壊される。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境における免疫抑制サイトカインの遮断剤が使用され、これには、免疫細胞に結合し、阻害するシグナル伝達分子の能力を減少させるそれらの放出の遮断剤または競合的阻害剤が含まれる。このようなシグナル伝達分子には、限定されないが、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ１０、アルギナーゼ、誘導性ＮＯＳ、反応性ＮＯＳ、Ａｒｇ１、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、およびＰＧＥ２が含まれる。しかしながら、さらなる実施形態では、所定の免疫抑制シグナル伝達分子に応答するＮＫ細胞（または他の細胞）の能力が破壊および／または排除される、ＮＫ細胞などの免疫細胞が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはＴ細胞は、ＴＧＦ－ベータに対する感受性が減少したものになるように遺伝子編集される。ＴＧＦ－ベータは、少なくとも増殖および細胞傷害性のレベルに対するＮＫ細胞機能の阻害剤である。例えば、ＴＧＦ－ベータがＮＫ細胞活性および／または増殖を減少させる阻害経路のいくつかを模式的に示す図８Ａを参照されたい。したがって、一部の実施形態によれば、ＴＧＦ－ベータ受容体の発現は、編集されたＮＫが腫瘍微小環境におけるＴＧＦ－ベータの免疫抑制効果に抵抗性であるように、遺伝子編集を介してノックダウンまたはノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢ２受容体は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集の使用によって、遺伝子編集を介してノックダウンされるかまたはノックアウトされる。他の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーが使用される。ＴＧＦ－ベータ受容体の他のアイソフォーム（例えば、ＴＧＦ－ベータ１および／またはＴＧＦ－ベータ３）は、一部の実施形態では編集される。一部の実施形態では、Ｔ細胞におけるＴＧＦ－ベータ受容体は、遺伝子編集を介してノックダウンされる。
さらなる実施形態に従って、ＮＫ細胞（またはＴ細胞）機能の１つ以上の側面の他の調節因子は、遺伝子編集を介して調節される。種々のサイトカインは、免疫細胞に（上記のＴＧＦ－ベータと同様に）負または正のシグナルを与える。非限定的な例として、ＩＬ１５は、本明細書に開示されるように、ＮＫ細胞の正の調節因子であり、ＮＫ細胞のホーミング、ＮＫ細胞の遊走、ＮＫ細胞の拡大／増殖、ＮＫ細胞の細胞傷害性、および／またはＮＫ細胞の持続性のうちの１つ以上を増大させることができる。正常な生理的環境下でＮＫ細胞を抑制するために、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる）は、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１５シグナル伝達の重要な負の調節因子として作用する。本明細書で検討されるように、これは、ＩＬ１５生物学が、限定されないが、とりわけ増殖／拡大、活性化、細胞傷害性、持続性、ホーミング、遊走などを含むＮＫ細胞機能性の複数の側面に影響を与えるためである。したがって、いくつかの実施態様によれば、ＣＩＳＨの編集は、複数の機能にわたってＮＫ細胞の機能性を増大させ、より効果的で長期持続するＮＫ細胞治療をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＩＳの阻害剤が、操作されたＮＫ細胞投与と併せて使用される。いくつかの実施形態では、ＣＩＳ発現は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集の使用によって、ＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子編集を介してノックダウンまたはノックアウトされる。他の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーが使用される。一部の実施形態では、Ｔ細胞におけるＣＩＳ発現は、遺伝子編集を介してノックダウンされる。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、ＮＫ細胞に、標的部位にホーミングする増大した能力を付与する。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、ＮＫ細胞に、例えば組織内で、例えば化学誘引物質に応答して、または忌避剤から離れて、遊走する増大した能力を付与する。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、ＮＫ細胞に、活性化され、したがって、例えば、抗腫瘍効果を発揮する増大した能力を付与する。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、ＮＫ細胞に、増大した増殖能力を付与し、いくつかの実施形態では、ドナー血液試料からのロバストなＮＫ細胞数の生成を可能にする。さらに、このような実施形態では、ＣＩＳＨのために編集され、ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞は、より容易に、ロバストに、および一貫して培養において拡大される。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、ＮＫ細胞に、増大した細胞傷害性を付与する。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨの編集は、ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞および／または操作されたＴ細胞の細胞傷害効果を相乗的に増大させる。
いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、広範な経路を活性化するかまたは阻害する。ＣＩＳタンパク質は、例えば、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路を阻害することにより、ＩＬ１５シグナル伝達の負の調節因子である。これらの経路は、典型的には、ＩＬ１５応答性遺伝子（ＣＩＳＨを含む）の転写をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨのノックダウンは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ（例えば、ＪＡＫ１－ＳＴＡＴ５）シグナル伝達を脱阻害し、ＩＬ１５応答性遺伝子の転写を増大させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨのノックアウトは、哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を介したシグナル伝達の増大をもたらし、それに対応して、細胞代謝および呼吸に関する遺伝子の発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨのノックアウトは、ＩＬ１５誘導性のＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）の発現であるが、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－２／１５Ｒβではない発現の増加、ＩＬ１５および／またはＩＬ２のＮＫ細胞膜結合の増加、ＳＴＡＴ－３および／またはＳＴＡＴ－５のリン酸化の増加、Ｂｃｌ－２などの抗アポトーシスタンパク質の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨノックアウトは、ミトコンドリア機能（例えば、電子伝達鎖および細胞呼吸）および細胞周期に関する選択された遺伝子のＩＬ１５誘導性情報制御をもたらす。したって、いくつかの実施形態では、遺伝子編集によるＣＩＳＨのノックアウトは、少なくとも部分的には代謝リプログラミングを介して、ＮＫ細胞の細胞傷害性および／または持続性を増大させる。いくつかの実施形態では、ＴＸＮＩＰなどの細胞代謝の負の調節因子は、ＣＩＳＨノックアウトに応答して下方制御される。いくつかの実施形態では、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、ＴＯＰ２Ａ、ＣＫＳ２、およびＲＡＣＧＡＰ１を含む細胞生存および増殖のためのプロモーターは、ＣＩＳＨノックアウト後に上方制御されるが、一方、ＴＧＦＢ１、ＡＴＭ、およびＰＴＣＨ１などの抗増殖性またはプロアポトーシス性タンパク質は下方制御される。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨノックアウトは、ＣＸＣＬ－１０、ＩＬ２、ＴＮＦ、ＩＦＮｇ、ＩＬ１３、ＩＬ４、Ｊｎｋ、ＰＲＦ１、ＳＴＡＴ５、ＰＲＫＣＱ、ＩＬ２受容体ベータ、ＳＯＣＳ２、ＭＹＤ８８、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１、ＴＢＸ２１、ＬＣＫ、ＪＡＫ３、ＩＬ＆受容体、ＡＢＬ１、ＩＬ９、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、Ｔｃｆ７、ＰＲＤＭ１、および／またはＥＯＭＥＳのうちの１つ以上を介してまたはそれを通じてシグナル伝達の状態を変更させる（例えば、活性化または不活性化する）。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の遺伝子編集はまた、編集された免疫細胞の拡大、持続性および／または細胞傷害性における予想外の増大を提供することができる。本明細書に開示されるように、操作された細胞（例えば、ＣＡＲを発現する細胞）もまた編集され得、その組み合わせは、免疫療法のためのロバストな細胞を提供する。いくつかの実施形態では、編集は、予想外に改善されたＮＫ細胞の拡大、持続性および／または細胞傷害性を可能にする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ発現のノックアウトは、ＮＫ細胞におけるＩＬ１５媒介シグナル伝達の強力な負の調節因子を除去し、ＮＫ細胞を脱阻害し、増大したＮＫ細胞ホーミング、ＮＫ細胞遊走、ＮＫ細胞の活性化、拡大、細胞傷害性および／または持続性のうちの１つ以上を可能にする。さらに、いくつか実施形態では、編集は、他には抑制的な腫瘍微小環境におけるＮＫ細胞および／またはＴ細胞機能を増大させることができる。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子編集は、外因的に提供されるＮｏｔｃｈリガンドを必要とせずに、増大したＮＫ細胞拡大、持続性および／または細胞傷害性をもたらす。
上記で検討したように、ＣＡＲまたはキメラ受容体を発現するように操作されたＴ細胞は、いくつかの実施形態において採用される。また、上述したように、Ｔ細胞は、それらの表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態では、自己免疫細胞は、細胞の元のドナーに戻される。このような実施形態では、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞は、患者から得られ、拡大され、遺伝的に修飾され（例えば、ＣＡＲまたはキメラ受容体を用いる）、および／またはさらに拡大されてもよく、患者に再導入される。本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態では、同種異系免疫細胞は、細胞の元のドナーではない対象に移入される。このような実施形態では、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞は、ドナーから得られ、拡大され、遺伝的に修飾され（例えば、ＣＡＲまたはキメラ受容体を用いる）、および／またはさらに拡大されてもよく、対象に投与される。
同種免疫療法には、克服すべきいくつかのハードルがある。免疫能宿主では、投与された同種異系細胞は急速に拒絶され、宿主対移植片拒絶（ＨｖＧ）として公知である。これは、投与された細胞の有効性、特にそれらの持続性を実質的に制限する。免疫不能宿主では、同種異系細胞は生着することができる。しかしながら、投与された細胞がＴ細胞を含む場合（本明細書に開示されるいくつか実施形態は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団を用いる）、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）特異性は、宿主組織を異物として認識し、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）をもたらす。ＧｖＨＤは、宿主（細胞レシピエント）において重大な組織損傷を引き起こす可能性がある。本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、これらのハードルの両方に対処し、それによって、効果的であり、安全な同種異系免疫療法を可能にする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を減少および／または回避するのに有利に役立つことができる。ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合集団を使用するこのようなアプローチの非限定的実施形態は、図８Ｃに概略的に例示され、ＮＫ細胞はＣＡＲを発現するように操作され、Ｔ細胞はＣＡＲを発現するだけでなく、Ｔ細胞を非同種反応性にするように編集される。図８Ｄは、移植片対宿主病が起こるメカニズムを模式的に示す。同種異系Ｔ細胞および同種異系ＮＫ細胞はともに、腫瘍を標的化するＣＡＲを発現するように操作され、宿主に導入される。しかしながら、Ｔ細胞は、天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をなおも有する。このＴＣＲは、宿主細胞のＨＬＡ型を「非自己」として認識し、宿主細胞に対して細胞傷害性を発揮することができる。図８Ｅは、移植片対宿主病が、Ｔ細胞の遺伝子編集によってどのように減少させるかまたは代わりに回避することができるかの非限定的な実施形態を示す。簡単に述べると、このアプローチは、以下でより詳細に検討されるように、Ｔ細胞上の天然ＴＣＲをノックアウトするために、遺伝子編集を行うことができる。ＴＣＲが欠損すると、同種異系Ｔ細胞は宿主細胞の「非自己」ＨＬＡを検出することができず、したがって、宿主細胞に対して細胞傷害性を発揮するように誘発されない。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、天然Ｔ細胞の機能性を減少させ、および／または天然Ｔ細胞の発現を減少もしくは排除するために、遺伝子編集に供される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、ＴＣＲをノックアウトするために使用される。これらの実施形態および他の実施形態を以下において検討する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖（それはヘテロ二量体である）からなる。ヒトＴ細胞の大多数は、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖（別々の遺伝子にコードされている）からなるＴＣＲを有する。少ない割合のＴ細胞は、ガンマ鎖とデルタ鎖（γ／δ鎖）からなるＴＣＲを有する（細胞はガンマ－デルタＴ細胞として公知である）。
（免疫グロブリンのように）無傷な抗原を認識するのではなく、Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子と結合して、処理されたペプチド断片によって活性化される。これは、ＭＨＣ制限として公知である。ＴＣＲがドナーＭＨＣとレシピエントＭＨＣの間の差異を認識した場合、その認識はＴ細胞増殖およびＧＶＨＤの潜在的発生を刺激する。一部の実施形態では、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、および／またはＴＣＥδのいずれかをコードする遺伝子は、ドナーＴ細胞がドナーＭＨＣと宿主ＭＨＣの間の差異を認識する傾向を減少させ、それによって同種抗原およびＧＶＨＤの認識を減少させるように破壊されるかまたは代わりに修飾される。
Ｔ細胞媒介性免疫は、免疫応答を微調整するのに役立つ共刺激シグナルと阻害シグナルの間のバランスを伴う。免疫チェックポイントとしても公知である阻害シグナルは、自己免疫（例えば、自己寛容）の回避を可能にし、また免疫媒介性損傷を制限する。免疫チェックポイントタンパク質発現は、しばしば腫瘍によって変化し、腫瘍細胞における免疫抵抗性を増大させ、免疫療法の有効性を制限する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化の振幅を下方制御する。対照的に、ＰＤ１は、炎症応答中の末梢組織におけるＴ細胞エフェクター機能を制限し、自己免疫も制限する。免疫チェックポイント遮断は、いくつかの実施形態では、機能的細胞性免疫の活性化に対する障壁を克服するのを助ける。いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４；ＣＤ１５２としても公知である）およびプログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ１またはＰＤＣＤ１、ＣＤ２７９としても公知である）を含むＴ細胞上の阻害リガンドに特異的な拮抗抗体が、免疫療法を増大させるために使用される。
いくつかの実施形態では、非同種反応性であり、高活性である遺伝子修飾されたＴ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、特定の免疫チェックポイント遺伝子が不活性化されるようにさらに修飾され、したがって、免疫チェックポイントタンパク質はＴ細胞によって発現されない。いくつかの実施形態では、これは、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインの操作または破壊の非存在下で行われる（例えば、ＴＣＲは、依然としてＴ細胞シグナル伝達を開始することができる）。
いくつかの実施形態では、同種異系ドナー由来のＴリンパ球における免疫チェックポイント遺伝子の不活化と組み合わせたＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータの遺伝的不活化は、ＧＶＨＤのリスクを有意に減少させる。いくつかの実施形態では、これは、ドナー細胞とレシピエント細胞の間のＭＨＣ差異の認識に関与する１つ以上の置換タンパク質鎖（アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ）の少なくとも一部を除去することによって行われる。一部の実施形態では、これは、Ｔ細胞の増殖および活性を依然として可能にしながら行われる。
同種異系細胞が投与されるいくつかの実施形態では、受け入れた対象は、投与された免疫細胞の機能を支持するかまたは代わりに増大させるために、いくつかの他の補助処置を受ける場合がある。いくつかの実施形態では、対象は、前処理（例えば、放射線または化学療法を用いる）され得る。いくつかの実施形態では、補助処置は、リンパ球増殖因子（ＩＬ－２など）の投与を含む。
さらに、いくつかの実施形態では、編集は、例えば、宿主免疫応答に対して細胞をマスクすることによって、投与された細胞（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはその他のいずれか）の持続性を改善することができる。場合によっては、レシピエントの免疫細胞が、ドナー細胞、特に同種異系ドナーからのドナー細胞を攻撃し、これは宿主対移植片病（ＨｖＧ）として公知である。図８Ｆは、宿主Ｔ細胞が、天然／機能性ＴＣＲとともに、ドナーＴおよび／またはドナーＮＫ細胞上のＨＬＡを非自己として識別するＨｖＧの概略図を示す。このような場合、宿主Ｔ細胞ＴＣＲが同種異系細胞ＨＬＡに結合すると、同種異系細胞が除去され、ドナーの操作されたＮＫ／Ｔ細胞の持続性が減少する。ＨｖＧに関して、投与された同種異系Ｔ細胞の拒絶反応を防ぐために、細胞を受け取った対象は、それらの免疫系の抑制を必要とする。いくつかの実施形態では、糖質コルチコイドが使用され、限定されないが、とりわけ、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンが含まれる。レシピエント自身のＴ細胞におけるグルココルチコイド受容体の活性化は、免疫応答に関与する遺伝子の発現を変化させ、サイトカイン産生のレベルの減少をもたらし、これは、Ｔ細胞のアネルギーおよびＴ細胞活性化への干渉（レシピエントにおける）につながる。他の実施形態は、レシピエント免疫細胞の特定のタイプを枯渇させることができる抗体の投与に関する。このような標的の１つはＣＤ５２であり、ＴおよびＢリンパ球上で高レベルで発現され、単球上でより低レベルで発現されるが、顆粒球および骨髄前駆細胞上には存在しない。ＣＤ５２に対する指向性を有するヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブによるレシピエントの処置または前処置は、循環リンパ球および単球の急速な枯渇を誘導することが示されており、これは、レシピエント免疫細胞の減少を考えると、ＨｖＧの可能性を減少させる。免疫抑制薬は、投与された同種異系の操作されたＴ細胞の有効性を制限する場合がある。したがって、本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態は、免疫抑制治療に抵抗性である遺伝子操作された同種異系ドナー細胞に関する。いくつかの実施形態では、以下により詳細に検討されるように、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞などの免疫細胞は、宿主免疫細胞からの細胞傷害性応答を回避することによって、それらの持続性が延長されるように（ＣＡＲを発現するように操作されることに加えて）編集される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＬＡ分子を同種異系ＮＫおよび／またはＴ細胞から除去するための遺伝子編集は、宿主Ｔ細胞による除去を減少させる。いくつかの実施形態では、同種異系ＮＫおよび／またはＴ細胞は、ベータ－２ミクログロブリン（ＨＬＡクラスＩ分子）およびＣＩＩＴＡ（ＨＬＡクラスＩＩ分子）のうちの１つ以上をノックアウトするように編集される。図８Ｇは、このアプローチを概略的に示す。
混合同種異系細胞療法のいくつかの実施形態では、操作された細胞集団は、例えば、ＨｖＧを回避するためにＨＬＡ分子を除去するように治療細胞が編集される場合に、互いを実際に標的化する。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞のこのような編集は、編集された同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の、ＣＡＲ ＮＫ細胞による細胞傷害性攻撃および宿主ＮＫ細胞による除去に対する脆弱性をもたらし得る。これは、一般的にＫＩＲ分子が提示する「自己」阻害シグナルが欠けていることによって引き起こされる。図８Ｈは、このプロセスを概略的に示す。いくつかの実施形態では、遺伝子編集を用いて、宿主免疫系から、および他の投与された操作された細胞によるフラトリサイドから同種異系細胞をマスクする１つ以上の「マスキング」分子の発現をノックインすることができる。図８Ｉは、このアプローチを概略的に示す。いくつかの実施形態では、タンパク質を同種異系細胞の表面上に発現させて、ＮＫ（操作されたＮＫと宿主ＮＫの両方）による標的化を阻害することができ、有利には、同種異系ＣＡＲ－ＴとＣＡＲ－ＮＫの両方の持続性を延長する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ＣＤ４７をノックインするために使用され、その発現は、「私を食べない」シグナルとして効果的に機能する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集を用いてＨＬＡ－Ｅの発現をノックインする。ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞の表面にそれぞれ存在する阻害性および活性化受容体ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃの両方に結合する。しかしながら、ＮＫＧ２Ａは、大部分のヒトＮＫ細胞においてより高度に発現され、したがって、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅの操作された細胞上での発現は、ＨＬＡ－Ｅに編集された（または自然発現された）細胞に対するＮＫ細胞（宿主とドナーの両方）の阻害効果をもたらす。さらに、いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスＨＬＡ相同体が、それらが操作されたＮＫおよび／またはＴ細胞によって発現されるようにノックインされ、したがって、ウイルスが宿主免疫系を回避する能力を細胞上に付与する。いくつかの実施形態では、これらのアプローチは、有利には、同種異系ＣＡＲ－ＴとＣＡＲ－ＮＫの両方の持続性を延長する。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ、ＴＧＦＢＲ、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＳＨ、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、または本明細書に開示される任意の他の標的遺伝子）のいずれかの遺伝子編集（ノックアウトまたはノックインのいずれか）は、ＤＮＡ切断の標的化導入、およびその後のＤＮＡ修復メカニズムを介して達成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの二本鎖切断は、非相同末端接続（ＮＨＥＪ）によって修復され、酵素は、切断を修復するために、ＤＮＡ末端を互いに直接接続するために使用される。しかしながら、いくつかの実施形態では、二本鎖切断は、有利にはより正確である相同指向性修復（ＨＤＲ）によって修復され、それによって、配列特異的切断および修復を可能にする。ＨＤＲは、二本鎖切断の隣接配列と相同である配列内の所望の遺伝因子（例えば、ＴＣＲのコード配列を破壊する挿入因子）を有するベクターなどの、切断点における欠損ＤＮＡ配列の再生のための鋳型として相同配列を使用する。これは、ＤＳＢの部位に挿入される所望の変化（例えば、挿入）をもたらす。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、種々の操作されたヌクレアーゼの１つ以上によって達成される。いくつかの実施形態では、制限酵素は、特に、二本鎖切断が複数の領域で所望される場合に使用される。いくつかの実施形態では、生物工学処理されたヌクレアーゼが使用される。Ｚｎｃフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼおよび／またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムのうちの１つ以上を使用して、１つ以上のＴＣＲサブユニットをコードする遺伝子を特異的に編集する。
メガヌクレアーゼは、大きなＤＮＡ配列（１４～４０塩基対）を認識し、切断するそれらの能力によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーからのメガヌクレアーゼが使用され、突然変異誘発およびスクリーニングに供されて、ＴＣＲもしくはＣＩＳＨ、または本明細書に開示される任意の他の標的遺伝子における特定の部位などの固有の配列（複数可）を認識するメガヌクレアーゼ変異体が生成される。ＴＣＲの標的部位を容易に同定することができる。ＴＣＲの領域内の標的部位のさらなる情報は、米国特許出願公開第２０１８／０３２５９５５号、米国特許出願公開第２０１５／００１７１３６号に見出すことができ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、２つ以上のメガヌクレアーゼまたはそれらの機能的断片を融合させて、標的遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ）内の所望の標的配列を認識するハイブリッド酵素を作製する。
メガヌクレアーゼとは対照的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、ジンクフィンガーまたは転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）などのペプチドを認識する特異的ＤＮＡ配列に連結された非特異的ＤＮＡ切断触媒ドメインに基づく機能を有する。有利には、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、このようにして、配列非依存的なＤＮＡの切断を可能にし、標的認識において高程度の配列特異性を有する。ジンクフィンガーモチーフは、転写因子において自然に機能して、転写のための特異的ＤＮＡ配列を認識する。各フィンガーのＣ末端部分は、ＤＮＡ配列の特異的認識に関与する。ＺＦＮによって認識される配列は比較的短いが（例えば、約３塩基対）、いくつかの実施形態では、認識部位が特徴付けられている２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のジンクフィンガーの組み合わせが使用され、それによって、ＴＣＲ（または免疫チェックポイント阻害剤）の一部などの特異的配列の標的化を可能にする。次に、合わせたＺＦＮは、標的化されたＤＮＡ切断を誘導するために、ＦｏｋＩ（適宜ＦｏｋＩヘテロ二量体）などのエンドヌクレアーゼの触媒ドメイン（複数可）と融合させる。ＴＣＲおよび／または免疫チェックポイント阻害剤を編集するためのＺＦＮの使用に関する追加情報は、米国特許第９，５９７，３５７号に見出すことができ、参照により本明細書に組み込まれる。
