JP2023550172A - Ｎｋｇ２ａを標的にする抗体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【要約】本発明は、ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体、及びそれを含む多重特異性抗体、キメラ受容体、抗体複合体、医薬組成物及びキット、並びにＮＫＧ２Ａ発現に関連する疾患の予防・治療・診断におけるそれらの使用を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は免疫治療分野に属する。より具体的に、本発明は、ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体、及び疾患の予防・治療・診断におけるその使用に関する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、体内で非常に重要な種類のリンパ球であり、自然免疫と獲得免疫でいずれも重要な作用を果たす。ＮＫ細胞表面には２種類の表面受容体があり、その機能に応じて阻害型と活性化型に分けられ、それぞれＮＫ細胞の異なる認識モードを仲介し、異なる活性化シグナル及び阻害性シグナルを伝達する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーは、多く研究されている１種類の受容体ファミリーであり、主にＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ等のメンバーを含む。そのうち、ＮＫＧ２Ａは、阻害性受容体に属し、そのリガンドが非古典的な主要組織適合性複合体クラスＩ分子ＨＬＡ－Ｅである。標的細胞で発現されるＨＬＡ－Ｅ分子は、ＮＫＧ２Ａに結合された後、ＮＫ細胞への殺傷機能は抑制作用を有するようになる。従って、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体は、腫瘍特異的リンパ球による腫瘍細胞への殺傷活性を向上させる可能性がある。
複数種類の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、当分野で説明された。例えば、Ｓｉｖｏｒｉ等（ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９６；２６：２４８７－９２）にはマウス抗－ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０が言及され、Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ等（ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９７；２７：５６３－７）にはマウス抗－ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９（現在、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．から市販され取得されるもの，商品番号ＩＭ２７５０，ＵＳＡ）が説明され、Ｖａｎｃｅ等（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９；１９０：１８０１－１２）にはネズミ抗－マウスＮＫＧ２－抗体２０Ｄ５（現在、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから市販され取得されるもの，カタログ番号．５５０５１８，ＵＳＡ）が言及され、アメリカ専利出願開示２００３００９５９６５にはマウス抗体３Ｓ９が説明され、それがＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅに結合されると言われている。
本発明は、ＮＫＧ２Ａを標的にする新型抗体、疾患の予防・治療・診断におけるその使用を提供することを目的とする。
第１態様で、本発明は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１で示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２で示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号３で示されるＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４で示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５で示されるＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６で示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域は、２１番目のアミノ酸がＭ、８５番目のアミノ酸がＴであり、前記重鎖可変領域は、３４番目のアミノ酸がＭ、４９番目のアミノ酸がＡ、６１番目のアミノ酸がＰ、９７番目のアミノ酸がＴであるＮＫＧ２Ａを標的にする抗体を提供する。
一実施形態において、前記軽鎖可変領域は、２２番目のアミノ酸がＳ又はＴ、５８番目のアミノ酸がＩ又はＶ、１０４番目のアミノ酸がＬ又はＶである。
好ましい一実施形態において、前記ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１０及び１３から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、配列番号１０及び１３に比べて１つ又はいくつか（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個）のアミノ酸の保守的な修飾を有し、前記重鎖可変領域は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或は、配列番号１１に比べて１つ又はいくつか（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個）のアミノ酸の保守的な修飾を有する。より好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号１０及び１３から選択されるもので示される軽鎖可変領域と、配列番号１１で示される重鎖可変領域とを含む。
一実施形態において、前記ＮＫＧ２Ａ抗体のアミノ酸配列は、配列番号１２及び１４から選択される。
本発明は、上記ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸分子をさらに提供する。故に、一実施形態において、前記ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸分子は、配列番号１６～１７から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有し、そのコードしたＮＫＧ２Ａ抗体が、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合可能である。好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸分子は、配列番号１６～１７から選択される。
他の一態様において、本発明は、上記したＮＫＧ２Ａ抗体、他の抗原に特異的に結合される１つ又は複数の第２抗体又はその抗原結合部分を含む多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体又は三重特異性抗体）をさらに提供する。
一実施形態において、第２抗体又はその抗原結合部分は、例えば全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、マイクロ抗体、二重抗体又はｓｄＡｂのような任意抗体又は抗体断片形式を有しても良い。
本発明は、上記ＮＫＧ２Ａ抗体又は多重特異性抗体をコードする核酸分子のベクター、及び前記ＮＫＧ２Ａ抗体又は多重特異性抗体を発現する宿主細胞をさらに提供する。
他の一態様で、本発明は、１つ又は複数種類のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドが上記したＮＫＧ２Ａ抗体、又は前記ＮＫＧ２Ａ抗体を含有する多重特異性抗体を含み、前記シグナル伝達ドメインが１つ又は複数の共刺激ドメインを含むキメラ受容体をさらに提供する。
一実施形態において、前記キメラ受容体は、２種類のＮＫ阻害性リガンドを含み、そのうち、第１ＮＫ阻害性リガンドは、上記したＮＫＧ２Ａ抗体であり、第２ＮＫ阻害性リガンドは、（１）ＬＩＲ１、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１などのＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片、又は（２）ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、及びそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される。
一実施形態において、本発明のキメラ受容体における前記シグナル伝達ドメインは、１つ又は複数の共刺激ドメインから構成される。即ち、例えば、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインのような一次シグナル伝達ドメインが含まれない。
他の一実施形態において、本発明のキメラ受容体のシグナル伝達ドメインは、例えばＣＤ３ζ細胞内領域のような一次シグナル伝達ドメインを含んでもよい。
本発明は、上記定義されたＮＫＧ２Ａを標的にするキメラ受容体をコードする核酸分子、及び前記核酸分子を含むベクターを更に提供する。
本発明は、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体を発現し、そのうちの少なくとも１種類のＭＨＣ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングする改変免疫細胞を更に提供する。
一実施形態において、前記ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される。
一実施形態において、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体を発現する前記改変免疫細胞は、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子をさらに含み、その発現が抑制され又はサイレンシングし、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の実例は、例えばＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζを含む。
一実施形態において、本発明で提供される改変免疫細胞は、腫瘍抗原を標的にするキメラ抗原受容体をさらに発現する。
一実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞から選択される。
他の一態様において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体及び第２機能的構造を含む抗体複合体であって、前記第２機能的構造が、Ｆｃ、放射性同位体、半減期を延長する構造部分、検出可能なマーカー及び薬剤から選択される抗体複合体をさらに提供する。
一実施形態において、前記半減期を延長する構造部分は、アルブミンの結合構造、トランスフェリンの結合構造、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンに結合されるホワイトポリペプチド（抗体を含む）から選択される。一実施形態において、検出可能なマーカーは、フルオロフォア、化学発光化合物、生物発光化合物、酵素、抗生物質耐性遺伝子及び造影剤から選択される。一実施形態において、前記薬剤は、細胞毒素及び免疫調節剤から選択される。
他の一態様において、本発明は、本発明に記載の抗体、多重特異性抗体、抗体複合体又はキメラ受容体を含む検出キットを更に提供する。
