KR20230109651A - Nkg2a를 표적으로 하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 NKG2A를 표적으로 하는 항체, 및 이를 포함하는 다중특이성 항체, 키메라 수용체, 항체 접합체, 약학 조성물 및 키트, 및 NKG2A 발현 관련 질병의 진단/치료/예방에서 이의 용도를 제공한다.

Description

NKG2A를 표적으로 하는 항체 및 이의 용도
본 발명은 면역치료 분야에 속한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 NKG2A를 표적으로 하는 항체, 및 질병 예방 및/또는 치료 및/또는 진단에서 이의 용도에 관한 것이다.
자연 살해(NK) 세포는 체내에서 매우 중요한 유형의 림프구로, 선천면역과 후천면역에서 모두 중요한 역할을 한다. NK 세포의 표면에는 두 가지 유형의 표면 수용체가 있으며, 기능에 따라 억제형과 활성화형으로 나눌 수 있다. 이는 각각 NK 세포의 상이한 인식 모드를 매개하며, 상이한 활성화 신호와 억제 신호를 전달한다. CD94/NKG2 계열은 비교적 많이 연구된 수용체 계열의 유형이며, 주로 NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, NKG2H 등 구성원을 포함한다. 그 중 NKG2A는 억제성 수용체이며, 이의 리간드는 비고전적 주조직 적합성 복합체 클래스 I 분자 HLA-E이다. 표적 세포에 발현되는 HLA-E 분자는 NKG2A와 결합한 후, NK 세포의 살상 기능을 억제할 수 있다. 따라서 CD94/NKG2A를 표적으로 하는 항체는 종양 세포에서 종양 특이적 림프구의 살상 활성을 향상시킬 수 있다.
다양한 항-NKG2A 항체가 당업계에 공개되어 있다. 예를 들어, Sivori 등(Eur JImmunol 1996; 26:2487-92)은 마우스 항-NKG2A 항체 Z270을 언급하였고, Carretero 등(EurJ Immunol 1997; 27:563-7)은 마우스 항-NKG2A 항체 Z199(현재 시판 중인 Beckman Coulter, Inc., Cat. No. IM2750, USA)를 설명하였고, Vance 등(J Exp Med 1999; 190:1801-12)은 래트 항-마우스 NKG2-항체 20D5(현재 시판 중인 BD Biosciences Pharmingen, Cat. No. 550518, USA)를 언급하였고, 미국 특허출원공개 20030095965는 NKG2A, NKG2C 및 NKG2E에 결합하는 것으로 알려진 마우스 항체 3S9를 설명하였다.
본 발명의 목적은 NKG2A를 표적으로 하는 새로운 항체, 및 질병 예방 및/또는 치료 및/또는 진단에서 이의 용도를 제공하는 데에 있다.
제1 양상에 있어서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 NKG2A를 표적으로 하는 항체를 제공한다. 여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 여기에서 상기 경쇄 가변 영역의 21번째 아미노산은 M이고, 85번째 아미노산은 T이고, 상기 중쇄 가변 영역의 34번째 아미노산은 M이고, 49번째 아미노산은 A이고, 61번째 아미노산은 P이고, 97번째 아미노산은 T이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역의 22번째 아미노산은 S 또는 T이고, 58번째 아미노산은 I 또는 V이고, 104번째 아미노산은 L 또는 V이다.
바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 NKG2A 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 및 13로부터 선택되어 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 10 및 13과 비교하여 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개) 아미노산의 보존적 변형을 가지며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 11과 비교하여 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개) 아미노산의 보존적 변형을 가진다. 보다 바람직하게는, 상기 NKG2A 항체는 SEQ ID NO: 10 및 13으로부터 선택되어 표시되는 경쇄 가변 영역과 SEQ ID NO: 11로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 NKG2A 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12 및 14로부터 선택된다.
본 발명은 상기 NKG2A 항체를 암호화하는 핵산 분자를 더 제공한다. 따라서, 일 실시방식에 있어서, 상기 NKG2A 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 16 내지 17로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 동일성을 가지며, 이의 암호화된 NKG2A 항체는 NKG2A에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 NKG2A 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 16 내지 17로부터 선택된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 다중특이성 항체(바람직하게는 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체)를 제공하며, 여기에는 상술한 NKG2A 항체 및 다른 항원과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 임의 항체 또는 항체 단편 형태를 구비할 수 있으며, 예를 들어 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 sdAb가 있다.
본 발명은 상기 NKG2A 항체 또는 다중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 NKG2A 항체 또는 다중특이성 항체를 발현하는 숙주 세포를 더 제공한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 NK 억제 리간드, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 더 제공한다. 여기에서 상기 NK 억제 리간드는 상기 NKG2A 항체 또는 상기 NKG2A 항체를 포함하는 다중특이성 항체를 포함하고, 여기에서 상기 신호전달 도메인은 하나 이상의 보조자극 도메인을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 키메라 수용체는 두 가지의 NK 억제 리간드를 포함한다. 여기에서 제1 NK 억제 리간드는 상술한 바와 같은 NKG2A 항체이고, 제2 NK 억제 리간드는 (1) 하기 NK 억제 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편: LIR1, NKG2B, CD94, LIR2, LIR3, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1, CEACAM1, LAIR1 및 KLRG1; 또는 (2) HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCIL, 시알산, PD-L1, PD-L2, CD155, CD112, CD113, Gal-9, FGL1, 및 이들이 함유하는 NK 억제 수용체 결합 도메인으로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 수용체 내의 상기 신호전달 도메인은 하나 이상의 보조자극 도메인으로 구성된다. 즉, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d와 같은 1차 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
다른 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 수용체의 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 영역과 같은 1차 신호전달 도메인을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 NKG2A를 표적으로 하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 본 발명의 NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하고 적어도 하나의 MHC-관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 조작된 면역 세포를 더 제공한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 MHC-관련 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함하며, 여기에서 상기 TCR/CD3 유전자의 예시에는 예를 들어 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 조작된 면역 세포는 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 더 발현한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 수지상 세포로부터 선택된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 제2 기능성 구조가 포함된다. 여기에서 상기 제2 기능성 구조는 Fc, 방사성 동위원소 및 반감기를 연장하는 구조 부분, 검출 가능한 마커 및 약물로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 반감기를 연장하는 구조 부분은 알부민의 결합 구조, 트랜스페린의 결합 구조, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민의 단편 및 인간 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드(항체 포함)로부터 선택된다. 일 실시방식에 있어서, 검출 가능한 마커는 형광단, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물, 효소, 항생제 내성 유전자 및 조영제로부터 선택된다. 일 실시방식에 있어서, 상기 약물은 세포 독소 및 면역 조절제로부터 선택된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 검출 키트를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 항체, 다중특이성 항체, 항체 접합체 또는 키메라 수용체가 포함된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 항체, 키메라 수용체, 다중특이성 항체, 조작된 세포 또는 항체 접합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 NKG2A 발현 관련 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 진단하는 방법을 더 제공하며, 여기에는 피험자에게 상술한 바와 같은 항체, 키메라 수용체, 다중특이성 항체, 항체 접합체, 조작된 면역 세포 또는 약학 조성물을 투여하는 단계가 포함된다.
발명의 상세 내용
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
NKG2A 항체
본 발명의 맥락에서, "Z199 항체"는 Carretero 등(Eur JImmunol 1997; 27:563-7)에 의해 기술된 마우스 항-NKG2A 항체 Z199이며, 현재 Beckman Coulter, Inc.를 통해 상업적으로 입수 가능하고, Cat. No.는 IM2750이다. "hZ199 항체"는 SEQ ID NO: 7로 표시되는 경쇄 가변 영역과 SEQ ID NO: 8로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 Z199 항체를 말하며, 전장 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다.
