TW202405165A - 編碼膜型細胞激素及tnf受體超家族分子之細胞內域的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本發明之課題為提供：在不含細胞激素的培養條件下、或無法期待高濃度之細胞激素的活體內，亦可良好地維持生存及/或細胞增殖的免疫細胞；用以製備該免疫細胞的分子等。 使膜型IL2、膜型IL7或膜型IL15與源自TNFRSF分子的細胞內域作為各自分別的多肽之組合而在免疫細胞中表現，或是使兩者作為同一多肽而在免疫細胞中表現。

Description

編碼膜型細胞激素及TNF受體超家族分子之細胞內域的多核苷酸

本發明係有關於：能夠使留滯於細胞膜的IL2、IL7或IL15(以下，有時各自稱為「膜型IL2或IL2TM」、「膜型IL7或IL7TM」及「膜型IL15或IL15TM」)與源自TNF受體超家族(TNFRSF)分子的細胞內域作為各自分別的多肽之組合而在免疫細胞中表現、或是能夠使兩者作為同一多肽而在免疫細胞中表現的多核苷酸；包含該多核苷酸的表現載體；經導入該表現載體的免疫細胞；含有該免疫細胞的醫藥；上述同一多肽或上述組合多肽；上述同一多肽或上述組合多肽於細胞膜上表現的免疫細胞；使用上述表現載體而製備包含上述免疫細胞之細胞集團的方法等。

免疫係分類為先天免疫與後天免疫。先天免疫係以自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞、顆粒球等免疫細胞為中心之對於廣範圍的病原體之迅速的免疫反應。另一方面，後天免疫係以樹突細胞、B細胞、T細胞等免疫細胞為中心之選擇性且有效的免疫反應。

於再生醫療領域中，係嘗試開發以下過繼性免疫細胞療法(adoptive immune cell therapy)(亦稱為過繼性免疫療法(adoptive immunotherapy))：採集存在於體內之免疫細胞，使其在體外增殖，再放回患者體內。於過繼性免疫細胞療法中，能夠使用基因改造技術而對免疫細胞賦予新的功能。例如，嘗試開發辨識呈現對癌細胞為特異性的細胞內抗原的主要組織相容性抗原複合體(Major Histocompatibility Antigen Complex；MHC)之T細胞受體(T Cell Receptor；TCR)、或表現高親和性CD16之免疫細胞。又，亦進行使源自複數個不同蛋白質之嵌合多肽在免疫細胞中表現。作為該嵌合多肽，已知例如：連結辨識癌抗原之抗體與T細胞之活化區而成的嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor；CAR)、或連結辨識自體抗體之抗原與T細胞之活化區而成的嵌合自體抗體受體(Chimeric autoantibody receptor；CAAR)(非專利文獻1)。近年，會表現CAR之T細胞(CAR-T細胞)係對於血液癌顯示非常高的藥效，而受到矚目。

T細胞係在由透過TCR/CD3複合體之抗原辨識所致之訊息、與由抗原非特異性共刺激分子(co-stimulatory molecule)(亦稱為共刺激因子、協同刺激因子、協同刺激分子)所致之訊息的兩者傳遞時被活化。然而，已有報告：在腫瘤細胞已知共刺激分子的表現降低，即便CAR-T細胞可辨識到標的之腫瘤細胞，亦不會傳遞來自共刺激分子之充分的訊息，所以CAR-T細胞並不被充分地活化，得不到抗腫瘤效果。於是，現在已開發一種CAR-T細胞，其係於CAR基因併入共刺激分子之基因，藉由透過CAR之抗原辨識而傳遞共刺激訊息。藉由變更併入至CAR基因之共刺激分子之基因的種類、數目、組合等，而嘗試CAR-T細胞之存活率及增殖能力的提升、或往記憶T細胞之分化誘導等種種功能的賦予及強化(非專利文獻2)。

另一方面，亦有報告：以CAR-T細胞療法，則對於實質癌並不顯示充分的藥效。這被認為原因之一是因所移植的CAR-T細胞與標的腫瘤細胞的局部化之差異等，而與血液癌相比，在實質癌則CAR-T細胞與抗原之接觸機會低，所以並不引發增殖訊息，就其結果而言，未供給需要量的細胞激素(非專利文獻3、4)。因而冀求：在與抗原之接觸低的環境下亦生存及增殖，且能夠活化之CAR-T細胞的開發；或使用該CAR-T細胞之對於癌症的過繼性免疫細胞療法(即癌症免疫療法)的開發。

細胞激素於種種免疫細胞的分化、成熟、活化及增殖中負責重要的任務一事已廣為人知。例如，作為參與NK細胞或T細胞的生存及增殖之細胞激素，已知共通γ鏈(γc)細胞激素家族。γc細胞激素家族，係會與包含共通之γc次單元的受體結合，且由白血球介素2 (IL2)、白血球介素4 (IL4)、白血球介素7 (IL7)、白血球介素9 (IL9)、白血球介素15 (IL15)及白血球介素21 (IL21)所構成。γc細胞激素家族的受體係以γc為共通而由2或3組件構成，於細胞激素所作用之免疫細胞表現。已知於過繼性免疫細胞療法中，使此等細胞激素、或此等細胞激素與細胞激素受體之嵌合多肽於免疫細胞表現之技術。

共刺激分子被大致分為：免疫球蛋白超家族(IgSF)分子、與TNF/TNF(腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor))受體超家族(TNFRSF)分子。作為IgSF分子，已知B7/CD28家族分子(CD28、CTLA4、PD1、ICOS)、TIM家族(TIM1、TIM3)、CD2/SLAM家族(SLAM、CD2、CD84、CRACC、BLAME)等。又，作為TNFRSF分子，已知CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、HVEM、CD27、TNFR2、CD30、DR3、GITR、LTβR等。

非專利文獻5中記載一種T細胞，其係將使IL15與IL15Rα連結而成的嵌合多肽(以下，有時稱為「IL15-IL15Rα」)之表現載體進行基因導入，使該嵌合多肽表現，藉此而強化生存及增殖之T細胞。然而，針對留滯於細胞膜的細胞激素(以下，有時稱為「膜型細胞激素」)及TNFRSF分子的共表現，並未具體地記載。此外，在同一文獻中，係使IL15-IL15Rα與CD19 CAR(採用CD28作為共刺激分子，且採用CD3ζ作為ITAM[基於免疫受體酪胺酸之活化模體(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)]細胞內訊息傳遞區而成的CAR)共表現。

非專利文獻6中記載一種T細胞，其係將膜型IL7之表現載體進行基因導入，使該膜型IL7表現，藉此而強化生存及增殖之T細胞。然而，針對膜型細胞激素及TNFRSF分子的共表現，並未具體地記載。此外，在同一文獻中，雖使膜型IL7與CD19 CAR共表現，但並未記載該CAR所採用的共刺激分子與ITAM細胞內訊息傳遞區之具體的構造。

專利文獻1中記載一種NK細胞，其係將膜型IL15之表現載體進行基因導入，使該膜型IL15表現，藉此而強化生存及增殖之NK細胞。然而，針對膜型細胞激素及TNFRSF分子的共表現，並未具體地記載。

專利文獻2中記載一種T細胞，其係使非活化域所結合的IL15或IL15-IL15Ra表現，藉此而強化生存及增殖之T細胞。然而，針對膜型細胞激素及TNFRSF分子的共表現，並未具體地記載。

專利文獻3中記載一種將TeIL21/15進行基因導入而成的T細胞。而記載在這種T細胞，生存及增殖被強化，且抗腫瘤活性提升。然而，針對膜型細胞激素及TNFRSF分子的共表現，並未具體地記載。

專利文獻4中記載一種NK細胞，其係使於NKG2D CAR(採用CD3ζ作為ITAM細胞內訊息傳遞區而成的CAR)的訊息傳遞域包含OX40、4-1BB或CD28結構域的細胞毒性訊息傳遞複合體、與膜型IL15共表現。然而，針對與細胞毒性訊息傳遞複合體分開地使共刺激分子及膜結合型細胞激素共表現，並未具體地記載。

專利文獻5中記載一種使CAR與膜型IL15共表現之NK細胞及T細胞，該CAR於訊息傳遞域包含源自OX40等共刺激分子的細胞內域與CD3ζ細胞內域。然而，針對與CAR分開地使TNFRSF分子及膜型細胞激素共表現，並未具體地記載。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] 國際公開第2015/174928號小冊 [專利文獻2] 國際公開第2018/161026號小冊 [專利文獻3] 國際公開第2019/157130號小冊 [專利文獻4] 國際公開第2020/056045號小冊 [專利文獻5] 國際公開第2020/247392號小冊 [非專利文獻]

[非專利文獻1] Ellebrecht et al, Science. 2016;353(6295):179-84. [非專利文獻2] Kershaw et al, Nat Rev Cancer. 2013 Aug;13(8):525-41. [非專利文獻3] Knochelmann et al, Front Immunol. 2018 Jul 27;9:1740. [非專利文獻4] Junghans et al, Cancer Gene Ther. 2017 Mar;24(3):89-99. [非專利文獻5] Hurton et al, PNAS. Nov 14, 2016 [非專利文獻6] Hurton et al, Blood (2009) 114 (22):3035.

[發明欲解決之課題]

過繼性免疫細胞療法大多為採用源自患者之免疫細胞的自體細胞治療之情形，希望不分患者而在活體內發揮治療效果。因此，用於治療的免疫細胞係冀求可不被患者影響地增殖者。再者，於活體內無法期待在離體(ex vivo)培養所使用的高濃度之細胞激素，因此為了發揮充分的治療效果，係冀求免疫細胞即使在低濃度之細胞激素條件下亦至少維持生存，且希望會增殖。

然而，如後述之本實施例1所示，於源自於複數個供體之周邊血液單核細胞(PBMC)的T細胞中使膜型IL15或「IL15-IL15Rα」表現，且以不含細胞激素的培養基(亦稱為「培養液」)進行培養時，可見到T細胞之細胞增殖能力於每個供體大為不同、或於培養初期T細胞數減少之供體。又，於大多數的供體，在培養2週以後可見到T細胞之細胞增殖能力降低，發現無法長期間維持T細胞之細胞增殖能力。亦即，發現：僅使膜型IL15或「IL15-IL15Rα」在T細胞中表現，則在細胞激素不存在下，未必可得到充分的細胞之維持生存或增殖效果。因此，預料即使將該T細胞使用於過繼性免疫細胞療法，對於許多患者亦無法期待充分的效果，而需要用以進一步強化用於治療的免疫細胞之功能(例如，細胞增殖能力)，且提高過繼性免疫細胞療法之效果的新的技術開發。又，在表現膜型細胞激素的CAR-T細胞，基於以下理由而並未期待免疫細胞之長期間的增殖或維持生存等之功能提升：對於共刺激分子的訊息傳遞而言，需要與標的抗原之結合；來自CD3ζ等ITAM細胞內訊息傳遞區之訊息係與共刺激分子之訊息同時被傳遞至T細胞，所以表現CAR的免疫細胞自身疲乏或受到損傷等。

本發明之課題在於提供：在不含細胞激素的培養條件下、或無法期待高濃度之細胞激素的活體內，亦可良好地維持生存及/或細胞增殖的免疫細胞；用以製備該免疫細胞的分子等。 [用以解決課題之手段]

本發明人等為解決上述課題而持續專心致力研究。於該過程中發現若使膜型IL2、膜型IL7或膜型IL15與源自TNFRSF分子的細胞內域作為各自分別的多肽之組合(即本件組合多肽)而在免疫細胞中表現、或是使兩者作為同一多肽(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體)而在免疫細胞中表現，則與以下免疫細胞相比，在不含細胞激素的培養條件下之細胞增殖性係改善：僅表現膜型IL2、膜型IL7或膜型IL15的免疫細胞；作為同一多肽而表現膜型IL15及源自CD28家族分子的細胞內域(TNFRSF分子以外的共刺激分子)的免疫細胞；或是作為同一多肽而表現膜型IL2、膜型IL7及膜型IL15以外的膜型細胞激素、與源自TNFRSF分子的細胞內域的免疫細胞。

又，已確認：若使留滯於細胞膜的配體分子(以下，有時稱為「膜型配體分子」)與源自TNFRSF分子的細胞內域連結而成者(以下，有時稱為「本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體」)、及膜型IL15在免疫細胞中共表現，則與使不包含膜型配體分子之源自TNFRSF分子的細胞內域、及膜型IL15共表現的免疫細胞相比，在不含細胞激素的培養條件下之細胞增殖性係改善。

又，已在體內(in vivo)系統確認：表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的免疫細胞，係無關於有無對活體內進行投予前之數日的事前培養，且不依賴於成為免疫細胞之來源的供體，而可在活體內良好地維持生存及/或細胞增殖。

又，已在體外(in vitro)及體內系統確認：表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的不含共刺激分子的CAR-T細胞(第一代CAR-T細胞)，係較現存之第二代CAR-T細胞更具有強且持續性的癌細胞毒殺活性。

又，已確認：若將包含表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的免疫細胞之細胞集團，在IL15、IL2及IL7不存在下進行培養，則可製備高純度之包含該免疫細胞的細胞集團。