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、３３または３４アミノ酸反復のアレイを特徴とする特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮはヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインをＴＡＬＥドメインに融合させたものであり、配列に依存しない二本鎖ＤＮＡ切断の導入が可能になり、非常に正確な標的部位の認識を可能にする。ＴＡＬＥＮは、標的部位に二本鎖切断を起こすことができ、これは誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、小さな挿入または欠失を導入することによって遺伝子破壊をもたらす。有利には、ＴＡＬＥＮは、いくつかの実施形態では使用され、少なくとも部分的には、ＤＮＡ結合におけるそれらのより高い特異性、減少したオフターゲット効果、およびＤＮＡ結合ドメインの構築の容易さに起因する。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、細菌がウイルスに対する防御として使用する遺伝因子である。このリピートは、ウイルスゲノムに由来し、細菌ゲノムに組み込まれた短い配列である。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）は、これらの配列を処理し、一致するウイルスＤＮＡ配列を切断する。Ｃａｓ遺伝子を含むプラスミドを真核細胞に導入し、ＣＲＩＳＰＲを特異的に構築することにより、真核生物ゲノムを任意の所望の位置で切断することができる。ＣＲＩＳＰＲに関する追加情報は、米国特許公開第２０１４／００６８７９７号に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、例えば、ＣＩＳＨ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅなどにおいてノックアウトまたはノックインされる標的遺伝子をコードする遺伝子（複数可）を操作するために使用される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、Ｔ細胞のＴＣＲの１つ以上、および／または１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤をコードする遺伝子を編集するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、およびＴＣＲδのうちの１つ以上を切断するために使用される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲのＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインの機能に影響を及ぼすことなく切断される。実施形態およびどの標的遺伝子が編集されるべきかに応じて、クラス１またはクラス２ Ｃａｓが使用される。いくつかの実施形態では、クラス１ Ｃａｓが使用され、Ｃａｓタイプは、以下のタイプ：Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＵ、ＩＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、ＩＶ、ＩＶＡ、ＩＶＢ、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、クラス２ Ｃａｓが使用され、Ｃａｓタイプは、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、Ｖ、ＶＩ、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ（以前はＣ２ｃ２として公知である）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、上記で検討したように、ＣＩＳＨの編集は、編集された細胞、特に、編集されたＮＫ細胞、増大した拡大、細胞傷害性および／または持続性を有利に与える。さらに、いくつかの実施形態では、ＴＣＲへの修飾は、ＴＣＲαへの修飾を含むが、ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達に影響を与えず、Ｔ細胞増殖を可能にする。一実施形態では、ＴＣＲαは、細胞におけるｐｒｅ－Ｔαの発現によって不活性化され、したがって、機能的アルファ／ベータＴＣＲの非存在下で機能的ＣＤ３複合体を回復させる。本明細書に開示されるように、非同種反応性修飾Ｔ細胞はまた、ＣＡＲを発現して、非同種反応性Ｔ細胞特異性を腫瘍マーカーに向けるが、しかし、ＭＨＣとは無関係であるように操作される。編集の組み合わせは、いくつかの実施形態では、非限定的な例として、例えば、組み合わせたＴＣＲおよびＣＩＳＨのノックアウト、またはＣＩＳＨのノックアウトおよびＣＤ４７のノックインなどとして使用される。
細胞外ドメイン（腫瘍結合因子）
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、本明細書に記載されるように、腫瘍結合ドメイン（抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体に関する。腫瘍結合ドメインは、実施形態に依存して、とりわけ、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲを標的化する。本明細書に記載される組成物および方法のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されるように、腫瘍細胞によって発現されるリガンドに結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むキメラ受容体（活性化キメラ受容体とも呼ばれる）に関する。リガンド結合ドメインは、実施形態に依存して、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６（とりわけ）を標的化する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ｖＨもしくはｖＬドメイン、ラクダＶＨＨドメイン、または非免疫グロブリン足場、例えば、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、レペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、センチリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、アルマジロリピートタンパク質、自己抗原、受容体またはリガンドの野生型もしくは非野生型配列に由来するかまたはそれを含む。一部の実施形態では、腫瘍結合ドメインは、１を超える抗原結合ドメインを含む。実施形態では、抗原結合ドメインは、ＴＣＲドメイン（例えば、ＴＣＲ－アルファ、ＴＣＲ－ベータ１、ＴＣＲ－ベータ２、ｐｒｅＴＣＲ－アルファ、ｐｒｅ－ＴＣＲ－アルファ－Ｄｅｌ４８、ＴＣＲ－ガンマ、またはＴＣＲ－デルタの定常鎖）のＮＨ２末端に直接的にまたは任意のリンカーを介して操作可能に連結される。
抗原結合タンパク質
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が提供される。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合タンパク質」は、その通常の意味が与えられるものとし、また、抗原に結合する抗原結合断片、および、適宜、抗原結合断片が抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進する立体構造をとることを可能にする足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質をも指すものとする。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）またはその断片である。一部の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体の重鎖由来の、または抗原に結合する抗体の軽鎖由来の３つのすべてのＣＤＲを含む。さらに一部の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体（重鎖由来の３つおよび軽鎖由来の３つ）由来の６つのすべてのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを含み、いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの任意の組み合わせであり得る。一部の実施形態における抗原結合断片は、抗体断片である。
抗原結合タンパク質の非限定的な例としては、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合断片）、抗体誘導体、および抗体類似体が挙げられる。さらなる具体的な例としては、限定されないが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ラクダ重鎖抗体のＶＨドメイン；ＶＨＨ断片）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられる。これらの分子は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、またはブタ、イヌ、またはラクダなどの任意の哺乳動物源に由来することができる。抗体断片は、無傷の（例えば、天然の）抗体と標的抗原の結合について競合し得、断片は、無傷の抗体の修飾（例えば、酵素的または化学的切断）または組換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成を用いてデノボ合成され得る。抗原結合タンパク質は、例えば、移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する代替のタンパク質骨格または人工足場を含むことができる。このような足場は、限定されないが、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された突然変異を含む抗体由来足場、ならびに、例えば、生体適合性ポリマーを含む完全に合成された足場を含む。さらに、ペプチド抗体模倣物（「ＰＡＭ」）、ならびに足場としてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣物に基づく足場を使用することができる。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖または複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ以上の抗体断片を含む。例えば、抗原結合タンパク質は、限定されないが、ダイアボディ；細胞内抗体；ドメイン抗体（単一のＶＬもしくはＶＨドメイン、またはペプチドリンカーによって接続された２つ以上のＶＨドメイン）；マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ）；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に結合した１つ以上のペプチド）；線状抗体（相補的な軽鎖ポリペプチドとともに１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１））；小モジュラー免疫医薬；および免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＶＨ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＶＨ、およびＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を含むことができる。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、免疫グロブリンの構造を有する。本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリン」は、その通常の意味が与えられ、また、四量体分子を指すものとし、各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。
軽鎖および重鎖内では、可変領域（Ｖ）および定常領域（Ｃ）は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接続された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖と重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。
ヒトの軽鎖はカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。抗体「軽鎖」とは、抗体分子中にそれらの天然に存在する立体構造で存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（Ｋ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、単一免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および単一免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを含み得る。
重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥとして定義する。抗体「重鎖」とは、その天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち、より大きいものを指し、通常、抗体が属するクラスを決定する。重鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に、単一免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、および、適宜免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを含み得る。
ＩｇＧクラスは、サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４にさらに分けられる。ＩｇＡクラスは、サブクラス、すなわちＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられる。ＩｇＭは、限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有し、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメイン間（例えば、軽鎖と重鎖間）、および抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結される。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体である。用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、モノクローナル、またはポリクローナル、多重または一本鎖、または無傷の免疫グロブリンであり得、天然供給源または組換え供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。抗体は、「ヒト化」、「キメラ」または非ヒトであり得る。抗体は、任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリンを含み得、例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、および二重特異性抗体を含む。無傷抗体は、一般的に、少なくとも２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む。抗体配列は、単一の種からのみ誘導することができ、または「キメラ」であり得、すなわち、抗体の異なる部分は、以下にさらに記載するように、２つの異なる種に由来することができる。他に指示がない限り、用語「抗体」はまた、２つの実質的に全長の重鎖および２つの実質的に全長の軽鎖を含む抗体を含むが、ただし、抗体が２つの全長の軽鎖および重鎖で構成される抗体と同じかまたは類似した結合および／または機能を保持することを条件とする。例えば、重鎖および／または軽鎖のＮ末端および／またはＣ末端における１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を有する抗体は定義に含まれるが、抗体が２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体と同じかまたは類似した結合および／または機能を保持することを条件とする。抗体の例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、および合成抗体が挙げられる。一部の実施形態では、モノクローナルおよびポリクローナル抗体が提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリクローナル抗体」は、その通常の意味が与えられるものとし、また、組成および結合特異性において典型的に広く変化する抗体集団を指すものとする。本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）は、その通常の意味が与えられるものとし、また、同一の配列を有する抗体集団の１つ以上を指すものとする。モノクローナル抗体は、抗原上の特定のエピトープで抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体の断片または抗原結合断片である。用語「抗体断片」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により）能力を保持する抗体の少なくとも１つの部分を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ｖＬまたはｖＨのいずれか）などの一重ドメイン抗体、ラクダｖＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成される多重特異性抗体、および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が挙げられる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびｂｉｓ－ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005を参照されたい）に組み込むことができる。抗原結合断片はまた、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場に移植することもできる（例えば、フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。抗体断片は、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）への特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも１つのＣＤＲを含むＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、および／またはＦｖ断片を含み得る。抗体断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ断片が提供される。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；ならびにｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する。いくつかの実施形態では、これらの抗体断片は、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、体内抗体、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるように、少なくとも１つのＣＤＲを含む。
本明細書には、いくつかの実施形態では、一本鎖可変断片も提供される。本明細書で使用される場合、用語「一本鎖可変断片」（「ｓｃＦｖ」）は、その通常の意味を与えられるものとし、また、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介してＶＬおよびＶＨ領域が接続されて連続タンパク質鎖を形成する融合タンパク質を指すものとし、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自身で折り返し、一価抗原結合部位を形成するのに十分な長さである。明瞭にすることを目的として、他に指示がない限り、「一本鎖可変断片」は、本明細書中で定義される抗体または抗体断片ではない。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を減少させるかまたは許容しないように構成されたリンカーによって接続されたＶＨおよびＶＬドメインを含み、したがって、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対合することを可能にする。いくつかの実施形態によれば、ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対合から生じるダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリボディおよびテトラボディは、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、それぞれ、３つおよび４つの抗原結合部位を形成するが、これらは同じであるかまたは異なることができる。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲを含む。本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲ」は、その通常の意味を与えられるものとし、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」または「超可変領域」とも呼ばれる）も指すものとする。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）がある。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、標的タンパク質上の特定のエピトープまたはドメインに特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に、天然に存在する軽鎖および重鎖可変領域はいずれも、典型的には、これらの要素：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の次の順に一致する。これらのドメインの各々において位置を占めるアミノ酸に番号を付ける番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD)またはChothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883に定義される。所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、このシステムを用いて同定され得る。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸の他の番号付けシステムには、ＩＭＧＴ（登録商標）（the international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005）、およびAHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001)が含まれる。１つ以上のＣＤＲを、共有結合的または非共有結合的に分子に組み込んで、それを抗原結合タンパク質とすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部として１つ以上のＣＤＲ（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質には、１つ以上のＣＤＲが非共有結合的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれた、本明細書に記載されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、生体適合性フレームワーク構造は、局在化表面領域において抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合するアミノ酸の１つ以上の配列を提示することができる、立体構造的に安定な構造支持体、またはフレームワーク、または足場を形成するのに十分なポリペプチドまたはその一部を含む。このような構造は、天然に存在するポリペプチドもしくはポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得るか、または天然に存在するポリペプチドもしくは折り畳みに対して、アミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換などの１つ以上の修飾を有し得る。実施形態に応じて、足場は、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌もしくはウイルスなどの種々の異なる種（または１を超える種）のポリペプチドから誘導することができる。
実施形態に応じて、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場または骨格に基づく。一部のこのような実施形態では、これらのフレームワーク構造は、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、チトクロームｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ－Ｄ１、Ｚドメインおよび／またはテンダミスタトドメインに基づく。
いくつかの実施形態では、１を超える結合部位を有する抗原結合タンパク質もまた提供される。いくつかの実施形態では、結合部位は互いに同一であるが、いくつかの実施形態では、結合部位は互いに異なる。例えば、抗体は、典型的には、２つの同一の結合部位を有し、一方、「二重特異性」または「二機能的」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、これは、二重特異性キメラ抗原受容体が、操作された細胞に、複数の腫瘍マーカーを標的化する能力を付与することができるため、特に有利である。例えば、ＣＤ１９およびさらなる腫瘍マーカー、とりわけ、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６、または本明細書に開示されるかもしくは腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原として当該技術分野において認識される任意の他のマーカーには、二重特異性抗体が結合し得る。
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、その通常の意味を与えられるものとし、１つの抗体からの１つ以上の領域、および１つ以上の他の抗体からの１つ以上の領域を含む抗体をも指すものとする。一部の実施形態では、１つ以上のＣＤＲは、抗がん抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＰＤ－Ｌ１、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲなど）抗体に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲの全ては、抗がん抗原抗体（例えば、抗ＣＤ１９抗体）に由来する。一部の実施形態では、１を超える抗がん抗原抗体由来のＣＤＲは、混合され、キメラ抗体中で適合される。例えば、キメラ抗体は、第１の抗がん抗原抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第２の抗がん抗原抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および第３の抗がん抗原抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含み得る。さらに、本明細書に開示される抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、同じ抗がん抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲなど）抗体の１つ、ヒト抗体などの１つ以上の異なる抗体、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来の抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それに相同であるか、またはそれに由来するが、一方、鎖（複数可）の残りは、別の種由来の抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それに相同であるか、またはそれに由来する。また、本明細書には、所望の生物学的活性を示すこのような抗体の断片も提供される。
一部の実施形態では、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列における１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号３２に示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２の軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３３に従って、重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ポリヌクレオチド配列番号３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２の配列に従って軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３２の配列に従って軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３３の配列に従って重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３３の配列に従って重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３３の配列に従って重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、さらなる抗ＣＤ１９結合コンストラクトが提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖが配列番号３５の配列を含む重鎖可変領域を含むＣＤ１９を標的化するｓｃＦｖが提供される。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３５に示されるＨＣＶドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３５に示されるＨＣＶドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３５に示されるＨＣＶドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３５に示されるＨＣＶドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