본 발명에서 제공하는 새로운 NKG2A 항체는 hZ199를 기반으로 복귀 돌연변이를 수행하여 수득되어, 더 높은 친화력과 더 나은 NK 세포 살상 억제 효과를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당업자가 이해하는 가장 광범위한 함의를 가지며, 여기에는 단일 클론 항체(온전한 항체 포함), 다중 클론 항체, 다가 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 기대하는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 하나 이상의 CDR 서열을 갖는 항체 단편 또는 합성 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명에 따른 항체는 임의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등) 또는 아형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등)일 수 있다.
통상적으로, 온전한 항체에는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 포함되며, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 각각의 중쇄에 연결되며, "Y"형 구조를 나타낸다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서 중쇄 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR): CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서 경쇄 가변 영역은 3개의 CDR: CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을, 경쇄 불변 영역은 1개의 불변 도메인 CL을 포함한다. 중쇄/경쇄 가변 영역에서, CDR은 더욱 보존된 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된다. 중쇄/경쇄의 가변 영역은 항원과의 인식 및 결합을 담당하는 반면, 불변 영역은 항체가 숙주 조직이나 인자와 결합하도록 매개할 수 있으며, 여기에는 면역계의 다양한 세포(예를 들어 이펙터 세포)와 고전적인 보체계의 첫 번째 구성 요소가 포함된다.
주어진 CDR 또는 FR에 대한 정확한 아미노산 서열 경계는 당업계에 잘 알려진 여러 넘버링 방식을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 이러한 방식에는, Kabat et al.(1991), "Sequences ofProteins of Immunological Interest," 제5판 Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Maryland("Kabat" 넘버링 방식); Al-Lazikaniet al.(1997)JMB273, 927-948("Chothia" 넘버링 방식); MacCallum et al., J.Mol.Biol.262:732-745(1996), "Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding sitetopography." J.Mol.Biol.262, 732-745"("Contact" 넘버링 방식); Lefranc MP et al. "IMGTunique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-like domains.", Dev Comp Immunol, 2003년 1월; 27(1):55-77("IMGT" 넘버링 방식); Honegger A 및 Pl
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ckthun A, "Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool." JMol Biol, 2001년 6월 8일; 309(3):657-70("Aho" 넘버링 방식); 및 Martin et al., "Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272("AbM" 넘버링 방식)가 포함된다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 방식은 구조적 비교를 기반으로 하는 반면, Chothia 방식은 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 방식의 넘버링은 모두 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하며, 특정 삽입 및 결실("인델(indel)")을 상이한 위치에 배치하여, 상이한 번호를 생성한다. Contact 방식은 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하며, 여러 측면에서 Chothia 넘버링 방식과 유사하다. AbM 방식은 Kabat 및 Chothia 정의 간의 절충안이며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용하는 방식을 기반으로 한다.
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 이의 가변 영역)의 "CDR"은 임의의 상기 방식 또는 다른 공지된 방식에 의해 정의된 CDR을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정한 CDR(예를 들어, CDR3)에 주어진 아미노산 서열이 포함된다고 명시된 경우, 이러한 CDR은 임의 상기 방식 또는 기타 공지된 방식에 정의된 상응하는 CDR(예를 들어 CDR3)의 서열을 더 가질 수 있다. 마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 이의 가변 영역)의 "FR"은 임의의 상기 방식 또는 다른 공지된 방식에 의해 정의된 FR을 포함하는 것으로 이해된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원의 아미노산 넘버링은 Chothia 방식을 따른다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체 단편" 또는 "항원 결합 부위"는 온전한 항체의 일부분만을 포함하는데, 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원을 결합하는 능력을 보유한다. 본 발명의 항체 단편의 예시에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd 단편, Fd', Fv 단편, scFv, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL), 선형 항체, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디", 단일 도메인 항체, 나노바디, 상기 항원의 천연 리간드 또는 이의 기능성 단편 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 "항체"는 상기에서 정의된 바와 같은 항체 단편을 포함한다.
"단일쇄 항체" 또는 "scFv"는 본원에서 혼용될 수 있으며, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 링커에 의해 연결된 항체를 지칭한다. 링커의 최적 길이 및/또는 아미노산 조성이 선택될 수 있다. 링커의 길이는 scFv의 가변 도메인 폴딩 및 상호작용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 사실상 비교적 짧은 링커(예를 들어 5-10개 아미노산 사이)를 사용하면 사슬 내 폴딩을 방지할 수 있다. 링커의 크기 및 조성의 선택에 대해서는, 예를 들어 Hollinger et al., 1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794; 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715를 참조하며, 이는 전체 내용이 참조로 본원에 포함되었다. scFv는 임의의 순서로 연결된 VH 및 VL, 예를 들어 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있다.
제1 양상에 있어서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 NKG2A를 표적으로 하는 항체를 제공한다. 여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 여기에서 상기 경쇄 가변 영역의 21번째 아미노산은 M이고, 85번째 아미노산은 T이고, 상기 중쇄 가변 영역의 34번째 아미노산은 M이고, 49번째 아미노산은 A이고, 61번째 아미노산은 P이고, 97번째 아미노산은 T이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역의 22번째 아미노산은 S 또는 T이고, 58번째 아미노산은 I 또는 V이고, 104번째 아미노산은 L 또는 V이다.
바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 NKG2A 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 및 13로부터 선택되어 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 10 및 13과 비교하여 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개) 아미노산의 보존적 변형을 가지며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 11과 비교하여 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개) 아미노산의 보존적 변형을 가진다. 보다 바람직하게는, 상기 NKG2A 항체는 SEQ ID NO: 10 및 13으로부터 선택되어 표시되는 경쇄 가변 영역과 SEQ ID NO: 11로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 NKG2A 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12 및 14로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개의(뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 비교에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도를 의미하며, 통상적으로 백분율로 표시된다. 바람직하게는, 동일성은 비교되는 서열의 전체 길이 상에서 결정된다. 따라서 완전히 동일한 서열의 2개 카피는 100% 동일성을 갖는다. 당업자는 일부 알고리즘을 사용하여 서열 동일성을 결정할 수 있음을 알고 있으며, 예를 들어 Blast(Altschul 등(1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-3402), Blast2(Altschul 등(1990) J.Mol.Biol.215: 403-410), Smith-Waterman(Smith 등(1981) J.Mol.Biol.147: 195-197) 및 ClustalW가 있다.
본원에서 사용되는 "보존적 변형"이라는 용어는 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 현저한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 추가 및 결실이 포함된다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 키메라 항원 수용체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있으며, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 포함된다. 보존적 변형은 예를 들어 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 관련된 잔기의 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 선택할 수 있다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 상술한 바와 같은 NKG2A 항체를 포함하는 다중특이성 항체(바람직하게는 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체)를 더 제공하며, 여기에는 다른 항원과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 항체가 더 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "다중특이성"은 항원 결합 단백질이 다중에피토프 특이성을 갖는 것을 의미한다(즉, 하나의 생체분자 상의 2개, 3개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 2개, 3개 또는 그 이상의 상이한 생체분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음). 본 명세서에 사용된 용어 "이중특이성"은 항원 결합 단백질이 2가지의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 것을 나타낸다.
일 실시방식에 있어서, 제2 항체는 임의 항체 또는 항체 단편 형태를 구비할 수 있으며, 예를 들어 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 sdAb가 있다.