本發明係基於此等之見解以至完成者。

亦即，本發明係如下所述。 〔1〕一種多核苷酸(以下，有時稱為「本件多核苷酸」)，其含有編碼細胞外域(以下，有時稱為「本件細胞激素細胞外域」)之細胞外域編碼區(以下，有時稱為「本件細胞激素細胞外域編碼區」)、及編碼細胞內域(以下，有時稱為「本件TNFRSF分子細胞內域」)之細胞內域編碼區(以下，有時稱為「本件TNFRSF分子細胞內域編碼區」)，其中 該細胞外域含有源自於配體蛋白質(以下，有時稱為「本件細胞激素」。典型而言，為IL15、IL2或IL7。)的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNF受體超家族(TNFRSF)分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM(基於免疫受體酪胺酸之活化模體)細胞內訊息傳遞區， 該多核苷酸係 (a)被設計為：藉由前述細胞外域及前述細胞內域透過跨膜域連結，而作為以同一多肽(以下，有時稱為「本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體」)表現之含有細胞外域-細胞內域的分子基因(以下，有時稱為「本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體編碼區」)，能夠於免疫細胞中表現；或 (b)被設計為：藉由前述細胞外域及前述細胞內域各自與第一細胞膜結合域及第二細胞膜結合域連結，而作為以由第一多肽及第二多肽所構成的組合多肽(以下，有時稱為「本件組合多肽」)表現之含有細胞外域的分子基因及含有細胞內域的分子基因(以下，有時稱為「本件組合多肽編碼區」)，能夠於免疫細胞中表現。 〔2〕如上述〔1〕中記載的多核苷酸，其中IL15、IL2、IL7及TNFRSF分子源自於人類、小鼠或大鼠。 〔3〕如上述〔1〕或〔2〕中記載的多核苷酸，其中含有源自於會與IL15之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域係含有具有與序列識別號22所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL15受體結合之活性；含有源自於會與IL2之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域係含有具有與序列識別號17所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL2受體結合之活性；含有源自於會與IL7之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域係含有具有與序列識別號20所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL7受體結合之活性。 〔4〕如上述〔1〕～〔3〕之任一者中記載的多核苷酸，其中TNFRSF分子為TNFR2、OX40、HVEM、CD27或CD137。 〔5〕如上述〔1〕～〔4〕之任一者中記載的多核苷酸，其中免疫細胞為T細胞或自然殺手細胞。 〔6〕如上述〔1〕～〔5〕之任一者中記載的多核苷酸，其中跨膜域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。 〔7〕如上述〔1〕～〔6〕之任一者中記載的多核苷酸，其中細胞外域及跨膜域透過連接子(linker)肽而連結。 〔8〕如上述〔7〕中記載的多核苷酸，其中連接子肽為源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽。 〔9〕如上述〔1〕～〔5〕之任一者中記載的多核苷酸，其中第一細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域，第二細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。 〔10〕如上述〔1〕～〔5〕及〔9〕之任一者中記載的多核苷酸，其中細胞外域及第一細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結，且細胞內域及第二細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結。 〔11〕如上述〔1〕～〔5〕、〔9〕及〔10〕之任一者中記載的多核苷酸，其中第一多肽及第二多肽透過自切割肽(self-cleaving peptide)而連結。 〔12〕如上述〔11〕中記載的多核苷酸，其中自切割肽為自切割肽T2A。 〔13〕如上述〔1〕～〔5〕及〔9〕～〔12〕之任一者中記載的多核苷酸，其中第二多肽具有包含以下胺基酸序列的細胞外域，該胺基酸序列源自於存在於進行基因導入前述多核苷酸的免疫細胞之受體的配體分子。 〔14〕如上述〔13〕中記載的多核苷酸，其中配體分子為IL7或IL21。 〔15〕如上述〔1〕～〔14〕之任一者中記載的多核苷酸，其進一步編碼包含單鏈抗體、跨膜域及ITAM細胞內訊息傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)。 〔16〕一種載體(以下，有時稱為「本件載體」)，其包含啟動子、及可操作地(operably)連結於該啟動子之下游的如上述〔1〕～〔15〕之任一者中記載的多核苷酸。 〔17〕一種免疫細胞(以下，有時稱為「本件免疫細胞(1)」)，其經導入如上述〔16〕中記載的載體。 〔18〕一種醫藥(以下，有時稱為「本件醫藥」)，其含有如上述〔17〕中記載的免疫細胞。 〔19〕如上述〔18〕中記載的醫藥，其中免疫細胞係於將如上述〔16〕中記載的載體進行基因導入至前述免疫細胞後、10日以內被投予至治療或預防對象。 〔20〕一種多肽(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體)，其包含細胞外域、跨膜域及細胞內域， 該細胞外域含有源自於配體蛋白質的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNF受體超家族(TNFRSF)分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM(基於免疫受體酪胺酸之活化模體)細胞內訊息傳遞區。 〔21〕一種組合多肽(即本件組合多肽)(以下，有時將本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體及本件組合多肽總稱為「本件多肽」)，其係由含有細胞外域及第一細胞膜結合域之第一多肽(以下，有時稱為「本件第一多肽」)、以及含有第二細胞膜結合域及細胞內域之第二多肽(以下，有時稱為「本件第二多肽」)所構成， 該細胞外域含有源自於配體蛋白質的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNF受體超家族(TNFRSF)分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM(基於免疫受體酪胺酸之活化模體)細胞內訊息傳遞區。 〔22〕如上述〔20〕或〔21〕中記載的多肽，其中IL15、IL2、IL7及TNFRSF分子源自於人類、小鼠或大鼠。 〔23〕如上述〔20〕～〔22〕之任一者中記載的多肽，其中含有源自於會與IL15之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域，係含有具有與序列識別號22所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL15受體結合之活性；含有源自於會與IL2之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域，係含有具有與序列識別號17所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL2受體結合之活性；含有源自於會與IL7之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域，係含有具有與序列識別號20所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL7受體結合之活性。 〔24〕如上述〔20〕～〔23〕之任一者中記載的多肽，其中TNFRSF分子為TNFR2、OX40、HVEM、CD27、或CD137。 〔25〕如上述〔20〕及〔22〕～〔24〕之任一者中記載的多肽，其中跨膜域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。 〔26〕如上述〔20〕及〔22〕～〔25〕之任一者中記載的多肽，其中細胞外域及跨膜域透過連接子肽而連結。 〔27〕如上述〔26〕中記載的多肽，其中連接子肽為源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽。 〔28〕如上述〔21〕～〔24〕之任一者中記載的多肽，其中第一細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域，第二細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。 〔29〕如上述〔21〕～〔24〕及〔28〕之任一者中記載的多肽，其中細胞外域及第一細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結，且細胞內域及第二細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結。 〔30〕如上述〔21〕～〔24〕、〔28〕及〔29〕之任一者中記載的多肽，其中第一多肽及第二多肽透過自切割肽而連結。 〔31〕如上述〔30〕中記載的多肽，其中自切割肽為自切割肽T2A。 〔32〕如上述〔21〕～〔24〕及〔28〕～〔31〕之任一者中記載的多肽，其中第二多肽具有包含以下胺基酸序列的細胞外域，該胺基酸序列源自於存在於表現前述多肽的免疫細胞之受體的配體分子。 〔33〕如上述〔32〕中記載的多肽，其中配體分子為IL7或IL21。 〔34〕一種免疫細胞(以下，有時稱為「本件免疫細胞(2-1)」)，其中如上述〔20〕及〔22〕～〔27〕之任一者中記載的多肽係於細胞膜上表現。 〔35〕一種免疫細胞(以下，有時稱為「本件免疫細胞(2-2)」)，其中如上述〔21〕～〔24〕及〔28〕～〔33〕之任一者中記載的多肽中之第一多肽及第二多肽係於細胞膜上表現。 〔36〕如上述〔35〕中記載的免疫細胞，其經導入搭載有第一多肽及第二多肽之載體、或是經導入搭載有第一多肽之載體及搭載有第二多肽之載體。 〔37〕一種製備包含如上述〔17〕及〔34〕～〔36〕之任一者中記載的免疫細胞的細胞集團的方法(以下，有時稱為「本件製備方法」)，其包含以下之步驟(A)及(B)： (A)將如上述〔16〕中記載的載體進行基因導入至免疫細胞的步驟； (B)將經基因導入之免疫細胞於基因導入後培養5日以上的步驟。 〔38〕如上述〔37〕中記載的方法，其中於步驟(B)中，將經基因導入之免疫細胞在以下配體蛋白質不存在下進行培養，該配體蛋白質係會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，且藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞。

又，作為實施本發明之其他形態，可舉出例如：包含將本件免疫細胞(1)、本件免疫細胞(2-1)或本件免疫細胞(2-2)(以下，有時將此等總稱為「本件免疫細胞」)投予至需要治療或預防疾病之對象的步驟之治療或預防疾病的方法(以下，有時稱為「本件治療或預防方法」)；用於治療或預防疾病之用途的本件免疫細胞；本件免疫細胞的在製造醫藥中之用途；包含本件多核苷酸、本件載體、本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體或本件組合多肽的免疫細胞之細胞增殖改善用套組(以下，有時稱為「本件套組」)等。 [發明之效果]

依據本發明，若使本件細胞激素細胞外域及本件TNFRSF分子細胞內域各自分別地在免疫細胞的細胞膜上表現、或是以經連結之狀態在免疫細胞的細胞膜上表現，則該免疫細胞係無關於有無對活體內進行投予前之數日的事前培養，且不依賴於成為免疫細胞之來源的供體，而在無法期待高濃度之細胞激素的活體內亦可良好地維持生存及/或細胞增殖，並且可提高CAR-T細胞等治療用免疫細胞的治療效果。

[用以實施發明的形態]

本發明提供一種多核苷酸作為本件多核苷酸， 該多核苷酸含有編碼細胞外域(即本件細胞激素細胞外域)之多核苷酸(即本件細胞激素細胞外域編碼區)、及編碼細胞內域(即本件TNFRSF分子細胞內域)之多核苷酸(即本件TNFRSF分子細胞內域編碼區)， 該細胞外域含有源自於配體蛋白質(即本件細胞激素)的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM細胞內訊息傳遞區。

又，本件多核苷酸之一個態樣為一種多核苷酸，其係(a)被設計為：藉由本件細胞激素細胞外域及本件TNFRSF分子細胞內域透過跨膜域連結，而作為以同一多肽(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體)表現之含有細胞外域-細胞內域的分子基因(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體編碼區)，能夠於免疫細胞中表現。

又，本件多核苷酸之其他的態樣為一種多核苷酸，其係(b)被設計為：藉由本件細胞激素細胞外域及本件TNFRSF分子細胞內域各自與第一細胞膜結合域及第二細胞膜結合域連結，而作為以由本件第一多肽及本件第二多肽所構成的組合多肽(即本件組合多肽)表現之含有細胞外域的分子基因及含有細胞內域的分子基因(即本件組合多肽編碼區)，能夠於免疫細胞中表現。

具有上述(a)之特徵的本件多核苷酸(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體編碼區[換言之，編碼本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的多核苷酸])，係含有本件細胞激素細胞外域編碼區、跨膜域編碼區及本件TNFRSF分子細胞內域編碼區，且藉由本件細胞激素細胞外域及本件TNFRSF分子細胞內域透過前述跨膜域連結，而以會作為本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體在免疫細胞中表現之方式設計的多核苷酸。

又，具有上述(b)特徵的本件多核苷酸(即本件組合多肽編碼區[換言之，編碼本件組合多肽的多核苷酸])，係含有包含本件細胞激素細胞外域編碼區及第一細胞膜結合域編碼區的多核苷酸(以下，有時稱為「本件第一多肽編碼區」)、與包含第二細胞膜結合域編碼區及本件TNFRSF分子細胞內域編碼區的多核苷酸(以下，有時稱為「本件第二多肽編碼區」)，且以會作為由本件第一多肽及本件第二多肽所構成的組合多肽在免疫細胞中表現之方式設計的多核苷酸。

＜1.用語之說明＞ 於本說明書中，所謂「細胞激素」，係意指由免疫細胞所分泌，且藉由與存在於免疫細胞的細胞表面之受體結合而參與選自免疫細胞的分化、成熟、活化及增殖的1或2種以上之功能的低分子量(通常，分子量10000～30000之範圍內，較佳為15000～30000)多肽。就上述細胞激素而言，可舉出例如IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL15、IL21、IL1α、IL1β、IL18、IL33、IL36、IL37、IL38等。

於本說明書中，所謂「本件細胞激素」，係意指一種配體蛋白質，其係會與選自由IL2、IL7及IL15所組成之群組的任一個細胞激素之受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞。典型之本件細胞激素為天然型的IL2、IL7或IL15。又，本件細胞激素並不限定於天然型的細胞激素，而可採用維持功能的變異體(例如文獻「Nature. 2019 Jan;565(7738):186-191. doi: 10.1038/s41586-018-0830-7」中記載的變異體IL2/IL15[序列識別號56])。再者，就本件細胞激素之其他的態樣而言，可採用包含具有對於IL2受體、IL7受體或IL15受體之促效劑活性的單株抗體或使用其互補性決定區(CDR)序列而設計的scFv(單鏈Fv)、Fab等之抗原結合性片段的蛋白質。模擬IL15之功能的抗IL15受體scFv，係記載於例如文獻「Cell. 2022 Apr 14;185(8):1414-1430.e19. doi: 10.1016/j.cell.2022.02.025.」中。

於本說明書中，所謂「膜型細胞激素」，係意指經人工設計為使源自於天然分泌型細胞激素或模擬其功能之配體蛋白質的胺基酸序列以維持與該細胞激素之受體的結合活性之狀態而與跨膜域或細胞膜結合域連結之形式的嵌合肽，在本說明書中有被記述為「細胞激素TM」之情形。使用分泌型細胞激素之情形，不限定於天然型細胞激素的胺基酸序列，只要保持與受體之結合活性，則於天然型或變異體細胞激素的胺基酸序列中，可有數個(例如10個以下、7個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下或1個)胺基酸取代、缺失、插入及/或附加。這種胺基酸的變更，希望是於細胞激素的胺基酸序列中在被報告對與受體之結合為重要的胺基酸以外的位置被變更。關於IL2，作為對與IL2受體α次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、L72及Y107(各自相當於序列識別號17的第35個、第37個、第38個、第41個、第42個、第43個、第44個、第45個、第61個、第62個、第64個、第65個、第68個、第72個及第107個胺基酸殘基)，作為對與IL2受體β次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告L19、D20、M23、R81、D84、S87及N88(各自相當於序列識別號17的第19個、第20個、第23個、第81個、第84個、第87個及第88個胺基酸殘基)，作為對與γc次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告E15、L18、Q22、N119、T123、Q126、S127、I129、S130及T133(各自相當於序列識別號17的第15個、第18個、第22個、第119個、第123個、第126個、第127個、第129個、第130個及第133個胺基酸殘基)(文獻「Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Feb 21;103(8):2788-93. doi: 10.1073/pnas.0511161103.」及文獻「Nat Immunol. 2012 Dec;13(12):1187-95. doi: 10.1038/ni.2449.」)。又，關於IL7，作為對與IL7受體α次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告K10、Q11、S14、V15、L16、V18、S19、Q22、S71、T72、D74、L77、H78、L80、K81、E84、G85、I88及L89(各自相當於序列識別號20的第10個、第11個、第14個、第15個、第16個、第18個、第19個、第22個、第71個、第72個、第74個、第77個、第78個、第80個、第81個、第84個、第85個、第88個及第89個胺基酸殘基)，作為對與γc次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告C47、R133、Q136、E137、K139、T140、C141、N143及K144(各自相當於序列識別號20的第47個、第133個、第136個、第137個、第139個、第140個、第141個、第143個及第144個胺基酸殘基)(文獻「Structure. 2009 Jan 14;17(1):54-65. doi: 10.1016/j.str.2008.10.019.」)。又，關於IL15，作為對與IL15受體α次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告D22、A23、Y26、E46、V49、E53、E87、E89及E90(各自相當於序列識別號22的第22個、第23個、第26個、第46個、第49個、第53個、第87個、第89個及第90個胺基酸殘基)，作為對與IL15受體β次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告S7、D8、K10、K11、D61、E64及N65(各自相當於序列識別號22的第7個、第8個、第10個、第11個、第61個、第64個及第65個胺基酸殘基)，作為對與γc次單元之結合為重要的胺基酸殘基，有報告K10、S29、D30、H32、H105、Q108、M109、I111及N112(各自相當於序列識別號22的第10個、第29個、第30個、第32個、第105個、第108個、第109個、第111個及第112個胺基酸殘基)(文獻「Nat Immunol. 2007 Sep;8(9):1001-7. doi: 10.1038/ni1492.」及文獻「Nat Immunol. 2012 Dec;13(12):1187-95. doi: 10.1038/ni.2449.」)。設計本件細胞激素的膜型細胞激素之情形，亦能夠採用在與此等對受體之結合為重要的胺基酸殘基不同的胺基酸殘基導入變異之胺基酸序列。又，並無採用天然型或變異型細胞激素的胺基酸序列之全長之必要，只要保持與受體之結合活性，則亦可其N末端及/或C末端的一部分(例如20%以下、19%以下、18%以下、17%以下、16%以下、15%以下、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下)缺失。