さらに、いくつかの実施形態では、ＣＤ１９を標的化するｓｃＦｖは、配列番号３６の配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３６に示されるＬＣＶドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３６に示されるＬＣＶドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３６に示されるＬＣＶドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号３６に示されるＬＣＶドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む抗ＣＤ１９結合部分もまた提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号３７の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号３７の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号３８の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号３８の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号３９の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号３９の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４０の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４０の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４１、４２、または４３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４１、４２、または４３の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号４４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号４４の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＨＬ）を含む抗ＣＤ１９結合部分もまた提供され、ＶＬ領域は第１、第２および第３の相補性決定領域（それぞれＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３）を含み、ＶＨ領域は第１、第２および第３の相補性決定領域（それぞれＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号４５、４６、４７、または４８の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号４５、４６、４７、または４８の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４９、５０、５１または５２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４９、５０、５１または５２の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む抗ＣＤ１９結合部分もまた提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号５３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号５３の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号５４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号５４の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号５５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号５５の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号５６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号５６の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号５７の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号５７の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号５８の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号５８の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０４に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０４に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０４に示されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１０４に示されるＶＨドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１０４に示されるＶＨドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０５に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０５に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０５に示されるＶＬドメインアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１０５に示されるＶＬドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１０５に示されるＶＬドメインアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０４に示されるＶＨドメインアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１０５に示されるＶＬドメインアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１０５の軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１０４に従って、重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０６に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０６に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０６に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する重鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変部は、配列番号１０６に示されるＶＨアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変部は、配列番号１０６に示されるＶＨアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０７に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０７に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０７に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する軽鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号１０７に示されるＶＬアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）への特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号１０７に示されるＶＬアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む抗ＣＤ１９結合部分もまた提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号１０８の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番１０８号の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号１０９の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号１０９の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号１１０の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号１１０の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号１１１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号１１１の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号１１２、１１３、または１１４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号１１２、１１３、または１１４の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号１１５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号１１５の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、配列番号１１６を含むか、または配列番号１１６の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、もしくは約９８％の配列同一性を有する配列である。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１７、１１８、または１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１７、１１８、または１１９に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１７、１１８、または１１９に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１７、１１８、または１１９に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する軽鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号１１７、１１８、または１１９に示されるＶＬアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号１１７、１１８、または１１９に示されるＶＬアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１２０、１２１、１２２、または１２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１２０、１２１、１２２、または１２３に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１２０、１２１、１２２、または１２３に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１２０、１２１、１２２、または１２３に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する重鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変部は、配列番号１２０、１２１、１２２、または１２３に示されるＶＨアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合を保持する。いくつかの実施形態では、重鎖可変部は、配列番号１２０、１２１、１２２、または１２３に示されるＶＨアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する特異的結合が改善されている。
いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む抗ＣＤ１９結合部分もまた提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号１２４、１２７、または１３０の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号１２４、１２７、または１３０の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号１２５、１２８、または１３１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号１２５、１２８、または１３１の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号１２６、１２９、または１３２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号１２６、１２９、または１３２の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号１３３、１３６、１３９、または１４２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号１３３、１３６、１３９、または１４２の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号１３４、１３７、１４０、または１４３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号１３４、１３７、１４０、または１４３の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号１３５、１３８、１４１、または１４４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号１３５、１３８、１４１、または１４４の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる抗ＣＤ１９結合部分は、当該技術分野において公知であり、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３９９，６４５号、米国特許出願公開第２０１８／０１５３９７７号、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６３５号、米国特許出願公開第２０１８／０２５１５１４号、および米国特許出願公開第２０１８／０３１２５８８号に開示されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態は、クラウジン６に対する指向性を有し、クラウジン３、４、または９（または他のクラウジン）への結合をほとんど示さないかまたは全く示さないＣＡＲに関する。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８８に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８８に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８８に示されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する重鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変部は、配列番号８８に示されるＶＨアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＬＤＮ６）への特異的結合を保持し得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変部は、配列番号８８に示されるＶＨアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＬＤＮ６）に対する特異的結合が改善されている。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８９、９０または９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８９、９０または９１に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８９、９０または９１に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変部を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８９、９０または９１に示されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する軽鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号８９、９０または９１に示されるＶＬアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異（例えば、ヒト化の目的のため）を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＬＤＮ６）への特異的結合を保持する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号８９、９０または９１に示されるＶＬアミノ酸配列において、１つ以上のさらなる突然変異を有し得るが、がん抗原（例えば、ＣＬＤＮ６）に対する特異的結合が改善されている。
いくつかの実施形態では、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む軽鎖ＣＤＲ（それぞれＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３）を含む抗ＣＬＤＮ６結合部分もまた提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、第１、第２および第３の相補性決定領域を含む重鎖ＣＤＲ（それぞれＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号９５、９８、または１０１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号９５、９８、または１０１の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号９６、９９、または１０２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号９６、９９、または１０２の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号９７、１００、または１０３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＣ ＣＤＲ３は、配列番号９７、１００、または１０３の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号９２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号９２の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号９３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号９３の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号９４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号９４の配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６以外のクラウジンに結合しない。
腫瘍リガンドに結合するナチュラルキラーグループドメイン
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞などの操作された免疫細胞は、腫瘍細胞を認識し、破壊するそれらの能力のために利用される。例えば、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体、または上記キメラ抗原受容体をコードする核酸（または、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲなどのうちの１つ以上に対する指向性を有するＣＡＲ）を含み得る。ＮＫ細胞は、細胞表面に抑制性受容体と活性化受容体の両方を発現する。抑制性受容体は、健常細胞の表面に発現する自己分子と結合し（したがって、「自己」細胞に対する免疫応答を妨げる）、一方、活性化受容体は、腫瘍細胞などの異常な細胞上に発現するリガンドと結合する。抑制性受容体活性化と活性化受容体活性化の間のバランスが活性化受容体に有利な場合、ＮＫ細胞活性化が起こり、標的（例えば、腫瘍）細胞が溶解する。
ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）は、細胞上に発現される種々のリガンドを認識するＮＫ細胞活性化受容体である。種々のＮＫＧ２Ｄリガンドの表面発現は、一般的に健常細胞では低いが、例えば、悪性形質転換によって上方制御される。ＮＫＧ２Ｄによって認識されるリガンドの非限定的な例としては、限定されないが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６、ならびにＮＫ細胞の細胞溶解または細胞傷害性機能を制御する標的細胞上に発現される他の分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１つ以上の腫瘍リガンドに結合し、Ｔ細胞を活性化するために、細胞外ドメインを発現するように操作される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、結合因子／活性化部分としてＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された細胞は、ＮＫＧ２ファミリーの別のメンバー、例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、および／またはＮＫＧ２Ｅを発現するように操作される。一部の実施形態では、このような受容体の組み合わせが操作される。さらに、いくつかの実施形態では、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの他の受容体が発現される。
いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞（例えば、肝細胞）の表面上のリガンドを認識するための細胞外成分としての全長ＮＫＧ２Ｄを含む細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。一実施形態では、全長ＮＫＧ２Ｄは、配列番号２７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、全長ＮＫＧ２Ｄ、またはその機能的断片は、ヒトＮＫＧ２Ｄである。本開示の方法および組成物において使用するためのキメラ受容体に関するさらなる情報は、ＰＣＴ特許公開第２０１８／１８３３８５号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞または他の疾患細胞の表面上のリガンドを認識するための細胞外成分としてのＮＫＧ２Ｄの機能的断片を含む細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの機能的断片は、配列番号２５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片は、完全長野生型ＮＫＧ２Ｄと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、断片は、配列番号２５からの１つ以上のさらなる突然変異を有することができるが、リガンド結合機能を保持するか、またはいくつかの実施形態では、増大したリガンド結合機能を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの機能的断片は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、二量体、三量体、または他のコンカテマー形式として提供され、このような実施形態は、増大したリガンド結合活性を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、完全または部分的に最適化されたコドンであってもよい。一実施形態では、コドンを最適化されたＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、配列番号２８の配列を含む。いくつかの実施形態によれば、有利には、機能的断片は、その天然の膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを欠いているが、ＮＫＧ２Ｄのリガンドに結合するその能力、ならびにリガンド結合時に活性化シグナルを変換する能力を保持する。このような断片のさらなる利点は、ＮＫＧ２Ｄを細胞膜に局在化させるためにＤＡＰ１０を発現させる必要がないことである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドよってコードされる細胞傷害性受容体複合体は、ＤＡＰ１０を含まない。いくつかの実施形態では、ＮＫまたはＴ細胞などの免疫細胞（例えば、本明細書に開示される実施形態に従って操作された非同種反応性Ｔ細胞）は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、およびＮＫＧ２Ｄリガンド、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、および／またはＵＬＢＰ６を標的化する１つ以上のキメラ受容体を発現するように操作される。このような細胞は、いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５も同時に発現する。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、二量体化するように構成される。二量体化は、実施形態に応じて、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含み得る。いくつかの実施形態では、二量体化は、細胞傷害性受容体複合体（したがって、受容体を発現するＮＫ細胞）によるリガンド認識の改善をもたらし、有害な毒性効果の減少（または欠如）をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、内部二量体、または１つ以上の成分サブユニットの反復を採用する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、第２のＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインに結合した第１のＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン、および膜貫通／シグナル伝達領域（または別個のシグナル伝達領域とともに別個の膜貫通領域）を含み得てもよい。
いくつかの実施形態では、種々のドメイン／サブドメインは、リンカー、例えば、使用されるＧＳ３リンカー（配列番号１５および１６、それぞれヌクレオチドおよびタンパク質）（またはＧＳｎリンカー）によって分離される。本明細書に開示される種々の実施形態に従って使用される他のリンカーは、限定されないが、配列番号１７、１９、２１または２３によってコードされるものを含む。これは、受容体複合体の発現、安定性、および／または機能性を増大させることができるポリヌクレオチドに沿って、受容体複合体の種々の成分部分を分離する可能性を提供する。
細胞傷害性シグナル伝達複合体
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、細胞傷害性シグナル伝達複合体を含むキメラ抗原受容体（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、またはＥＧＦＲ（とりわけ）に対する指向性を有するＣＡＲ）、またはＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、および／もしくはＵＬＢＰ６などのＮＫＧ２Ｄリガンドに対する指向性を有するキメラ受容体に関する。本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態によれば、提供される細胞傷害性受容体複合体は、標的細胞の表面上のリガンドに結合する細胞外ドメイン（複数可）上で細胞傷害性シグナル伝達カスケードを開始する１つ以上の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体は、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、および／または少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、１を超える成分部分は、所定のドメインを構成する－例えば、共刺激ドメインは２つのサブドメインを含むことができる。さらに、一部の実施形態では、ドメインは、複数の機能を果たすことができ、例えば、膜貫通ドメインは、シグナル伝達機能を提供するのに役立つことができる。
膜貫通ドメイン