他の一態様において、本発明は、本発明に記載の抗体、キメラ受容体、多重特異性抗体、改変免疫細胞又は抗体複合体、及び１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
他の一態様において、本発明は、被験者に上記した抗体、キメラ受容体、多重特異性抗体、抗体複合体、改変免疫細胞又は医薬組成物を投与することを含む、ＮＫＧ２Ａ発現に関連する疾患の治療・予防・診断の方法をさらに提供する。
発明の内容
別段の指定がない限り、本明細書で使用されるすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
ＮＫＧ２Ａ抗体
本発明のコンテキストで、「Ｚ１９９抗体」は、Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ等（ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；２７：５６３－７）に記載のマウス抗－ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９であり、現在、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．から市販され取得され、商品番号がＩＭ２７５０である。「ｈＺ１９９抗体」とは、ヒト化Ｚ１９９抗体であり、配列番号７で示される軽鎖可変領域と、配列番号８で示される重鎖可変領域とを含み、全長アミノ酸配列が配列番号９で示される。
本発明で提供される新しいＮＫＧ２Ａ抗体は、ｈＺ１９９を基に復帰突然変異が行われて取得されたものであり、より高い親和性及びＮＫ細胞殺傷のよりよい抑制効果を提供する。
本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、当業者が理解する最も広い意味を有し、且つモノクローナル抗体（インタクト抗体が含まれる）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示すことができる１つまたは複数のＣＤＲ配列を持つ抗体断片または合成ポリペプチドを含む。本発明の前記抗体は、任意種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等）であってもよい。
通常、インタクト抗体は、ジスルフィド結合により結合された２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、各軽鎖は、ジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に結合され、「Ｙ」字形構造を呈する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３等の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３等の３つの定数ドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含み、ここで、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３等の３つのＣＤＲを含み、軽鎖定常領域は１つの定数ドメインＣＬを含む。重鎖／軽鎖可変領域において、ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される。重鎖／軽鎖の可変領域は、抗原との識別及び結合を担当し、定常領域は、抗体と宿主組織又は因子との結合を仲介することができ、免疫システムの各種細胞（例えばエフェクター細胞）と古典的な補体システムの第１成分を含む。
当分野で周知の多数の番号付けスキームを使用して所与のＣＤＲ又はＦＲの精確なアミノ酸配列境界を容易に特定することができ、これらの番号付けスキームとして、Ｋａｂａｔ等（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」第５版Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ベセスダ，メリーランド州（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）と、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ等，（１９９７）ＪＭＢ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）と、ＭａｃＣａｌｌｕｍ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５”（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）と、ＬｅｆｒａｎｃＭＰ等，「ＩＭＧ Ｔｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄＩｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，」ＤｅｖＣｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３年１月；２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）と、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，「Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，」ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１年６月８日、３０９（３）：６５７－７０（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）と、Ｍａｒｔｉｎ等，「Ｍｏｄｅｌｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」ＰＮＡＳ，１９８９，８６（２３）：９２６８－９２７２（「ＡｂＭ」番号付けスキーム）とを含む。
所定のＣＤＲ又はＦＲの境界は、鑑定用のプロトコルによって異なる可能性がある。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造比較に基づくものである一方、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づくものである。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームの番号は、最も一般的な抗体領域の配列長さに基づくものであり、ある插入及び欠失（「挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）」）を異なる箇所に置くことによって、異なる番号が生成される。Ｃｏｎｔａｃｔスキームでは、複雑な結晶構造に対する分析に基づくものであり、且つ多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと類似する。ＡｂＭスキームは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義間の妥協案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づいて使用されるスキームである。
故に、特に規定がない限り、所定の抗体又はその領域（例えばその可変領域）の「ＣＤＲ」は、任意の上記スキール又は他の既知スキールによって定義されたＣＤＲをカバーすることを理解すべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）が所定のアミノ酸配列を含むように指定する場合に、このようなＣＤＲは、任意の上記スキール又は他の既知スキールによって定義された対応のＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）の配列を有してもよいと理解すべきである。同様に、特に規定がない限り、所定の抗体又はその領域（例えばその可変領域）のＦＲは、任意の上記スキール又は他の既知スキールによって定義されたＦＲをカバーすることを理解すべきである。特に明示がない限り、本明細書におけるアミノ酸の番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａスキームが採用される。
本明細書で使用されるように、「抗体断片」又は「抗原結合部分」という用語は、インタクト抗体の一部のみを含み、一般的にインタクト抗体の抗原結合部位を含み、これによって抗原に結合される能力を保留する。本発明における抗体断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｄ′、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合によるＦｖ（ｓｄＦｖ）、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、線形抗体、２つの抗原結合部位を有する「ダブルボディ」、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、前記抗原の天然リガンド又はその機能的断片等を含むが、それらに限定されない。故に、本発明の「抗体」は、上記定義された抗体断片をカバーする。
「シングルチェーン抗体」と「ｓｃＦｖ」は本明細書で交互に使用可能で、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーにより結合された抗体である。リンカーの最適長さ及び／又はアミノ酸組成を選択することができる。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折り畳み及び相互作用の状況に明らかに影響をもたらす。実際に、短いリンカー（例えば５～１０個のアミノ酸にある）を使用すると、鎖内折り畳みを防止することができる。リンカーの大きさ及び組成の選択について、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、アメリカ専利出願公報番号２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、及びＰＣＴ公報番号ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照し、その全文が引用されて本明細書に合併する。ｓｃＦｖは、例えばＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのような、任意の順序で連結されるＶＨ及びＶＬを含んでもよい。
第１態様で、本発明は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１で示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２で示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号３で示されるＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４で示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５で示されるＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６で示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域は、２１番目のアミノ酸がＭ、８５番目のアミノ酸がＴであり、前記重鎖可変領域は、３４番目のアミノ酸がＭ、４９番目のアミノ酸がＡ、６１番目のアミノ酸がＰ、９７番目のアミノ酸がＴである、ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体を提供する。
一実施形態において、前記軽鎖可変領域は、２２番目のアミノ酸がＳ又はＴ、５８番目のアミノ酸がＩ又はＶ、１０４番目のアミノ酸がＬ又はＶである。