於本說明書中，所謂「嵌合多肽」，係意指藉由基因操作而使2種類以上之源自不同蛋白質的多肽結合(連結)而成之多肽。有將包含源自於會與活體內之受體結合之配體(例如細胞激素、生長因子、生理活性肽等)的胺基酸序列或結構域構造之嵌合多肽稱為嵌合配體之情形。於本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體中，本件細胞激素細胞外域、與跨膜域或本件TNFRSF分子細胞內域成為嵌合的關係，於本件第一多肽中，本件細胞激素細胞外域與第一細胞膜結合域成為嵌合的關係。

於本說明書中記述嵌合多肽之情形，於各個來源分子名之隔著「-」表示。膜型蛋白質之情形，以左側為細胞外域、右側為細胞內域的順序表示。例如，膜型IL15與TNFR2之細胞內域連結而成的嵌合肽，係記述為「IL15TM-TNFR2」。又，使不同蛋白質於同一細胞共表現之情形，於分子名之間表示「/」。例如，包含膜型IL15與源自TNFR2的細胞內域之本件第二多肽，係記述為「IL15TM/TNFR2」。僅表示TNFRSF分子或共刺激分子作為分子名之情形，則表示係以下跨膜域或細胞膜結合域與TNFRSF分子或共刺激分子之細胞內域的嵌合肽，該跨膜域或細胞膜結合域不包含特徵性的細胞外域，而訊息肽、標籤肽、連接子肽、間隔子(spacer)等可存在於細胞外。

就成為本件多核苷酸或本件多肽所包含的各結構域・區域、或是免疫細胞之來源的生物種而言，若為哺乳類，則不特別限制，可舉出例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等囓齒類；兔等之兔形目；豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄類；犬、貓等之食肉目；人類、猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猴、紅毛猩猩、黑猩猩等靈長類，較佳為人類、小鼠或大鼠。

於本說明書中，所謂「TNFRSF分子」，係被分類於TNF受體超家族的受體分子，已報告其負責與免疫細胞的維持・增殖相關之訊息傳遞(Annu Rev Immunol. 2005;23:23-68. doi:10.1146/annurev.immunol. 23.021704.115839.)。就TNFRSF分子而言，可舉出例如TNFR1、NGFR、FAS、BCMA、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、HVEM、CD27、TNFR2、CD30、DR3、GITR、LTβR等。其中，CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、HVEM、CD27、TNFR2、CD30、DR3、GITR及LTβR等亦已知為共刺激分子或有助於免疫細胞的維持・增殖之分子。只要未特別提及，則於本說明書之關於嵌合多肽的記載中，有記載TNFRSF分子名之情形，表示嵌合肽之細胞內域包含源自於該TNFRSF分子之細胞內域的胺基酸序列。

於本說明書中，所謂「ITAM細胞內訊息傳遞區」，係意指包含酪胺酸磷酸化模體(基於免疫受體酪胺酸之活化模體；ITAM)的細胞內域，該酪胺酸磷酸化模體在免疫細胞藉由標的抗原結合所導致的免疫細胞內的活化訊息傳遞級聯(cascade)中為重要的，就ITAM細胞內訊息傳遞區而言，可舉出例如CD3ζ、CD3δ、FcRγ等細胞內域。在T細胞，MIC (MHC I類相關鏈(MHC class I-related chain))所呈現之抗原與TCR的結合訊息係透過TCR/CD3複合體而往細胞內傳遞。於NK細胞中，和抗原結合之抗體與Fc受體的結合訊息係透過Fc受體的ITAM訊息傳遞區而引起細胞的活化。將這種透過ITAM之免疫細胞的活化訊息稱為「ITAM依賴性活化訊息」，亦已知其對於對標的細胞的細胞毒殺活性為重要的，但另一方面免疫細胞自身疲乏、及/或受到損傷。

於本說明書中，於膜型蛋白質在細胞上表現之情形，「細胞外域」係通常其大部分存在於細胞外的結構域，並無該結構域所包含的胺基酸殘基全部存在於細胞外之必要，依所採用的胺基酸序列及其周邊的胺基酸序列，而亦有採取相當於細胞外域之胺基酸序列的C末端側的一部分被埋入細胞膜內的構造之情形。

於本說明書中，於膜型蛋白質在細胞上表現之情形，「跨膜域」係通常其大部分存在於細胞膜中的結構域，並無該結構域所包含的胺基酸殘基全部存在於細胞膜中之必要，依所採用的胺基酸序列及其周邊的胺基酸序列，而亦有採取相當於跨膜域之胺基酸序列的N末端的一部分存在於細胞外、及/或相當於跨膜域之胺基酸序列的C末端側的一部分存在於細胞內的構造之情形。

於本說明書中，於膜型蛋白質在細胞上表現之情形，「細胞內域」係通常其大部分存在於細胞內的結構域，並無該結構域所包含的胺基酸殘基全部存在於細胞內之必要，依所採用的胺基酸序列及其周邊的胺基酸序列，而亦有採取相當於細胞內域之胺基酸序列的N末端側的一部分被埋入細胞膜內的構造之情形。

於本說明書中，所謂『「源自於」某蛋白質或其部分結構域「的胺基酸序列」』，係含有具有與來源之天然蛋白質的胺基酸之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且於表現為多肽之際保持該天然蛋白質或其部分結構域所具有之功能・活性的至少一部分之胺基酸序列。

於本說明書中，所謂「至少80%序列同一性」，係意指相對於對象之序列整體的序列同一性為80%以上，且意指較佳為85%以上、更佳為88%以上、進一步較佳為90%以上、進一步更佳為93%以上、特佳為95%以上、特更佳為98%以上、最佳為100%之同一性。

於本說明書中，「序列同一性」之用語係意指多核苷酸序列或胺基酸序列的近似性之程度(其藉由查詢序列(query sequence)與其他之較佳為同一型之序列(核酸或蛋白質序列)的匹配來決定)。就計算及決定「序列同一性」之較佳的電腦程式法而言，可舉出GCG BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215:403-410；Altschul et al.,Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402；Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12:387)、以及BLASTN 2.0 (Gish W., http://blast.wustl.edu, 1996-2002)、以及FASTA (Pearson及Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA1988, 85:2444-2448)、以及決定及比對重複最長的一對片段重疊組(contig)的GCG GelMerge (Wibur及Lipman，SIAMJ. Appl. Math. 1984, 44:557-567；Needleman及Wunsch，J. Mol. Biol. 1970, 48:443-453)，但並不限定於此等。

於本說明書中，所謂「具有與序列識別號X所示(或序列識別號X的)胺基酸序列之至少80%序列同一性」，換言之係意指具有於序列識別號X的胺基酸序列中有0、1或數個胺基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列，且具有與由序列識別號X的胺基酸序列所構成的多肽同等之功能。此處，所謂「有1或數個胺基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列」，係意指例如有1～30個之範圍內、較佳為1～20個之範圍內、更佳為1～15個之範圍內、進一步較佳為1～10個之範圍內、進一步較佳為1～5個之範圍內、進一步較佳為1～3個之範圍內、進一步較佳為1～2個之範圍內的數目之胺基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的胺基酸序列。又，於本說明書中，所謂「具有與序列識別號X的核苷酸序列之至少80%序列同一性」，換言之係意指具有於序列識別號X的核苷酸序列中有0、1或數個核苷酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的核苷酸序列，且具有與由序列識別號X的核苷酸序列所構成的多核苷酸同等之功能。此處，所謂「有1或數個核苷酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的核苷酸序列」，係意指例如有1～30個之範圍內、較佳為1～20個之範圍內、更佳為1～15個之範圍內、進一步較佳為1～10個之範圍內、進一步較佳為1～5個之範圍內、進一步較佳為1～3個之範圍內、進一步較佳為1～2個之範圍內的數目之核苷酸殘基缺失、取代、插入及/或附加的核苷酸序列。此等胺基酸殘基及核苷酸殘基的變異處理，可藉由化學合成、基因工程學手法、突變誘發等發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的任意方法來進行。

於本說明書中，所謂「免疫細胞」，係意指於活體中負責免疫功能之細胞、或由幹細胞被人工誘導為具有與該種細胞同等之功能的細胞之細胞。就免疫細胞而言，可舉出例如T細胞、NK細胞、B細胞等淋巴球系細胞、或單核球、巨噬細胞、樹突細胞等抗原呈現細胞、或嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞等顆粒球。就該T細胞而言，可舉出α･βT細胞、γ･δT細胞、CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶T細胞、初始T細胞(naive T cell)、NKT細胞。由幹細胞往免疫細胞之分化誘導法，例如關於由iPS細胞往T細胞之分化誘導或往NK細胞之分化誘導，已於文獻「Nat Biotechnol 2014, 32:554-561」等有報告。

免疫細胞中亦包含：利用基因改造技術，將至少一個編碼治療或預防用肽/多肽的多核苷酸、或至少一個治療或預防用肽/多肽導入源自活體之T細胞，而表現治療或預防用肽/多肽的免疫細胞；或由ES細胞或iPS細胞經分化誘導而成的免疫細胞。

於本說明書中，所謂「治療或預防用肽/多肽」，係意指具有對於疾病之治療效果及/或預防效果的源自天然之蛋白質(多肽)或經人工設計的蛋白質、構成彼等蛋白質的肽、維持彼等蛋白質或肽之生物學功能的變體等。就源自天然之蛋白質或肽而言，若為已知有以下情形之蛋白質、肽等，則不特別限定：人類內源性地保留，且其表現降低會促進疾病狀態的發病或進展，或是藉由使其表現亢進、或補充，而改善疾病狀態、使進展鈍化。就經人工設計的蛋白質或肽而言，可例示例如抗體醫藥所使用的單株抗體、CAR-T細胞治療所使用的嵌合抗原受體、對於自體免疫疾病之CAAR-T細胞治療所使用的嵌合自體抗體受體、基於對於天然受體之結合活性而經人工設計的配體肽等。

＜2.本件多肽之各構成＞ 本發明提供包含以下所說明之各結構域、部分構造等的本件多肽、及編碼本件多肽的多核苷酸(即本件多核苷酸)。

本件多肽所包含的本件細胞激素細胞外域，係包含源自於本件細胞激素的胺基酸序列之細胞外域，此處所謂「源自於本件細胞激素的胺基酸序列」，係意指為天然(野生型)的分泌型細胞激素之本件細胞激素的胺基酸序列、或具有與為天然分泌型細胞激素之本件細胞激素同等之受體結合能力的變體(變異型)的胺基酸序列。就該變體而言，可舉出例如前述之文獻「Nature. 2019 Jan;565(7738):186-191. doi: 10.1038/ s41586-018-0830-7」中記載的變異體IL2/IL15[序列識別號56])等。

成為本件細胞激素之來源的生物種，若為哺乳類則不特別限定，可例示人類、小鼠、大鼠、猴、犬、兔、豬等，但較佳為人類、小鼠或大鼠，更佳為人類。包含本件細胞激素的本發明之各構成區域的表示中並無特別表示成為來源之生物種之情形，係意指為源自於人類分子的區域/胺基酸序列。

就本件細胞激素細胞外域而言，可舉出例如： 含有具有與人類IL15的胺基酸序列(序列識別號22)、小鼠IL15的胺基酸序列(序列識別號33)或大鼠IL15的胺基酸序列(序列識別號34)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類、小鼠或大鼠的IL15受體結合之活性的多肽； 含有具有與人類IL15的胺基酸序列(序列識別號22)之至少80%序列同一性並維持選自由被報告對與該受體之結合為重要的S7、D8、K10、K11、D22、A23、Y26、S29、D30、H32、E46、V49、E53、D61、E64、N65、E87、E89、E90、H105、Q108、M109、I111及N112所組成之群組的1或數個(例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個)胺基酸殘基之胺基酸序列，且保持與人類的IL15受體結合之活性的多肽，較佳為含有維持前述對與受體之結合為重要的胺基酸殘基全部之胺基酸序列的前述多肽； 含有具有與人類IL2的胺基酸序列(序列識別號17)、小鼠IL2的胺基酸序列(序列識別號35)或大鼠IL2的胺基酸序列(序列識別號36)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類、小鼠或大鼠的IL2受體結合之活性的多肽； 含有具有與人類IL2的胺基酸序列(序列識別號17)之至少80%序列同一性並維持選自由被報告對與該受體之結合為重要的E15、L18、L19、D20、Q22、M23、K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、L72、R81、D84、S87、N88、Y107、N119、T123、Q126、S127、I129、S130及T133所組成之群組的1或數個(例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個)胺基酸殘基之胺基酸序列，且保持與人類的IL2受體結合之活性的多肽，較佳為含有維持前述對與受體之結合為重要的胺基酸殘基全部之胺基酸序列的前述多肽； 含有具有與人類IL7的胺基酸序列(序列識別號20)、小鼠IL7的胺基酸序列(序列識別號37)或大鼠IL7的胺基酸序列(序列識別號38)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類、小鼠或大鼠的IL7受體結合之活性的多肽； 含有具有與人類IL7的胺基酸序列(序列識別號20)之至少80%序列同一性並維持選自由被報告對與該受體之結合為重要的K10、Q11、S14、V15、L16、V18、S19、Q22、C47、S71、T72、D74、L77、H78、L80、K81、E84、G85、I88、L89、R133、Q136、E137、K139、T140、C141、N143及K144所組成之群組的1或數個(例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個)胺基酸殘基之胺基酸序列，且保持與人類的IL7受體結合之活性的多肽，較佳為含有維持前述對與受體之結合為重要的胺基酸殘基全部之胺基酸序列的前述多肽等。