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、膜貫通ドメインを含むキメラ受容体（例えば、腫瘍抗原指向性ＣＡＲおよび／またはリガンド指向性キメラ受容体）に関する。一部の実施形態は、ＮＫＧ２Ｄまたは別の膜貫通タンパク質からの膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインが採用されるいくつかの実施形態では、採用される膜貫通タンパク質の部分は、その正常な膜貫通ドメインの少なくとも一部を保持する。
しかしながら、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方に通常発現される膜貫通糖タンパク質であるＣＤ８の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８αを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、「ヒンジ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αの「ヒンジ」は、配列番号１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジは切断されるかまたは修飾され、配列番号１の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αの「ヒンジ」は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αは、配列番号２の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断されるかまたは修飾され得る。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジは切断されるかまたは修飾され、配列番号３の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジは切断されるかまたは修飾され、配列番号４の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。
いくつかの実施形態では一緒になって、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通複合体は、配列番号１３の核酸配列よってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通複合体は切断されるかまたは修飾され、配列番号１３の配列を有するＣＤ８ヒンジ／膜貫通複合体と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通複合体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通複合ヒンジは切断されるかまたは修飾され、配列番号１４の配列を有するＣＤ８ヒンジ／膜貫通複合体と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメイン複合体ヒンジは切断されるかまたは修飾され、配列番号３０の配列を有するＣＤ２８膜貫通ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。
共刺激ドメイン
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、共刺激ドメインを含むキメラ受容体（例えば、腫瘍抗原指向性ＣＡＲおよび／または腫瘍リガンド指向性キメラ受容体）に関する。さらに、いくつかの実施形態では、種々の膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン（および膜貫通／シグナル伝達ドメインの組み合わせ）、追加の共活性化分子を提供することができる。これらは、例えば、免疫細胞の活性をさらに増大させる特定の分子であり得る。サイトカインは、一部の実施形態において使用され得る。例えば、非限定的な例として、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５などの特定のインターロイキンが使用される。一部の実施形態では、治療のための免疫細胞は、分泌型のような分子を発現するように操作される。さらなる実施形態では、このような共刺激ドメインは、自己分泌刺激分子（または隣接する細胞へのパラクリン刺激因子としてさえも）として作用する膜結合性であるように操作される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作される。このような実施形態では、ＮＫ上のｍｂＩＬ１５発現は、ＮＫ細胞の増殖および／または寿命を増大させることによって、操作されたＮＫ細胞の細胞傷害効果を増大させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子操作された非同種反応性Ｔ細胞などのＴ細胞は、膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作される。このような実施形態では、Ｔ細胞上のｍｂＩＬ１５発現は、操作されたＴ細胞の活性および／または繁殖（例えば、寿命）を増大させることによって、操作されたＴ細胞の細胞傷害効果を増大させる。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１１の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断されるかまたは修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は切断されるかまたは修飾され、配列番号１２の配列を有するｍｂＩＬ１５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。
一部の実施形態では、腫瘍抗原指向性ＣＡＲおよび／または腫瘍リガンド指向性キメラ受容体は、１つ以上の細胞質プロテアーゼ切断部位、例えば、Ｔ２Ａ切断部位、Ｐ２Ａ切断部位、Ｅ２Ａ切断部位、および／またはＦ２Ａ切断部位を含むポリヌクレオチドによってコードされる。このような部位は、細胞質プロテアーゼによって認識され、切断され、ポリヌクレオチドによってコードされる受容体の種々の成分部分の分離（および別々の発現）をもたらすことができる。結果として、実施形態に応じて、操作された細胞傷害性受容体複合体の種々の構成部分は、単一のベクターまたは複数のベクターによりＮＫ細胞またはＴ細胞にデリバリーされ得る。したがって、図に概略的に示されるように、コンストラクトは、単一のポリヌクレオチドよってコードされ得るが、切断部位も含み、そのため、コンストラクトの下流要素は、別個のタンパク質として細胞により発現される（ＩＬ－１５を有する一部の実施形態における場合のように）。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位が使用される。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位は、配列番号９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位は、配列番号９の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断されるかまたは修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位は切断されるかまたは修飾され、配列番号１０の配列を有するＴ２Ａ切断部位と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。
シグナル伝達ドメイン
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（例えば、腫瘍抗原指向性ＣＡＲおよび／または腫瘍リガンド指向性キメラ受容体）に関する。例えば、本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従って操作された免疫細胞は、ＣＤ３ Ｔ細胞受容体複合体（またはその断片）の少なくとも１つのサブユニットを含み得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータは、配列番号７の核酸配列よってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータは、配列番号７の配列を有するＣＤ３ゼータと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断されるかまたは修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインは切断されるかまたは修飾され、配列番号８の配列を有するＣＤ３ゼータドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。
いくつかの実施形態では、予期せぬ増大したシグナル伝達は、その活性が相乗的に作用する複数のシグナル伝達ドメインの使用によって達成される。例えば、いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５の配列を有するＯＸ４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断されるかまたは修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは切断されるかまたは修飾され、配列番号６の配列を有するＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、１つ以上の他のドメインとともに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。さらなる例として、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤゼータの組み合わせが使用される。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢドメインを含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、切断されるかまたは修飾され、配列番号２９の配列を有する４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、１つ以上の他のドメインとともに使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、４－１ＢＢとＣＤ３ゼータとの組み合わせが使用される。さらなる例として、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインはＣＤ２８ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインは切断されるかまたは修飾され、配列番号３１の配列を有するＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、１つ以上の他のドメインとともに使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。さらなる例として、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。
細胞傷害性受容体複合体コンストラクト
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、キメラ抗原受容体、例えば、ＣＤ１９指向性キメラ受容体、ならびにＮＫＧ２Ｄのリガンドを標的化する活性化キメラ受容体（ＡＣＲ）に関する。遺伝子修飾された非同種反応性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞などの免疫細胞におけるこれらの細胞傷害性受容体複合体の発現は、がん性細胞などの特定の標的細胞の標的化および破壊を可能にする。このような細胞傷害性受容体複合体の非限定的な例は、以下でより詳細に検討される。
キメラ抗原受容体細胞傷害性受容体複合体コンストラクト
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の一般的な構造とともに、種々の細胞傷害性受容体複合体（細胞傷害性受容体とも呼ばれる）が本明細書において提供される。図１～７は、がん細胞の表面上に発現され、キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を活性化する腫瘍抗原または腫瘍関連抗原に結合する腫瘍結合部分を含むコンストラクトの非限定的な概略図を模式的に示す。図６は、ＮＫＧ２Ｄ活性化キメラ受容体を非限定的な例として有するキメラ受容体複合体の概略図を示す（ＮＫＧ２Ｄ ＡＣＲａおよびＡＣＲｂを参照されたい）。図６は、ＮＫＧ２Ｄ活性化キメラ受容体を非限定的な例として有する二重特異性ＣＡＲ／キメラ受容体複合体の概略図を示す（二重特異性ＣＡＲ／ＡＣＲａおよびＣＡＲ／ＡＣＲｂを参照されたい）。
図に示されるように、キメラ受容体のいくつかの実施形態は、抗腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジドメイン、Ｉｇ４ ＳＨドメイン（またはヒンジ）、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ζ ＩＴＡＭドメインまたはサブドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、ＮＫｐ８０ドメイン、ＣＤ１６ ＩＣドメイン、２Ａ切断部位、および膜結合ＩＬ－１５ドメインを含む（ただし、いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－１５が使用される）。いくつかの実施形態では、結合および活性化機能は、別々のドメインによって行われるように操作される。いくつかの実施形態は、１を超える腫瘍結合因子部分または他の結合因子／活性化部分との複合体に関する。一部の実施形態では、結合因子／活性化部分は、ＣＤ１９以外の他のマーカー、例えば、本明細書に記載されるがん標的を標的化する。例えば、図６および７は、ＣＤ１２３、ＣＬＤＮ６、ＢＣＭＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ７０、メソテリア、ＰＤ－Ｌ１、およびＥＧＦＲなどの異なる抗原を標的化するＣＡＲコンストラクトの非限定的な例の概略図を示す。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体コンストラクトの一般的構造は、ヒンジおよび／または膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、これらは、単一のドメインによって達成され得るか、またはいくつかの実施形態では、複数のサブドメインが使用され得る。受容体複合体は、標的細胞へのホーミング部分の結合後にシグナルを変換し、最終的に標的細胞における細胞傷害効果をもたらすシグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、複合体は、共刺激ドメインをさらに含み、いくつかの実施形態では、相乗的に作用して、シグナル伝達ドメインの機能を増大させる。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞などの免疫細胞におけるこれらの複合体の発現は、所定の腫瘍マーカーを発現するがん性細胞などの特定の標的細胞の標的化および破壊を可能にする。このような受容体複合体の一部は、標的細胞の表面上のＣＤ１９に結合し、操作された細胞を活性化する抗ＣＤ１９部分、またはＣＤ１９結合部分を含む細胞外ドメインを含む。ＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメインは、シグナル伝達ドメインとして協調して作用し得る。ＩＬ－１５ドメイン、例えば、ｍｂＩＬ－１５ドメインは、共刺激ドメインとして作用し得る。ＩＬ－１５ドメイン、例えば、ｍｂＩＬ－１５ドメインは、それを発現する免疫細胞（例えば、ＮＫまたはＴ細胞）を、標的腫瘍細胞に対して特に有効にすることができる。ｍｂＩＬ－１５ドメインなどのＩＬ－１５ドメインは、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクトにコードされ得ることが承認される。さらに、各成分は、１つ以上の別々の構成要素にコードされ得る。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体またはＣＤ１９指向性受容体は、配列番号３４の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、もしくはそれ以上、または前述のパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲で同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態に応じて、種々の結合因子を用いてＣＤ１９を標的化することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド結合因子が使用され、一方、一部の実施形態では、抗体またはその断片が使用される。抗体を採用するいくつかの実施形態では、抗体配列は、それらの天然型から最適化されるか、ヒト化されるか、または代わりに操作されるかもしくは突然変異されて、抗体または断片の安定性、親和性、アビディティ、または他の特徴のうちの１つ以上が増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的である抗体が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的であるｓｃＦｖが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的な抗体またはｓｃＦｖは、配列番号１０４または１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、重鎖可変部は、配列番号１０４または１０６の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変部は、配列番号１０４または１０６の重鎖可変部をコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１０４または１０６の重鎖可変部をコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的な抗体またはｓｃＦｖは、配列番号１０５または１０７のいずれかのアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号１０５または１０７の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号１０５または１０７の軽鎖可変部をコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１０５または１０７の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体またはｓｃＦｖは、１つ、２つ、または３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号１１１のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号１１１の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号１１２、１１３、または１１４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号１１２、１１３、または１１４の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号１１５のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号の配列１１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号１０８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号１０８の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号１０９のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号１０９の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号１１０の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲが提供される。一部の実施形態では、配列番号１１６の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲが提供される。
一実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｃを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能同等性を共有する配列を含む。開示される配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ １ｄを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示される配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／Ｉｇ４ＳＨ－ＣＤ８ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ４ａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、Ｉｇ４ ＳＨドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／Ｉｇ４ＳＨ－ＣＤ８ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ４ｂを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、Ｉｇ４ ＳＨドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示される配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｅを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示される配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｆを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／Ｉｇ４ＳＨ－ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２、ＣＡＲ２ｉを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、Ｉｇ４ ＳＨドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／Ｉｇ４ＳＨ－ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３２８／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２、ＣＡＲ２ｊを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、Ｉｇ４ ＳＨドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／Ｉｇ４ＳＨ－ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ４ｃを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、Ｉｇ４ ＳＨドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／Ｉｇ４ＳＨ－ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ４ｄを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、Ｉｇ４ ＳＨドメイン、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ３αＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ４ｅを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ３αＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ４ｆを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ ４ｇを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図４、ＣＡＲ ４ｈを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ８アルファＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９部分、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ８アルファＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ ５ｂを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ３ ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ｃ参照）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ３ ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ｄを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ３ ＴＭ／４－１ＢＢ／ＮＫｐ８０キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ｅを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、およびＮＫｐ８０ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ３ ＴＭ／４－１ＢＢ／ＮＫｐ８０／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ｆを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、ＮＫｐ８０ドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ３ ＴＭ／ＣＤ１６細胞内ドメイン／４－１ＢＢキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ｇを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ１６細胞内ドメイン、および４－１ＢＢドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８アルファヒンジ／ＣＤ３ ＴＭ／ＣＤ１６／４－１ＢＢ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、ＣＡＲ５ｈを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ１６細胞内ドメイン、４－１ＢＢドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、二重特異性ＣＡＲ／ＡＣＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン（全長または断片のいずれか）、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＮＫＧ２Ｄ ＥＣドメイン／ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図５、二重特異性ＣＡＲ／ＡＣＲｂを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、腫瘍結合因子、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン（全長または断片のいずれか）、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体が提供される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号８５の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ａキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号８５と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ａキメラ抗原受容体は、配列番号８６と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ｍｂＩＬ１５をさらに含むＣＡＲ１ａコンストラクトが提供される（例えば、図１ ＣＡＲ１ｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｃを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５（図１、ＣＡＲ１ｄを参照されたい）をさらに含む。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号５９の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｄキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号５９と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ１９キメラ抗原受容体は、配列番号６０と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。