핵산, 벡터, 숙주 세포
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 NKG2A 항체 또는 다중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 RNA, DNA 또는 cDNA일 수 있다. 본 발명의 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 핵산은 기본적으로 분리된 핵산이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 NKG2A 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 16 내지 17로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 서열 동일성을 가지며, 이의 암호화된 NKG2A 항체는 NKG2A에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 NKG2A 항체를 암호화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 16 내지 17로 표시된다.
본 발명의 핵산은 벡터 형태일 수도 있으며, 벡터에 존재하고/하거나 벡터의 일부분일 수 있다. 해당 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 YAC이다. 벡터는 특히 발현 벡터일 수 있으며, 즉 NKG2A 항체가 생체외 및/또는 생체내에서(즉, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) 발현되는 벡터를 제공할 수 있다. 해당 발현 벡터는 통상적으로 적어도 하나의 본 발명의 핵산 분자를 포함하며, 이는 하나 이상의 적합한 발현 제어 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절 요소 및 이의 서열을 선택하여 특정 숙주에서의 발현을 용이하게 하는 것은 당업자가 잘 알고 있는 것이다. 본 발명의 NKG2A 항체의 발현에 유용하거나 필요한 조절 요소 및 기타 요소의 구체적인 예시에는 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 인테그레이터, 선별 마커, 리더 서열, 리포터 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 NKG2A 항체, 다중특이성 항체를 발현하고/하거나 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 박테리아 세포는 그람 음성 박테리아 균주(예를 들어 대장균(Escherichia coli) 균주, 프로테우스속(Proteus) 균주 및 슈도모나스속(Pseudomonas) 균주) 및 그람 양성 박테리아 균주(예를 들어 바실루스속(Bacillus) 균주, 스테렙토미세스속(Streptomyces) 균주, 포도상구균속(Staphylococcus) 균주 및 락토코쿠스속(Lactococcus) 균주)의 세포를 포함한다.
적합한 진균 세포는 트리코데르마속(Trichoderma), 뉴로스포라속(Neurospora) 및 아스페르길루스속(Aspergillus) 종의 세포; 또는 사카로마이세스속(Saccharomyces)(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스속(Schizosaccharomyces)(예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베속(Schizosaccharomyces pombe)), 피치아속(Pichia)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichiapastoris) 및 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica)) 및 한세눌라속(Hansenula) 종의 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는 예를 들어 HEK293 세포, CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등을 포함한다.
그러나, 본 발명은 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 당업계에서 이종 단백질을 발현하기 위한 임의 기타 세포도 사용할 수 있다.
키메라 수용체
다른 양상에 있어서, 본 발명은 상술한 바와 같은 NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 더 제공한다. NKG2A는 NK 억제 수용체이기 때문에, NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체는 NK 세포의 살상 작용을 억제하는 데 사용될 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 NK 억제 리간드, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다. 여기에서 상기 NK 억제 리간드는 상기 NKG2A 항체 또는 상기 NKG2A 항체를 포함하는 다중특이성 항체를 포함하고, 여기에서 상기 신호전달 도메인은 하나 이상의 보조자극 도메인을 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 키메라 수용체는 다양한 NK 억제 리간드, 예컨대 두 가지의 NK 억제 리간드를 포함한다. 여기에서 제1 NK 억제 리간드는 상술한 바와 같은 NKG2A 항체이고, 제2 NK 억제 리간드는 기타 NK 억제 리간드를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편, 및/또는 기타 NK 억제 수용체의 천연 리간드 또는 이에 포함된 NK 억제 수용체 결합 영역이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 제2 NK 억제 리간드는 하기 NK 억제 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편으로부터 선택된다: NKG2/CD94 성분(예를 들어, NKG2A, CD94), 살해 세포 Ig-유사 수용체(KIR) 패밀리 구성원(예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2 및 KIR3DL3), 백혈구 Ig-유사 수용체(LIR) 패밀리 구성원(예를 들어, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5 및 LIR8), NK 세포 수용체 단백질 1(NKR -P1) 패밀리 구성원(예를 들어, NKR-P1B 및 NKR-P1D), 면역 체크포인트 수용체(예를 들어, PD-1, TIGIT 및 CD96, TIM3, LAG3), 암배아 항원 관련 세포 접착 분자 1(CEACAM1), 시알산 결합 면역글로불린-유사 렉틴(SIGLEC) 패밀리 구성원(예를 들어, SIGLEC7 및 SIGLEC9), 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1), Ly49 패밀리 구성원(예를 들어, Ly49A, Ly49C, Ly49F, Ly49G1 및 Ly49G4) 및 살해 세포 렉틴-유사 수용체 G1(KLRG1). 보다 바람직하게는, 상기 제2 NK 억제 리간드는 하기 NK 억제 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편으로부터 선택된다: NKG2B, CD94, LIR1, LIR2, LIR3, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1, CEACAM1, LAIR1 및 KLRG1. 보다 바람직하게는, 상기 제2 NK 억제 리간드는 하기 NK 억제 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편으로부터 선택된다: CD94, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1, CEACAM1, LIR1, LAIR1 및 KLRG1.
일 실시방식에 있어서, 상기 제2 NK 억제 리간드는 기타 NK 억제 수용체의 천연 리간드 또는 이에 포함된 NK 억제 수용체 결합 영역이며, 예를 들어 HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCIL, 시알산, 면역 체크포인트 리간드(예를 들어 PD-L1/PD-L2, CD155, CD112, CD113, Gal-9, FGL1 등), 및 이들이 포함하는 NK 억제 수용체 결합 영역이다. 바람직하게는, 상기 제2 NK 억제 리간드는 HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, PD-L1, PD-L2, 또는 이들이 포함하는 NK 억제 수용체 결합 영역으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 제2 NK 억제 리간드는 HLA-E 세포외 영역, HLA-G 세포외 영역, E-카드헤린 세포외 영역, PD-L1 세포외 영역 및 PD-L2 세포외 영역으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 제2 NK 억제 리간드는 E-카드헤린 세포외 영역이며, EC1 및 EC2를 포함하고, 보다 바람직하게는 EC1, EC2, EC3, EC4 및 EC5를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "막횡단 도메인"은 면역 세포(예를 들어, 림프구, NK 세포 또는 NKT 세포)의 표면에서 키메라 수용체를 발현시킬 수 있고, 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 안내할 수 있는 폴리펩티드 구조를 의미한다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성일 수 있으며, 임의 막결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 키메라 수용체와 표적 항원이 결합하면, 막횡단 도메인은 신호전달을 수행할 수 있다. 특히 본 발명에 적용되는 막횡단 도메인은 예를 들어 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, TCRγ 사슬, TCRδ 사슬, CD3ζ 서브유닛, CD3ε 서브유닛, CD3γ 서브유닛, CD3δ 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 이의 기능적 단편으로부터 유래될 수 있다. 또는 막횡단 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 주로 류신과 발린 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 막횡단 도메인은 CD8α 사슬 또는 CD28로부터 유래된다. 이는 SEQ ID NO: 17 또는 19로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 18 또는 20으로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어 "보조자극 도메인"은 상기 보조자극 분자로부터의 세포내 기능적 신호전달 도메인을 의미하며, 여기에는 상기 보조자극 분자의 전체 세포내 부분 또는 이의 기능적 단편이 포함된다. "보조자극 분자"는 T 세포 상에서 보조자극 리간드에 특이적으로 결합함으로써, T 세포의 보조자극 반응(예를 들어, 증식)을 매개하는 동족 결합 배우체를 의미한다. 보조자극 분자에는 MHC 클래스 1 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 보조자극 도메인의 비제한적 예시에는 하기 단백질로부터 유래하는 세포내 영역이 포함되나 이에 한정되지 않는다: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM 및 ZAP70. 바람직하게는, 본 발명의 CAR의 보조자극 도메인은 4-1BB, CD28 또는 4-1BB+CD28로부터 유래된다. 