本件多肽所包含的本件TNFRSF分子細胞內域，係含有源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域且不含有ITAM細胞內訊息傳遞區的細胞內域，此處，所謂「源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域」，係意指被分類於TNFRSF的受體分子之細胞內域或為其一部分，且保持TNFRSF分子之細胞內訊息傳遞活性的多肽。該多肽可為包含天然(野生型)的TNFRSF分子之細胞內域的胺基酸序列者，亦可為包含具有與天然TNFRSF分子之細胞內域同等之功能的變體(變異型)的胺基酸序列者。

就上述TNFRSF分子而言，可舉出例如TNFR1、NGFR、FAS、BCMA、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、HVEM、CD27、TNFR2、CD30、DR3、GITR、LTβR等，CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、HVEM、CD27、TNFR2、CD30、DR3、GITR及LTβR因亦已知為共刺激分子或有助於免疫細胞的維持・增殖之分子而較佳，由於已在後述之本實施例證實其效果，可合適地例示選自TNFR2、OX40、HVEM、CD27及CD137的TNFRSF分子。

就上述「源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域」而言，可舉出例如： 含有具有與人類TNFR2之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號5)、小鼠TNFR2之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號39)或大鼠TNFR2之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號40)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽； 含有具有與人類OX40之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號6)、小鼠OX40之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號41)或大鼠OX40之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號42)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽； 含有具有與人類HVEM之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號7)、小鼠HVEM之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號43)或大鼠HVEM之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號44)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽； 含有具有與人類CD27之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號8)、小鼠CD27之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號45)或大鼠CD27之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號46)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽； 含有具有與人類CD137之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號9)、小鼠CD137之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號47)或大鼠CD137之細胞內域的胺基酸序列(序列識別號48)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽等。

就本件多肽所採用之跨膜域而言，若為可貫穿細胞膜之多肽即可，可為源自於天然受體蛋白質的跨膜域，亦可為不天然存在而經人工設計的跨膜域。此處，就源自於天然受體蛋白質的跨膜域而言，可舉出源自於公知的各式各樣受體蛋白質之跨膜域，較佳為源自於在免疫細胞上表現之受體蛋白質的跨膜域，具體而言，可舉出源自前述之TNFRSF分子、T細胞受體α或β鏈、CD3ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD22、CD33、CD27、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等的跨膜域，由於已在後述之本實施例證實其效果，可合適地例示源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。

作為上述源自CD8α的跨膜域，具體而言可舉出含有具有與源自人類CD8α的跨膜域的胺基酸序列(序列識別號16)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽，又，作為上述源自CD28的跨膜域，具體而言可舉出含有具有與源自人類CD28的跨膜域的胺基酸序列(序列識別號30)之至少80%序列同一性的胺基酸序列之多肽。

本件多肽所包含的各結構域亦可透過連接子肽及/或間隔子而連結。就連接子肽或間隔子之具體的插入部位而言，可舉出選自以下的1或2個以上之部位：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體、本件第一多肽及本件第二多肽的N末端；此等多肽的C末端；本件細胞激素細胞外域與跨膜域之間；跨膜域與本件TNFRSF分子細胞內域之間；本件細胞激素細胞外域與第一細胞膜結合域之間；及本件TNFRSF分子細胞內域與第二細胞膜結合域之間。

就上述連接子肽及間隔子而言，若為不阻礙本件多肽之功能者，則不特別限制。就連接子肽的長度而言，例如為3～300個胺基酸殘基之範圍內(例如4～200個胺基酸殘基、5～150個胺基酸殘基、6～100個胺基酸殘基、10～100個胺基酸殘基、15～62個胺基酸殘基等)。就上述連接子肽而言，可舉出例如源自天然存在的蛋白質之連接子肽(例如源自CD8α的連接子肽、源自CD8β的連接子肽、源自CD28的連接子肽)、源自於鉸鏈區(hinge region)(例如源自CD8α的鉸鏈區；源自CD8β的鉸鏈區；源自CD28的鉸鏈區；IgG2[長鉸鏈])、IgG3[短鉸鏈]等源自各種IgG的鉸鏈區)之肽、經人工合成的連接子肽(例如可動性連接子[彈性連接子(Flexible Linker)]肽)，較佳為選自源自CD8α的連接子肽及源自CD28的連接子肽之連接子肽。作為該源自CD8α的連接子肽，具體而言，可舉出具有與序列識別號15、31及32之任一者的胺基酸序列之至少80%序列同一性的多肽，又，作為上述源自CD28的連接子肽，具體而言，可舉出具有與序列識別號29的胺基酸序列之至少80%序列同一性的多肽，作為上述可動性連接子肽，具體而言，可舉出具有與序列識別號27的胺基酸序列之至少80%序列同一性的多肽。

又，就間隔子的長度而言，例如為1～10個胺基酸殘基之範圍內(例如2～4個胺基酸殘基)。就上述間隔子而言，可舉出例如甘胺酸及絲胺酸連續之物(例如GCG、GCGC、GCGCG等)。

就本件多肽而言，可為包含用以使本件多肽在免疫細胞的細胞膜上表現・局部化的訊息肽者。就訊息肽而言，若為不阻礙本件多肽之功能，且使本件多肽在免疫細胞的細胞膜上的表現・局部化成為可能者，則不特別限制。就訊息肽的長度而言，例如為10～70個胺基酸殘基之範圍內，較佳為15～60個胺基酸殘基，更佳為15～30個胺基酸殘基。訊息肽的連結部位並不特別限制，可為本件多肽的N末端或羧基(C)末端，亦可為本件細胞激素細胞外域與跨膜域之間、跨膜域與本件TNFRSF分子細胞內域之間、本件細胞激素細胞外域與第一細胞膜結合域之間、或本件TNFRSF分子細胞內域與第二細胞膜結合域之間，但較佳為本件多肽(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體、本件第一多肽及本件第二多肽)的N末端。就上述訊息肽而言，可舉出例如源自於天然存在的分泌蛋白質(例如上述細胞激素)或膜蛋白質(例如上述共刺激分子)之訊息肽，較佳為源自CD8α的訊息肽或源自IL2的訊息肽。作為該源自CD8α的訊息肽，具體而言可舉出具有與序列識別號4的胺基酸序列之至少80%序列同一性的多肽，作為該源自IL2的訊息肽，具體而言可舉出具有與序列識別號3的胺基酸序列之至少80%序列同一性的多肽。

本件多肽由於被設計成編碼本件多肽的多核苷酸(即本件多核苷酸)能夠在免疫細胞中表現，而通常在免疫細胞中表現。此處就免疫細胞而言，若為於活體中負責免疫功能之細胞則不特別限制，由於已在後述之本實施例證實其效果，可合適地例示選自T細胞及NK細胞的免疫細胞。就進行基因導入本件多核苷酸之免疫細胞及表現本件多肽之免疫細胞而言，可為存在於活體內(體內)之狀態的免疫細胞，但通常為存在於活體外之狀態的免疫細胞。

本件多核苷酸所包含的本件細胞激素細胞外域編碼區，係藉由參照本件細胞激素細胞外域的胺基酸序列、與對應各種生物種之公知的密碼子表，而發明所屬技術領域中具有通常知識者可具體且明確地掌握對應該胺基酸序列之核苷酸序列。例如，本件細胞激素細胞外域為包含源自於人類IL15的細胞外域的胺基酸序列(具有與序列識別號22的胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列)的多肽之情形，可例示編碼源自於人類IL15的細胞外域的cDNA(多核苷酸)(亦即，包含具有與序列識別號49的核苷酸序列之至少80%序列同一性的核苷酸序列之多核苷酸)。

本件多核苷酸所包含的本件TNFRSF分子細胞內域編碼區，係藉由參照源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域的胺基酸序列、與對應各種生物種之公知的密碼子表，而發明所屬技術領域中具有通常知識者可具體且明確地掌握對應該胺基酸序列之核苷酸序列。例如，源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域為包含源自於人類TNFR2之細胞內域的胺基酸序列(具有與序列識別號5的胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列)的多肽之情形，可例示編碼源自於人類TNFR2之細胞內域的區域的cDNA(多核苷酸)(亦即，包含具有與序列識別號50的核苷酸序列之至少80%序列同一性的核苷酸序列之多核苷酸)。

就本件多核苷酸而言，可為包含編碼用以使本件多肽在免疫細胞的細胞膜上表現・局部化的訊息肽之區域(多核苷酸)者。

就本件多核苷酸而言，可為在選自以下的1或2個以上之部位包含編碼連接子肽的多核苷酸及/或編碼間隔子的多核苷酸者：本件多核苷酸之上游；本件多核苷酸之下游；本件細胞激素細胞外域編碼區與跨膜域編碼區之間；跨膜域編碼區與本件TNFRSF分子細胞內域編碼區之間；本件細胞激素細胞外域編碼區與第一細胞膜結合域編碼區之間；第二細胞膜結合域編碼區與本件TNFRSF分子細胞內域編碼區之間。

於本說明書中，所謂「上游」，係意指於將本件多核苷酸以成為可操作之方式連結於本件載體中之啟動子下游時，本件多核苷酸之較靠近啟動子側(相對於從啟動子之轉錄方向而言為較上游側)的末端，又，所謂「下游」，係意指本件多核苷酸之較遠離啟動子側(相對於從啟動子之轉錄方向而言為較下游側)的末端。

於本說明書中，所謂「以會在免疫細胞中表現之方式設計的多核苷酸」，更具體而言係意指將包含在免疫細胞中發揮功能的啟動子、與可操作地連結於該啟動子之下游的多核苷酸之載體導入免疫細胞之情形，以該多核苷酸所編碼的目的之多肽(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體或本件組合多肽)會在免疫細胞中表現之方式設計的多核苷酸。

就本件多核苷酸而言，進行基因導入本件多核苷酸之免疫細胞並非表現治療或預防用肽/多肽的免疫細胞之情形，其中有使用本件多核苷酸而製備對於任意疾病的治療或預防用免疫細胞之必要時，較佳為進一步包含至少一個編碼治療或預防用肽/多肽的多核苷酸。

本件多核苷酸可為包含本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體編碼區或本件組合多肽編碼區的mRNA、cDNA等之形態，亦可為適於用以使本件多肽在細胞膜上表現之基因導入的質體、載體、病毒等之形態。

構成本件多核苷酸之核苷酸，可為具有天然構造的DNA或RNA，亦可為具有以下構造的核苷酸(亦稱為「修飾核酸」)，該構造係具有天然構造的DNA或RNA經化學性地修飾而成者。例如，本件多核苷酸以mRNA之形式被提供至細胞之情形，為了賦予對由RNase所致之分解的抗性，而使用修飾核酸。修飾核酸較佳為核苷酸中的鹼基部分經修飾者，若為例如5位經取代之嘧啶核苷酸、1位可經取代之假尿苷則為佳，具體而言可例示5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、1-烷基假尿苷。又，就1-烷基假尿苷而言，可為1-(C1-C6烷基)假尿苷，較佳為1-甲基假尿苷或1-乙基假尿苷。

本件多核苷酸可基於本件多肽的胺基酸序列，藉由常用方法而輕易地製作。編碼胺基酸序列的核苷酸序列可基於序列表中記載的胺基酸序列而取得，可使用標準的分子生物學的及/或化學的程序而製作本件多核苷酸。例如，可基於核苷酸序列而合成多核苷酸，可從cDNA庫藉由組合使用聚合酶連鎖反應(PCR)所得到的DNA片段而製作本件多核苷酸。

本件多核苷酸可為包含為了在特定宿主細胞之表現而密碼子經最適化的核苷酸序列者。這樣地經最適化的核苷酸序列，可將目的之胺基酸序列藉由應用公知的演算法、軟體而取得。

本件多核苷酸可為編碼本件多核苷酸的單股(有義股)之多核苷酸，亦可為由該有義股與其互補序列之反義股所構成的雙股之多核苷酸，其形態可選擇對多核苷酸往細胞的導入方法而言適當之形態。例如，mRNA或慢病毒(lentivirus)載體之情形，為單股之形態，質體DNA之情形，可採用雙股之形態。

＜2-1.本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體＞ 就本件多肽之一個態樣而言，可舉出本件細胞激素細胞外域與本件TNFRSF分子細胞內域直接連結而成的膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體，具體而言，可舉出一種嵌合多肽，其包含細胞外域、跨膜域及細胞內域，該細胞外域含有源自於配體蛋白質的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞，該細胞內域含有源自於TNFRSF分子之細胞內域的區域且不含有ITAM細胞內訊息傳遞區。

就本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體而言，若為於使本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體在免疫細胞中表現時，本件細胞激素細胞外域及本件TNFRSF分子細胞內域透過跨膜域而連結於同一多肽上者即可，再者，只要本件細胞激素細胞外域存在於(內源性細胞激素原本存在的)細胞外，且本件TNFRSF分子細胞內域存在於(內源性TNFRSF分子之細胞內域原本存在的)細胞內，則可為由胺基(N)末端起以本件細胞激素細胞外域、跨膜域及本件TNFRSF分子細胞內域的順序連結而成者，亦可為由N末端起以本件TNFRSF分子細胞內域、跨膜域及本件細胞激素細胞外域的順序連結而成者。