開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｅを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図１、ＣＡＲ１ｄを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ２８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号６１の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｄキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号６１と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｄキメラ抗原受容体は、配列番号６２と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＩＣＯＳ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｇを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図１、ＣＡＲ１ｈを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＩＣＯＳ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号６３の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｈキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号６３と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｈキメラ抗原受容体は、配列番号６４と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｈ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１、ＣＡＲ１ｉを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図３Ａ、ＮＫ１９－４ｂを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号６５の配列を有する核酸分子よってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｈキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｈキメラ抗原受容体は、配列番号６６と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ１ｈ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＮＫＧ２ＤＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２、ＣＡＲ２ａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５（図２、ＣＡＲ２ｂを参照されたい）をさらに含む。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＮＫＧ２ＤＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号６７の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｂキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号６７と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｂキメラ抗原受容体は、配列番号６８と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２ ＣＡＲ２ｃを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４０シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図２、ＣＡＲ２ｄを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ可変重鎖、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号６９の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｄキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号６９と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｄキメラ抗原受容体は、配列番号７０と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ＥＧＦＲｔキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２、ＣＡＲ２ｅを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位（ｓｉｄｅ）、および上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の切断型を含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図２、ＣＡＲ２ｆを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５／２Ａ／ＥＧＦＲｔキメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の切断型、追加の２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号７１の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｆキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号７１と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｆキメラ抗原受容体は、配列番号７２と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２、ＣＡＲ２ｇを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４０シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図２、ＣＡＲ２ｈを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ可変軽鎖、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号７３の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｈキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号７３と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ２ｈキメラ抗原受容体は、配列番号７４と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ２７／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図３、ＣＡＲ３ａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図３、ＣＡＲ３ｂを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ２７／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号７５の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｂキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号７５と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｂキメラ抗原受容体は、配列番号７６と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ７０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図３、ＣＡＲ３ｃを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ７０シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図３、ＣＡＲ３ｄを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ７０／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ７０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号７７の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｄキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号７７と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｄキメラ抗原受容体は、配列番号７８と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、Ｆｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ１６１／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図３、ＣＡＲ３ｅを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ１６１シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図３、ＣＡＲ３ｆを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ１６１／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ１６１シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号７９の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｆキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｆキメラ抗原受容体は、配列番号８０と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図３、ＣＡＲ３ｇを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４０Ｌシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図３、ＣＡＲ３ｈを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４０Ｌシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号８１の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｈキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｈキメラ抗原受容体は、配列番号８２と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、腫瘍結合因子／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４４／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図３、ＣＡＲ３ｉを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、腫瘍結合因子、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４４シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ｍｂＩＬ１５をさらに含む（図３、ＣＡＲ３ｊを参照されたい）。非限定的な実施形態として、本明細書には、抗ＣＤ１９部分／ＣＤ８ヒンジ／ＣＤ８ａＴＭ／ＣＤ４４／ＣＤ３ゼータ／２Ａ／ｍＩＬ－１５キメラ抗原受容体複合体が提供される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ４４シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータドメイン、２Ａ切断部位、およびｍｂＩＬ－１５ドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号８３の配列を有する核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｊキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ３ｊキメラ抗原受容体は、配列番号８４と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ｓｃＦｖはＦｌａｇタグを含まない。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１２３／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図６、ＣＤ１２３ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ１２３部分、ＣＤ８アルファヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じる得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＣＤ１２３ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図６、ＣＤ１２３ ＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図６、ＣＬＤＮ６ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＬＤＮ６結合部分、ＣＤ８アルファヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じる得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＣＬＤＮ６ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図６、ＣＬＤＮ６ ＣＡＲｂを参照されたい）。
実施形態に応じて、種々の結合因子を使用して、ＣＬＤＮ６を標的化することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド結合因子が使用され、一方、いくつかの実施形態では、抗体またはその断片が使用される。抗体を採用するいくつかの実施形態では、抗体配列は、それらの天然型から最適化され、ヒト化され、または代わりに操作されもしくは突然変異されて、抗体または断片の安定性、親和性、アビディティ、または他の特徴のうちの１つ以上が増加する。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的な抗体が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的なｓｃＦｖが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的な抗体またはｓｃＦｖは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変部を含む。一部の実施形態では、重鎖可変部は、配列番号８８の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変部は、配列番号８８の重鎖可変部をコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号８８の重鎖可変部をコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６に特異的な抗体またはｓｃＦｖは、配列番号８９、９０、または９１のいずれかのアミノ酸配列を含む軽鎖可変部を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号８９、９０、または９１の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変部は、配列番号８９、９０、または９１の軽鎖可変部をコードするポリヌクレオチドの相補物と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号８９、９０、または９１の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドよってコードされるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはｓｃＦｖは、１つ、２つ、または３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号９２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１の重鎖ＣＤＲは、配列番号９２の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号９３のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第２の重鎖ＣＤＲは、配列番号９３の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号９４のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第３の重鎖ＣＤＲは、配列番号９４の配列少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号９５、９８、または１０１のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１の軽鎖ＣＤＲは、配列番号９５、９８、または１０１の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号９６、９９、または１０２のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第２の軽鎖ＣＤＲは、配列番号９６、９９、または１０２の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号９７、１００、または１０３のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第３の軽鎖ＣＤＲは、配列番号９７、１００、または１０３の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。
有利には、いくつかの実施形態では、ＣＬＤＮ６ ＣＡＲは、ＣＬＤＮ６に対して高度に特異的であり、ＣＬＤＮ３、４、または９のいずれにも実質的に結合しない。
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図６、ＢＣＭＡ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＢＣＭＡ結合部分、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＢＣＭＡ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図６、ＢＣＭＡ ＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図６、ＨＥＲ２ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＨＥＲ２結合部分、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＨＥＲ２ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図６、ＨＥＲ２ ＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータ活性化キメラ受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図６、ＮＫＧ２Ｄ ＡＣＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインと結合することができるＮＫＧ２Ｄ受容体の断片を含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、配列番号１４５の核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１７４のアミノ酸配列よってコードされる。一部の実施形態では、キメラ受容体の配列は、配列番号１４５と異なることができるが、実施形態に応じて、配列番号１４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を残存する。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は配列番号１４５とは異なることができるが、キメラ受容体は、ＮＫ細胞活性化および／または細胞傷害性機能を保持するか、または一部の実施形態では増大している。さらに、いくつかの実施形態では、このコンストラクトは、ｍｂＩＬ１５と共発現され得るものであってもよい（図７、ＮＫＧ２Ｄ ＡＣＲｂ）。本開示の方法および組成物において使用するためのキメラ受容体に関するさらなる情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開第２０１８／１８３３８５号に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図７、ＣＤ７０ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＣＤ７０結合部分、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＣＤ７０ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図７、ＣＤ７０ ＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗メソテリン／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図７、メソセリンＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗メソテリン結合部分、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むメソセリンＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図７、メソセリンＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図７、ＰＤ－Ｌ１ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＰＤ－Ｌ１結合部分、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが承認されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＰＤ－Ｌ１ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図７、ＰＤ－Ｌ１ ＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ／ＣＤ８ａヒンジ／ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン／ＯＸ４０／ＣＤ３ゼータキメラ抗原受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図７、ＥＧＦＲ ＣＡＲａを参照されたい）。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、抗ＥＧＦＲ結合部分、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインを含むかまたはそれらから構成される。いくつかの実施形態では、この受容体複合体は、本明細書に開示される配列の組み合わせから得られた配列を含む核酸分子によってコードされるか、または本明細書に開示される配列の組み合わせから得られたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、構成部分の例として本明細書に含まれるものなどの本明細書に記載される１つ以上の配列番号に従う配列を含む。いくつかの実施形態では、コード核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に記載される１つ以上の配列番号の組み合わせから生じる配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性、相同性および／または機能的同等性を共有する配列を含む。開示された配列の特定の配列変化、伸長、および／または切断は、例えば、クローニング（例えば、制限部位の作製のための）の容易さまたは効率の結果として、配列を組み合わせる場合に生じ得ることが理解されなければならない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍｂＩＬ１５をさらに含むＥＧＦＲ ＣＡＲコンストラクトが提供される（例えば、図７、ＥＧＦＲ ＣＡＲｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドなどの発現ベクターは、その非限定的な例が配列番号８７に提供されるが、本明細書において提供されるキメラ抗原受容体のいずれかを発現するために使用される。
処置方法
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されているように、キメラ抗原受容体および／または活性化キメラ受容体を含む細胞または免疫細胞を用いて、がんを処置し、軽快させ、阻害し、または予防する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、がんを処置または予防することを含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、腫瘍指向性キメラ抗原受容体および／または腫瘍指向性キメラ受容体を発現する、治療上有効量の免疫細胞を投与することを含む。このように処置され得るがんのタイプの例は、本明細書に記載される。
特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（複数可）を用いた対象の処置は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成し、例えば、（ｉ）疾患またはそれに関連する症状の重症度の減少または軽快；（ｉｉ）疾患に関連する症状の持続期間の減少；（ｉｉｉ）疾患またはそれに関連する症状の進行に対する保護；（ｉｖ）疾患またはそれに関連する症状の退行；（ｖ）疾患に関連する症状の発生または発症に対する保護；（ｖｉ）疾患に関連する症状の再発に対する保護；（ｖｉｉ）対象の入院の減少；（ｖｉｉｉ）入院期間の減少；（ｉｘ）疾患を有する対象の生存の増加；（ｘ）疾患に関連する症状の数の減少；（ｘｉ）別の治療法の予防効果または治療効果の強化、改善、補足、補完、または増強が含まれる。有利には、本明細書に開示される非同種反応性の操作されたＴ細胞は、上記のうちの１つ以上をさらに増大させる。投与は、限定されないが、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、肝内、腹腔内、および／または患部組織への局所デリバリーなどの種々の経路によることができる。
投与および用量
本明細書では、がんを有する対象を処置する方法であって、本明細書に開示される細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞）を含む組成物を対象に投与することを含む方法がさらに提供される。例えば、本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、がん患者を処置するための、腫瘍指向性キメラ抗原受容体および／もしくは腫瘍指向性キメラ受容体の使用、または腫瘍指向性キメラ抗原受容体および／もしくは腫瘍指向性キメラ受容体を発現する細胞の使用に関する。がんを処置するためのこのような操作された免疫細胞の使用もまた提供される。
特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞（複数可）を用いた対象の処置は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成し、例えば、（ｉ）疾患またはそれに関連する症状の重症度の減少または軽快；（ｉｉ）疾患に関連する症状の持続期間の減少；（ｉｉｉ）疾患またはそれに関連する症状の進行に対する保護；（ｉｖ）疾患またはそれに関連する症状の退行；（ｖ）疾患に関連する症状の発生または発症に対する保護；（ｖｉ）疾患に関連する症状の再発に対する保護；（ｖｉｉ）対象の入院の減少；（ｖｉｉｉ）入院期間の減少；（ｉｘ）疾患を有する対象の生存の増加；（ｘ）疾患に関連する症状の数の減少；（ｘｉ）別の治療法の予防効果または治療効果の強化、改善、補足、補完、または増強が含まれる。これらの比較の各々は、例えば、本明細書に開示されるコンストラクトを発現しない細胞を用いた、疾患に対する細胞ベースの免疫療法を含む、疾患に対する異なる療法に対するものである。有利には、本明細書に開示される非同種反応性の操作されたＴ細胞は、上記のうちの１つ以上をさらに増大させる。