일 실시방식에 있어서, 4-1BB 보조자극 도메인과 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 24로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일 실시방식에 있어서, CD28 보조자극 도메인과 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 22로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 하나 이상의 보조자극 도메인으로 구성된다(즉, 예를 들어 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래되는 1차 신호전달 도메인을 포함하지 않음). 다른 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 수용체의 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 영역과 같은 1차 신호전달 도메인을 더 포함할 수 있다. 바람직한 실시방식에 있어서, 상기 CD3ζ 세포내 영역과 SEQ ID NO: 25 또는 27로 표시되는 아미노산 서열은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 26 또는 28로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 수용체는 항체와 막횡단 도메인 사이에 위치한 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 막횡단 도메인을 항체에 연결하도록 작용하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적으로, 힌지 영역은 항체에 더 큰 유연성과 접근성을 제공하는 역할을 한다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역으로부터 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 항체 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 부분적으로와 같이 천연 분자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래될 수 있다. 또는 힌지 영역은 자연 발생 힌지 서열에 대응하는 합성 서열이거나, 완전히 합성된 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시방식에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α, CD28, FcγRIIIα 수용체, IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역 부분을 포함하고, 보다 바람직하게는 CD8α, CD28 또는 IgG4 힌지이며, 이는 SEQ ID NO: 33, 35 또는 37로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 34, 36 또는 38로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CR은 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때 신생 단백질이 소포체에 이어서 세포 표면에 지시되도록 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 코어는 단일 α-나선을 형성하는 경향이 있는 긴 길이의 소수성 아미노산을 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 말단에는 통상적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 영역이 있다. 신호 펩티다제는 전좌 동안 또는 완료 후 절단되어 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 그 후, 유리 신호 펩티드는 특정 프로테아제에 의해 소화된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신호 펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 B2M, CD8α, IgG1, GM-CSFRα 등에서 유래된 신호 펩티드이다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 신호 펩티드는 B2M 또는 CD8α로부터 유래되며, 이는 SEQ ID NO: 29 또는 31로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 30 또는 32로 표시되는 핵산 분자와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 CR은 본원에 제공된 NKG2A 항체 또는 상기 NKG2A 항체를 포함하는 다중특이성 항체, CD8α 막횡단 영역 및 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 신호전달 도메인은 CD28 및 4-1BB로부터 선택되는 보조자극 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 상기 신호전달 도메인은 CD28 및 4-1BB로부터 선택되는 보조자극 도메인으로 구성된다. 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 영역을 더 포함한다. 상기 실시방식에 있어서, 상기 CAR은 B2M, CD8α, IgG1 또는 GM-CSFRα 유래의 신호 펩티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 NKG2A를 표적으로 하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 (외인성) 유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 비히클로 사용되는 핵산 분자이며, 상기 핵산 분자는 예를 들어 숙주 세포에서 복제 및/또는 발현될 수 있다. 벡터는 일반적으로 표적화 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "표적화 벡터"는 분리된 핵산을 예를 들어, 특정 표적화 부위의 서열을 사용하여 상동 재조합 또는 하이브리드 재조합효소에 의해 세포 내부로 전달하는 매체이다. "발현 벡터"는 본 발명의 키메라 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 것과 같은 이종 핵산 서열의 전사 및 적합한 숙주 세포에서의 이들의 mRNA 번역에 사용되는 벡터이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있고 다수가 상업적으로 입수 가능하다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 파지, 파지미드, 코스미드 및 인공 염색체(BAC 및 YAC 포함)를 포함한다. 벡터 자체는 통상적으로 핵산 분자이며, 통상적으로 삽입물(트랜스진)을 포함하는 DNA 서열과 벡터의 "백본" 역할을 하는 비교적 큰 서열이다. 조작된 벡터는 통상적으로 숙주 세포의 자율 복제 기점(폴리뉴클레오티드의 안정적인 발현이 필요한 경우), 선별 마커 및 제한 효소 절단 부위(예를 들어 다중 클론 부위, MCS 등)도 포함한다. 벡터는 프로모터, 폴리A 꼬리(polyA), 3' UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오퍼레이터, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그 등 요소를 더 포함한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 벡터는 체외 전사된 벡터이다.
조작된 면역 세포
NKG2A는 HLA-E와 같은 비고전적 HLA-I 클래스 분자에 결합한 다음 NK 세포와 같은 면역 세포의 활성화를 억제할 수 있다. 따라서 외인성 NKG2A 항체의 도입은 NKG2A에 결합함으로써 NK 세포의 살상 작용을 억제할 수 있으며, 이는 일부 경우(예를 들어, HLA-I 클래스 분자 결실 또는 범용 CAR-T 세포 제조의 경우)에서 특히 유용하다.
따라서 일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하고 적어도 하나의 MHC-관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 조작된 면역 세포를 더 제공한다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 제2 NK 억제 리간드를 포함하는 제2 키메라 수용체를 더 발현하며, 여기에서 상기 제2 NK 억제 리간드는 기타 NK 억제 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편, 및/또는 기타 NK 억제 수용체의 천연 리간드 또는 이에 포함된 NK 억제 수용체 결합 영역이다.
본원에 사용되는 바와 같이, MHC 관련 유전자는 MHC 유전자 자체(예를 들어, MHC-I 클래스 분자 및 MHC-II 클래스 분자), 및 MHC 유전자와 상호작용하거나 그 발현을 조절하는 유전자를 포함한다. MHC-I 클래스 분자의 예시에는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M이 포함되나 이에 한정되지 않는다. MHC-II 클래스 분자의 예시는 HLA-DPAl, HLA-DQA1 및 HLA-DRA가 포함되나 이에 한정되지 않는다. MHC 유전자와 상호작용하거나 그의 발현을 조절하는 유전자의 예시에는 TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK 및 CIITA가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 일 실시방식에 있어서, MHC 관련 유전자의 발현을 억제 또는 침묵시키는 것은 하기의 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 의미한다: HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함하며, 여기에서 상기 TCR/CD3 유전자의 예시에는 예를 들어 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ가 포함된다.
바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 본 발명의 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자 및 적어도 하나의 MHC-관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 포함한다. 여기에서 상기 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 적어도 하나의 MHC 관련 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 적어도 하나의 MHC 관련 유전자는 B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 B2M의 발현은 억제되거나 침묵된다. 일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 CIITA의 발현은 억제되거나 침묵된다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 B2M과 CIITA의 발현은 억제되거나 침묵된다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 B2M과 RFX5의 발현은 억제되거나 침묵된다.
유전자 발현을 억제하거나 유전자를 침묵시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있는 것이며, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR 시스템에서의 Cas 효소에 의해 DNA 절단을 매개하거나, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, shRNA 등 기술에 의해 유전자를 비활성화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 조작된 면역 세포는 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 더 발현한다.