作為本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體而言較佳者，係本件細胞激素為IL15或IL7之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體，更佳係本件細胞激素為IL15或IL7，且TNFSF分子為OX40或CD137之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體，進一步較佳係採用CD8α之連接子及跨膜域的IL15TM-OX40(序列識別號52的胺基酸編號21～257)、IL15TM-CD137(序列識別號53的胺基酸編號21～262)、IL7TM-OX40(序列識別號54的胺基酸編號21～295)或IL7TM-CD137(序列識別號55的胺基酸編號21～300)的本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體。

就本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體編碼區而言，只要於使本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體在免疫細胞中表現時，本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體中的本件細胞激素細胞外域存在於(內源性細胞激素原本存在的)細胞外，且本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體中的本件TNFRSF分子細胞內域存在於(內源性TNFRSF分子之細胞內域原本存在的)細胞內，則可為從上游起以本件細胞激素細胞外域編碼區、跨膜域編碼區及本件TNFRSF分子細胞內域編碼區的順序連結而成者，亦可為從上游起以本件TNFRSF分子細胞內域編碼區、跨膜域編碼區及本件細胞激素細胞外域編碼區的順序連結而成者。

本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體編碼區所包含的跨膜域編碼區，係藉由參照跨膜域的胺基酸序列、與對應各種生物種之公知的密碼子表，而發明所屬技術領域中具有通常知識者可具體且明確地掌握對應該胺基酸序列之核苷酸序列。例如，跨膜域為含有源自人類CD8α的跨膜域的胺基酸序列(具有與序列識別號16的胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列)的多肽之情形，可例示編碼源自人類CD8α的跨膜域的cDNA(多核苷酸)(亦即，包含具有與序列識別號51的核苷酸序列之至少80%序列同一性的核苷酸序列之多核苷酸)。

＜2-2本件組合多肽＞ 就本件多肽之一個態樣而言，可舉出包含本件細胞激素細胞外域之第一多肽、與包含本件TNFRSF分子細胞內域之第二多肽在同一免疫細胞上組合地表現的組合多肽，更具體而言，係由包含本件細胞激素細胞外域及第一細胞膜結合域之第一多肽(即本件第一多肽)、以及含有第二細胞膜結合域及本件TNFRSF分子細胞內域之第二多肽(即本件第二多肽)所構成的組合多肽。

本件組合多肽所採用之本件第一多肽，係實質上包含本件細胞激素細胞外域及第一細胞膜結合域的嵌合多肽。其細胞內域中並不含有訊息傳遞域，但可包含連接子肽、間隔子等。就本件第一多肽而言，只要於使本件第一多肽在免疫細胞中表現時，本件細胞激素細胞外域存在於(內源性細胞激素原本存在的)細胞外，則可為由N末端起以本件細胞激素細胞外域及第一細胞膜結合域的順序連結而成者，亦可為由N末端起以第一細胞膜結合域及本件細胞激素細胞外域的順序連結而成者。又，本件第一多肽，亦可附加實質上不具有生物活性之胺基酸序列作為其細胞內域。就這種胺基酸序列之例而言，可例示例如作為間隔子使用之胺基酸序列、連接子肽、鉸鏈肽等。

本件組合多肽所採用之本件第二多肽，係包含第二細胞膜結合域及內源性TNFRSF分子之細胞內域，且包含可含有連接子肽、後述之相當於本件膜型配體之胺基酸序列等作為其細胞外域之構造的嵌合多肽。又，本件第二多肽，係在其細胞內域中不含有ITAM細胞內訊息傳遞區之點上與CAR分子及CAAR分子不同。就本件組合多肽中之本件第二多肽而言，只要於使本件第二多肽在免疫細胞中表現時，本件TNFRSF分子細胞內域存在於(內源性TNFRSF分子之細胞內域原本存在的)細胞內，則可為由N末端起以本件TNFRSF分子細胞內域及細胞膜結合域的順序連結而成者，亦可為由N末端起以細胞膜結合域及本件TNFRSF分子細胞內域的順序連結而成者。

所謂本件組合多肽所採用之「(第一或第二)細胞膜結合域」，係意指具有會與免疫細胞的細胞膜結合之性質的多肽。就上述(第一或第二)細胞膜結合域而言，可舉出例如跨膜域、脂質錨定物(lipid anchor)、醣脂質錨定物(glycolipid anchor)等。本件第一多肽中之第一細胞膜結合域及本件第二多肽中之第二細胞膜結合域為跨膜域之情形，本件第一多肽及本件第二多肽可稱為內源性膜多肽，本件第一多肽及本件第二多肽中之細胞膜結合域為脂質錨定物或醣脂質錨定物之情形，本件第一多肽及本件第二多肽可稱為周邊膜多肽(peripheral membrane polypeptide)。就第一細胞膜結合域及第二細胞膜結合域而言，較佳為跨膜域，由於已在後述之本實施例證實其效果，而更佳為採用源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域作為第一細胞膜結合域，採用源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域作為第二細胞膜結合域。

就本件第二多肽中之第二細胞膜結合域而言，可為1)源自與本件第二多肽中之TNFRSF分子相同的TNFRSF分子之細胞膜結合域，亦可為2)源自與本件第二多肽中之TNFRSF分子不同的TNFRSF分子之細胞膜結合域、或源自TNFRSF分子以外的多肽之細胞膜結合域。上述1)之情形，亦可使用TNFRSF分子其自身作為本件第二多肽，但較佳為不包含TNFRSF分子之細胞外域(會與TNFRSF分子之配體結合的區域)者。此外，上述2)之情形，TNFRSF分子之細胞內域與第二細胞膜結合域成為嵌合的關係。

就本件第二多肽而言，由於與CAR不同，而較佳為不包含對於以下標的分子的結合域(例如對於標的分子之單鏈抗體)者，該標的分子係存在於表現本件第二多肽之免疫細胞所作為標的之細胞。

就本件第二多肽而言，較佳為具有以下細胞外域者(即後述之本實施例中的類型(IV)之分子[本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體])，該細胞外域包含源自於存在於表現本件組合多肽的免疫細胞之受體的配體分子之胺基酸序列。

就本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體中的配體分子而言，可舉出例如細胞激素、趨化介素、Wnt、TGFβ等。就上述細胞激素而言，可舉出例如IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL15、IL21、IL1α、IL1β、IL18、IL33、IL36、IL37、IL38等，由於已在後述之本實施例證實其效果，可合適地例示選自IL7及IL21的細胞激素。就本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體中的配體分子而言，較佳為本件第一多肽中之膜型細胞激素以外的本件細胞激素。亦即，採用例如IL2TM或IL7TM作為本件第一多肽中之膜型細胞激素之情形，就本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體中的配體分子而言，較佳為IL15。

就本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體中的包含源自於配體分子的胺基酸序列之細胞外域而言，例如，除了前述之源自於人類、小鼠或大鼠的IL15、IL2、或IL7的細胞外域的胺基酸序列以外，還可舉出： 含有具有與人類IL4的胺基酸序列(序列識別號18)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類的IL4受體結合之活性的多肽； 含有具有與人類IL6的胺基酸序列(序列識別號19)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類的IL6受體結合之活性的多肽； 含有具有與人類IL9的胺基酸序列(序列識別號21)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類的IL9受體結合之活性的多肽； 含有具有與人類IL21的胺基酸序列(序列識別號23)之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與人類的IL21受體結合之活性的多肽等。

就本件組合多肽編碼區所採用之本件第一多肽編碼區而言，只要於使本件第一多肽編碼區在免疫細胞中表現時，本件細胞激素細胞外域存在於(內源性細胞激素原本存在的)細胞外，則可為從上游起以本件細胞激素細胞外域編碼區及第一細胞膜結合域編碼區的順序連結而成者，亦可為從上游起以第一細胞膜結合域編碼區及本件細胞激素細胞外域編碼區的順序連結而成者。又，就本件組合多肽編碼區所採用之本件第二多肽編碼區而言，只要於使本件第二多肽編碼區在免疫細胞中表現時，本件TNFRSF分子細胞內域存在於(內源性TNFRSF分子之細胞內域原本存在的)細胞內，則可為從上游起以本件TNFRSF分子細胞內域編碼區及第二細胞膜結合域編碼區的順序連結而成者，亦可為從上游起以第二細胞膜結合域編碼區及本件TNFRSF分子細胞內域編碼區的順序連結而成者。

本件組合多肽編碼區所採用之(第一或第二)細胞膜結合域編碼區，係藉由參照(第一或第二)細胞膜結合域的胺基酸序列、與對應各種生物種之公知的密碼子表，而發明所屬技術領域中具有通常知識者可具體且明確地掌握對應該胺基酸序列之核苷酸序列。例如，(第一或第二)細胞膜結合域為含有源自人類CD8α的跨膜域的胺基酸序列(具有與序列識別號16的胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列)的多肽之情形，可例示編碼源自人類CD8α的跨膜域的cDNA(多核苷酸)(亦即，包含具有與序列識別號51的核苷酸序列之至少80%序列同一性的核苷酸序列之多核苷酸)。

本件組合多肽編碼區中的本件第一多肽編碼區及本件第二多肽編碼區，可為由各自分別的多核苷酸所構成的組合，亦可為同一多核苷酸，為同一多核苷酸之情形，可藉由將本件第一多肽編碼區與本件第二多肽編碼區之間透過編碼自切割肽(亦稱為自剪切肽)的多核苷酸連結，而本件第一多肽與本件第二多肽在免疫細胞內獨立地表現。於本說明書中，就自切割肽而言，可舉出例如源自口蹄疫病毒(FMDV)之2A肽(自切割肽F2A)、源自馬鼻炎A病毒(ERAV)之2A肽(自切割肽E2A)、源自豬鐵士古病毒-1(PTV-1)之2A肽(自切割肽P2A)、源自明脈扁刺蛾(Thosea asigna)病毒(TaV)等之2A肽(自切割肽T2A)等，較佳為自切割肽T2A。作為該自切割肽T2A，具體而言，可舉出具有與序列識別號14的胺基酸序列之至少80%序列同一性的多肽。

就本件組合多肽編碼區中的本件第二多肽編碼區而言，由於與編碼CAR的多核苷酸不同，而較佳為不包含編碼對於以下標的分子的結合域(例如對於標的分子之單鏈抗體)之多核苷酸者，該標的分子係存在於進行基因導入本件組合多肽編碼區之免疫細胞所作為標的之細胞。

就本件組合多肽編碼區中的本件第二多肽編碼區而言，由於已在後述之本實施例證實其效果，而較佳為具有編碼以下細胞外域的多核苷酸者(亦即，編碼本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體的多核苷酸)，該細胞外域包含源自於存在於進行基因導入本件組合多肽編碼區的免疫細胞之受體的配體分子之胺基酸序列。

＜3.多肽表現技術・本件免疫細胞＞ 本發明提供：將包含本件多核苷酸的載體(即本件載體)對免疫細胞進行基因導入之方法；經導入本件載體的免疫細胞(即本件免疫細胞(1))；表現本件多肽的免疫細胞(即本件免疫細胞(2-1)或本件免疫細胞(2-2))；本件免疫細胞的製造方法(製作方法)等。

就本件載體而言，若為包含啟動子、與可操作地連結於該啟動子之下游的本件多核苷酸，且可轉錄本件多核苷酸所編碼的mRNA者，則不特別限制。

本件載體之中，就包含本件組合多肽編碼區者而言，可為包含第一啟動子與可操作地連結於第一啟動子之下游的本件第一多肽編碼區且進一步包含第二啟動子與可操作地連結於第二啟動子之下游的本件第二多肽編碼區者、或包含第一啟動子與可操作地連結於第一啟動子之下游的本件第一多肽編碼區之載體及包含第二啟動子與可操作地連結於第二啟動子之下游的本件第二多肽編碼區之載體的組合，但亦可為本件第一多肽編碼區及本件第二多肽編碼區可操作地連結於一個啟動子之下游者。後者之情形，可藉由將本件第一多肽編碼區與本件第二多肽編碼區之間透過編碼自切割肽的多核苷酸連結，而本件第一多肽與本件第二多肽在免疫細胞內獨立地表現。

本件載體可因應目的而適宜選擇，可舉出例如非病毒載體(例如附加型載體(episomal vector)、人造染色體載體、質體載體)或病毒載體。又，載體可為環狀者，亦可為線狀者。

就本件載體中所使用的啟動子而言，若為RNA聚合酶(較佳為RNA聚合酶及基本轉錄因子)會結合，且使位於其下游之本件多核苷酸所編碼的mRNA之轉錄開始的區域，則不特別限制，可舉出例如SRα啟動子、SV40早期啟動子、病毒的LTR(末端長重複序列(Long Terminal Repeat))、CMV(巨細胞病毒)啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子、HSV-TK(單純疱疹病毒胸苷激酶)啟動子、EF1α啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子等。又，亦可將人類CMV的IE基因之強化子與啟動子一起使用。就一例而言，可使用CAG啟動子(包含巨細胞病毒強化子與雞β-肌動蛋白啟動子與β-球蛋白基因的poly A訊息部位)。

上述附加型載體係能夠在染色體外自主複製之載體。使用附加型載體之具體的手段已揭示於Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)。於本發明之一實施態樣中，可使用將loxP序列同方向地配置於附加型載體之複製所需要的載體要素之5’側及3’側而成的附加型載體。附加型載體由於能夠在染色體外自主複製，即使不併入至基因體亦可提供在宿主細胞內之穩定的表現。

就上述附加型載體而言，可舉出例如包含源自於EBV、SV40等的自主複製所需要的序列作為載體要素之載體。作為自主複製所需要的載體要素，具體而言為複製起始點、及編碼與複製起始點結合而調控複製的蛋白質之基因，例如於EBV可舉出複製起始點oriP與EBNA-1基因，於SV40可舉出複製起始點ori與SV40LT基因。

就上述人造染色體載體而言，可舉出YAC(酵母菌人造染色體)載體、BAC(細菌人造染色體)載體、PAC (P1-衍生人造染色體)載體等。

就上述質體載體而言，可舉出pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。

上述所謂病毒載體，係意指利用病毒的感染能力及複製能力之基因載體，更具體而言，係意指包含由病毒基因體除去關於病原性之基因且併入外來基因(本案之情形，為本件多核苷酸)的病毒載體質體(可為DNA，亦可為RNA)之病毒粒子(亦稱為「重組病毒」)。就上述病毒載體而言，可舉出反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV；Adeno-associated virus)載體、仙台病毒載體、疱疹病毒載體、牛痘病毒載體、痘病毒載體、小兒麻痺病毒載體、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)載體、棒狀病毒載體、副黏液病毒載體、正黏液病毒載體等。