投与は、限定されないが、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、肝内、腹腔内、および／または患部組織への局所デリバリーなどの種々の経路によることができる。ＮＫ細胞および／またはＴ細胞などの免疫細胞の用量は、所定の対象について、それらの体重、疾患タイプおよび状態、ならびに処置の所望の攻撃性に基づいて容易に決定することができるが、実施形態に応じて、約１０５細胞／ｋｇ～約１０１２細胞／ｋｇ（例えば、１０５～１０７、１０７～１０１０、１０１０～１０１２、およびその中の重複範囲）の範囲である。一実施形態では、用量漸増レジメンが使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫおよび／またはＴ細胞などの様々な免疫細胞が、例えば、約１×１０６細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇの間で投与される。実施形態に応じて、種々のタイプのがんを処置することができる。いくつかの実施形態では、肝細胞がん腫が処置される。本明細書において提供されるさらなる実施形態は、がんの以下の非制限的な例の処置または予防を含み、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん腫、カポジ肉腫、リンパ腫、胃腸がん、虫垂がん、中枢神経系がん、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍（限定されないが、例えば、星状細胞腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、神経膠芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄芽腫）、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、頸部がん、結腸がん、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、乳管がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、腎細胞がん、白血病、口腔がん、鼻咽頭がん、肝臓がん、肺がん（限定されないが、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん）、膵臓がん、腸がん、リンパ腫、黒色腫、眼がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、下垂体がん、子宮がん、および膣がんが含まれる。
一部の実施形態では、本明細書には、配列番号１～１７４（または配列番号１～１７４のうちの２つ以上の組み合わせ）のそれぞれの核酸またはアミノ酸配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（およびその範囲）の配列同一性および／または相同性を有し、それぞれの配列番号１～１７４（または配列番号１～１７４のうちの２つ以上の組み合わせ）と比較して、限定されないが、（ｉ）増大した増殖、（ｉｉ）増大した活性化、（ｉｉｉ）核酸およびアミノ酸配列よってコードされる受容体を有するＮＫ細胞が結合するリガンドを提示する細胞に対する増大した細胞傷害活性、（ｉｖ）増大した腫瘍または感染部位へのホーミング、（ｖ）減少した標的外の細胞傷害効果、（ｖｉ）増大した免疫刺激性サイトカインおよびケモカイン（限定されないが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ－２２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５を含む）の増大した分泌、（ｖｉｉ）さらなる先天性および適応性免疫応答を刺激する増大した能力、および（ｖｉｉ）それらの組み合わせを含む機能のうちの１つ以上も示す核酸およびアミノ酸配列もまた提供される。
さらに、いくつかの実施形態では、核酸コードの縮重を主要因としながら、本明細書に開示される核酸のいずれかに対応するアミノ酸配列が提供される。さらに、本明細書に明示的に開示されたものとは異なるが、機能的類似性または同等性を有する配列（核酸またはアミノ酸のいずれか）もまた、本開示の範囲内で企図される。上記には、突然変異、切断、置換、または他のタイプの修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、開示された細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性受容体複合体の発現のために少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される。
さらに、いくつかの実施形態によれば、本明細書において提供されるポリヌクレオチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供され、細胞傷害性受容体複合体の発現のために、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されてもよいベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスである。
さらに、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、または細胞傷害性受容体複合体を含む、操作された免疫細胞（例えば、ＮＫおよび／またはＴ細胞）が提供される。さらに、本明細書では、操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞および／または操作されたＴ細胞）の混合物を含む組成物が提供され、各集団は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、または細胞傷害性受容体複合体を含む。さらに、本明細書には、操作された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞および／または遺伝子操作されたＴ細胞）の混合物を含む組成物が提供され、各集団は、本明細書において開示されるポリヌクレオチド、ベクター、または細胞傷害性受容体複合体を含み、Ｔ細胞集団は、ｇｖＨＤおよび／またはＨｖＤを減少／除去するために遺伝子修飾されている。一部の実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、同じドナー由来である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、異なるドナー由来である。
ＮＫ細胞および／またはＴ細胞などの免疫細胞の用量は、所定の対象について、それらの体重、疾患タイプおよび状態、ならびに処置の所望の攻撃性に基づいて容易に決定することができるが、実施形態に応じて、約１０５細胞／ｋｇ～約１０１２細胞／ｋｇ（例えば、１０５～１０７、１０７～１０１０、１０１０～１０１２、およびその中の重複範囲）の範囲である。一実施形態では、用量漸増レジメンが使用される。いくつかの実施形態では、様々なＮＫ細胞が、例えば、約１×１０６細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇの間で投与される。実施形態に応じて、種々のタイプのがんまたは感染症を処置することができる。
がんの種類
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体および／または腫瘍指向性キメラ受容体を含む免疫細胞を、がんを有する患者に投与することに関する。本明細書において提供される種々の実施形態は、以下のがんの非限定的な例の処置または予防を含む。がんの例としては、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん腫、カポジ肉腫、リンパ腫、胃腸がん、虫垂がん、中枢神経系がん、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍（限定されないが、例えば、星状細胞腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄芽腫）、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、頸部がん、結腸がん、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、乳管がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、腎細胞がん、白血病、口腔がん、鼻咽頭がん、肝臓がん、肺がん（限定されないが、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん）、膵臓がん、腸がん、リンパ腫、黒色腫、眼がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、下垂体がん、子宮がん、および膣がんが挙げられる。
がん標的
本明細書に記載される組成物および方法のいくつかの実施形態は、がん抗原を標的化するキメラ受容体を含む免疫細胞に関する。標的抗原の非限定的な例には、以下が含まれる：ＣＤ５、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも呼ばれる）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮細胞増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖｉｉｉ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；急性白血病またはリンパ腫で発現するが、造血前駆細胞では発現しないグリコシル化ＣＤ４３エピトープ、非造血がんで発現するグリコシル化ＣＤ４３エピトープ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；キット（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（精巣またはＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ（ＦＲａまたはＦＲ１）；葉酸受容体ベータ（ＦＲｂ）；受容体チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面結合（ＭＵＣ１）；上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；Ｐｒｏｓｔａｓｅ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータタイプ、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）とアベルソンマウス白血病ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＣｌａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量－黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クラウジン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳ０－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐにあるＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロスタイン；スルビビン；テロメラーゼ；前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴ Ａ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴＩ）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ；逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレークポイント；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスプロテインＰａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス発がん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ＩＢ １（ＣＹＰＩＢ １）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはインプリント部位の調節因子の兄弟）、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮がん抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスプロテインＰａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＭＰＬ、ビオチン、ｃ－ＭＹＣエピトープタグ、ＣＤ３４、ＬＡＭＰ１ ＴＲＯＰ２、ＧＦＲアルファ４、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ６、ＮＹＢＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ２００Ｒ、Ｓｌｅａ（ＣＡ１９．９；シアリルルイス抗原）；フコシル－ＧＭ１、ＰＴＫ７、ｇｐＮＭＢ、ＣＤＨ１－ＣＤ３２４、ＤＬＬ３、ＣＤ２７６／Ｂ７Ｈ３、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＤ１７９ｂ－ＩＧＬｌｌ、ＴＣＲガンマ－デルタ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３２（ＦＣＧＲ２Ａ）、Ｔｎ ａｇ、Ｔｉｍｌ－／ＨＶＣＲ１、ＣＳＦ２ＲＡ（ＧＭ－ＣＳＦＲ－アルファ）、ＴＧＦベータＲ２、Ｌｅｗｓ Ａｇ、ＴＣＲ－ベータ鎖、ＴＣＲ－ベータ２鎖、ＴＣＲ－ガンマ鎖、ＴＣＲ－デルタ鎖、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲまたはＧＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４、ＨＩＶ１エンベロープ糖タンパク質、ＨＴＬＶ１－Ｔａｘ、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ－ＥＢＮＡ３ｃ、ＫＳＨＶ Ｋ８．１、ＫＳＨＶ－ｇＨ、インフルエンザＡ血球凝集素（ＨＡ）、ＧＡＤ、ＰＤＬ１、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）に対する自己抗体、デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）に対する自己抗体、ＨＬＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩｇＥ、ＣＤ９９、Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ、組織因子１（ＴＦ１）、ＡＦＰ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｃｌａｕｄｉｎｌ ８．２（ＣＬＤ１８Ａ２またはＣＬＤＮ１８Ａ．２））、Ｐ－糖タンパク質、ＳＴＥＡＰ１、Ｌｉｖｌ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、Ｃｒｉｐｔｏ、ｇｐＡ３３、ＢＳＴ１／ＣＤ１５７、低コンダクタンスクロライドチャネル、およびＴＮＴ抗体によって認識される抗原。
以下は、下記に開示される実施例において使用された実験方法および材料の非限定的な記載である。
本明細書に開示される種々の実施形態をさらに構築するために、異なる経路を介してＮＫ機能を媒介するいくつかの遺伝子を選択して、遺伝子編集技術を介してそれらの発現を減少／排除する影響を評価した。これらの初期標的は、操作されたＮＫ細胞、操作されたＴ細胞、またはそれらの組み合わせを利用するか否かにかかわらず、免疫細胞媒介免疫療法の１つ以上の側面を増大させるために、本明細書に開示される実施形態に従って編集することができる遺伝子タイプの非限定的な例を表す。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、名称から示唆されるように、腫瘍の周囲の環境であり、周囲の血管および毛細血管、その領域を循環するかまたはそれに保持される免疫細胞、線維芽細胞、腫瘍細胞、免疫細胞またはその領域の他の細胞によって関連する種々のシグナル伝達分子、ならびに周囲の細胞外マトリックスが含まれる。ＴＭＥの修飾を含む、宿主免疫細胞による検出および／または破壊を回避するために、種々の機構が腫瘍によって使用される。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、またはさらに免疫寛容を誘導することによって、一部には、ＴＭＥにおける免疫細胞の侵入を制限し、および／またはＴＭＥにおける免疫細胞の増殖／拡大を制限することによって、ＴＭＥを変化させ得る。腫瘍はまた、ＥＣＭを修飾することができ、新たな部位への腫瘍の血液溢出を発生させることができる。形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦｂ）は、炎症を減少させ、自己免疫を防御する場合に有益な効果を有する。しかしながら、抗腫瘍免疫応答を阻害するように機能することも可能であり、したがって、ＴＧＦｂの発現の上方制御は、腫瘍の進行および転移に関係していると考えられている。ＴＧＦｂシグナル伝達は、ＮＫ細胞によって発現されるＴＧＦｂ受容体、例えば、ＴＧＦｂ受容体アイソフォームＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）と相互作用することによって、ＮＫ細胞の細胞傷害性機能を阻害することができる。本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従って、遺伝子編集を介するＴＧＦＢＲ２の発現の減少または排除（例えば、ＴＧＦＢＲ２ガイドＲＮＡによってガイドされるＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９による）は、ＮＫ細胞におけるＴＧＦｂの阻害効果を中断する。
上記で検討したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＮＫ細胞によるＴＧＦＢＲ２の発現を特異的に標的化し、減少させた。以下に要約するガイドＲＮＡの種々の非限定的な例を試験した。
Figure 2022535429000002
簡単に説明すると、凍結保存された精製ＮＫ細胞を０日目に解凍し、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９および１つの（または２つの）ガイドＲＮＡ（確立された市販のトランスフェクションガイドラインを用いて）によるエレクトロポレーションに供し、次に、４００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２培地中で１日間培養し、続いて、フィーダー細胞（例えば、４－１ＢＢＬおよび／またはｍｂＩＬ１５を発現する修飾されたＫ５６２細胞）を用いて４００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２培養を行った。７日目に、ノックアウト効率を決定し、ＮＫ細胞に、ＮＫ１９－１ ＣＡＲコンストラクトをコードするウイルス（ＣＡＲの非限定的な例として）を用いて形質導入した。１４日目に、ノックアウト効率をフローサイトメトリーまたは他の手段によって決定し、得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。
ＴＧＦＢＲ２発現のフローサイトメトリー分析を図９Ａ～９Ｇに示す。図９Ａは、ＮＫ細胞を模擬ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集条件（ナンセンスまたは欠損ガイドＲＮＡ）に曝露した対照データを示す。示されるように、ＮＫ細胞の約２１％は、ＴＧＦＢＲ２発現に対して陽性である。ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９装置をガイドＲＮＡ１（配列番号１４７）を用いてガイドした場合、ＴＧＦＢＲ２発現は減少しなかった（図９Ｂを参照されたい）。同様の結果が図９Ｃおよび９Ｄに示され、個々に使用されたガイドＲＮＡ２（配列番号１４８）およびガイドＲＮＡ３（配列番号１４９）は、ＴＧＦＲＢ２発現に限定的な影響を及ぼした。対照的に、ガイドＲＮＡの組み合わせは、ＴＧＦＢＲ２発現の減少をもたらした。図９Ｅは、ガイドＲＮＡ１（配列番号１４７）とガイドＲＮＡ２（配列番号１４８）の組み合わせからの結果を示し、図９Ｆは、ガイドＲＮＡ１（配列番号１４７）とガイドＲＮＡ３（配列番号１４９）の組み合わせを使用した後のＴＧＦＢＲ２の発現を示す。いずれの場合も、ガイドＲＮＡ単独の使用（約１１～１２％発現）と比較して、ＴＧＦＢＲ２発現は約５０％減少した。図９Ｇは、ガイドＲＮＡ２（配列番号１４８）とガイドＲＮＡ３（配列番号１４９）の両方を用いた場合のＴＧＦＢＲ２発現の顕著な減少を示し、ＴＧＦＢＲ２を発現するＮＫ細胞はわずか約１％である。次世代シークエンシングを用いて、フローサイトメトリー発現分析を確認した。これらのデータは、図１０Ａ～１０Ｇに示され、図９Ａ～９ＧのそれぞれのガイドＲＮＡに対応する。これらのデータは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓシステムとともに使用されるガイドＲＮＡが、ＮＫ細胞上のＴＧＦＢＲ２などの特定の標的分子の発現を減少させることができることを確認する。いくつかの実施形態によれば、ＴＧＦＢＲガイドＲＮＡ２とガイドＲＮＡ３などのガイドＲＮＡの組み合わせは、ＮＫ細胞によるＴＧＦＢＲ２の発現を本質的に排除するために相乗的に協働する。
これらの発現ノックアウト実験に基づき、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞の細胞傷害性を阻害するＴＧＦｂの能力を評価した。そうするために、ＮＫ細胞は、上記で検討したようにＴＧＦＢＲ２遺伝子編集に供され、遺伝子編集装置を用いたエレクトロポレーションの２１日後に、得られた細胞の細胞傷害性を、１：１および１：２のエフェクター：標的比で、ＴＧＦｂの非存在下（黒丸）または存在下（２０ｎｇ／ｍＬ；白四角）、ＲＥＨ腫瘍細胞に対して評価した。データは、図１１Ａ～１１Ｄに要約される。図１１Ａは、ガイドＲＮＡ１と２の組み合わせに関するデータを示す。ＴＧＦｂの添加による１：１と１：２の両方の比で検出された細胞傷害性パーセントの減少によって証明されるように、これらのデータは、ＴＧＦＢＲ２の存在（受容体の発現の限定された減少による）が、ＴＧＦｂがＮＫ細胞の細胞傷害性活性を阻害することを可能にするという点で、上記で検討した発現データと一致する。図１１Ｄは、模擬結果を示し、図１１Ａに示されるものと同様の細胞傷害性パターンを有する。図１１Ｂは、ガイドＲＮＡ１および３を用いてＴＧＦＢＲ２発現をノックダウンした場合に、ＴＧＦｂの存在がＮＫ細胞の細胞傷害性を１：１の標的比で減少させた、同様のデータを示す。１：２の標的比では、ＮＫ細胞は、ＴＧＦｂが存在するか否かにかかわらず、同程度の細胞傷害性を示した（ＴＧＦＢＲ２ノックダウンＮＫ細胞単独と比較して減少した）。他の実験条件とは対照的に、および発現データと一致して、図１１Ｃは、ガイドＲＮＡ２と３の両方を用いてＣＲＩＳＰｒで編集されたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。試験した他のＮＫ細胞の細胞傷害性を減少させる濃度でＴＧＦｂが存在するにもかかわらず、遺伝子編集のために本質的にＴＧＦＢＲ２発現を欠くこれらのＮＫ細胞は、細胞傷害性において無視できる低下を示す。これらのデータは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態によれば、例えば、免疫細胞活性の負の調節因子の発現を破壊するための遺伝子編集技術の使用は、本明細書に開示される免疫細胞の増大した細胞傷害性および／または持続性をもたらすことを示す。
図１２Ａ～１２Ｆは、ＴＧＦＢＲ２に対する指向性を有するさらなるガイドＲＮＡに関連するフローサイトメトリーデータを提示する（表１を参照されたい）。図１２Ａは、ＮＫ細胞（例えば、ＴＧＦＢＲ２を発現しないＮＫ細胞）によるＴＧＦＢＲ２の発現の陰性対照評価を示す。図１２Ｂは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９遺伝子編集装置でエレクトロポレーションされなかったＮＫ細胞についての陽性対照データを示し、したがって、ＮＫ細胞によるＴＧＦＢＲ２の約３７％の発現をもたらした。図１２Ｃ、１２Ｄおよび１２Ｅは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９編集を受け、それぞれガイドＲＮＡ４（配列番号１５０）、ガイドＲＮＡ５（配列番号１５１）、またはガイドＲＮＡ６（配列番号１５２）によってガイドされたＮＫ細胞によるＴＧＦＢＲ２発現を示す。ガイドＲＮＡ４は、ＴＧＦＢＲ２発現の中程度のノックダウン（陽性対照と比較して約１０％減少）をもたらした。対照的に、ガイドＲＮＡ５およびガイドＲＮＡ６は各々、ＴＧＦＢＲ２発現を有意に減少させ、それぞれ約３３％および２８％減少させた。これらの２つの単一ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ２およびガイドＲＮＡ３（図１２Ｆに示される追加データ）の組み合わせで見られた（上記で検討した）減少と同等であった。本明細書において検討されるいくつかの実施形態に従って、操作された免疫細胞は、得られた免疫細胞が、操作された細胞に増大した細胞傷害性を付与するキメラコンストラクトを発現するように操作されるように遺伝子編集に供さる。さらに、このような細胞は、例えば、免疫細胞の活性または持続性を減少させるように機能する阻害経路の少なくとも一部を破壊することによって、免疫細胞を脱阻害するように遺伝子修飾される。本明細書において検討されるように、細胞傷害性コンストラクトの遺伝子編集および発現が適合性であることを確認するために、ＣＤ１９を標的化するキメラ抗原受容体コンストラクト（ここではＮＫ１９－１として特定される）の非限定的な例の発現を、遺伝子編集後にＴＧＦＢＲ２発現をノックダウンするために評価した。これらのデータを図１３Ａ～１３Ｆに示す。
図１３Ａは、抗ＣＤ１９指向性ＣＡＲ（ＮＫ１９－１）の非限定的な例の発現の陰性対照評価を示す。ここでは、ＮＫ細胞は、ＮＫ１９－１コンストラクトで形質導入されなかった。対照的に、図１３Ｂは、エレクトロポレートされていないＮＫ細胞（ＣＲＩＳＰｒ遺伝子編集プロトコルを介する処理の欠如を説明するための対照として）によるＮＫ１９－１の陽性対照発現を示す。図１３Ｃは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ４の使用を介してＴＧＦＢＲ２ノックダウンを受けたＮＫ細胞によるＮＫ１９－１の発現を示す。示されるように、ＣＲＩＳＰｒによる遺伝子編集後には、ＮＫ１９－１発現の見掛けの減少のみがある。いくつかの実施形態によれば、ガイドＲＮＡおよび／または遺伝子編集のメカニズム（例えば、ＣＲＩＳＰｒ対ＴＡＬＥＮ）に応じて、ＣＡＲ発現のわずかな変化が減少および／または排除される。これは、例えば、図１３Ｄに見ることができ、ガイドＲＮＡ５の使用は、ＮＫ細胞によるＮＫ１９－１発現のさらにより小さな変化をもたらした。図１３Ｅおよび１３Ｆは、ガイドＲＮＡ６単独、ならびにガイドＲＮＡ２＋３に関するデータを示す（それぞれ）。総合すると、これらのデータは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従って使用される２つのアプローチ、すなわち、キメラ受容体の発現を誘導する遺伝子編集および遺伝子修飾は、免疫細胞を編集して、免疫細胞機能の負の調節因子の発現を減少／除去するプロセスが、キメラ受容体コンストラクトのロバストな発現を妨げないという点で、互いに適合性であることを示す。実際、いくつかの実施形態では、免疫細胞の遺伝子編集および操作は、より効果的で、強力であり、および／またはより長く持続する細胞傷害性免疫細胞をもたらす。
図１４Ａ～１４Ｄは、遺伝子編集（例えば、遺伝子ノックアウト）および／または遺伝子操作（例えば、ＣＡＲ発現）に供されるＮＫ細胞の細胞傷害性の評価の方法および結果、ならびにそれらのそれぞれの対照を示す。最初に図１４Ｄから開始して、０日目に、ＮＫ細胞は、指示されたガイドＲＮＡの１つ（またはそれらの組み合わせ）とともに、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９成分を用いてエレクトロポレーションに供された。ＮＫ細胞を１日間、高ＩＬ２培地で培養し、続いて、低ＩＬ２およびフィーダー細胞（上記で検討される）を用いてさらに６日間培養した。７日目に、ＮＫ細胞は示された抗ＣＤ１９ ＣＡＲウイルスで形質導入された。７日後、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－ベータの存在下でＩｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイを行った。上記で検討したように、ＴＧＦ－ベータは、腫瘍を排除する際の免疫細胞の有効性を減少させる試みにおいて、腫瘍細胞から放出され、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で腫瘍微小環境に浸透する強力な免疫抑制因子である。結果を図１４Ａに示す。上のトレースで示されるように、Ｎａｌｍ６細胞は、単独で増殖し、実験期間中、ロバストに拡大する。エレクトロポレートされていないＮＫ細胞（遺伝子編集またはＣＡＲ発現なし；ＵＮ－ＥＰ ＮＫ）は、Ｎａｌｍ６拡大の減少を引き起こした。Ｎａｌｍ６増殖を減少したのは、なおさらに、遺伝子編集と操作されたＣＡＲ発現（ＴＧＦＢＲ－４ ＣＡＲ１９およびＴＧＦＢＲ－６ ＣＡＲ１９）の両方を受けたＮＫ細胞であった。これらの結果は、最初に、これらの２つの技術（例えば、編集および操作）が互いに適合性であり、得られた免疫細胞において、特に、ＴＧＦ－ベータのような腫瘍微小環境における免疫抑制因子に対する細胞内の抵抗性を生じさせることによって、細胞傷害性が増大し得ることを示す。エレクトロポレーションを受けたが、ＣＡＲ（ＥＰ ＮＫ）を発現するように操作されなかったＮＫ細胞は、Ｎａｌｍ６増殖を減少させた。しかしながら、最も注目すべきは、ＣＡＲ１９－１を発現するように操作されたＮＫ細胞の使用（ＣＡＲの非限定的な例として）に起因するＮａｌｍ６拡大の劇的な阻害であり、ＮＫ細胞はまた、ガイドＲＮＡ２とガイドＲＮＡ３（ＴＧＦＢＲ－２＋３ ＣＡＲ１９）の組み合わせ、または単一ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡ５（ＴＧＦＢＲ－５ ＣＡＲ１９）の使用のいずれかを介して、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトを受けた。これらのデータは、本明細書に開示されたいくつかの実施形態によれば、免疫細胞の細胞傷害性のロバストな増大は、阻害経路の減少（例えば、遺伝子編集を介した免疫細胞上のＴＧＦＢＲ２のノックアウトによるＴＧＦｂの阻害効果の減少）と細胞傷害性シグナル伝達複合体の導入（例えば、ＣＡＲを発現するための細胞の操作を介した）の相乗的な組み合わせによって実現することができることをさらに証明する。図１４Ｂおよび１４Ｃは、それぞれ、図１４Ａからの対照データおよび選択されたデータを示す。図１４Ｂは、Ｎａｌｍ６細胞単独に対して試験された全てのコンストラクトの有意な細胞傷害効果を示す（例えば、腫瘍微小環境の免疫抑制効果を再現しない）。試験した各コンストラクトは、腫瘍細胞増殖を効果的に排除した。図１４Ｃにおいて、腫瘍微小環境を再現するために、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－ベータの存在下で腫瘍チャレンジ実験を行った。図１４Ｃは、ＴＧＦＢ２受容体をノックアウトするための遺伝子編集の効果をより明確に示すために、１４Ａから選択されたデータである。ＮＫ１９－１を発現するように操作された細胞（ＣＡＲの非限定的な例として）は、対照と比較して腫瘍増殖を減少させる能力を示した。しかしながら、ＮＫ１９－１を発現し、操作されたＮＫ細胞（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集およびガイドＲＮＡの非限定的な例の使用を介して）は、腫瘍細胞の増殖においてさらにより有意な減少を示した。したがって、いくつかの実施形態によれば、図１４Ａ（および１４Ｃ）に示されるような結果をもたらす、これらの遺伝子編集技術は、免疫抑制性腫瘍微小環境においてさえ、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増大させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、類似の技術をＴ細胞に使用することができる。さらに、いくつかの実施形態では、類似のアプローチがＮＫ細胞とＴ細胞の両方で使用される。さらに、さらなる実施形態では、遺伝子編集を用いて、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、または他のいずれの細胞であれ、編集された細胞に、腫瘍微小環境において見出される１つ以上の免疫抑制因子に対する耐性を生じさせる。