好ましい一実施形態において、前記ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１０及び１３から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、配列番号１０及び１３に比べて１つ又はいくつか（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個）のアミノ酸の保守的な修飾を有し、前記重鎖可変領域は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或は、配列番号１１に比べて１つ又はいくつか（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個）のアミノ酸の保守的な修飾を有する。より好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号１０及び１３から選択されるもので示される軽鎖可変領域と、配列番号１１で示される重鎖可変領域とを含む。
一実施形態において、前記ＮＫＧ２Ａ抗体のアミノ酸配列は、配列番号１２及び１４から選択される。
本明細書で使用されるように、「配列同一性」という用語は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列が比較において同一位置で同じ残基を有する度合を表し、且つ一般的にパーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全体長さで決められる。従って、完全に同じ配列を有する２つのコピーは、１００％の同一性を有する。当業者は、いくつかのアルゴリズム、例えばＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ等（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列同一性を特定することができると認識している。
本明細書で使用されるように、「保守的な修飾」という用語とは、当該アミノ酸配列を含有する抗体又は抗体断片の結合特徴を明らかに影響又は変更しないアミノ酸修飾を指す。これらの保守的な修飾はアミノ酸の置換、添加及び欠失を含む。修飾は、当分野での既知の標準技術、例えば部位特異的変異導入及びＰＣＲ仲介の変異導入により、本発明のキメラ抗原受容体に導入される。アミノ酸の保守的な置換は、アミノ酸残基は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換えられることである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当分野で定義され、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、ホルマジンチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。保守的な修飾は、例えば極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は係る残基の両親媒性の類似性に応じて選択されてもよい。
一態様において、本発明は、上記したＮＫＧ２Ａ抗体を含み、他の抗原に特異的に結合される１つまたは複数の第２抗体をさらに含む多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体又は三重特異性抗体）をさらに提供する。
本明細書で使用されるように、「多重特異性」という用語とは、抗原結合タンパク質がポリトープ特異性を有するという意味である（即ち、１つの生体分子における２つ、３つ又はそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合可能で、又は２つ、３つ又はそれ以上の異なる生体分子におけるエピトープに特異的に結合可能である）。本明細書で使用されるように、「二重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質が２種類の異なる抗原結合特異性を有すると表す。
一実施形態において、第２抗体は、例えば全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、マイクロ抗体、二重抗体又はｓｄＡｂのような任意抗体又は抗体断片形式を有してもよい。
核酸、ベクター、宿主細胞
他の一態様において、本発明は、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体又は多重特異性抗体をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は基本的に離れる核酸である。
一実施形態において、前記ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸分子は、配列番号１６～１７から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有し、そのコードしたＮＫＧ２Ａ抗体が、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合可能である。好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａ抗体をコードする核酸分子は、配列番号１６～１７で示される。
本発明の核酸は、ベクター形式で呈されてもよいし、ベクター中に存在し、かつ／又はベクターの一部としてもよいし、このベクターは、例えばプラスミド、粘着末端プラスミド又はＹＡＣである。ベクターは、特に発現ベクターであり、即ちインビトロ及び／又はインビボ（即ち適当な宿主細胞、宿主有機体及び／又は発現システム）でＮＫＧ２Ａ抗体が発現されるベクターである。この発現ベクターは、通常、少なくとも一種類の本発明の核酸分子を含み、１つ又は複数の適当な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）に作動可能に連結される。特定宿主で発現するように、前記制御エレメント及びその配列を選択するのは、当業者にとってよく知っている。本発明のＮＫＧ２Ａ抗体の発現に有用し、又は必要な制御エレメント及びその他のエレメントについての具体的な実例は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、インテグレータ、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない。
他の一態様において、本発明は、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体、多重特異性抗体を発現し、かつ／又は本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本発明の好ましい宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞である。
適当な細菌細胞は、グラム陰性菌株（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）菌株、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株）、グラム陽性細菌株（例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）菌株及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌株）の細胞を含む。
適当な真菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種の細胞を含み、或いは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えばピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピキアメタノロフィラス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））及びハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種の細胞を含む。
適当な哺乳動物細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞等を含む。
しかしながら、本発明は、両生類細胞、虫細胞、植物細胞及び当分野での異種タンパク質を発現するための任意の他の細胞を用いてもよい。
キメラ受容体
他の一態様で、本発明は、上記したＮＫＧ２Ａ抗体を含むキメラ受容体をさらに提供する。ＮＫＧ２Ａは、ＮＫ阻害性受容体であるため、ＮＫＧ２Ａ抗体を含むキメラ受容体はＮＫ細胞の殺傷作用の抑制に用いることができる。
一実施形態において、本発明は、１つ又は複数種類のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドが上記したＮＫＧ２Ａ抗体、又は前記ＮＫＧ２Ａ抗体を含有する多重特異性抗体を含み、前記シグナル伝達ドメインが１つ又は複数の共刺激ドメインを含むキメラ受容体を提供する。
一実施形態において、前記キメラ受容体は、複数種類のＮＫ阻害性リガンドを含み、例えば２種類のＮＫ阻害性リガンドであって、そのうち、第１ＮＫ阻害性リガンドは、上記したＮＫＧ２Ａ抗体であり、第２ＮＫ阻害性リガンドは、他のＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片、かつ／或いは、他のＮＫ阻害性受容体の天然リガンド又はそれに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域である。
一実施形態において、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分（例えばＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４）と、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー（例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ３）と、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー（例えばＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５及びＬＩＲ８）と、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー（例えばＮＫＲ－Ｐ１Ｂ及びＮＫＲ－Ｐ１Ｄ）と、免疫チェックポイント受容体（例えばＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）と、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）と、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー（例えばＳＩＧＬＥＣ７及びＳＩＧＬＥＣ９）と、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）と、Ｌｙ４９ファミリーメンバー（例えばＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１及びＬｙ４９Ｇ４）と、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）から選択されるＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片である。より好ましくは、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１和ＫＬＲＧ１などのＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片から選択される。さらに、より好ましくは、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、ＣＤ９４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＩＲ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１などのＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片から選択される。