病毒載體(即重組病毒)可藉由以下方法而獲得：將包含本件多核苷酸、往病毒之封入所需要的區域(例如LTR)等之病毒製作用質體載體、或是該病毒製作用質體載體及表現病毒粒子之形成所需要的構成基因(例如gag、pol、env)之包裝質體(packaging plasmid)，使用脂質轉染(lipofection)法、電穿孔法、磷酸鈣法等方法而對PG13細胞株(ATCC[美國典型培養物保藏中心]，CRL-10686)、PA317細胞株(ATCC，CRL-9078)、Lenti-X293T細胞株(Takara Bio公司製，632180)、PLAT-A細胞株、PLAT-E細胞株、PLAT-F細胞株、PLAT-GP細胞株等包裝細胞(packaging cell)進行轉染，回收包含重組病毒之培養上清液，且因應需要而濃縮重組病毒。於重組病毒之濃縮，可因應病毒的種類而使用適當的套組(例如Lenti-X concentrator [Takara Bio公司製，631232])。就該病毒製作用質體載體而言，可舉出例如為慢病毒製作用質體載體之pLVSIN EF1α pur (Takara Bio公司製，6186)及pLVSIN-IRES-ZsGreen1 (Takara Bio公司製，6191)、或為反轉錄病毒製作用質體載體之pQCXIX (Takara Bio公司製，Z1515N)、或為AAV製作用質體載體之pAAV-CMV (Takara Bio公司製，6651)等。於將上述病毒製作用質體載體或上述包裝質體對細胞進行轉染之際，可使用導入輔助試藥(例如Opti-MEM IReduced Serum Media [Thermo Fisher Scientific公司製，31985070])。上述病毒製作用質體載體與包裝質體的轉染，可適宜選擇因應病毒的種類之套組而進行，例如病毒載體為慢病毒之情形，可使用例如Lentiviral High Titer Packaging Mix (Takara Bio公司製，6194)等。又，就包裝細胞而言，可使用例如293細胞或具有高轉染效率之293T細胞(具體而言，為前述之Lenti-X293T細胞株)。

就製作慢病毒之更具體的方法而言，可舉出例如下述方法：將上述病毒製作用質體、前述之Lentiviral High Titer Packaging Mix、及TransIT-293轉染試劑(Takara Bio公司製，MIR2704)於前述之Opti-MEM I Reduced Serum Media中混合，於保溫15分鐘後添加到事前培養至半滿(semiconfluent)的前述之Lenti-X 293T細胞株中，培養24～48小時後，回收培養液中包含的慢病毒，因應需要而使用Lenti-Xconcentrator (Takara，631232)，且按照步驟準則來濃縮慢病毒。

本件載體除了啟動子以外，亦可依期望而含有強化子、poly A附加訊息、標記基因、複製起始點、編碼與複製起始點結合而調控複製的多肽之基因等。該所謂標記基因，係指藉由將該標記基因進行基因導入至細胞而使細胞的篩選或選擇成為可能之基因。就上述標記基因之具體例而言，可舉出抗藥性基因、螢光蛋白質基因、發光酵素基因、呈色酵素基因等。此等可單獨使用1種，亦可將2種以上併用。就上述抗藥性基因之具體例而言，可舉出新黴素抗性基因、四環黴素抗性基因、康黴素抗性基因、吉歐黴素抗性基因、潮黴素抗性基因等。就上述螢光蛋白質基因之具體例而言，可舉出藍色螢光蛋白質(BFP)、綠色螢光蛋白質(GFP)基因、黃色螢光蛋白質(YFP)基因、紅色螢光蛋白質(RFP)基因等。就上述發光酵素基因之具體例而言，可舉出螢光素酶基因等。就上述呈色酵素基因之具體例而言，可舉出β半乳糖苷酶基因、β葡萄糖醛酸酶(β glucuronidase)基因、鹼性磷酸酶基因等。

就本件免疫細胞(1)而言，若為導入本件載體，且本件多肽(即本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體或本件組合多肽)於細胞膜上表現的免疫細胞即可。又，就本件免疫細胞(2-1)而言，若為本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體於細胞膜上表現的免疫細胞即可。又，就本件免疫細胞(2-2)而言，若為本件組合多肽於細胞膜上表現的免疫細胞即可。本件免疫細胞，係通常在容器(例如培養盤或皿、細胞保存用或細胞分取用管)內的液體中或經液體潤濕(濕的)狀態生存・維持。就該液體而言，若為本件免疫細胞可生存・維持者，則不特別限制，可舉出例如培養液(例如含或不含血清、且/或含或不含上述細胞激素之培養液)、生理食鹽水、磷酸緩衝化生理食鹽水、Tris緩衝化生理食鹽水、HEPES緩衝化生理食鹽水、林格氏液(乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、重碳酸林格氏液等)、5%葡萄糖水溶液等液體。就上述血清而言，可舉出例如0.1～30(v/v)%的血清(胎牛血清[Fetal bovine serum；FBS]、小牛血清[Calf bovine serum；CS]等)。又，就上述培養液而言，可舉出例如動物細胞培養用培養液(DMEM、EMEM、IMDM、RPMI1640、αMEM、F-12、F-10、M-199、AIM-V等)。又，就上述不含血清的培養液(無血清培養液)而言，可舉出例如適量(例如、1～30%)添加有市售的B27補充劑(-胰島素)(Life Technologies公司製)、N2補充劑(Life Technologies公司製)、B27補充劑(Life Technologies公司製)、Knockout血清替代品(Invitrogen公司製)等血清替代物之上述動物細胞培養用培養液。本件免疫細胞由於即使在不含細胞激素的條件下亦可生存・維持，就上述培養液而言，較佳為不含細胞激素的培養液。

於本件免疫細胞(1)及本件免疫細胞(2-1)中表現的本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體，由於並非免疫細胞內源性的，而必然為外源性者。又，於本件免疫細胞中表現之本件第一多肽為包含本件細胞激素細胞外域與(第一)細胞膜結合域者，由於並非免疫細胞內源性的，而必然為外源性者。另一方面，於本件免疫細胞中表現之本件第二多肽，係依態樣而會包含與免疫細胞內源性者相同之物，但並非內源性者，而為外源性者。

本件免疫細胞可藉由將本件載體對免疫細胞進行基因導入而製作。就將本件載體對免疫細胞進行基因導入之方法而言，若為適於本件載體及免疫細胞的方法即可，例如，使用非病毒載體作為本件載體之情形，可舉出例如：如國際公開第96/10038號小冊、國際公開第97/18185號小冊、國際公開第97/25329號小冊、國際公開第97/30170號小冊、及國際公開第97/31934號小冊(藉由引用而視為本說明書的一部分)所記載地，使用微脂粒或包含陽離子脂質等之微粒子等的方法；文獻「Jin et al, EMBO Mol Med. 2016 Jul; 8(7): 702-711.」等中記載的導入骨架/基質附著區元件(scaffold/matrix attachment region element)表現之附加型載體的方法；文獻「Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 22;8:131-140.」中記載的使用將PiggyBac法等轉位子系的導入方法中所採用的病毒粒子進行放射線照射而破壞內含物而成之外殼等的方法；藉由例如使用CRISPR/Cas9或鋅指核酸酶(zinc finger nuclease)的基因體編輯技術，而對目的之細胞的基因體導入本件載體(具體而言，線狀之本件載體)的方法(例如美國專利第8,956,828號公報)等。

又，使用病毒載體(即重組病毒)作為本件載體之情形，就將本件載體對免疫細胞進行基因導入之方法而言，可舉出使用前述之包含重組病毒之培養上清液、或經濃縮的重組病毒而使免疫細胞感染病毒的方法。

本件免疫細胞(2-1)及本件免疫細胞(2-2)亦可藉由對免疫細胞導入本件多肽而製作。就將本件多肽進行基因導入至免疫細胞的方法而言，並無特別限制，可適宜選擇公知的方法而使用。就該種方法而言，可舉出例如使用蛋白質導入試藥的方法、使用蛋白質導入域(PTD)融合蛋白質的方法、顯微注射法等。就蛋白質導入試藥而言，已市售以陽離子性脂質為基底的BioPOTER(註冊商標)蛋白質遞送試劑(Gene Therapy Systmes公司製)及Pro-JectTM蛋白質轉染試劑(PIERCE公司製)、以脂質為基底的Profect-1 (Targeting Systems公司製)、以膜穿透性肽為基底的Penetratin Peptide (Q biogene公司製)及Chariot套組(Active Motif公司製)、利用HVJ套膜(不活化仙台病毒)的GenomONE(石原產業公司製)等。

就本件免疫細胞(2-2)而言，較佳為經導入搭載有第一多肽及第二多肽之載體的免疫細胞、或是經導入搭載有第一多肽之載體及搭載有第二多肽之載體的免疫細胞。就該「搭載有第一多肽及第二多肽之載體」而言，若為第一多肽與第二多肽被搭載於同一載體者即可，具體而言可舉出：前述之包含第一啟動子與可操作地連結於第一啟動子之下游的本件第一多肽編碼區，且進一步包含第二啟動子與可操作地連結於第二啟動子之下游的本件第二多肽編碼區之載體；或本件第一多肽編碼區及本件第二多肽編碼區可操作地連結於一個啟動子之下游，且將本件第一多肽編碼區與本件第二多肽編碼區之間透過編碼自切割肽的多核苷酸而連結之載體。又，就上述「搭載有第一多肽之載體及搭載有第二多肽之載體」而言，若為第一多肽與第二多肽被搭載於不同載體者即可，此處，作為「搭載有第一多肽之載體」，具體而言可舉出前述之包含第一啟動子與可操作地連結於第一啟動子之下游的本件第一多肽編碼區之載體，作為「搭載有第二多肽之載體」，具體而言可舉出前述之包含第二啟動子與可操作地連結於第二啟動子之下游的本件第二多肽編碼區之載體。

免疫細胞可從血液、骨髓液等體液、或脾臟、胸腺、淋巴結等組織、或浸潤於原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織的免疫細胞進行單離、純化而獲得。又，免疫細胞為T細胞之情形，亦可單離周邊血液單核細胞(PBMC)後藉由抗CD3抗體刺激而獲得。

將本件免疫細胞應用於自體細胞治療之情形，就本件治療或預防方法而言，可為於將本件免疫細胞投予至需要治療或預防疾病之對象的步驟之前，進一步包含以下之步驟者。 a)從需要治療或預防疾病之對象採集免疫細胞的步驟； b)將包含本件多核苷酸的載體(即本件載體)進行基因導入至所採集之免疫細胞的步驟；及 c)培養(擴大培養)包含本件免疫細胞之細胞集團的步驟。

於一個態樣中，所採集之免疫細胞(較佳為包含T細胞或NK細胞之細胞集團，更佳為PBMC或CD3陽性細胞區分(fraction))亦可於基因導入前以因應免疫細胞的種類或性質之刺激因子處理而使其活化。免疫細胞為T細胞之情形，通常以可溶型或膜結合型之抗CD3抗體(例如OKT3或mOKT3)及/或抗原呈現細胞(例如人造抗原呈現細胞[aAPC；artificial antigen presenting cell]、表現膜型之抗CD3單株抗體的抗原呈現細胞)進行刺激，但亦可因應T細胞的種類或性質而適宜選擇其他適當的刺激因子・條件。又，免疫細胞為NK細胞之情形，就刺激因子而言，係使用抗CD16抗體、IL2、IL18等。又，如PBMC地使用T細胞與NK細胞的混合物之情形，亦可適宜組合前述之刺激因子而使用。

又，於其他的態樣中，進行基因導入本件載體之免疫細胞係以成為一定的細胞濃度(例如0.1～2×10 ⁶個細胞/mL)的方式懸浮，而添加至病毒結合盤。該病毒結合盤可藉由將前述之重組病毒濃縮液添加至塗覆5～10μg/mL之抗CD3抗體(殖株名：OKT3)及20～100μg/mL之RetroNectin的盤而製作。

就用於基因導入的培養液而言，可採用例如前述之添加有血清或血清替代物、IL-2等細胞激素的培養液(例如AIM-V [Thermo Fisher Scientific公司製，12055083])。添加有免疫細胞的病毒結合盤亦可進行離心處理。

上述步驟b)亦可反覆進行複數次(例如2～10次之範圍內，較佳為2、3、4或5次)，以使免疫細胞中之本件多肽的表現達成至充分的程度。

於一個態樣中，上述步驟b)亦可繼續進行連續2日以上，例如連續2日、連續3日、連續4日。又，使用病毒結合盤而將本件載體進行基因導入至免疫細胞之情形，可每2～3日交換培養液，且連續培養5～20日。

將本件免疫細胞應用於異體細胞治療之情形，可藉由採用通常的基因導入方法或使用CRISPR/CAS9等的基因編輯方法等，而將包含本件多核苷酸的載體(即本件載體)導入幹細胞(例如，ES細胞、iPS細胞等多潛能性幹細胞；由多潛能性幹細胞被分化誘導成血球系細胞的細胞等)。例如，對於該多潛能性幹細胞，使用基因體編輯技術而將本件載體導入多潛能性幹細胞之基因體，製作經適當地基因導入的多潛能性幹細胞。多潛能性幹細胞由於能夠進行增幅，可藉由在需要的時期增幅需要量，且實施往T細胞等免疫細胞之分化誘導，而應用於異體治療。

＜4.本件醫藥、疾病的治療或預防方法＞ 本發明提供：包含本件免疫細胞之醫藥；藉由投予本件免疫細胞之疾病的治療或預防方法等。

就本件醫藥而言，可為由本件免疫細胞其自身所構成者，亦可為包含本件免疫細胞及添加劑的組成物之形態(即醫藥組成物)。就該添加劑而言，可例示例如藥學上容許之通常的載劑、黏合劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、pH緩衝劑、等張劑、被覆劑、增溶劑、助溶劑等摻合成分。

本件免疫細胞，係如後述之本實施例所示，不僅具有免疫細胞之細胞增殖改善作用，作為治療用免疫細胞之治療效果亦高。因此，本件免疫細胞可有利地應用於用以在過繼性免疫細胞療法等方法使用之醫藥。