일 실시방식에 있어서, 본 키메라 항원 수용체는 하기에서 선택되는 종양 항원을 표적화한다: TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate 수용체 α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gploo, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate 수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos 관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 전립선 특이적 단백질, 서비빈과 텔로머라제, PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, Claudin18.2, NKG2D 및 이들의 임의 조합. 바람직하게는, 상기 표적은 CD19, CD20, CD22, BAFF-R, CD33, EGFRvIII, BCMA, GPRC5D, PSMA, ROR1, FAP, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CAIX, WT1, NY-ESO-1, CD79a, CD79b, GPC3, Claudin18.2, NKG2D 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된다. 표적화할 항원에 따라, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 해당 항원에 특이적인 항체가 포함되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CD19가 표적화할 항원인 경우, CD19 항체는 본 발명의 키메라 항원 수용체에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포"는 하나 이상의 이펙터 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인 분비, ADCC 및/또는 CDC 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK 세포 및/또는 NKT 세포일 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 제대혈줄기세포, 전구세포, 골수줄기세포, 유도만능줄기세포, 전능줄기세포 또는 조혈줄기세포 등과 같은 줄기세포에서 유래한다. 바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 1차 T 세포와 같이 체외 배양된 T 세포, 또는 Jurkat, SupT1 등과 같이 체외 배양된 T 세포주의 T 세포, 또는 피험자로부터 획득한 T 세포와 같은 임의의 T 세포일 수 있다. 피험자의 예시에는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 트랜스진 물종 포함한다. T 세포는 말초혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다양한 출처에서 얻을 수 있다. T 세포는 농축되거나 정제될 수도 있다. T 세포는 임의 발육 단계에 있는 CD4+/CD8+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, γδ-T 세포, αβ-T 세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않을 수 있다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 인간 T 세포이다. Ficoll 분리와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 피험자의 혈액으로부터 T 세포를 얻을 수 있다.
당업계에 공지된 통상의 방법(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 형질전환 등)을 채택하여 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 면역 세포에 도입할 수 있다. "형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)를 표적 세포에 도입하는 과정이다. 한 가지 예시는 RNA 형질감염, 즉 RNA(예를 들어 체외 전사된 RNA, ivtRNA)를 숙주 세포에 도입하는 과정이다. 해당 용어는 주로 진핵 세포의 비바이러스 방법에 사용된다. "형질도입"이라는 용어는 통상적으로 바이러스 매개의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 전달을 설명하는 데 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 통상적으로 세포막에 일시적인 기공 또는 "구멍"을 열어 물질 섭취를 허용하는 것이다. 인산칼슘 사용, 전기천공법, 세포 압출 또는 양이온성 지질을 물질과 혼합하여 세포막과 융합하고 이들의 운반물을 내부의 리포좀에 침착시켜 형질감염을 수행할 수 있다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 예시적인 기술에는 지질 소포-매개 섭취, 열 충격-매개 섭취, 인산칼슘-매개 형질감염(인산칼슘/DNA 공침전), 미세주입 및 전기천공법이 포함된다. 용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)의 박테리아뿐만 아니라 비동물 진핵 세포(식물 세포 포함)로의 비-바이러스 전달을 설명하는 데 사용된다. 따라서 형질전환은 박테리아 또는 비동물성 진핵 세포의 유전적 변형이며, 이는 주변 환경으로부터 세포막에 의한 직접적인 섭취와 외인성 유전 물질(핵산 분자)의 후속 통합에 의해 생성된다. 형질전환은 수동 수단으로 수행할 수 있다. 형질전환이 일어나기 위해서는 세포나 박테리아가 수용능 상태에 있어야 한다. 원핵 형질전환의 경우, 기술에는 열충격 매개 섭취, 완전한 세포와 세균 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공법이 포함될 수 있다. 핵산 또는 벡터가 면역 세포에 도입된 후, 당업자는 통상적인 기술에 의해 수득된 면역 세포를 증폭 및 활성화할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 다양한 조작된 면역 세포를 더 제공한다. 여기에서 하나의 면역 세포는 본 발명에 따른 키메라 수용체 및 임의의 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현하고, 다른 하나의 면역 세포는 기타 NK 억제 수용체를 표적화하는 제2 키메라 수용체를 발현한다. 해당 실시방식에 있어서, 상기 제2 키메라 수용체는 제2 NK 억제 리간드, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고, 여기에서 상기 제2 NK 억제 리간드, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인은 "키메라 수용체" 부분에 기재된 바와 같이 정의된다. 이러한 실시방식에 있어서, 상기 다양한 조작된 면역 세포는 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 상기 다양한 면역 세포는 동일한 조성물 또는 상이한 조성물에 있을 수 있다. 세포의 예시적 조성물에는 본 출원의 이하에 설명된 조성물이 포함된다.
항체 접합체
일 양상에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 제2 기능성 구조가 포함된다. 여기에서 상기 제2 기능성 구조는 Fc, 방사성 동위원소 및 반감기를 연장하는 구조 부분, 검출 가능한 마커 및 약물로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 Fc가 포함된다. 본 명세서에 사용된 용어 "Fc"는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는 데 사용되며, 여기에는 천연 Fc 및 변이체 Fc가 포함된다. "천연 Fc"는 온전한 항체의 분해에 의해 생성된, 단량체 또는 다량체 여부에 상관없는 비항원 결합 단편을 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 천연 Fc가 생산되는 면역글로불린의 공급원은 바람직하게는 인간이다. 천연 Fc 단편은 공유 결합(예를 들어 이황화 결합) 및 비공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 구성된다. 유형(예를 들어 IgG, IgA, IgE, IgD, IgM) 또는 아형(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라, 천연 Fc 분자 단량체 서브유닛 사이에 1-4개의 분자간 이황화 결합을 갖는다. 천연 Fc의 예시는 IgG의 파파인 분해에 의해 생성된 이황화 결합을 통해 연결된 이량체이다(Ellison et al.(1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9 참조). 본 명세서에 사용된 용어 "천연 Fc"는 일반적으로 단량체, 이량체 및 다량체 형태를 의미한다. "변이체 Fc"는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 "아미노산 변형"에 의해 "천연" 또는 "야생형" Fc의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 지칭하며, "Fc 변이체"로 칭하기도 한다. 따라서, "Fc"는 단일 사슬 Fc(scFc), 즉 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 Fc 단량체로 구성된 단일 사슬 Fc를 포함하며, 이는 기능적 이합체 Fc 영역으로 자연적으로 폴딩될 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 상기 Fc는 바람직하게는 인간 면역글로불린의 Fc이며, 보다 바람직하게는 인간 IgG1의 Fc이다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 방사성 동위원소가 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 방사성 동위원소의 예시에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 99mTc, 123I, 18F 및 68Ga가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 반감기를 연장하는 구조 부분이 포함되고, 상기 반감기를 연장하는 구조 부분은 알부민의 결합 구조, 트랜스페린의 결합 구조, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민의 단편 및 인간 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드(항체 포함)로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 검출 가능한 마커가 포함된다. 용어 "검출 가능한 마커"는 본원에서 신호 검출이 가능한 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는 MRI 조영제, 신티그래피 조영제, X선 영상 조영제, 초음파 조영제, 광학 영상 조영제일 수 있다. 검출 가능한 마커의 예시에는 형광단(예를 들어 플루오레세인, Alexa 또는 시아닌), 화학 발광 화합물(예를 들어 루미놀), 생물 발광 화합물(예를 들어 루시페라아제 또는 알칼리 포스파타제), 효소(예를 들어 겨자무과산화효소, 포도당-6-포스파타제, β-갈락토시다제), 항생제(예를 들어 카나마이신, 암피실린, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등) 내성 유전자 및 조영제(예를 들어 나노입자 또는 가돌리늄)이 포함된다. 당업자는 사용하는 검출 시스템에 따라 적합한 검출 가능한 마커를 선택할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 항체 접합체를 제공하며, 여기에는 본 발명에 정의된 NKG2A 항체 및 상기 NKG2A 항체와 접합되는 약물을 포함하는데, 예를 들어 세포 독소 또는 면역 조절제(즉, 항체 약물 접합체)가 있다. 통상적으로 약물은 공유 결합을 통해 항체와 연결되며, 통상적으로 링커에 의존한다. 일 실시방식에 있어서, 상기 약물은 세포 독소이다. 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 약물은 면역 조절제이다. 세포 독소의 예시에는 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 다카르바진, 질소 머스타드, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조신, 미토마이신, 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP), 시스플라틴, 카르보플라틴, 조루비신, 독소루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 악티노마이신 D, 블레오마이신, 칼리케아미신, 미트로마이신, 안트라마이신(AMC), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 파클리탁셀, 리신, 슈도모나스 외독소, 젬시타빈, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 에토포사이드, 테니포사이드, 콜히친, 디하이드록시안트라세디온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 프로카바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 미토탄(O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 면역 조절제의 예시에는 간시클로비르, 에타너셉트, 타크로리무스, 시롤리무스, 사이클로스포린, 사이클로스포린, 라파마이신, 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트 레티노이드, 글루코코르티코이드 및 유사체, 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 종양 괴사 인자(TNF), 조혈 인자, 인터루킨(예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 및 IL-21), 콜로니 자극 인자(예를 들어 G-CSF 및 (GM-CSF), 인터페론(예를 들어 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ), "S1 인자"로 명명된 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴, 또는 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
키트와 약학 조성물
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 검출 키트를 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 항체, 다중특이성 항체, 키메라 수용체 또는 항체 접합체가 포함된다.