一実施形態において、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、他のＮＫ阻害性受容体の天然リガンド又はそれに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域であり、例えばＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、免疫チェックポイントリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１等）、及びそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域である。好ましくは、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、又はそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン細胞外領域、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域及びＰＤ－Ｌ２細胞外領域から選択される。より好ましくは、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリン細胞外領域であり、ＥＣ１及びＥＣ２を含み、より好ましくはＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５を含む。
本明細書で使用されるように、「膜貫通ドメイン」という用語とは、キメラ受容体を免疫細胞（例えばリンパ球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞）表面で発現させ、且つ免疫細胞の標的細胞に対する細胞応答をガイドするポリペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然又は合成のものであってもよいし、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。キメラ受容体と標的抗原とが結合される場合に、膜貫通ドメインはシグナル伝達を行うことができる。特に本発明における膜貫通ドメインに適用され、例えばＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びその機能性断片に由来してもよい。或いは、膜貫通ドメインは合成したものであってもよく、且つ主に疎水性残基、例えばロイシンとバリンを含んでもよい。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖又はＣＤ２８に由来し、配列番号１７又は１９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号１８又は２０で示される核酸分子に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。
本明細書で使用されるように、「共刺激ドメイン」という用語とは、共刺激分子からの細胞内機能的シグナル伝達ドメインという意味で、前記共刺激分子の全体細胞内部分、又はその機能断片を含む。「共刺激分子」とは、Ｔ細胞において共刺激リガンドに特異的に結合されることによって、Ｔ細胞の共刺激反応（例えば増殖）を仲介する同源結合配偶体を指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、それらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ及びＺＡＰ７０等のタンパク質に由来する細胞内領域を含むが、それらに限定されない。好ましくは、本発明ＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ＋ＣＤ２８に由来する。一実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号２４で示される核酸分子に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。一実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号２２で示される核酸分子に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、１つ又は複数の共刺激ドメインから構成される（即ち、例えば来自ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインのような一次シグナル伝達ドメインが含まれない）。他の一実施形態において、本発明のキメラ受容体のシグナル伝達ドメインは、例えばＣＤ３ζ細胞内領域のような一次シグナル伝達ドメインを含んでもよい。好ましい実施形態において、前記ＣＤ３ζ細胞内領域は、配列番号２５又は２７で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号２６又は２８で示される核酸分子に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明のキメラ受容体は、抗体と膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域を含んでもよい。本明細書で使用されるように、「ヒンジ領域」という用語は、一般的に膜貫通ドメインを抗体に連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、抗体へより大きい柔軟性とアクセス性を提供するためのものである。ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含んでもよい。ヒンジ領域は、全部又は一部が天然分子に由来し、例えば全部又は一部がＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域に由来し、又は全部又は一部が抗体定常領域に由来してもよい。或いは、ヒンジ領域は、自然に発生するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、又は完全に合成したヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含み、より好ましくはＣＤ８α、ＣＤ２８又はＩｇＧ４のヒンジであり、配列番号３３、３５又は３７で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、或いは、そのコード配列が配列番号３４、３６又は３８で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明のＣＲは、細胞、例えばＴ細胞で発現される場合に、新生タンパク質が小胞体まで導入されてから細胞表面まで導入されるように、シグナルペプチドを含んでもよい。シグナルペプチドのコアは、長い疎水性アミノ酸セグメントを含んでもよく、単一のα－螺旋を形成する傾向がある。シグナルペプチドの末端には、一般的にシグナルペプチダーゼによって認識、カットされたアミノ酸セグメントがある。シグナルペプチダーゼは、移行中又は完成後にカットされ、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質が生成する。その後、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼに消化される。本発明に適用可能なシグナルペプチドは、当業者によって周知されるものであり、例えばＢ２Ｍ、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲα等から派生されるシグナルペプチドである。一実施形態において、本発明に適用可能なシグナルペプチドは、Ｂ２Ｍ又はＣＤ８αに由来し、配列番号２９又は３１で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号３０又は３２で示される核酸分子に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、前記ＣＲは、本明細書で提供されるＮＫＧ２Ａ抗体、又は前記ＮＫＧ２Ａ抗体を含有する多重特異性抗体、ＣＤ８α膜貫通領域及びシグナル伝達ドメインを含み、前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択される共刺激ドメインを含む。好ましくは、前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択される共刺激ドメインから構成される。他の一実施形態において、前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内領域をさらに含む。この実施形態において、前記ＣＡＲは、Ｂ２Ｍ、ＣＤ８α、ＩｇＧ１又はＧＭ－ＣＳＦＲαに由来するシグナルペプチドをさらに含んでもよい。
本発明は、上記定義されたＮＫＧ２Ａを標的にするキメラ受容体をコードする核酸分子、及び前記核酸分子を含むベクターを更に提供する。
本明細書で使用されるように、「ベクター」という用語は、（外因性）の遺伝子材料を宿主細胞に転移するためのメディエーター核酸分子であり、この宿主細胞において前記核酸分子は、例えばコピーされ、且つ／又は発現されてもよい。ベクターは一般的にターゲティングベクターと発現ベクターを含む。「ターゲティングベクター」は、例えば同源リコンビナントにより又は特異的標的部位での配列のハイブリッドリコンビナーゼを用いて分離した核酸を細胞内部まで送達する媒体である。「発現ベクター」は、異種核酸配列（例えば、本発明のキメラ受容体ペプチドをコードするそれらの配列）の適合な宿主細胞での転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に用いられるベクターである。本発明に適用できる適当なベクターは当分野で既知されるものであり、たくさん購買され取得されることができる。一実施形態において、本発明のベクターは、プラスミド、ウィルス（例えばレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ、ポリオーマウィルス及びアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）等）、ファージ、ファージミド、コスミド及び人工染色体（ＢＡＣとＹＡＣを含む）を含むが、それらに限定されない。ベクター自身は一般的に核酸分子であり、一般的に挿入物（遺伝子導入）を含むＤＮＡ配列と、ベクターの「スケルトン」である大きい配列である。改変ベクターには、一般的に宿主細胞での自己複製の起源（ポリヌクレオチドの安定的発現の必要があれば）、選択マーカー及び制限酵素切断部位（例えばマルチクローニングサイト，ＭＣＳ）も含む。ベクターは、プロモーター、ポリＡテール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペレーター、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグ等のエレメントをさらに含んでもよい。具体的な一実施形態で、前記ベクターは、インビトロ転写のベクターである。
改変免疫細胞
ＮＫＧ２Ａは、例えば、ＨＬＡ－Ｅのような非古典的ＨＬＡクラスＩ分子に結合され、さらに免疫細胞、例えばＮＫ細胞の活性化を抑制することができる。したがって、外因性のＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａに結合されることによって、ＮＫ細胞の殺傷作用を抑制する効果を実現することができ、これは、ある場合（例えばＨＬＡクラスＩ分子が欠失し或いは汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する場合）に特に有用である。