於本說明書中，所謂「免疫細胞之細胞增殖改善」，係意指改善在細胞激素不存在下培養免疫細胞時發生的細胞存活率降低及/或細胞增殖效率降低，且/或改善對活體內投予免疫細胞後在活體內的免疫細胞之細胞存活率降低及/或細胞增殖效率降低。

本件免疫細胞，係藉由對於可期待對於需要治療或預防疾病之對象所固有的疾病之治療效果或預防效果的免疫細胞集團導入本件載體而製作本件免疫細胞，且將本件免疫細胞放回該對象之活體內，藉此而可治療或預防疾病。就可用於這種治療或預防的源自對象之免疫細胞集團而言，可例示例如在癌症患者中，具有攻擊作為治療對象的癌細胞之活性的T細胞或NK細胞(例如，表現對於癌症表面抗原之TCR的細胞集團等)等。

就本件免疫細胞而言，較佳為除了本件多肽以外，進一步表現治療或預防用肽/多肽者。表現治療或預防用肽/多肽的本件免疫細胞，係除了本件多核苷酸以外，進一步包含編碼治療或預防用肽/多肽之多核苷酸者。表現治療或預防用肽/多肽的本件免疫細胞，由於藉由本件多肽之效果而改善細胞增殖，而可使所表現之治療或預防用肽/多肽的治療效果或預防效果持續、及/或增強。

就應用於本發明之治療或預防用肽/多肽而言，並不特別限制，可舉出例如對於存在於作為治療或預防標的之細胞的標的分子之單株抗體；包含對於相同標的分子之單鏈抗體(scFv)、跨膜域及ITAM細胞內訊息傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)；包含辨識成為自體免疫疾病之原因的自體抗體之抗原、跨膜域及ITAM細胞內訊息傳遞區之嵌合自體抗體受體(CAAR)；TCR；生理活性肽；細胞激素；趨化介素；酵素替代療法用酵素等，由於已在後述之本實施例證實其效果，可合適地例示CAR。

就上述生理活性肽而言，可舉出例如生長激素(GH)肽、副甲狀腺激素(PTH)肽、紅血球生成素(EPO)肽、類升糖素肽1受體(GLP-1R)配體肽、排鈉肽(例如心房排鈉肽[ANP]、腦排鈉肽[BNP]、C型排鈉肽[CNP])等應用於醫療之肽。

就上述酵素替代療法用酵素而言，可舉出例如阿糖苷酶α (Alglucosidase alfa)、阿加糖酶α (Agalsidase alfa)、阿加糖酶β (Agalsidase Beta)、伊米苷酶(Imiglucerase)、維拉苷酶α (Velaglucerase alfa)等。

就本件醫藥(本件免疫細胞)的治療或預防對象之疾病而言，可因應在本件免疫細胞中表現之治療或預防用肽/多肽的種類或性質而適宜選擇。例如， 治療或預防用肽/多肽為CAR之情形，應用本件醫藥之疾病為癌症(大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟癌、胰臟癌、膽管癌、淋巴瘤、白血病等)等， 治療或預防用肽/多肽為CAAR之情形，應用本件醫藥之疾病為自體免疫疾病(重症肌無力症、風濕病、多發性硬化症、視神經脊髓炎、IgG4相關疾病、膜性腎病變、快速進行性腎絲球腎炎、擴張性心肌病變等)等， 治療或預防用肽/多肽為GH肽之情形，應用本件醫藥之疾病為成人生長激素缺乏症等， 治療或預防用肽/多肽為PTH肽之情形，應用本件醫藥之疾病為骨質疏鬆症等， 治療或預防用肽/多肽為EPO肽之情形，應用本件醫藥之疾病為貧血、膠原病(慢性關節性風濕病、全身性紅斑狼瘡等)、慢性感染症(結核病、感染性心內膜炎、肝膿腫等)、過敏性疾病(異位性皮膚炎、乾癬等)、自體免疫疾病(風濕病、多發性硬化症等)、腫瘤(卵巢腫瘤、黑色素瘤等)、慢性腎衰竭、甲狀腺低能症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)等， 治療或預防用肽/多肽為GLP-1R配體肽之情形，應用本件醫藥之疾病為代謝疾病(第2型糖尿病、高血壓、異常血脂症、脂肪肝等)等， 治療或預防用肽/多肽為排鈉肽之情形，應用本件醫藥之疾病為心臟衰竭(急性心臟衰竭(AHF)、腎病變、心臟纖維化(類澱粉變性症)等， 治療或預防用肽/多肽為阿糖苷酶α之情形，應用本件醫藥之疾病為龐貝氏症等， 治療或預防用肽/多肽為阿加糖酶α或阿加糖酶β之情形，應用本件醫藥之疾病為法布瑞氏症(Fabry’s disease)、溶體儲積症等， 治療或預防用肽/多肽為伊米苷酶之情形，應用本件醫藥之疾病為高雪氏症(Gaucher’s disease)等， 治療或預防用肽/多肽為維拉苷酶α之情形，應用本件醫藥之疾病為溶體儲積症、高雪氏症等。 表現治療或預防用肽/多肽的本件免疫細胞，因由本件多肽所致之效果，而即使在無法期待高濃度之細胞激素的活體內亦可良好地維持生存・細胞增殖，所以因治療或預防用肽/多肽在活體內恆定地表現，而可充分期待對於此等疾病之持續性的治療效果或預防效果。因此，投予本件醫藥(本件免疫細胞)之治療或預防對象為罹患任意疾病者(疾病患者)或有任意疾病之發病風險者。

為本件醫藥之有效成分的本件免疫細胞，係即使投予至治療或預防對象之前不進行超過10日的事前培養，亦在活體內可良好地維持生存及/或細胞增殖。因此，從時間對效果比或費用對效果比方面來看，本件醫藥中的本件免疫細胞，係即使藉由在將本件載體對免疫細胞進行基因導入後短期間被投予至治療或預防對象，亦可期待治療效果或預防效果。此處就「基因導入後短期間」之上限而言，可舉出例如基因導入後10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日、1日(24小時)等，可合適地例示10日(亦即，對本件免疫細胞進行基因導入後10日以內)。又，就該期間之下限而言，可舉出例如基因導入後0小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時等。

將本件免疫細胞投予(移植)至需要過繼性免疫細胞療法的對象(患者)之情形，此等免疫細胞之提供者(供體)與投予之對象(接受者)可相同(自體移植)，亦可為不同的過繼性免疫細胞療法(亦即，異體移植之過繼性免疫細胞療法)，但從迴避移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease；GVHD)之觀點來看，較佳為供體與接受者相同的過繼性免疫細胞療法(亦即，自體移植之過繼性免疫細胞療法)。

將本件免疫細胞投予至治療或預防對象之情形，就投予之本件免疫細胞的細胞數而言，由於依治療或預防之疾病的種類、程度、或投予對象的人種、性別、年齡等而不同，而無法一概地特定，但通常為1×10 ⁴～1×10 ⁹，較佳為1×10 ⁵～1×10 ⁸，更佳為1×10 ⁶～1×10 ⁷。

就本件免疫細胞之投予方法而言，可舉出例如使用導管進行插入、對冠狀動靜脈內或直接對組織或臟器進行輸注、對靜脈進行注射等方法。

＜5.本件製備方法＞ 就本發明之其他的態樣而言，提供選擇性地濃縮・製備藉由將包含本件多核苷酸的載體(即本件載體)對免疫細胞進行基因導入而適當地導入所期望之基因的免疫細胞集團之方法(本件製備方法)。經適當地基因導入本件載體之免疫細胞，由於與基因導入失敗的免疫細胞比較而具有經改善之細胞增殖作用，可藉由基因導入操作後一定期間在體外進行細胞培養，而製備經選擇性地濃縮之細胞集團。

就本件製備方法而言，若為包含將本件載體進行基因導入至免疫細胞的步驟(A)、及將經基因導入之免疫細胞於基因導入後培養5日以上的步驟(B)之製備包含本件免疫細胞之細胞集團的方法，則不特別限制，此處就「5日以上」而言，可舉出例如8日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、15日以上、16日以上、17日以上、18日以上、19日以上、20日以上等，製備高純度之包含本件免疫細胞的細胞集團之情形，較佳為15日以上。此外，於利用本件免疫細胞之疾病的預防或治療中，由於未必需要選擇性地濃縮經適當地導入所期望之基因的免疫細胞集團(本件免疫細胞集團)，即使藉由如上述之本件載體之基因導入後短期間的本件免疫細胞投予亦可得到治療或預防效果。

為了使用本件製備方法而製備高純度之包含本件免疫細胞的細胞集團，較佳為於上述步驟(B)中，將經基因導入之免疫細胞在配體蛋白質(較佳為全部的本件細胞激素)不存在下進行培養，其中該配體蛋白質係會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，且藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞。於本說明書中，所謂「高純度之包含本件免疫細胞的細胞集團」，係意指細胞集團中所包含的本件免疫細胞數之比例為至少80%，較佳為至少85%，更佳為至少88%，進一步較佳為至少90%，進一步更佳為至少92%，特佳為至少94%，最佳為至少96%。

於本件製備方法中，得到同時表現本件多核苷酸以外的基因的細胞作為本件免疫細胞之情形，可於步驟(A)中使用在事前導入其他的基因的免疫細胞，亦可使用同時搭載有本件多核苷酸與其他的基因之本件載體。可藉由本件製備方法而特異性地濃縮表現該其他的基因的免疫細胞，例如可製造表現所期望之CAR的免疫細胞之含有比例高的細胞集團。

於上述步驟(A)中，免疫細胞為T細胞之情形，可於將包含T細胞的PBMC進行抗CD3抗體刺激前或進行抗CD3抗體刺激後，將本件載體進行基因導入，亦可與抗CD3抗體刺激同時進行基因導入。又，T細胞為具有特定性質的細胞集團之情形，亦可採用因應該細胞集團的種類或性質之刺激因子來替代抗CD3抗體。就將本件載體對免疫細胞進行基因導入之方法而言，若為適於本件載體及免疫細胞的方法即可，可舉出例如前述之電穿孔法、磷酸鈣法、脂質轉染法、病毒感染法等方法。又，免疫細胞係如前述地，可從血液、骨髓液等體液、或脾臟、胸腺、淋巴結等組織、或浸潤於原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織的免疫細胞進行單離、純化而獲得。

使用病毒載體(即重組病毒)作為基因導入至免疫細胞的本件載體之情形，就使重組病毒感染免疫細胞的方法而言，並不特別限制，可因應目的而適宜選擇，可舉出例如凝聚胺(Polybrene)法(具體而言，使用凝聚胺而使重組病毒粒子感染免疫細胞的方法)、RetroNectin法(具體而言，使用塗覆RetroNectin的容器[例如培養盤或皿]而使重組病毒粒子感染免疫細胞的方法)等。

於上述步驟(B)中，就用於經基因導入之免疫細胞的培養之培養液而言，可舉出例如包含0.1～30(v/v)%的血清(FBS、CS等)之動物細胞培養用培養液(DMEM、EMEM、IMDM、RPMI1640、αMEM、F-12、F-10、M-199、AIM-V等)、MyeloCult H5100培養基(STEMCELL Technologies公司製，ST-05150)等。又，就不含血清的培養液(無血清培養液)而言，可舉出例如前述之適量(例如1～30%)添加有市售的B27補充劑(-胰島素)、N2補充劑、B27補充劑、Knockout血清替代品等血清替代物之上述動物細胞培養用培養液等。

於上述步驟(B)中，經基因導入之免疫細胞的培養溫度通常為約30～40℃之範圍內，較佳為37℃。又，培養時的CO ₂濃度通常為約1～10%之範圍內，較佳為約5%。又，培養時的溼度通常為約70～100%之範圍內，較佳為約95～100%之範圍內。又，培養時的O ₂濃度可為正常氧濃度(18～22% O ₂)，亦可為低氧濃度(0～10% O ₂)。

本件免疫細胞的純度，可使用經螢光物質(例如異藻藍蛋白(APC)、藻紅素(PE)、FITC(螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate))、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 700、PE-Texas Red、PE-Cy5、PE-Cy7等)標識的對於本件細胞激素之抗體，將本件免疫細胞進行染色，並使用Hoechst 33342、Hoechst 33258等進行活細胞的染色，或使用DAPI(4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole))、TO-PRO-3 Iodide 二碘化4-[3-(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亞基)-1-丙烯基]-1-[3-(三甲銨基)丙基]-喹啉鎓(Quinolinium,4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1- [3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodide)、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain (Life Technology公司製)、7-胺基放線菌素D (7-aminoactinomycin D)、碘化丙啶(Propidium Iodide；PI)等進行死細胞的染色，且藉由流式細胞測量術解析而測定細胞集團中的活細胞數與本件免疫細胞數，作為本件免疫細胞在活細胞中所占的比例來算出。

就本件套組而言，若為被特定於所謂「為了改善免疫細胞的細胞增殖」的用途之包含本件多核苷酸、本件多肽或本件載體之套組，則不特別限制，該套組中通常包含一般此種套組所包含者，例如載劑；pH緩衝劑；穩定劑；操作說明書；記載將本件多核苷酸、本件多肽、或本件載體進行基因導入至免疫細胞中的方法之說明書等。

以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明之技術範圍並不限定於此等之例示。此外，未將來源動物種一併記載於基因名之情形，係使用源自人類的基因。又，細胞培養係於37℃、5% CO ₂條件下進行。 [實施例]

於以下之實施例中，作為各實驗手法而採用以下之方法。 [病毒製作用質體載體] 於往人類T細胞之目的基因導入所使用的慢病毒的製作，係使用將pLVSIN IRES-ZsGreen1 (Takara Bio公司製，6191)所包含的編碼綠色螢光蛋白質(ZsGreen1)之基因序列取代為編碼其他螢光蛋白質的BFP之基因序列的pLVSINIRES-BFP。目的基因係導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位(multiple cloning site)，製備慢病毒製作用質體載體。於標的細胞的樹立，係使用pLVSIN IRES-ZsGreen1或pLVSIN EF1α pur (Takara Bio公司製，6186)。於往人類NK細胞之目的基因導入所使用的反轉錄病毒的製作，係使用pMSGV1(文獻「Hum GeneTher. 2005 Apr;16(4):457-72.」)。目的基因係與編碼自切割肽T2A(序列識別號14)及GFP之基因連結，插入pMSGV1的啟動子之下游，製備反轉錄病毒製作用質體載體。