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 본 발명에 따른 항체, 키메라 수용체, 다중특이성 항체 또는 항체 접합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 피험자 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 적합(즉, 원하지 않는 국소적 또는 전신적 효과를 일으키지 않고 원하는 치료 효과를 이끌어낼 수 있음)한 담체 및/또는 부형제를 의미하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania: Mack Publishing Company,1995 참조). 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예시에는 충전제, 결합제, 붕해제, 코팅제, 흡착제, 접착방지제, 유동보조제, 산화방지제, 향미제, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 희석제, 습윤제, 방부제, 유화제, 코팅제, 등장화제, 흡수 지연제, 안정화제 및 장력 조절제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 부형제의 선택은 본 발명의 원하는 약학 조성물의 제조를 위해 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약학 조성물에 사용하기 위한 예시적인 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함한다. 통상적으로, 적합한 부형제의 선택은 특히 사용되는 활성제, 치료할 질병 및 약학 조성물의 원하는 제형에 따라 달라진다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 투여 경로에 적합하다. 통상적으로, 투여는 비경구적으로 수행된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수내, 척수강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 설하 또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 형태, 예컨대 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태로 제조될 수도 있으며, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 겔, 분말, 정제, 용액, 기체 에어로졸 형태, 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 엘릭시르, 추출물, 팅크 또는 액체 추출물의 형태, 또는 원하는 투여 방법에 사용하기 위해 특별히 적합한 형태일 수 있다. 약제의 제조를 위한 본 발명에 공지된 공정은 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 밀링, 유화, 캡슐화, 포매 또는 동결건조 공정을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 면역 세포를 포함하는 약학 조성물은 통상적으로 용액 형태로 제공되며, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 치료될 질환의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합에 적합한 약제의 바람직한 예시에는 시스플라틴, 메이탄신 유도체, 라첼마이신(rachelmycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 도세탁셀, 에토포사이드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 나트륨 포르피린 II(sorfimer sodiumphotofrin II), 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레이트 글루쿠로네이트(trimetreate glucuronate), 아우리스타틴 E(auristatin E), 빈크리스틴 및 독소루비신과 같은 항암 약물; 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, DNase 및 RNase와 같은 펩티드 세포 독소; 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이리듐 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213과 같은 방사성 핵종; 항체-지정 효소 전구 약물 등의 전구 약물; 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 촉진 단백질 등과 같은 면역자극제; 항-CD3 항체 또는 이의 단편, 보체 활성제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩티드와 같은 항체 또는 이의 단편이 포함된다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 화학 요법, 방사선 요법과 같이 다른 하나 이상의 치료 방법과 조합 사용될 수 있다.
치료/예방/진단 용도
다른 일 양상에 있어서, 본 발명은 NKG2A 발현 관련 질환을 치료 및/또는 예방 및/또는 진단하는 방법을 더 제공하며, 여기에는 피험자에게 상술한 바와 같은 항체, 다중특이성 항체, 항체 접합체 또는 약학 조성물을 투여하는 단계가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, NKG2A 발현과 관련된 질환에는 암, 감염성 질환, 염증성 질환 및 자가면역 질환이 포함된다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 암의 예시에는 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암 및 편평 세포 암종을 포함하는 피부암을 포함하는 고형암; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모상 세포 림프종 및 버킷 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하는 림프계 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 전골수구성 백혈병 및 골수이형성 증후군을 포함하는 골수계 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 유래 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종을 포함하는 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 유래 종양; 및 흑색종, 색소성 피부건조증, 각질극세포종, 정상피종, 갑상선의 여포성 암종 및 기형암종을 포함하는 기타 종양이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 감염성 질환의 예시에는 바이러스, 박테리아, 원생동물 또는 진균에 의해 발생하는 감염이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 바이러스는 예를 들어 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수두 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 1형(HSV-1), 단순 포진 2형(HSV-2), 우역, 라이노 바이러스, 에코 바이러스, 로타 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 유두종 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 아르보 바이러스, 콕사키 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1형 또는 2형(HIV-1, HIV-2)를 포함하고, 박테리아는 예를 들어 포도상구균, 연쇄상구균, 바실러스, 락토바실러스, 리스테리아, 코리네박테리움 디프테리아 등을 포함한다. 본 발명의 항체로 치료할 수 있는 염증성 질환의 예시에는 부신염, 폐포 염증, 담낭담관염, 맹장염, 귀두염, 안검염, 기관지염, 활액낭염, 심장염, 봉와직염, 자궁경부염, 담낭염, 성대 염증, 달팽이관염, 대장염, 결막염, 방광염, 피부염, 게실염, 뇌염, 심내막염, 식도염, 유스타키오관 염증, 섬유조직 염증, 모낭염, 위염, 위장염, 치은염, 설염, 간비장염, 각막염, 내이염, 후두염, 림프관염, 유방염, 중이염, 수막염, 자궁염, 점막염 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 자가면역질환의 예시에는 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 전신성 홍반성 루푸스, Wegener 육아종성 질환, 자가면역 간염, Behcet병, Crohn병, 원발성 담즙성 간경변증, 경피증, 궤양성 대장염, sjogren 증후군, 제1형 당뇨병, 포도막염, Graves병, 알츠하이머병, 건선, 백반증 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
다른 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 항-NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체와 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체가 면역 세포에서 공동 발현될 때, 치료될 수 있는 질병은 키메라 항원 수용체가 표적화하는 종양 항원에 의존한다. 예를 들어, 본 발명의 항-NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체와 CD19를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체가 공동 발현되거나 투여될 때, 치료될 수 있는 질병은 CD19 발현과 관련된 질병, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 만성 B 림프구성 백혈병(B-CLL), B-세포 호지킨 림프종(B-HL) 및 비호지킨 림프종(B-NHL)을 포함한 B 세포 악성 종양이다. 해당 실시방식에 있어서, 항-NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체는 재주입된 조작된 면역 세포에 대한 NK 세포의 살상을 억제하는 데 사용되며, 키메라 항원 수용체는 종양 항원에 결합함으로써 표적 세포의 살상을 지시하는 데 사용된다.