修飾された免疫細胞がそれらの増加した細胞傷害活性を発揮する潜在的メカニズムを評価するために、試験された細胞の各タイプのサイトカイン放出プロファイルを評価し、データを図１５Ａ～１５Ｄに示した。簡単に説明すると、各ＮＫ細胞群は、細胞傷害性アッセイ開始の一晩前に２０ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＧＦｂ １で処理された。ＮＫ細胞を洗浄して、Ｎａｌｍ６腫瘍細胞とともにＮＫ細胞を共培養する前に、ＴＧＦｂを除去した。ＮＫ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比（２×１０４エフェクター：２×１０４標的細胞）で核赤色蛍光タンパク質（Ｎａｌｍ６－ＮＲ）を発現するＮａｌｍ６腫瘍細胞と共培養した。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定された。図１５Ａに示されるように、遺伝子編集によってＴＧＦＢＲ２発現が減少した場合、ＩＦＮｇの放出が中程度に増加した（例えば、「ＴＧＦＢＲ２＋３ Ｎａｌｍ６ ＮＲ」のヒストグラムバーを参照されたい）。抗ＣＤ１９ ＣＡＲの導入は、ＩＦＮｇ産生（ＥＰ＋ＮＫ１９－１ Ｎａｌｍ６－ＮＲ）の実質的な増加を誘導した。しかしながら、最も顕著には、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現と組み合わせてＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９を介したＴＧＦＢＲ２発現のノックダウンを導くための、単一のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡの組み合わせのいずれかの使用を表す、図１５Ａに示される最後の４つのグループ（破線ボックスを参照されたい）である。これらの増加した量のＩＦＮｇの放出は、少なくとも部分的には、これらの二重に修飾された免疫細胞を用いて見られる増大した細胞傷害性に関与する。ＩＦＮｇと同様に、ＧＭ－ＣＳＦ放出はこれらの群において有意に増大した。ＧＭ－ＣＳＦは、骨髄細胞の分化を促進することができ、また、免疫刺激アジュバントとしても作用することができるため、放出の増加は、これらの細胞で見られる細胞傷害性の増加において役割を果たす可能性がある。同様のパターンは、グランザイムＢ（ＮＫ細胞によって放出される強力な細胞傷害性タンパク質）およびＴＮＦアルファ（別の強力なサイトカイン）の放出を評価する場合に見られる。これらのデータは、種々のサイトカインの放出の増加が、本明細書に開示されたいくつかの実施形態に従って、腫瘍微小環境に見られる免疫抑制効果に抵抗する遺伝子編集助剤として、遺伝子編集および遺伝子修飾された免疫細胞で見られる細胞傷害性の実質的な増加を引き起こすのに役割を果たすことをさらに証明する。
さらなる実施形態に従って、免疫細胞上の受容体、経路またはタンパク質の発現の破壊または排除は、標的がん細胞に対する免疫細胞の増大した活性（例えば、細胞傷害性、持続性など）をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、これは、免疫細胞の脱阻害から生じる。ナチュラルキラー細胞は、種々の受容体、特に受容体のナチュラルキラーグループ２ファミリー内の受容体を発現する。本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従う１つのこのような受容体であるＮＫＧ２Ｄ受容体を使用して、ＮＫ細胞によって発現され、このようなＮＫ細胞の増大した抗がん活性をもたらす細胞傷害性シグナル伝達コンストラクトを生成させる。さらに、ＮＫ細胞は阻害受容体であるＮＫＧ２Ａ受容体を発現する。腫瘍が免疫細胞に対して抵抗性を発現する１つの機序は、ペプチド負荷されたＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ｅ）の発現を介するものであり、ＨＬＡ－ＥとＮＫＧ２Ａ受容体とのライゲーションを介してＮＫ細胞の活性を抑制する。したがって、１つのアプローチは、ＨＬＡ－Ｅと、ＮＫ細胞上の発現されたＮＫＧ２Ａ受容体との相互作用を遮断することであるが、本明細書に開示されるいくつかの実施形態によれば、ＮＫＧ２Ａの発現は破壊され、これは阻害経路を破綻させ、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増大を可能にする。
図１６Ａ～１６Ｄは、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａ発現の発現破壊に関連するデータを示す。ＴＧＦＢＲ２に関して上記で検討したように、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９を用いて、下記の表２に示されるガイドＲＮＡの非限定的な例を用いて、ＮＫＧ２Ａ発現を破壊した。
Figure 2022535429000003
図１６Ａは、ＮＫ細胞による対照ＮＫＧ２Ａ発現を示し、ＮＫ細胞の約７０％がＮＫＧ２Ａを発現する。図１６Ｂは、ＮＫＧ２Ａ発現の有意な減少が達成され得ることを示し、ガイドＲＮＡ１の使用によりＮＫＧ２Ａ発現の５０％以上が減少する。図１６Ｃは、ガイドＲＮＡ２を用いたＮＫＧ２Ａ発現のより緩やかな減少を示し、このＮＫ細胞の３０％弱がＮＫＧ２Ａを発現する。図１６Ｄは、ガイドＲＮＡ３の使用が、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ａ発現の最もロバストな破壊を提供することを示し、ＮＫ細胞のわずか約１２％がＮＫＧ２Ａを発現する。
図１７Ａは、遺伝子編集装置を用いたエレクトロポレーションの７日後におけるＲｅｈ腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ａ発現の減少したＮＫ細胞に関連する細胞傷害性データの要約を示す。ＮＫ細胞を２：１のＥ：Ｔおよび１：１のＥ：Ｔ比の両方で試験した。１：１のＥ：Ｔでは、遺伝子編集されたＮＫ細胞型の各々は、模擬ＮＫ細胞よりも強い程度の細胞傷害性を誘導した。ガイドＲＮＡ１およびガイドＲＮＡ２で処理されたＮＫ細胞を用いて検出された改善された細胞傷害性は、模擬と比較してわずかに増大した。ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ発現の最大の破壊を誘導したガイドＲＮＡはまた、模擬に比べて細胞傷害性の最大の増加をもたらした（１：１のＮＫＧ２Ａ－ｇＲＮＡ３を参照されたい）。２：１の比で、修飾されたＮＫ細胞型の各々は、模擬ＮＫ細胞を有意に上回った。より低い比と同様に、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９を標的化するためにガイドＲＮＡ３を用いて編集されたＮＫ細胞は、細胞傷害性の最もロバストな増加を示し、ＮＫＧ２Ａ発現破壊の程度と逆の関係を示した。上記で検討したように、腫瘍細胞上のＨＬＡ－ＥとＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａとの相互作用は、介入なしに、ＮＫ細胞活性を阻害し得る。図１７Ｂは、Ｒｅｈ腫瘍細胞が実際にＨＬＡ－Ｅ分子を発現し、したがって、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ発現を破壊する遺伝子編集の非存在下では、ＮＫ細胞シグナル伝達を阻害することが予想されることを確認する（図１７Ａの模擬ＮＫ細胞群で見られるように）。
ＨＬＡ－Ｅ／ＮＫＧ２Ａ相互作用の破壊は、ＮＫ細胞の細胞傷害性に明確なプラスの影響を与えたが、免疫細胞シグナル伝達に影響を与える可能性のある他の経路を調査した。このような一例がＣＩＳ／ＣＩＳＨ経路である。サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）は、ＮＫ細胞におけるＩＬ－１５シグナル伝達の負の調節因子であり、ヒトにおいてはＣＩＳＨ遺伝子よってコードされる。ＩＬ－１５シグナル伝達は、ＮＫ細胞の拡大、生存、細胞傷害性およびサイトカイン産生にプラスの影響を及ぼすことができる。したがって、ＣＩＳＨの破壊は、ＮＫ細胞をＩＬ－１５に対して感受性をより高くし、それによってそれらの抗腫瘍効果を増加させることができた。
上記で検討したように、ＣＲＩＳＰｒ／ＣＡｓ９は、ＣＩＳＨの発現を破壊するために使用されたが、さらなる実施形態では、他の遺伝子編集アプローチを使用することができる。ＣＩＳＨ標的化ガイドＲＮＡの非限定的な例を下記の表３に示す。
Figure 2022535429000004
ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞と同様に、ＣＩＳＨノックアウト（ガイドＲＮＡ１またはガイドＲＮＡ２を用いて（ＣＩＳＨ－３－５についてデータは示さない））遺伝子編集されたＮＫ細胞に、遺伝子編集装置でエレクトロポレートした７日後に、１：１および２：１のＥ：Ｔ比でＲｅｈ腫瘍細胞を用いてチャレンジを行った。図１８は、模擬ＮＫ細胞は、１：１でＲｅｈ細胞に対して５０％を超える細胞傷害性を示したが、遺伝子編集されたＮＫ細胞群の各々は、ほぼ２０％の改善された細胞傷害性を示し、Ｒｅｈ細胞に対して平均約７０％の細胞傷害性を示した。増大した細胞傷害性は２：１の比でさらに顕著であった。模擬ＮＫ細胞はＲｅｈ細胞の約６５％を死滅させたが、ＣＩＳＨガイドＲＮＡ２で編集されたＮＫ細胞はＲｅｈ細胞の約８５％を死滅させ、ＣＩＳＨガイドＲＮＡ１で編集されたＮＫ細胞はＲｅｈ細胞の９０％超を死滅させた。これらのデータは、ＣＩＳＨノックアウトが、上記で検討されたような他のプラス効果の中でも、ＮＫ細胞の細胞傷害性にプラスの影響を及ぼすことを明確に示す。
上記される実験と同様に、次に、ＣＩＳＨ発現のノックダウンが、例えば、ＣＡＲ（ここでは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＡＲ１９－１）の非限定的な例を用いて形質導入することによって、ＮＫ細胞をさらに修飾する能力に悪影響を及ぼすかどうかを評価した。これらのデータを図１９Ａ～１９Ｄに示す。図１９Ａは、ＣＤ１９ ＣＡＲの発現（その欠如）についての陰性対照データを示す（使用されるＣＡＲ１９－１コンストラクトに含まれるＦｌａｇタグの検出に基づくが、いくつかの実施形態はＦｌａｇまたは他のタグを採用しない）。図１９Ｂは、ＣＩＳＨガイド１ ＲＮＡによって標的化された遺伝子編集にあらかじめ供されたＮＫ細胞によるＣＤ１９－１ ＣＡＲのロバストな発現を示す。図１９Ｃは、ＣＩＳＨガイド２ ＲＮＡによる遺伝子編集標的化を以前に受けたＮＫ細胞についての同様のデータを示す。図１９Ｄは、遺伝子編集エレクトロポレーションプロトコルに曝露されたが、実際の遺伝子編集を伴わないＮＫ細胞のさらなる対照データを示し、したがって、遺伝子編集プロトコル自体が、ＣＡＲをコードするウイルスコンストラクトを用いたＮＫ細胞のその後の形質導入に悪影響を及ぼさないことを示す。図２０Ｃは、ＣＩＳＨ遺伝子編集が行われた後、ＣＩＳタンパク質（ＣＩＳＨよってコードされる）の発現がないことを確認するウエスタンブロットを示す。したがって、一部の実施形態によれば、ＮＫ細胞（またはＴ細胞）はともに、ＩＬ１５媒介シグナル伝達を介して１つ以上のＮＫ細胞（Ｔ細胞）特徴を増大させるために、例えば、ＣＩＳＨ発現をノックアウトするように編集され、また、抗腫瘍ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、操作および編集は、ＮＫ細胞機能（例えば、拡大、細胞傷害性、および／または持続性）に対して相乗的な増大をもたらす。
ＮＫ細胞は、ＣＩＳＨ発現を減少させるために遺伝子編集され得、また、その後、ＣＡＲを発現するように操作することができることを確立したため、このような二重に修飾されたＮＫ細胞の細胞傷害性を試験した。図２０Ａは、指示されたＮＫ細胞型に１：２の比率でＮａｌｍ６細胞を用いてチャレンジを行った、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイの結果を示す。実験タイムラインに関して、０日目に、ＮＫ細胞を、上記で検討したように、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９および種々のＣＩＳＨガイドＲＮＡを用いてエレクトロポレーションに供した。ＮＫ細胞を高ＩＬ－２培地中で１日間培養し、次に低ＩＬ－２培地に移動させ、それらを拡大のために４－１ＢＢおよび膜結合ＩＬ１５を発現するように修飾されたＫ５６２細胞とともに共培養した。７日目に、ＮＫ細胞に、ＣＡＲ１９－１ウイルスコンストラクトを用いて形質導入し、さらに７日間培養し、１４日目にＩｎｃｕＣｙｔｅ細胞傷害性アッセイを行った。
図２０Ａに見られるように、エレクトロポレートされたＮＫ細胞とエレクトロポレートされていないＮＫ細胞（それぞれ、ＥＰ ＮＫ、ＵＥＰ ＮＫ）はいずれも、Ｎａｌｍ６増殖の見掛けの減少を示した。遺伝子編集されたＮＫ細胞を評価する場合、ＣＩＳＨ－１およびＣＩＳＨ－２ ＮＫ細胞はいずれもＮａｌｍ６増殖の有意な妨げを示した。同様に、エレクトロポレートされたＮＫ細胞とエレクトロポレートされていないＮＫ細胞の両方が、ＣＡＲ１９－１を発現し、Ｎａｌｍ６増殖をさらに減少させた。最も顕著には、ＣＡＲ１９－１を発現する二重に修飾されたＣＩＳＨノックアウトは、Ｎａｌｍ６細胞増殖の完全な制御／防御を示した。これらの結果は、実施された２つの修飾アプローチ間の相乗的活性を表し、ＣＡＲ１９－１を発現する遺伝子編集されたＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞は、本明細書に開示される実施形態に従って、ロバストな抗腫瘍活性を示す。
これらの腫瘍制御効果は、二重チャレンジモデルでも再現された。この場合、実験タイムラインは、図２０Ａについて上記される通りであったが、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイ（ここでは１：１のＥ：Ｔで実施）の開始から７日後に、ウェルを洗浄し、追加用量のＮａｌｍ６腫瘍細胞（ウェルあたり２０Ｋ細胞）で再チャレンジを行った。データを図２０Ｂに示す。単一の腫瘍細胞チャレンジと同様に、Ｎａｌｍ６細胞は実験期間を通して拡大を示し、ＥＰおよびＵＥＰ ＮＫ細胞は、２回目のチャレンジ後に類似した全体的なＮａｌｍ６増殖を可能にした。Ｎａｌｍ６腫瘍細胞の２回目のチャレンジでさえ、ＮＫ細胞発現ＣＡＲ１９－１コンストラクト（ＥＰＣＡＲ１９およびＵＥＰＣＡＲ１９）は、ＮＫ細胞単独よりも多くＮａｌｍ６増殖を抑制した。興味深いことに、２回目のチャレンジでは、ノックアウトＣＩＳＨ発現のために遺伝子編集されたＮＫ細胞は、ＣＡＲ１９－１を発現する細胞と比較して、Ｎａｌｍ６増殖を抑制する能力が中程度に高いことを示した。上記で検討したように、これはＣＩＳＨノックアウトにより上方制御される種々の代謝経路を介したシグナル伝達の増大によるものであり得る。注目すべきことに、１回のチャレンジと同様に、ＣＩＳＨ発現をノックアウトするように遺伝子編集され、ＣＡＲ１９－１を発現するように操作された二重に修飾されたＮＫ細胞は、Ｎａｌｍ６細胞増殖を抑制する実質的な能力を示した。ＣＩＳＨガイドＲＮＡ１およびＣＩＳＨガイドＲＮＡ２処理されたＮＫ細胞は、実験の最終段階まで互いに同等であり、ＣＩＳＨガイドＲＮＡ２処理されたＮＫ細胞は、Ｎａｌｍ６細胞数のわずかな増加を可能にした。それにもかかわらず、これらのデータは、二重に修飾されたＮＫ細胞が腫瘍細胞に対して増大した細胞傷害性を有することを示す。上述したように、いくつかの実施形態における操作されたアプローチと組み合わせた編集は、ＮＫ細胞機能に対する非複製的増大を有利にもたらし、ＮＫ細胞の１つ以上の側面（活性化、細胞傷害性、持続性など）を相乗的に増大させることができる。
機構的には、理論に拘束されることなく、ＣＩＳＨのノックダウンの二重の修飾およびＣＡＲ１９－１の発現は、ＮＫ細胞がより長い期間生存することを可能にし、したがって、腫瘍細胞に対する持続性が増大するようである。いくつかの実施形態では、これは、少なくとも部分的には、ＣＩＳＨのノックアウトに基づいて、編集された細胞における種々の代謝経路を介するシグナル伝達の増大に起因する。この分析のためのデータは、図２１Ａに示され、細胞数は、培養において７４日間にわたって示された群について得られた。試験した８群のうち６群は、培養において約２～３週間から７４日の時点まで、ＮＫ細胞数の着実な減少を示した。しかしながら、ＣＩＳＨ発現をノックダウンし、ＣＡＲ１９－１を発現するために処理されたＮＫ細胞の２つの群は、比較的安定した集団サイズを示した（ただし、２４日目に一過性の増加のため）。これらのデータは、二重に修飾されたＮＫ細胞は、１つの様式でのみ修飾された（または修飾されていない）ＮＫ細胞よりも良好に生存することができ、部分的に、図２０Ｂに示される二次腫瘍細胞チャレンジのような、より長期の実験にわたってそれらの増大した効力をもたらす可能性があることを示唆する。さらに、図２１Ｂは、対照Ｎａｌｍ６細胞、非修飾ＮＫ細胞、ＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞、およびＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞についての細胞傷害性データを示す。この実験は、各細胞群を培養において１００日間培養した後に行われた。Ｎａｌｍ６細胞のみが予想通り拡大を示した。対照ノックアウトＮＫ細胞（エレクトロポレーションのみを受けた）は、初期段階でＮａｌｍ６の拡大を遅延したが、最終的にＮａｌｍ６細胞は拡大した。ＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞は良好な抗腫瘍効果を示し、実験の後期段階ではＮａｌｍ６数のわずかな増加しか示さなかった。この培養後期におけるＮＫ細胞の細胞傷害性は、対照ＮＫ細胞によって許容される増殖を考慮すると予想外である。上記で検討したように、いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨ発現のノックアウトは、ＮＫ（またはＴ）細胞増殖、細胞傷害性、および／または持続性の増大のうちの１つ以上をもたらす種々のＩＬ１５応答性経路を介したより大きなシグナル伝達を可能にする。
これらの二重に修飾された細胞が、有意であり持続的な細胞傷害性を生じるメカニズムをさらに研究して、各群のサイトカイン放出プロファイルを評価した。これらのデータは、図２２Ａ～２２Ｅに示され、ＣＡＲ１９－１を発現するように操作されたＮＫ細胞のそれらの群は、各ヒストグラムの右側部分上の「ＣＡＲ１９」ラインの上に配置されることによって示される。
図２２Ａは、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ１または２（ガイドＲＮＡの非限定的実施形態として）のいずれかの使用を介してＣＩＳＨをノックアウトした場合、特に増加するＩＦＮｇ産生に関連するデータを示す。さらに興味深いことに、ＣＩＳＨノックアウトとＣＡＲ１９－１発現の組み合わせは、ＣＩＳＨノックアウトよりもＩＦＮｇ産生がほぼ２．５倍多く、他のいずれの群よりも４～５倍多くなる。ＴＮＦアルファ産生に関して、同様のデータを図２２Ｂに示す。同様に、ＣＩＳＨノックアウト単独、およびＣＡＲ１９－１を発現するＣＩＳＨ正常ＮＫは、ＧＭ－ＣＳＦをいくぶん放出するが、二重に修飾されたＣＩＳＨノックアウトおよびＣＡＲ１９－１を発現するＮＫ細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ放出の顕著な増加を示す。グランザイムＢ放出プロファイルは、図２２Ｄに示されるように、二重に修飾された細胞が最も多くのサイトカインを放出することを再び示している。興味深いことに、グランザイムＢの発現レベルは、ＣＩＳＨ １およびＣＩＳＨ ２ ＮＫ細胞群の細胞傷害性プロファイルと相関する。ＣＩＳＨ ２ ＮＫ群とＣＩＳＨ ２／ＣＡＲ１９群はともに、それらのＣＩＳＨ １対応物よりもグランザイムＢの放出が少なく、図２０Ｂの長期細胞傷害性データに反映されており、ＣＩＳＨの発現減少がグランザイムＢの放出と逆相関している可能性があることを示唆する。最後に、図２２Ｅは、パーフォリンの放出を示し、全てのＮＫ細胞群について有意に高く、図２２Ａ～２２Ｄに見られるのと同じパターンを反映しておらず、パーフォリンは、これらの実施形態では、細胞傷害性を制限するサイトカインではないことを示唆する。しかしながら、これらのデータは、免疫細胞が、遺伝子編集（例えば、免疫細胞により発現される抑制因子の発現を減少させるため、または阻害因子に応答する免疫細胞の能力を減少させるため）と、キメラ細胞傷害性シグナル伝達複合体（例えば、ＣＡＲを誘導する細胞傷害性など）を発現させるための細胞の操作の組み合わせに供されることを確認する。いくつかの実施形態では、二重に修飾された細胞は、本明細書に開示されるいくつかの態様に従って、よりロバストな（例えば、細胞傷害性誘導性の）サイトカインプロファイルを示し、および／または増加した生存性／持続性を示し、より大きな全体的な抗腫瘍効果を可能にする。いくつかの実施形態では、したがって、免疫細胞の二重修飾は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせを使用するか否かにかかわらず、全体的により有効ながん免疫療法レジームをもたらす。さらに、上記で検討したように、いくつかの実施形態では、二重に修飾された細胞はまた、それらの同種反応性を減少させるために修飾され、それによって、より効果的な同種細胞療法レジメンを可能にする。
ＣＢＬＢは、Ｔ細胞活性化を制限することが公知であるＥ３ユビキチンリガーゼである。ＮＫ細胞によるＣＢＬＢの発現の破壊が、操作されたＮＫ細胞からよりロバストな抗腫瘍応答を誘導し得るかどうかを決定するために、上記で検討したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、ＣＢＬＢの発現を破壊したが、さらなる実施形態では、他の遺伝子編集アプローチを用いることができる。
ＣＢＬＢ標的化ガイドＲＮＡの非限定的な例を以下の表４に示す。
Figure 2022535429000005
ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞と同様に、ＣｂｌプロトオンコジーンＢ（ＣＢＬＢ）ノックアウト（表４に示されるガイドＲＮＡ５［配列番号１６４、１６５、１６６］を使用する）、およびＣＩＳＨノックアウト（ＣＩＳＨガイドＲＮＡ５［配列番号１５７］を使用する）遺伝子編集されたＮＫ細胞に、遺伝子編集装置でエレクトロポレートした５日後に１：１および２：１のＥ：Ｔ比でＲｅｈ腫瘍細胞でチャレンジを行った。簡単に説明すると、親ＮＫ細胞を、フィーダー細胞とともに低ＩＬ－２培地中に７日間維持し、７日目にエレクトロポレートし、７～１０日目に高ＩＬ－２培地中でインキュベートし、１０～１２日目に低ＩＬ－２培地中でインキュベートし、次に１２日目にＲｅｈ腫瘍チャレンジアッセイに供した（図２３Ｃ）。図２３Ａは、模擬ＮＫ細胞が１：１の比率でＲｅｈ細胞に対して約４５％の細胞傷害性を示したが、ＣＢＬＢ ｇＲＮＡノックアウトＮＫ細胞群の各々は、約２０％高い細胞傷害性を示し、Ｒｅｈ細胞に対する細胞傷害性が平均約７０％であることを示す。２：１の比では、対応する増大した細胞傷害性は１：１比の群と類似し、模擬ＮＫ細胞は約６０％の細胞傷害性を示し、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞群の各々は、約２０％高い細胞傷害性を示し、Ｒｅｈ細胞に対する細胞傷害性が平均８０％である。ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ５ノックアウトＮＫ細胞群はまた、同様の結果を示し、１：１比で約６５％、２：１比で約８０％であり、上記で検討されたｇＲＮＡ１および２を用いた以前のＣＩＳＨノックアウト実験と一致した。全体として、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞における細胞傷害性の増加は、ＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞と比例する。これらのデータは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態によるＣＢＬＢノックアウトが、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対してプラスの影響を有することを示す。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨノックアウトとＣＢＬＢノックアウトの組み合わせは、操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性をさらに増大させるために使用される。いくつかの実施形態では、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、サイトカイン刺激に対してより高い応答性を示し、その一部は、それらの増大した細胞傷害性をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＢＬＢノックアウトは、ＩＦＮ－ｇおよびＴＮＦ－ａのようなエフェクターサイトカインの分泌の増加および活性化マーカーＣＤ６９の上方制御をもたらす増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＢＬＢのノックアウトは、ＣＡＲを発現するようにＮＫ細胞を操作することとともに使用され、ＮＫ細胞の細胞傷害性および／または持続性のさらなる増大をもたらす。
別のＥ３ユビキチンリガーゼであるトリパータイトモチーフ含有タンパク質２９（ＴＲＩＭ２９）は、ＮＫ細胞機能の負の調節因子である。ＴＲＩＭ２９は、一般的に、休止ＮＫ細胞によって発現されないが、活性化後（特に、ＩＬ－１２／ＩＬ－１８刺激によって）容易に上方制御される。上記で検討したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９はまた、ＴＲＩＭ２９の発現を破壊するために使用されたが、さらなる実施形態では、他の遺伝子編集アプローチを使用することができる。ＴＲＩＭ２９標的化ガイドＲＮＡの非限定的な例を以下の表５に示す。
Figure 2022535429000006
ＴＲＩＭ２９ノックアウト（表５に示されるｇＲＮＡ［配列番号１６７、１６７、１６９］を用いる）遺伝子編集されたＮＫ細胞に、遺伝子編集装置でエレクトロポレートした５日後に、１：１および２：１のＥ：Ｔ比でＲｅｈ腫瘍細胞でチャレンジを行った。タイムラインおよび培養パラメータは、ＣＢＬＢノックアウトの実施例と同じであった（図２３Ｃ）。図２３Ｂは、ＴＲＩＭ２９ノックアウトが、ＣＩＳＨノックアウトまたはＣＢＬＢノックアウトと比較して、細胞傷害性の増大に対して幾分ロバストさが劣る影響を有することを示す。ＴＲＩＭ２９ ｇＲＮＡ ＮＫ細胞群は各々、模擬細胞よりもＲｅｈ細胞に対する細胞傷害性がわずかに良好であった（１：１比で約５０％対約４５％の細胞傷害性、および２：１比で約７０％対約６０％の細胞傷害性）。比較的に、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ５を用いてトランスフェクトされたＮＫ細胞は、１：１と２：１の両方の比率で、模擬とＴＲＩＭ２９ノックアウトＮＫ細胞の両方と比較して、細胞傷害性を改善した。これらの結果は、ＴＲＩＭ２９のみが、これらの条件下でＮＫ細胞の細胞傷害性において僅かな効果を有するかまたは効果がないことを示すが、これは、少なくとも部分的には標的細胞型に起因している可能性がある（例えば、ＴＲＩＭ２９発現の変化に応答して変化した経路は、例えば、ＣＢＬＢ発現の変化によって変更された経路ほど活性ではない）。さらに、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞をＣＡＲコンストラクト、例えば、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲで操作し、ＴＲＩＭ２９発現をノックアウトする組み合わせは、ＮＫ細胞の細胞傷害性および／または持続性を有意に増大させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＩＭ２９発現のノックアウトは、ＮＫ細胞によるインターフェロン放出を上方制御する。
インターロイキン、特にインターロイキン－１５は、ＮＫ細胞の機能および生存において重要である。サイトカインシグナル伝達タンパク質の抑制因子（ＳＯＣＳ）は、ＮＫ細胞によるサイトカイン放出の負の調節因子である。プロテインチロシンホスファターゼＣＤ４５は、Ｓｒｃファミリーキナーゼ活性を介するＮＫ細胞活性の重要な調節因子である。ＣＤ４５発現は、ＩＴＡＭ特異的ＮＫ細胞機能、ならびに脱顆粒、サイトカイン産生、および拡大などのプロセスに関与する。したがって、ＣＤ４５発現のノックアウトは、効果がより小さいＮＫ細胞をもたらすはずである。上記で検討したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、ＣＤ４５およびＳＯＣＳ２の発現を破壊するために使用されたが、さらなる実施形態では、他の遺伝子編集アプローチを使用することができる。ＣＤ４５およびＳＯＣＳ２標的化ガイドＲＮＡの非限定的な例を下記の表６に示す。
Figure 2022535429000007