したがって、一態様では、本発明は、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体を発現し、そのうちの少なくとも１種類のＭＨＣ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングする改変免疫細胞を更に提供する。好ましい一実施形態において、前記改変免疫細胞は、第２ＮＫ阻害性リガンドを含む第２キメラ受容体をさらに発現し、そのうち、前記第２ＮＫ阻害性リガンドは、他のＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片、及び／或いは、他のＮＫ阻害性受容体の天然リガンド又はそれに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域である。
本明細書で使用されるように、ＭＨＣ関連遺伝子は、ＭＨＣ遺伝子自体（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子）と、ＭＨＣ遺伝子に相互作用し、又はその発現を調整する遺伝子とを含む。ＭＨＣクラスＩ分子の実例は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍを含むが、それらに限定されない。ＭＨＣクラスＩＩ分子の実例は、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１及びＨＬＡ－ＤＲＡを含むが、それらに限定されない。ＭＨＣ遺伝子に相互作用し、又はその発現を調整する遺伝子の実例は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡを含むが、それらに限定されない。
したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングするようにするとは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される、１つ又は複数の遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングするようにするという意味である。
一実施形態において、本発明のＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体を発現する前記改変免疫細胞は、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子をさらに含み、その発現が抑制され又はサイレンシングし、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の実例は、例えばＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζを含む。
好ましい一実施形態において、本発明のキメラ受容体を発現する前記改変免疫細胞は、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子と、少なくとも１種類のＭＨＣ関連遺伝子とを含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングし、そのうち、前記少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択され、前記少なくとも１種類のＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される。
好ましい一実施形態において、前記少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びそれらの組み合わせから選択され、前記少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される。一実施形態において、前記改変免疫細胞のＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ、及びＢ２Ｍの発現は抑制され又はサイレンシングする。一実施形態において、前記改変免疫細胞のＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ、及びＣＩＩＴＡの発現は抑制され又はサイレンシングする。好ましい一実施形態において、前記改変免疫細胞のＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現は抑制され又はサイレンシングする。好ましい一実施形態において、前記改変免疫細胞のＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＲＦＸ５の発現は抑制され又はサイレンシングする。
遺伝子の発現を抑制し、又は遺伝子をサイレンシングする方法は当業者にとってよく知っているが、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓ酵素によりＤＮＡ切断を仲介し、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ等の技術により遺伝子を不活化することを含むが、それらに限定されない。
一実施形態において、本発明で提供される改変免疫細胞は、腫瘍抗原を標的にするキメラ抗原受容体をさらに発現する。
一実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される腫瘍抗原を標的にする。好ましくは、前記ターゲットは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される。標的となる抗原により、本発明のキメラ抗原受容体は、この抗原に対して特異性を有する抗体を含むするように設計されてもよい。例えば、ＣＤ１９は、標的となる抗原であれば、ＣＤ１９抗体は、本発明のキメラ抗原受容体に用いることができる。
本明細書で使用されるように、「免疫細胞」という用語とは、１つ又は複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞の活性への殺傷、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫システムの任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞である。一実施形態において、免疫細胞は、例えば成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞等の幹細胞から派生される。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞であってもよく、例えば原代Ｔ細胞のような体外培養のＴ細胞、或いはＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等のようなＴ細胞などのインビトロで培養されたＴ細胞株からのもの、又は被験者から取得されたＴ細胞である。被験者の実例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらの遺伝子組み換え種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髓、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍の複数のソースから取得されることができる。Ｔ細胞は、濃縮され又は精製されてもよい。Ｔ細胞は、任意の発育段階にあってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞等を含むが、それらに限定されない。好ましい一実施形態において、免疫細胞は、ヒトＴ細胞である。当業者に既知される多種技術、例えばＦｉｃｏｌｌ分離を用いて被験者の血液からＴ細胞を取得することができる。
当分野での既知の一般的な方法（例えば形質導入、トランスフェクション、形質転換等）を採用して、キメラ受容体をコードする核酸配列を免疫細胞に導入することができる。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。一例としては、ＲＮＡトランスフェクションであり、即ち、ＲＮＡ（例えばインビトロ転写のＲＮＡ，ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルスアプローチに用いられる。「形質導入」という用語は一般的にウィルス仲介による核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するためのものである。動物細胞のトランスフェクションは、材料摂取を許容するように、一般的に細胞膜の一時的に開かれる孔または「穴」に係わる。リン酸カルシウムを用い、エレクトロポレーション、細胞押し出しにより、又カチオン性脂質と材料とを混合させて細胞膜に融合してそれらのキャリアを内部に沈着する脂質体が生成し、トランスフェクションを行うことができる。真核宿主細胞のトランスフェクションに用いる例示的技術は、脂質ベシクル仲介による取り込み、ヒートショック仲介による取り込み、リン酸カルシウム仲介によるトランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）が細菌中、非動物真核細胞（植物細胞を含む）中の非ウィルスへも転移することを説明するためのものである。従って、形質転換は、細菌又は非動物真核細胞の遺伝子変更であり、細胞膜によりその周囲から直接的に取り込んでから外因性の遺伝子材料（核酸分子）に組み込んで生成される。形質転換は、人工手段により実現されてもよい。形質転換の発生のために、細胞又は細菌は有能な状態であればならない。原核形質転換について、技術は、ヒートショック仲介による取り込み、完全細胞の細菌プロトプラストとの融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。核酸又はベクターを免疫細胞に導入すると、当業者は、一般的な技術により取得した免疫細胞を増幅、活性化することができる。
一実施形態において、本発明は、複数種類の改変免疫細胞をさらに提供し、そのうち１種類の免疫細胞は、本発明に記載のキメラ受容体及び腫瘍抗原を標的にする任意のキメラ抗原受容体を発現し、他方の種類の免疫細胞は、他のＮＫ阻害性受容体を標的にする第２キメラ受容体を発現する。この実施形態において、前記第２キメラ受容体は、第２ＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、前記第２ＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインの定義は、「キメラ受容体」の節に記載される。このような実施形態において、前記多種改変免疫細胞は、一緒に又は単独に投与されてもよい。一実施形態において、前記複数種類の免疫細胞は、同一組成物にあってもよいし、異なる組成物にあってもよい。細胞の例示的な組成物は、本出願の下記章節で説明される組成物を含む。
抗体複合体
他の一態様において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体及び第２機能的構造を含む抗体複合体であって、前記第２機能的構造が、Ｆｃ、放射性同位体、半減期を延長する構造部分、検出可能なマーカー及び薬剤から選択される抗体複合体を提供する。