이하 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 당업자는 본 발명의 도면 및 실시예가 단지 예시를 위한 것이며 본 발명을 제한하지 않음을 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 모순되지 않는 경우, 본원의 실시예와 실시예의 특징은 서로 조합될 수 있다.
도 1은 hZ199 및 이의 복귀 돌연변이 항체 hZ199-V1 및 hZ199-V2의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 서열 비교 결과이다. 회색으로 강조한 것은 복귀 돌연변이의 아미노산 부위이며, 숫자는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역에서 해당 돌연변이 부위의 위치를 나타낸다.
도 2는 NKG2A 항체를 함유하는 UNKi-T 세포의 scFv 발현 수준을 나타낸다.
도 3은 NK 세포 살상 작용에 대한 NKG2A 항체를 함유하는 UNKi-T 세포의 억제 효과를 나타낸다. Two-way ANOVA를 이용하여 분석하였으며, T test를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. **는 P 값이 0.01 미만으로 유의한 수준에 도달했음을 나타낸다.
실시예 1. NKG2A 항체의 제조
항체의 친화력과 특이성을 높이기 위해, 인간화 Z199 항체(hZ199)를 기반으로 복귀 돌연변이를 통한 방식으로 새로운 NKG2A 항체를 제작하였다. hZ199는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3, SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR-H3을 포함하며, 이의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시되고, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시되며, 전장 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다. 복귀 돌연변이의 방법은 당업계에 공지된 것이다. 예를 들어: hZ199 서열 중 일부 항체 친화력에 영향을 미칠 수 있는 아미노산(주로 프레임워크 영역)에 대해 복귀 돌연변이의 프라이머를 설계하고, 경쇄 가변 영역에 5개 돌연변이 지점을 설계하고, 중쇄 가변 영역에 4개 돌연변이 지점을 설계하여, 최종 조합하여 2개의 복귀 돌연변이의 항체를 수득하였다. 이는 hZ199-V1과 hZ199-V2로 명명하였으며, 이의 서열은 하기 표 1과 같다.
표 1. hZ199 및 이의 복귀 돌연변이 항체의 서열
실시예 2. NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 UNKi-T 세포의 제조 및 이의 기능 검증
B2m 신호 펩티드(SEQ ID NO: 29), hZ199(SEQ ID NO: 9) 또는 hZ199-V1(SEQ ID NO: 12), CD28 힌지 영역(SEQ ID NO: 35), CD8α 막횡단 영역(SEQ ID NO: 17), CD28 보조자극 도메인(SEQ ID NO: 21) 단백질을 암호화하는 서열을 합성하고, 이를 pLVX 벡터(Public Protein/Plasmid Library(PPL), Cat. No.: PPL00157-4a)에 클로닝하여, hZ199 플라스미드 및 hZ199-V1 플라스미드를 획득하였으며, 시퀀싱을 통해 플라스미드에서 표적 서열의 올바른 삽입을 확인하였다.
CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 31), hZ199-V2(SEQ ID NO: 14), IgG4 힌지 영역(SEQ ID NO: 37), CD828 막횡단 영역(SEQ ID NO: 19), 4-1BB 보조자극 도메인(SEQ ID NO: 23) 단백질을 암호화하는 서열을 합성하고, 이를 pLVX 벡터(Public Protein/Plasmid Library(PPL), Cat. No.: PPL00157-4a)에 클로닝하여, hZ199-V2 플라스미드를 획득하였으며, 시퀀싱을 통해 플라스미드에서 표적 서열의 올바른 삽입을 확인하였다.
멸균 튜브에 3ml Opti-MEM(Gibco, Cat. No. 31985-070)을 첨가하여 상기 플라스미드를 희석한 다음, 플라스미드:바이러스 패키징 벡터: 바이러스 엔벨로프 벡터=4:2:1의 비율에 따라 psPAX2(Addgene, Cat. No. 12260) 및 엔벨로프 벡터 pMD2.G(Addgene, Cat. No. 12259)를 첨가한다. 그 후, 120ul X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, Cat. No. 06366236001)을 추가하고 즉시 혼합하며 실온에서 15분 동안 배양한 후, 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 293T 세포의 배양 플라스크에 점적한다. 24시간 및 48시간에 바이러스를 수집하고 이를 합친 후, 초속 원심분리(25000g, 4℃, 2.5시간)로 농축된 렌티바이러스를 수득하였다.
DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco, Cat. No. 40203D)로 T 세포를 활성화하고 37℃ 및 5% CO2 하에서 1일 동안 배양하였다. 그 후, 농축된 렌티바이러스를 첨가하고 3일 동안 계속 배양한 후, NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 T 세포를 수득하였다.
그런 다음 CRISPR/Cas9 시스템을 채택하여 야생형 T 세포(즉 NT 세포)와 상기 NKG2A 항체를 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 T 세포 중의 TCR/CD3 성분(구체적으로 TRAC 유전자) 및 MHC 관련 유전자(구체적으로 B2M 및 RFX5)를 녹아웃하여, Mock T 세포, UNKi-hZ99-T 세포(hZ199 플라스미드 함유), UNKi-V1- T 세포(hZ199-V1 플라스미드 함유) 및 UNKi-V2-T 세포(hZ199-V2 플라스미드 함유)를 각각 수득하였다. FITC Mouse Anti-Human CD3(BD Pharmingen, Cat. No. 555916) 항체, PE mouse anti-human HLA-I(R&D Cat. No. FAB7098P) 및 APC anti-human DR, DP, DQ(biolegend, Cat. No. 361714) 항체를 사용하여, 유세포 분석기를 통해 UNKi-T 세포, Mock T 세포 및 NT 세포에서 CD3/HLA-I/HLA-II의 발현 효율을 검출하였고, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
표 2. UNKi-T 세포에서의 유전자 발현 효율
표 2에서 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T 세포 및 Mock T 세포에서 CD3/HLA-I/HLA-II의 발현이 효과적으로 억제 또는 침묵됨을 알 수 있다.
Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, F(ab')fragment specific antibody(Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-065-097) 및 APC Streptavidin(BD, Cat. No. 554067)을 사용하여 UNKi-T 세포 및 Mock T 세포에서 anti-NKG2A scFv 발현을 검출하였다(도 2).
본 발명에서 제조한 UNKi-T 세포 중의 scFv는 모두 효과적으로 발현됨을 알 수 있다.