サイトカインシグナル伝達２の抑制因子（ＳＯＣＳ２）のノックアウト（表６に示されるｇＲＮＡ［配列番号１７１、１７２、１７３］を用いる）遺伝子編集されたＮＫ細胞を、遺伝子編集装置でエレクトロポレートした７日後に、時間経過の細胞傷害性アッセイにおいて評価した。簡単に説明すると、親ＮＫ細胞を、フィーダー細胞とともに低ＩＬ－２培地中に７日間維持し、７日目にエレクトロポレートし、７～１１日目に高ＩＬ－２培地中でインキュベートし、１１～１４日目に低ＩＬ－２培地中でインキュベートし、次に１４日目に１：１のＥ：Ｔ比でＲｅｈ細胞に対するＩｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイに供した（図２４Ｃ）。図２３Ａは、第１のエレクトロポレーションシステムでエレクトロポレートされたＮＫ細胞を用いた細胞傷害性アッセイの結果を示す。このシステムを用いて、ＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡの各々でトランスフェクトされたＮＫ細胞は、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ２ ＮＫ細胞群（上記に記載される）と同様の細胞傷害性活性を示した。ＳＯＣＳ２の３つのｇＲＮＡ曲線を図２４Ａに重ね合わせる。ＣＤ４５ノックアウトＮＫ細胞を陰性対照として用いた（上記で検討したように、ＣＤ４５はＮＫ細胞活性の正の調節因子であるため、ＣＤ４５ノックアウトは細胞傷害性の減少を示す必要がある）。図２３Ｂは、同じスケジュールに従うが、第２のエレクトロポレーションシステムでエレクトロポレートされたＮＫ細胞を用いた細胞傷害性アッセイの結果を示す。この場合、検討したＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡのうち、ＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡ１はＲｅｈ細胞に対する細胞傷害性の改善をもたらした。ＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡ２および３は、第１のエレクトロポレーションシステムよりも効果が少ないＮＫ細胞を生じさせた。ＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡ１ノックアウトＮＫ細胞は、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ２ノックアウトＮＫ細胞と比較して、細胞傷害性においてわずかな増大を示した。これらの結果は、いくつかの実施態様によれば、ＳＯＣＳ２のノックアウトは、ＮＫ細胞の負の調節を減少させ、細胞傷害性が増大したＮＫ細胞を生じさせることを示す。いくつかの実施形態では、特異的ｇＲＮＡは、細胞傷害性ＮＫ細胞、例えば、ＳＯＣＳ２ ｇＲＮＡ１を増大させるために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ２のノックアウトは、ＣＡＲを発現するようにＮＫ細胞を操作するとともに使用され、ＮＫ細胞の細胞傷害性および／または持続性のさらなる増大をもたらす。
上記に開示された実施形態の特定の特徴および態様の種々の組み合わせまたはサブ組み合わせを作製することができ、さらに、１つ以上の発明の範囲内に入ることができると企図される。さらに、実施形態に関連する任意の特定の特徴、態様、方法、性質、特性、品質、属性、要素などの本明細書における開示は、本明細書に記載する他の全ての実施形態において使用することができる。したがって、開示された実施形態の種々の特徴および態様は、開示された発明の種々のモードを形成するために、互いに組み合わせることができるかまたは互いに置き換えることができることを理解するべきである。したがって、本明細書に開示される本発明の範囲は、上記された特定の開示された実施形態によって制限されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は種々の修飾、および代替形態に感受性が高いが、その具体例を図面に示し、本明細書において詳細に説明する。しかしながら、本発明は、開示された特定の形態または方法に限定されるものではなく、逆に、本発明は、記載された種々の実施形態および添付の請求の範囲の精神および範囲内に入る全ての修飾、均等物および代替物をカバーするものであることが理解されるべきである。本明細書に開示される任意の方法は、示される順序で行われる必要はない。本明細書に開示される方法は、実施者によって取られる特定の行為を含むが、しかしながら、それらは、明示的にまたは黙示的に、それらの行為の第三者の指示を含むこともできる。さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本開示がまたそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識する。
本明細書に開示される範囲はまた、任意のおよび全ての重複、サブ範囲、およびそれらの組み合わせを包含する。「最大（ｕｐ ｔｏ）」、「少なくとも」、「より大きい」、「より少ない」、「間」などの用語は、示された数字を含む。「約」または「ほぼ」などの用語の前にある数字は、示された数字を含む。例えば、「約９０％」は、「９０％」を含む。一部の実施形態では、少なくとも９５％の配列同一性または相同性は、参照配列に対する９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％の配列同一性または相同性を含む。さらに、配列がヌクレオチドまたはアミノ酸配列を「含む」として開示される場合、このような参照文献はまた、他に指示がない限り、配列が、示された配列「を含む」、「からなる」、または「から本質的になる」ことを含むものとする。本明細書で使用される任意のタイトルまたは小見出しは、組織目的であり、本明細書に開示される実施形態の範囲を制限するために使用されるべきではない。
配列
いくつかの実施形態では、核酸コードの縮重を主要因としながら、本明細書に開示される核酸のいずれかに対応するアミノ酸配列（および／または添付の配列表に含まれる）が提供される。さらに、本明細書に明示的に開示される配列（および／または添付の配列リストに含まれる）とは異なるが、機能的類似性または同等性を有する配列（核酸またはアミノ酸のいずれか）もまた本開示の範囲内で企図される。上記には、突然変異体、切断、置換、または他のタイプの修飾が含まれる。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態に従って、配列のいずれかを使用することができるか、または本明細書に開示される配列（および／または添付の配列表に含まれる）のいずれかの切断または突然変異形態を使用することができ、任意の組み合わせで使用することができる。

Claims (67)

  1. 複数のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、がん免疫療法のための遺伝子操作されたＮＫ細胞集団であって、
    複数のＮＫ細胞は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体を発現するように操作され、
    細胞傷害性シグナル伝達複合体は、ＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含み、
    ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５を発現するように操作され、
    ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質を発現するように遺伝子編集され、
    減少したＣＩＳ発現はＣＩＳＨ遺伝子の編集を介して操作され、ならびに
    遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然レベルのＣＩＳを発現するＮＫ細胞と比較して、増大した拡大能力、標的細胞に対する増大した細胞傷害性、および増大した持続性のうちの１つ以上を示す、前記遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  2. 細胞外リガンド結合ドメインが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される腫瘍マーカーに対する指向性を有する受容体を含む、請求項１に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  3. ＮＫ細胞により発現される細胞傷害性受容体が、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む、請求項１に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  4. 細胞傷害性受容体が、配列番号１４５と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  5. 細胞傷害性受容体が、配列番号１７４と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  6. ＮＫ細胞により発現される細胞傷害性受容体が、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインとＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  7. 抗ＣＤ１９抗体が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよびｓｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインが配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、コードされたＶＬドメインが配列番号１１８のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  8. Ｔ細胞により発現されるＣＡＲが、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  9. ＣＩＳの発現が、操作されていないＮＫ細胞と比較して実質的に減少している、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  10. ＮＫ細胞が検出可能なレベルのＣＩＳタンパク質を発現しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  11. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルの形質転換増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦＢＲ）を発現するようにさらに遺伝子操作されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  12. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルのベータ－２ミクロゴルブリン（Ｂ２Ｍ）を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  13. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルのＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター）を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  14. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、減少したレベルのナチュラルキラーグループ２、メンバーＡ（ＮＫＧ２Ａ）受容体を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  15. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＣＢＬＢ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのＣｂｌプロトオンコジーンＢタンパク質を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  16. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＴＲＩＭ２９遺伝子によってコードされる、減少したレベルの三要素モチーフ含有タンパク質２９タンパク質を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  17. ＮＫ細胞が、操作されていないＮＫ細胞と比較して、ＳＯＣＳ２遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカインシグナル伝達２タンパク質の抑制因子を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  18. ＮＫ細胞が、ＣＤ４７を発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  19. ＮＫ細胞が、ＨＬＡ－Ｅを発現するようにさらに遺伝子操作されている、請求項１～８に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  20. ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊するようにさらに遺伝子編集されている、請求項１～８に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  21. 少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）、ＮＫＧ２Ａ受容体、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３、ＫＩＲ２ＤＳ－１および／またはＫＩＲ２ＤＡ－２、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項２０に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
  22. 遺伝子操作されたＴ細胞集団をさらに含み、
    Ｔ細胞集団は、実質的に非同種反応性であり、
    非同種反応性Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の少なくとも１つの遺伝子編集されたサブユニットを含み、それにより、非同種反応性Ｔ細胞は、レシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さず、
    Ｔ細胞集団は、腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され、
    腫瘍マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  23. Ｔ細胞により発現されるＣＡＲがＣＤ１９に対する指向性を有する、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  24. Ｔ細胞により発現されるＣＡＲが、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  25. 修飾されたＴ細胞のＴＣＲサブユニットがＴＣＲαである、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  26. Ｔ細胞のＴＣＲへの修飾により、Ｔ細胞集団の少なくとも９０％が検出可能なレベルのＴＣＲを発現しなくなる、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  27. Ｔ細胞が、操作されていないＴ細胞と比較して、ＣＩＳ、ＴＧＦＢＲ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の発現を減少させるように、またはＣＤ４７もしくはＨＬＡ－Ｅを発現するようにさらに遺伝子編集されている、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  28. Ｔ細胞が、操作されていないＴ細胞と比較して、ＴＲＩＭ２９およびＳＯＣＳ２のうちの１つ以上の発現を減少させるようにさらに遺伝子編集されている、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  29. Ｔ細胞が、Ｔ細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊するようにさらに遺伝子編集され、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、およびリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）から選択される、請求項２２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  30. 発現を減少させるための遺伝子編集または発現を誘導するための遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  31. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む、請求項３０に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  32. ＣａｓがＣａｓ９である、請求項３１に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  33. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む、請求項３２に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  34. 発現を減少させるための遺伝子編集または発現を誘導するための遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  35. 発現を減少させるための遺伝子編集または発現を誘導するための遺伝子編集が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  36. ＯＸ４０サブドメインが、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項１～３５のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  37. ＣＤ３ゼータサブドメインが、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  38. ｍｂＩＬ１５が、配列番号１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項１～３７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団。
  39. 請求項１～３８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団を対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
  40. がんの処置における、請求項１～３９のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞集団の使用。
  41. がんの処置のための薬剤の製造における、請求項１～４０のいずれか一項に記載の免疫細胞の混合集団の使用。
  42. 対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、
    （ｉ）複数のＮＫ細胞であって、
    複数のＮＫ細胞は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体を発現するように操作され、
    細胞傷害性シグナル伝達複合体は、ＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含み、
    ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５を発現するように操作され、
    ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、細胞による、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質を発現するように遺伝子編集され、
    減少したＣＩＳ発現はＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子編集を介して操作され、ならびに
    遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然レベルのＣＩＳを発現するＮＫ細胞と比較して、増大した拡大能力、標的細胞に対する増大した細胞傷害性、および増大した持続性のうちの１つ以上を示す、複数のＮＫ細胞と；適宜、
    （ｉｉ）複数のＴ細胞であって、
    複数のＴ細胞は実質的に非同種反応性であり、
    非同種反応性Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾を含み、それにより、非同種反応性Ｔ細胞は、レシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さず；
    Ｔ細胞集団は、腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され、
    腫瘍マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、複数のＴ細胞と
    を含む、遺伝子操作された免疫細胞集団を投与することを含む方法。
  43. ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体が、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインおよびＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 細胞傷害性受容体が、配列番号１４５と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 細胞傷害性受容体が、配列番号１７４と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体が、ＣＤ１９に対する指向性を有する、請求項４２に記載の方法。
  47. ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体が、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４６に記載の方法。
  48. Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲが、ＣＤ１９に対する指向性を有する、請求項４２に記載の方法。
  49. Ｔ細胞により発現されるＣＡＲが、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体断片を含む腫瘍結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに（ｉｉｉ）ＯＸ４０共刺激サブドメインおよびＣＤ３ｚ共刺激サブドメインを含むシグナル伝達複合体、ならびに（ｉｖ）膜結合ＩＬ１５を含む、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 抗ＣＤ１９抗体が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、およびｓｃＦｖの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. ＶＨドメインが配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインが配列番号１１８のアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. ＮＫ細胞および／またはＴ細胞が、操作されていないＴ細胞と比較して、ＣＩＳ、ＴＧＦＢＲ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の発現を減少させるように、またはＣＤ４７もしくはＨＬＡ－Ｅを発現するように、さらに遺伝子編集されている、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. ＮＫ細胞および／またはＴ細胞が、操作されていないＮＫ細胞またはＴ細胞と比較して、ＴＲＩＭ２９およびＳＯＣＳ２のうちの１つ以上の発現を減少させるようにさらに遺伝子編集されている、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の方法。
  54. ＮＫ細胞および／またはＴ細胞が、細胞による少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現を破壊するようにさらに遺伝子編集され、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、およびリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）、ＮＫＧ２Ａ受容体、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３、ＫＩＲ２ＤＳ－１および／またはＫＩＲ２ＤＡ－２から選択される、請求項４２～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. ＯＸ４０サブドメインが、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. ＣＤ３ゼータサブドメインが、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項４２～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. ｍｂＩＬ１５が、配列番号１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 発現を減少させる遺伝子編集または発現を誘導する遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて行われる、請求項４２～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. ＣａｓがＣａｓ９である、請求項５９に記載の方法。
  61. ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、およびそれらの組み合わせから選択されるＣａｓを含む、請求項５８に記載の方法。
  62. 発現を減少させる遺伝子編集または発現を誘導する遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行われる、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の方法。
  63. 発現を減少させる遺伝子編集または発現を誘導する遺伝子編集が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて行われる、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の方法。
  64. がん免疫療法のための遺伝子操作された免疫細胞の混合集団であって、
    （ｉ）複数のＮＫ細胞であって、
    複数のＮＫ細胞は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体を発現するように操作され、
    細胞傷害性シグナル伝達複合体は、ＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含み、
    ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５を発現するように操作され、
    ＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して、細胞による、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる、減少したレベルのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有（ＣＩＳ）タンパク質を発現するように遺伝子編集され、
    減少したＣＩＳ発現はＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子編集を介して操作され、ならびに
    遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然レベルのＣＩＳを発現するＮＫ細胞と比較して、増大した拡大能力、標的細胞に対する増大した細胞傷害性、および増大した持続性のうちの１つ以上を示す、複数のＮＫ細胞と；
    （ｉｉ）複数のＴ細胞であって、
    複数のＴ細胞は実質的に非同種反応性であり、
    非同種反応性Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットへの少なくとも１つの修飾を含み、それにより、非同種反応性Ｔ細胞は、レシピエント対象の細胞に対して同種反応性作用を示さず；
    Ｔ細胞集団は、腫瘍マーカーに対する指向性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され、
    腫瘍マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、Ｈｅｒ２、メソテリン、クラウジン６、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、複数のＴ細胞と
    を含む、遺伝子操作された免疫細胞の混合集団。
  65. ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体が、配列番号１７４と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６４に記載の免疫細胞の混合集団。
  66. ＮＫ細胞によって発現される細胞傷害性受容体が、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６４に記載の免疫細胞の混合集団。
  67. Ｔ細胞によるＣＡＲが、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６４に記載の免疫細胞の混合集団。
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