一実施形態において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体及びＦｃを含む抗体複合体を提供する。本明細書で使用されるように、「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するためのもので、ネイティブＦｃとバリアントＦｃを含む。「ネイティブＦｃ」とは、無傷の抗体の消化によって生成され、モノマーまたはポリマーの形でもよい非抗原結合断片を含む分子又は配列を指す。ネイティブＦｃを生成した免疫グロブリンのソースは、ヒトに由来することが好ましい。ネイティブＦｃ断片は、共有結合（例えばジスルフィド結合）及び非共有結合によってダイマー又はポリマーとして結合されるモノマーポリペプチドから構成されてもよい。カテゴリ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）又はサブタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）によって、ネイティブＦｃ分子のモノマーサブユニット間に１～４個の分子間ジスルフィド結合がある。ネイティブＦｃの一実例として、パパインを用いてＩｇＧから生成されたジスルフィド結合によるダイマーを消化する（Ｅｌｌｉｓｏｎ等（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１－９参照）。本明細書で使用される「ネイティブＦｃ」は、一般的にモノマー、ダイマー及びポリマーの形である。「バリアントＦｃ」とは、少なくとも１つの文書で定義された「アミノ酸修飾」によって「ネイティブ」又は「ワイルドタイプ」Ｆｃのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を指し、「Ｆｃバリアント」とも称される。故に、「Ｆｃ」には、シングルチェーンＦｃ（ｓｃＦｃ）も含まれ、すなわちポリペプチドリンカーによって結合された２つのＦｃモノマーからなるシングルチェーンＦｃであり、機能的なダイマーＦｃ領域に自然に折りたたまれることができる。一実施形態において、前記Ｆｃは、ヒト免疫グロブリンのＦｃが好ましく、ヒトＩｇＧ１のＦｃがより好ましい。
一実施形態において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体及び放射性同位体を含む抗体複合体を提供する。本発明に適用する放射性同位体の実例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８Ｆ及び６８Ｇａを含むが、それらに限定されない。
一実施形態において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体及び半減期を延長する構造部分を含む抗体複合体であって、前記半減期を延長する構造部分が、アルブミンの結合構造、トランスフェリンの結合構造、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片及びヒト血清アルブミンに結合されるホワイトポリペプチド（抗体が含まれる）から選択される抗体複合体を提供する。
一実施形態において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体及び検出可能なマーカーを含む抗体複合体を提供する。「検出可能なマーカー」という用語は、本明細書で検出可能な信号を発生する化合物を指す。例えば、検出可能なマーカーは、ＭＲＩ造影剤、シンチグラフィー造影剤、Ｘ線イメージング造影剤、超音波造影剤、光イメージング造影剤であってもよい。検出可能なマーカーの実施例は、フルオロフォア（例えばフルオレセイン、Ａｌｅｘａ又はシアニン）、化学発光化合物（例えばルミノール）、生物発光化合物（例えばルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ）、抗生物質（例えばカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等）、耐性遺伝子及び造影剤（例えばナノ粒子またはガドリニウム）を含む。当業者は、使用される検出システムに基づいて適当な検出可能なマーカーを選択することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明で定義されたＮＫＧ２Ａ抗体と、例えば細胞毒素又は免疫調節剤（即ち、抗体薬剤複合体）のような前記ＮＫＧ２Ａ抗体に結合される薬剤を含む抗体複合体を提供する。通常、薬剤は、共有によって抗体に結合され、且つ一般的にリンカーに依存する。一実施形態において、前記薬剤は細胞毒素である。他の一実施形態において、前記薬剤は免疫調節剤である。細胞毒素の実例としては、メトトレキサート、アミノプテリン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル、ダカルバジン、窒素マスタード、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、１－メチルニトロソ尿素、シクロホスファミド、窒素マスタード、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン、マイトマイシン、ｃｉｓ－ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン、カルボプラチン、ゾルビシン、ドキソルビシン、デトルビシン、カミノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリケアミシン、ミスロマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、リシン、シュードモナス外毒素、ゲムシタビン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、エトポシド、テニポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、プロカルバジン、ヒドロキシカルバミド、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’－（ＤＤＤ））、インターフェロン、及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。免疫調節剤の実例としては、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、グルココルチコイド及びその類似物、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１）、コロニー刺激因子（例えばＧ－ＣＳＦ及び（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン（例えばインターフェロン－α、インターフェロン－β及びインターフェロン－γ）、「Ｓ１因子」と命名される幹細胞増殖因子、エリスロポエチン及びトロンボポエチン、又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
キット及び医薬組成物
他の一態様において、本発明は、本発明に記載の抗体、多重特異性抗体、キメラ受容体又は抗体複合体を含む検出キットを更に提供する。
他の一態様において、本発明は、本発明に記載の抗体、キメラ受容体、多重特異性抗体又は抗体複合体、及び１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される賦形剤」という用語とは、被験者および有効成分と薬理学的および／または生理学的に適合する（即ち、何らかの希望しない局部又は全身の作用を果たすことがなく、所要の治療効果を果たす）ベクター及び／又は賦形剤を指し、本分野で周知される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５参照）。薬学的に許容される賦形剤の実例は、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、粘着防止剤、流動促進剤、酸化防止剤、香料、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤、安定剤および等張化剤を含むが、それらに限定されない。当業者は、適当な賦形剤を選択して本発明の所望の医薬組成物を調製することを知っている。本発明に用いる医薬組成物における例示的賦形剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水である。通常、適当な賦形剤の選択は、特に使用される活性剤、治療対象の疾患及び医薬組成物の所望の剤型によって決められる。
本発明に係る医薬組成物は、複数の経路で投与される。一般的に、非経口で投与を完了する。非経口投与法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下、または鼻腔内で投与することを含む。
本発明の医薬組成物は、例えば固体、液体、気体、凍結乾燥形態等の各種形式で調製されることができ、特に軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアゾール、顆粒、丸剤、懸濁液、乳液、カプセル、シロップ、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、液体エキス剤抽出物の形態であってもよく、或いは、特に所要の投与方法に適用する形態である。本発明で既知の薬を製造するプロセスは、例えば、ルーチンの混合、溶解、造粒、糖衣製造、製粉、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスを含んでもよい。例えば本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は一般的に溶液の形態で提供され、且つ好ましくは薬学的に許容される緩衝剤を含む。
本発明に係わる医薬組成物は、治療及び／又は治療対象の疾患の予防に適用する１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されることもできる。組み合わせに適用する薬剤の好ましい実例は、例えばシスプラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーポルフィリンナトリウムＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチン及びアドリアマイシン等の既知の抗癌薬と、例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ＤＮＡ酵素及びＲＮＡ酵素等のペプチド細胞毒素と、例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５及びアスタチン２１３等の放射性核種と、例えば抗体指向性酵素プロドラッグのプロドラッグと、例えば血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質等の免疫刺激剤と、例えば抗ＣＤ３抗体又はその断片のような抗体又はその断片と、補体活化剤と、ヘテロタンパク質ドメインと、ホモタンパク質ドメインと、ウイルス／細菌タンパク質ドメインと、ウィルス／細菌ペプチドと、を含む。また、本発明の医薬組成物は、例えば化学療法、放射線療法等の他の１つ又は複数の治療方法と組み合わせて使用されてもよい。
治療・予防・診断の使用
他の一態様において、本発明は、被験者に上記した抗体、多重特異性抗体、抗体複合体、又は医薬組成物を投与することを含む、ＮＫＧ２Ａ発現に関連する疾患の治療・予防・診断の方法をさらに提供する。