하기 방법에 따라 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T 세포의 NK 세포 사멸 작용에 대한 억제 효과를 검출하였다. 본 발명에서 제조한 UNKi-T 세포 및 Mock-T 세포를 Far-Red(invitrogen, Cat. No. C34564)로 표지하였다. 그런 다음 표지된 UNKi-T 세포와 Mock T 세포를 1x104 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 도말하고, 효과 표적비 2:1로 NK92 세포를 첨가하여 공동 배양하였다. 16 내지 18시간 후, 유세포 분석기로 배양물 중 T 세포의 비율을 측정하고, T 세포에 대한 NK 세포의 살상률을 계산하였으며, 그 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
도 3에서 알 수 있듯이, 키메라 수용체를 발현하지 않는 NT 세포에 비해, 본 발명의 UNKi-T 세포는 T 세포에 대한 NK 세포의 살상 작용을 현저히 감소시킬 수 있다. 또한, hZ199 항체와 비교하여, 본 발명의 항체(즉, 복귀 돌연변이 hZ199-V1 및 hZ199-V2 항체)는 NK 세포 살상 작용에 대한 억제 효과가 더욱 우수하여, 본 발명의 항체의 친화력이 hZ199 항체보다 큰 것으로 나타났다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명을 한정하려는 것이 아님을 유의해야 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명은 다양한 수정 및 변경이 가능하다. 당업자는 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 등가 대체, 개선 등이 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다는 것을 이해한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bioheng Therapeutics Limited <120> NKG2A-targeting antibody and use thereof <130> BHPCT19 <150> CN2020113205575 <151> 2020-11-23 <150> PCT/CN2021/131435 <151> 2021-11-18 <160> 38 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 1 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Tyr Ile Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 2 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 3 Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 5 Ser Ser Gly Gly Ser Tyr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 6 His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile 165 170 175 Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg His 210 215 220 Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hZ199-V2 VL <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 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ttcactctca ctatttcaag cctcgaacca 240 gaggacttcg ctacttacta ttgtcagcaa tggagtggga acccgtacac gttcggacaa 300 ggaactaagc tcgagattaa aggtagtacc agcggatctg ggaagcctgg tagtggagag 360 ggcagcacaa agggtgaggt gcagttggta gaatcaggtg ggggactcgt gaaacccggc 420 ggatcattga ggctcagttg cgccgcatct ggattcacgt ttagttccta cgccatgtca 480 tgggtcaggc aagcccctgg aaaaggcctt gagtgggttg ctgaaatttc cagcgggggt 540 agctacactt actacccgga tagcgttaaa ggcagattca ctattagtag ggataacgcc 600 aagaacagtc tttacctcca gatgaattcc cttagggctg aagatacagc ggtctactac 660 tgtacaaggc acggggacta tccccgcttc ttcgatgtat ggggacaagg cacgcttgtg 720 acagtgagca gc 732 <210> 16 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hZ199-V2 <400> 16 gaaatagtct tgacccagtc tcccgctacc ctcagtcttt cacccggtga acgcgctacg 60 atgacgtgtt cagcatccag ctctgtgtct tcctacattt attggtacca gcagaaacca 120 ggccaagcgc cgcgcctcct catttacctt acttcaaacc ttgcatccgg tattcccgcg 180 agattcagcg gtagtggttc tggaacggat tttacactta cgattagttc acttgaaccc 240 gaagatttcg ccacgtatta 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<213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 19 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 20 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 20 ttttgggtcc tcgtcgtagt tggaggggta cttgcctgtt atagcctcct ggttaccgta 60 gcatttatta tattctgggt g 81 <210> 21 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 costimulatory domain <400> 21 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 22 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 costimulatory domain <400> 22 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 23 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB costimulatory domain <400> 23 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 1 5 10 15 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 20 25 30 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 35 40 <210> 24 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB costimulatory domain <400> 24 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120 <210> 25 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB costimulatory domain <400> 25 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 26 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 26 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 27 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Phe Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 50 55 60 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 65 70 75 80 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser 85 90 95 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 100 105 110 Pro Arg <210> 28 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta signaling domain <400> 28 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctttaacg agctcaatct aggacgaaga gaggagttcg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg 180 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 240 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc cttttccagg gtctcagtac agccaccaag 300 gacacctttg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 342 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M signal peptide <400> 29 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M signal peptide <400> 30 atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha signal peptide <400> 31 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 32 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha signal peptide <400> 32 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 33 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha hinge region <400> 33 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 34 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha hinge region <400> 34 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 35 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 hinge region <400> 35 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 35 <210> 36 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 hinge region <400> 36 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge region <400> 37 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge region <400> 38 gaaagcaaat acgggccgcc gtgtccaccc tgtccg 36

Claims (24)

  1. 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 NKG2A를 표적으로 하는 항체에 있어서,
    여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR-L1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR-L2, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR-L3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR-H1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR-H2, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR-H3을 포함하고, 여기에서 상기 경쇄 가변 영역의 21번째 아미노산은 M이고, 85번째 아미노산은 T이고, 상기 중쇄 가변 영역의 34번째 아미노산은 M이고, 49번째 아미노산은 A이고, 61번째 아미노산은 P이고, 97번째 아미노산은 T인 것을 특징으로 하는 NKG2A를 표적으로 하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    여기에서 상기 경쇄 가변 영역의 22번째 아미노산은 S 또는 T이고, 58번째 아미노산은 I 또는 V이고, 104번째 아미노산은 L 또는 V인 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    여기에서 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 및 13로부터 선택되어 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 10 및 13과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 보존적 변형을 가지며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, SEQ ID NO: 11과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 보존적 변형을 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기에서 상기 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 10 및 13으로부터 선택되고, 상기 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 11으로 표시되는 것을 특징으로 하는 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12 및 14로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 핵산 분자에 있어서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  7. 다중특이성 항체에 있어서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 다른 항원과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 포함되는 것을 특징으로 하는 다중특이성 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    여기에서 상기 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 sdAb로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다중특이성 항체.
  9. 벡터에 있어서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 숙주 세포에 있어서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  11. 키메라 수용체에 있어서,
    하나 이상의 NK 억제 리간드, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고, 여기에서 상기 NK 억제 리간드는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체를 포함하고, 상기 신호전달 도메인은 하나 이상의 보조자극 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 수용체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 두 가지의 NK 억제 리간드를 포함하고, 여기에서 제1 NK 억제 리간드는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체를 포함하고, 제2 NK 억제 리간드는 (1) 하기 NK 억제 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편: NKG2A NKG2B, CD94, LIR1, LIR2 ,LIR3, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1, CEACAM1, LAIR1 및 KLRG1; 또는 (2) HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCIL, 시알산, PD-L1, PD-L2, CD155, CD112, CD113, Gal-9, FGL1, 및 이들이 함유하는 NK 억제 수용체 결합 도메인으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 수용체.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    여기에서 상기 신호전달 도메인은 하나 이상의 보조자극 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 하는 키메라 수용체.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    여기에서 상기 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 수용체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인이 CD28 또는 4-1BB 세포내 영역으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 수용체.
  16. 조작된 면역 세포에 있어서,
    제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 키메라 수용체를 발현하고, 여기에서 적어도 하나의 MHC-관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    여기에서 상기 MHC-관련 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    여기에서 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함하며, 상기 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기에서 상기 조작된 면역 세포는 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 더 발현하는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  20. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    이는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 수지상 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  21. 항체 접합체에 있어서,
    여기에는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체 및 제2 기능성 구조가 포함되고, 여기에서 상기 제2 기능성 구조는 Fc, 방사성 동위원소 및 반감기를 연장하는 구조 부분, 검출 가능한 마커 및 약물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 접합체.
  22. 검출 키트에 있어서,
    여기에는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체, 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 키메라 수용체 또는 제21항에 따른 항체 접합체가 포함되는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  23. 약학 조성물에 있어서,
    여기에는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제7항 또는 제8항 에 따른 다중특이성 항체, 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 키메라 수용체, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포 또는 제21항에 따른 항체 접합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. NKG2A 발현 관련 질병의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단용 약물 제조에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제7항 또는 제8항에 따른 다중특이성 항체, 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 키메라 수용체, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포 또는 제21항에 따른 항체 접합체 또는 제23항에 따른 약학 조성물의 용도.
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