一実施形態において、ＮＫＧ２Ａ発現に関連する疾患は、癌、感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患を含む。本発明の抗体で治療可能な癌の実例は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む固形癌と、白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、および多発性骨髄腫を含む造血リンパ腫と、急性・慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄異形成症候群を含む骨髄性造血腫瘍と、線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来腫瘍と、黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽腫、及び神経膠腫を含む他の腫瘍と、星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系腫瘍と、線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫を含む間葉由来腫瘍と、黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌を含む他の腫瘍と、を含むが、それらに限定されない。本発明の抗体で治療可能な感染症の実例は、ウイルス、細菌、原生動物、または真菌によって引き起こされる感染症を含むが、それらに限定されなく、ウイルスは、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ－２）、牛疫、ライノウイルス、エコウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、アルボウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、１型または２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）を含み、細菌は、例えばブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、乳酸菌、リステリア菌、ジフテリア菌等を含む。本発明の抗体で治療可能な炎症性疾患の実例は、副腎炎、肺胞炎、胆嚢胆管炎、虫垂炎、亀頭包皮炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂窩織炎、子宮頚管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎症、線維組織炎症、毛嚢炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳房炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎等を含むが、それに限定されない。本発明の抗体で治療可能な自己免疫疾患の実例は、溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、強皮症、潰瘍性結腸炎症性疾患、シェーグレン症候群、１型糖尿病、ぶどう膜炎、バセドウ病、アルツハイマー病病気、乾癬、白斑等を含むが、それらに限定されない。
他の一実施形態において、本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体が、腫瘍抗原を標的にするキメラ抗原受容体とともに免疫細胞で一緒に発現される場合に、治療可能な疾患は、キメラ抗原受容体の標的となる腫瘍抗原に決められる。例えば，本発明の抗ＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体が、ＣＤ１９を標的にするキメラ抗原受容体とともに一緒に発現され又は投与される場合に、治療可能な疾患は、ＣＤ１９発現に関する疾患、例えば、急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、Ｂ細胞ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）等を含むＢ細胞悪性腫瘍である。この実施形態において、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体は、ＮＫ細胞による再注入の改変免疫細胞への殺傷を抑制するためのものであるが、キメラ抗原受容体は、腫瘍抗原との結合によって標的細胞を標的的に殺傷する。
以下、図面を参照しながら実例を合わせて本発明を詳細に説明する。説明すべきこととして、当業者は、本発明の図面及びその実施例が例示なものに過ぎず、本発明に対する任意の制限を構成しないと理解するはずである。矛盾しない場合、本出願における実施例及び実施例における特徴は互いに組み合わせることができる。
ｈＺ１９９及びその復帰突然変異抗体ｈＺ１９９－Ｖ１とｈＺ１９９－Ｖ２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列比較結果を示す。灰色で強調表示された復帰突然変異のアミノ酸部位であり、数字は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域における当該突然変異部位の位置を示す。 ＮＫＧ２Ａ抗体を含むＵＮＫｉ－Ｔ細胞のｓｃＦｖ発現レベルを示す。 ＮＫＧ２Ａ抗体を含むＵＮＫｉ－Ｔ細胞によるＮＫ細胞殺傷作用への抑制効果を示す。Ｔｗｏ－ｗａｙＡＮＯＶＡにより分析し、Ｔｔｅｓｔにより統計学的に分析する。＊＊は、Ｐ値が０．０１よりも小さいことを示し、かなりのレベルに達した。
実施例１．ＮＫＧ２Ａ抗体の調製
抗体の親和性及び特異性を増強するために、ヒト化Ｚ１９９抗体（ｈＺ１９９）に基づいて、復帰突然変異の方式によって新しいＮＫＧ２Ａ抗体を調製する。ｈＺ１９９は、配列番号１で示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２で示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号３で示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号４で示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５で示されるＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６で示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で示され、全長アミノ酸配列が配列番号９で示される。復帰突然変異の方法は、当分野で既知のものであり、例えば、ｈＺ１９９配列のうち、抗体親和性に影響するおそれがある一部のアミノ酸（主にフレームワーク領域）に対して復帰突然変異のプライマーを設計し、軽鎖可変領域で５つの突然変異点を設計し、重鎖可変領域で４つの突然変異点を設計し、最終的に組み合わせて２つの復帰突然変異の抗体を取得し、ｈＺ１９９－Ｖ１及びｈＺ１９９－Ｖ２として命名し、その配列を下記の表１に示す。
表１．ｈＺ１９９及びそのバックミュータント抗体の配列
実施例２．ＮＫＧ２Ａ抗体を含むキメラ受容体を発現するＵＮＫｉ－Ｔ細胞の調製及びその機能の検証
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２９）、ｈＺ１９９（配列番号９）又はｈＺ１９９－Ｖ１（配列番号１２）、ＣＤ２８ヒンジ（配列番号３５）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号１７）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２１）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）にクローンして、ｈＺ１９９プラスミド及びｈＺ１９９－Ｖ１プラスミドを取得するとともに、シーケンシングにより対象配列のプラスミドにおける正しい挿入を確認する。
ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３１）、ｈＺ１９９－Ｖ２（配列番号１４）、ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号３７）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号１９）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号２３）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）にクローンして、ｈＺ１９９－Ｖ２プラスミドを取得するとともに、シーケンシングにより対象配列のプラスミドにおける正しい挿入を確認する。
無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）に加入して上記プラスミドを希釈してから、プラスミド：ウイルス包装ベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１という比率で、包装ベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２６０）及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２５９）を加入する。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに均一に混ぜて、室温で１５分間インキュベートし、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物を２９３Ｔ細胞の培養フラスコに一滴ずつ加入する。２４時間及び４８時間の後にウイルスを収集し、それを合わせた後に、超遠心分離して（２５０００ｇ、４℃、２．５時間）濃縮レンチウイルスを取得する。
ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号４０２０３Ｄ）を用いてＴ細胞を活性化し、３７℃及び５％のＣＯ２で１日間培養する。そして、濃縮したレンチウイルスを加入し、３日間連続培養後、ＮＫＧ２Ａ抗体を含むキメラ受容体を発現するＴ細胞を取得する。
そして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて野生型Ｔ細胞（即ちＮＴ細胞）、及びＮＫＧ２Ａ抗体が含まれるキメラ受容体を発現する前記Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３成分（具体的にはＴＲＡＣ遺伝子）とＭＨＣ関連遺伝子（具体的にはＢ２ＭとＲＦＸ５）をノックアウトし、それぞれＭｏｃｋＴ細胞、ＵＮＫｉ－ｈＺ９９－Ｔ細胞（ｈＺ１９９プラスミドを含む）、ＵＮＫｉ－Ｖ１－Ｔ細胞（ｈＺ１９９－Ｖ１プラスミドを含む）及びＵＮＫｉ－Ｖ２－Ｔ細胞（ｈＺ１９９－Ｖ２プラスミドを含む）を取得する。ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５５９１６）抗体、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｉ（Ｒ＆Ｄ商品番号ＦＡＢ７０９８Ｐ）及びＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３６１７１４）抗体を用いて、フローサイトメトリーによりＵＮＫｉ－Ｔ細胞、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞及びＮＴ細胞におけるＣＤ３／ＨＬＡ－Ｉ／ＨＬＡ－ＩＩの発現効率を検出し、結果を下記の表２に示す。
表２．ＵＮＫｉ－Ｔ細胞における遺伝子発現効率
表２からわかるように、本発明で調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＣＤ３／ＨＬＡ－Ｉ／ＨＬＡ－ＩＩの発現は、効率的に抑制され又はサイレンシングする。
Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１０９－０６５－０９７）及びＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ，商品番号５５４０６７）を用いて、ＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ発現を検出する（図２）。
これによって分かるように、本発明で調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるｓｃＦｖはいずれも効率的に発現される。
下記の方法で、本発明で調製されるＵＮＫｉ－Ｔ細胞によるＮＫ細胞の殺傷作用への抑制効果を検出し、即ちＦａｒ－Ｒｅｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，商品番号Ｃ３４５６４）を用いて本発明で調製されるＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋ－Ｔ細胞をマークする。そして、１×１０４個の細胞／孔の濃度で、マークされたＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋＴ細胞を９６ウェルプレートに入れ、２：１のエフェクター：標的比でＮＫ９２細胞を加入し、共培養を行う。１６～１８時間後、フローサイトメトリーを用いてカルチャーにおけるＴ細胞の比率を検出して、さらにＮＫ細胞によるＴ細胞への殺傷効果を算出し、結果を図３に示す。
図３から分かるように、キメラ受容体を発現しないＮＴ細胞に比べて、本発明のＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、いずれもＮＫ細胞によるＴ細胞への殺傷作用を顕著に低減させることができる。また、ｈＺ１９９抗体に比べると、本発明の抗体（即ち、バックミュータントのｈＺ１９９－Ｖ１及びｈＺ１９９－Ｖ２抗体）を使用すると、ＮＫ細胞殺傷作用の抑制効果がよりよく、本発明の抗体の親和性がｈＺ１９９抗体よりも大きいことが示される。
説明すべきこととして、上記は、本発明の好ましい実施例に過ぎなく、本発明を制限するものではなく、当業者にとって、本発明は様々の変更及び変化を行うことができる。当業者によって理解されるように、本発明の思想と原則で行われたいかなる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (24)

  1. ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体であって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１で示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２で示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号３で示されるＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４で示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５で示されるＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６で示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域は、２１番目のアミノ酸がＭ、８５番目のアミノ酸がＴであり、前記重鎖可変領域は、３４番目のアミノ酸がＭ、４９番目のアミノ酸がＡ、６１番目のアミノ酸がＰ、９７番目のアミノ酸がＴであるＮＫＧ２Ａを標的にする抗体。
  2. 前記軽鎖可変領域は、２２番目のアミノ酸がＳ又はＴ、５８番目のアミノ酸がＩ又はＶ、１０４番目のアミノ酸がＬ又はＶである請求項１に記載の抗体。
  3. 前記軽鎖可変領域は、配列番号１０及び１３から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、配列番号１０及び１３に比べて１つ又はいくつかのアミノ酸の保守的な修飾を有し、前記重鎖可変領域は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、配列番号１１に比べて１つ又はいくつかのアミノ酸の保守的な修飾を有する請求項１に記載の抗体。
  4. 前記軽鎖可変領域は、配列番号１０及び１３から選択され、前記重鎖可変領域は、配列番号１１で示される請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 前記抗体のアミノ酸配列は、配列番号１２及び１４から選択される請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
  7. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、他の抗原に特異的に結合される１つ又は複数の第２抗体又はその抗原結合部分を含む多重特異性抗体。
  8. 前記第２抗体又はその抗原結合部分は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、マイクロ抗体、二重抗体又はｓｄＡｂから選択される請求項７に記載の多重特異性抗体。
  9. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項７又は８に記載の多重特異性抗体をコードする核酸分子を含むベクター。
  10. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項７又は８に記載の多重特異性抗体を発現する宿主細胞。
  11. １つ又は複数種類のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドが請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項７又は８に記載の多重特異性抗体を含み、前記シグナル伝達ドメインが１つ又は複数の共刺激ドメインを含むキメラ受容体。
  12. 前記キメラ受容体は、２種類のＮＫ阻害性リガンドを含み、そのうち、第１ＮＫ阻害性リガンドは、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体又は請求項７又は８に記載の多重特異性抗体を含み、第２ＮＫ阻害性リガンドは、（１）ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１などのＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその断片、及び／又は（２）ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、及びそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される請求項１１に記載のキメラ受容体。
  13. 前記シグナル伝達ドメインは、１つ又は複数の共刺激ドメインから構成される請求項１１又は１２に記載のキメラ受容体。
  14. 前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内領域を更に含む請求項１１又は１２に記載のキメラ受容体。
  15. 前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ細胞内領域から選択される請求項１１から１４のいずれか一項に記載のキメラ受容体。
  16. 請求項１１から１５のいずれか一項に記載のキメラ受容体を発現し、そのうち少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子の発現は抑制され又はサイレンシングする改変免疫細胞。
  17. 前記ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される請求項１６に記載の改変免疫細胞。
  18. 前記改変免疫細胞は、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子をさらに含み、その発現が抑制され又はサイレンシングし、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε及びＣＤ３ζから選択される請求項１６又は１７に記載の改変免疫細胞。
  19. 前記改変免疫細胞は、腫瘍抗原を標的にするキメラ抗原受容体をさらに発現する請求項１６から１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  20. Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞から選択される請求項１６から１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  21. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項７又は８に記載の多重特異性抗体、及び第２機能的構造を含み、前記第２機能的構造がＦｃ、放射性同位体、半減期を延長する構造部分、検出可能なマーカー及び薬剤から選択される抗体複合体。
  22. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、請求項７又は８に記載の多重特異性抗体、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のキメラ受容体又は請求項２１に記載の抗体複合体を含む検出キット。
  23. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、請求項７又は８に記載の多重特異性抗体、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のキメラ受容体、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞又は請求項２１に記載の抗体複合体、及び１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  24. ＮＫＧ２Ａ発現に関連する疾患の予防・治療・診断用の薬剤の調製における、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、請求項７又は８に記載の多重特異性抗体、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のキメラ受容体、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞又は請求項２１に記載の抗体複合体又は請求項２３に記載の医薬組成物の使用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115820645B (zh) * 2022-11-28 2023-09-22 上海恩凯细胞技术有限公司 制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法及其用途
CN118203672A (zh) * 2022-12-15 2024-06-18 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 类三特异性抗体药物制剂及其制备方法和应用
CN116178552A (zh) * 2022-12-30 2023-05-30 合肥天港免疫药物有限公司 抗cd94的抗体及其应用
WO2024165051A1 (zh) * 2023-02-09 2024-08-15 南京北恒生物科技有限公司 功能增强的细胞疗法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US20030095965A1 (en) 2001-05-02 2003-05-22 Katrien Van Beneden Antibodies to Ly49E and CD94/NKG2 receptors
WO2005004809A2 (en) 2003-07-01 2005-01-20 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
EP2495257A3 (en) 2005-08-19 2012-10-17 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN101952317B (zh) * 2008-01-24 2015-07-22 诺沃-诺迪斯克有限公司 人化抗-人nkg2a单克隆抗体
AU2012268939B2 (en) * 2011-06-17 2017-05-04 Novo Nordisk A/S Selective elimination of erosive cells
JP2022512954A (ja) * 2018-11-07 2022-02-07 シャンハイ ヒャマブ バイオテック カンパニー リミテッド Ｎｋｇ２ａ抗体およびその製造方法と使用
CN115501330A (zh) * 2021-06-07 2022-12-23 南京北恒生物科技有限公司 用于细胞免疫治疗的方法和组合物

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