[慢病毒之製備] 使用含有10%胎牛血清(FBS；Fetal Bovine Serum)之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM；Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Thermo Fisher Scientific公司製，10566-016)，先將Lenti-X 293T細胞株(Takara Bio公司製，632180)培養至長滿(confluent)，於轉染當日使用胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific公司製，12563029)進行剝離，以成為70%～80%滿之方式再接種於T培養瓶(T-flask)。2～4小時後，將上述慢病毒製作用質體載體、Lentiviral High Titer Packaging Mix (Takara Bio公司製，6194)及TransIT-293轉染試劑(Takara Bio公司製，MIR2704)與Opti-MEM I Reduced Serum Media (Thermo Fisher Scientific公司製，31985070)混合，於保溫15分鐘後添加至Lenti-X293T細胞株。於翌日以含有10% FBS之DMEM培養基進行培養基交換後，培養24小時而回收上清液。因應需要而於上清液回收後再添加含有10% FBS之DMEM培養基而培養24小時，將上清液再回收。所回收的上清液係於進行過濾器處理後，添加1/3量的Lenti-X concentrator (Takara Bio公司製，631232)，在4℃保溫1小時以上，進行離心(1000～4000×g，30～45分鐘)，使病毒沉澱。吸除上清液，以含有5% FBS之AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司製，12055083)(以下稱為「基礎培養基」)溶解沉澱物，作為慢病毒濃縮液而冷凍保存在-80℃或-150℃。

[反轉錄病毒之製備] 使用含有10% FBS之DMEM培養基，先將PLAT-F細胞(文獻「Exp Hematol. 2003 Nov;31(11):1007-14.」)培養至長滿，於轉染當日使用胰蛋白酶進行剝離，以成為70%～80%滿之方式再接種於T培養瓶。2～4小時後，將上述反轉錄病毒製作用質體載體及X-tremeGENE HP DNA轉染試藥(Roche公司製，6366236001)與Opti-MEM I Reduced Serum Media混合，於保溫15分鐘後添加至PLAT-F細胞株。於翌日以含有10% FBS之DMEM培養基進行培養基交換後，培養24小時而回收上清液。所回收的上清液係於進行過濾器處理後，添加1/3量的Retro-X concentrator (Takara Bio公司製，631456)，在4℃保溫1小時以上，進行離心(1000～4000×g，30～45分鐘)，使反轉錄病毒沉澱。吸除上清液，以MyeloCult H5100 (STEMCELL Technologies公司製，ST-05150)溶解沉澱物，製備反轉錄病毒濃縮液。

[目的基因表現T細胞之製備] 使用PBS(磷酸鹽緩衝生理食鹽水)，將抗CD3抗體(Biolegend公司製，317347)以成為5～10μg/mL的方式稀釋，將RetroNectin (Takara Bio公司製，T100B)以成為20～100μg/mL的方式稀釋，添加至未處理孔培養皿(Non-Treatment well dish)。在室溫靜置2小時或在4℃靜置整夜後，以PBS清洗，製備塗覆盤(以下稱為「CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤」)。將病毒濃縮液添加至盤，以2000×g進行離心2小時，藉此製備病毒結合盤。使用以終濃度成為100U/mL的方式添加有IL2 (Nipro公司製，87-890；或共和藥品公司製，58697900)的基礎培養基(以下稱為「IL2培養基」)，將源自人類的周邊血液單核細胞(PBMC；Cellular Technology Limited公司製，CTL-UP1)以成為1～2×10 ⁶個細胞/mL的方式懸浮，添加至病毒結合盤，以300×g進行離心3～5分鐘。依試驗，係於CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤混合慢病毒濃縮液及PBMC，以1000×g進行離心1小時。從培養3日後起使用3種類之培養基(基礎培養基、IL2培養基、或以成為10ng/mL的方式添加有IL15 [Miltenyi Biotec公司製，130-095-762]的基礎培養基[以下稱為「IL15培養基」])，而每1～3日交換全量培養基。製備表現膜型細胞激素的T細胞時，係從培養3日後起以基礎培養基進行培養基交換。因應需要而所回收的細胞係懸浮於CELLBANKER1 (Takara Bio公司製，CB011)使其成為0.5～1×10 ⁷個細胞/mL，冷凍保存在-80℃或-150℃。於實驗使用冷凍細胞之情形，係於融解後在以IL2培養基進行整夜培養後使用。

[目的基因表現NK細胞之製備] 使用PBS，將抗CD16抗體(Biolegend公司製，302050)以成為5μg/mL的方式稀釋，添加至未處理孔培養皿。在室溫靜置2小時或在4℃靜置整夜後，以PBS清洗，添加懸浮於以各自成為100U/mL及100ng/mL的方式添加有IL2及IL18 (R&D systems公司製，9124-IL)的MyeloCult H5100培養基(以下稱為「NK培養基」)的PBMC。於5日後回收細胞，使用CD56 MicroBeads (Miltenyi Biotec公司製，130-050-401)而純化CD56陽性細胞(即NK細胞)。使用PBS，將抗CD16抗體以成為5μg/mL的方式稀釋，將RetroNectin以成為20μg/mL的方式稀釋，添加至未處理孔培養皿。在室溫靜置2小時或在4℃靜置整夜後，以PBS清洗，製備塗覆盤(以下稱為「CD16 Ab/RetroNectin塗覆盤」)。使用NK培養基將CD56陽性細胞以成為1～2×10 ⁶個細胞/mL的方式懸浮，與反轉錄病毒濃縮液混合，而以1000×g進行離心1小時。從培養3日後起，使用MyeloCult H5100培養基而每1～3日交換全量培養基。

[流式細胞測量術] 於T細胞(即CD3陽性細胞)之檢測，係使用螢光標識抗CD3抗體(Alexa Fluor 488抗人類CD3抗體[Biolegend公司製，317310]，於NK細胞(即CD56陽性CD3陰性細胞)之檢測，係使用螢光標識抗CD56抗體(APC抗人類CD56抗體[Biolegend公司製，318310])及螢光標識抗CD3抗體(APC/Cy7抗CD3抗體[Biolengend公司製，300426])，於8種類之膜型細胞激素(IL15-IL15Rα、IL2TM、IL4TM、IL6TM、IL7TM、IL15TM、IL9TM及IL21TM)之檢測，係使用螢光標識抗體CD215抗體(PE抗人類CD215抗體[Biolegend公司製，330208])、及7種類之生物素化抗體(生物素化抗IL2抗體[生物素化抗人類IL2抗體〔Peprotech公司製，500-P22BT〕]、生物素化抗IL4抗體[生物素化抗人類IL4抗體〔Peprotech公司製，500-P24BT〕]、生物素化抗IL6抗體[生物素化抗人類IL6抗體〔Peprotech公司製，500-P26BT〕]、生物素化抗IL7抗體[生物素化抗人類IL7抗體[Peprotech公司製，500-P27BT]]、生物素化抗IL15抗體[生物素化抗人類IL15抗體〔Peprotech公司製，500-P15BT〕]、生物素化抗IL9抗體[生物素化抗人類IL9抗體〔Peprotech公司製，500-P29BT〕]、及生物素化抗IL21抗體[生物素化抗人類IL21抗體〔Peprotech公司製，500-P21BT〕])，於DYKDDDDK (FLAG)標籤之檢測，係使用螢光標識抗FLAG抗體(PE/Cy7抗DYKDDDDK標籤抗體[Biolegend公司製，637324])。將上述螢光標識抗體或生物素化抗體懸浮於FACS緩衝液(包含0.5% BSA、2mM EDTA及0.09%疊氮化物的PBS)使其成為1～10μg/mL後，添加至細胞，在4°C進行反應15分鐘。然後，以FACS緩衝液清洗，檢測上述生物素化抗體之情形，係將螢光標識鏈球菌親生物素蛋白(streptavidin) (APC/Fire 750鏈球菌親生物素蛋白[Biolegend公司製，405250])以FACS緩衝液稀釋100倍後，添加至細胞，在4℃保溫15分鐘之後，以FACS緩衝液清洗。抗體染色完畢的細胞係懸浮於含有1～10μg/mL 7-胺基放線菌素D (7-AAD；WAKO公司製，016-25241)之FACS緩衝液，而使用流式細胞儀(Miltenyi biotec公司製，MACSQuant Analyzer10，130-096-343)進行測定。作為FCS檔案擷取後，使用FLOW JO軟體(FLOWJO LLC公司製，VER.10.7.1)，於 FSC/SSC圖中選擇細胞區分，將為7-胺基放線菌素D陰性/BFP陽性之細胞群計數為經基因導入之活T細胞。

[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗] 將懸浮於IL2培養基的PBMC添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，且藉由添加慢病毒濃縮液而使表現各分子之慢病毒進行感染後，每1～3日的培養基交換係全部使用基礎培養基來實施。以試驗開始日為第0日，隨時間經過地進行採樣，按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，測定經基因導入之活T細胞(7-胺基放線菌素D陰性BFP陽性細胞)數。經基因導入之活T細胞的總數，係以採樣液量換算為總液量而算出。又，於隨時間經過的變化數據，因採樣而細胞數減少，所以作為稀釋倍率而與測定細胞數數據相乘，算出經基因導入之活T細胞的總數。

[不含細胞激素之條件下的NK細胞增殖試驗] 將懸浮於NK培養基的CD56陽性細胞添加至CD16 Ab/RetroNectin塗覆盤，且藉由添加反轉錄病毒濃縮液而使表現各分子之反轉錄病毒進行感染後，每1～3日的培養基交換係全部使用MyeloCult H5100培養基來實施。以試驗開始日為第0日，隨時間經過地進行採樣，按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，測定經基因導入之活NK細胞(亦即，7-胺基放線菌素D陰性、CD3陰性、CD56陽性且GFP陽性之細胞)數。經基因導入之活NK細胞的總數，係以採樣液量換算為總液量而算出。又，於隨時間經過的變化數據，因採樣而細胞數減少，所以作為稀釋倍率而與測定細胞數數據相乘，算出經基因導入之活NK細胞的總數。

[細胞毒殺活性評價] 為了樹立ZsGreen1基因導入RAJI細胞，首先係使用pLVSIN-IRES-ZsGreen1，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作慢病毒。將所製作之慢病毒按照規定方法而感染CD19陽性的RAJI細胞株(自ATCC取得，CCL-86)後，藉由限數稀釋法(limiting dilution)進行選殖，藉此樹立ZsGreen1基因導入RAJI細胞株。此外，於RAJI細胞株的培養，係使用含有10% FBS之RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640培養基(Thermo Fisher Scientific公司製，61870-036)。為了樹立CD19表現HeLa細胞株(CD19+HeLa細胞株)，首先按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，將編碼連結源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、源自CD19的細胞外域及跨膜域(序列識別號25)、間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)以及GFP而成的多肽之基因，導入pLVSIN EF1α pur，製作慢病毒。將所製作之慢病毒按照規定方法而感染HeLa S3細胞株(自ATCC取得，CCL-2.2)後，藉由限數稀釋法進行選殖，樹立CD19+HeLa細胞株。此外，於HeLa細胞株之培養，係使用含有10% FBS之DMEM培養基(Thermo Fisher Scientific公司製，10566-016)。將細胞毒殺活性之評價對象的T細胞1×10 ⁴個添加至96孔盤，將等量(即1×10 ⁴個)的RAJI細胞株或CD19+HeLa細胞株添加至各自獨立之孔，而進一步進行培養。培養係全部使用基礎培養基。於3日後，將T細胞之半量按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，解析3種類之螢光訊號(ZsGreen1、GFP及BFP)後，將1×10 ⁵個RAJI細胞或2×10 ⁴個CD19+HeLa細胞添加至剩餘半量的T細胞，而進一步進行培養。於7日後、12日後及14日後以同樣的手法各自分取半量的T細胞，按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，測定活RAJI細胞(7-胺基放線菌素D陰性ZsGreen1陽性細胞)數、活CD19+HeLa細胞(7-胺基放線菌素D陰性GFP陽性細胞)數及活CAR-T細胞(7-胺基放線菌素D陰性BFP陽性細胞)數。細胞毒殺活性係以將CAR-T細胞非添加孔之標的細胞數當作100%之情形的殘存標的細胞數表示。

[體內增殖試驗] 作為超免疫不全小鼠，而使用2種類之小鼠(NOD/Shi-scid-IL2Rγnull [NOG小鼠]及NOD.Cg-Prkdc＜scid＞IL2rg＜tm1Sug＞ B2m＜em1Tac＞ H2-Ab1＜tm1Doi＞/Jic [NOG-ΔMHC小鼠])。將3種類之T細胞(BFP表現對照T細胞、「IL15TM-CD137」表現T細胞及「IL15TM-HVEM」表現T細胞)，對5週齡(雄性)之上述2種類之小鼠進行尾靜脈投予。於9～14日後進行安樂死，採集脾臟而機械性地分散後，使用RBC溶胞緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司製，00-4333-57)進行溶血。採樣細胞懸浮液，添加含有10μg/mL 7-胺基放線菌素D之FACS緩衝液，按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，測定經基因導入之活T細胞(7-胺基放線菌素D陰性BFP陽性細胞)數。

[抗腫瘤活性之評價] 使用經導入螢光素酶基因之pLVSIN EF1α pur，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法製作慢病毒後，使其感染CD19+HeLa細胞株，樹立螢光素酶表現CD19+HeLa細胞株。懸浮於PBS後，將1×10 ⁶個螢光素酶表現CD19+HeLa細胞株對6週齡(雌性)的NOG小鼠腋窩進行皮下投予，製作擔癌模式小鼠。於11日後，將1×10 ⁵個的2種類之CAR-T細胞(「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞或「CAR(CD3ζ)/IL15TM-OX40」表現T細胞)投予至頸靜脈內。時序性地投予螢光素(Promega公司製，P1041)，使用FUSION FX7.EDGE (Vilber Lourmat公司製)測定源自螢光素之發光程度。

〈實施例1：先前技術中，不含細胞激素之條件下的T細胞增殖並不充分〉 用於過繼性免疫細胞療法的T細胞等治療用免疫細胞，係為了發揮所要求的功能，而有於活體內增殖或生存之必要性。已知T細胞係於體外的培養中，要求有IL15、IL2或IL7等細胞激素，一般而言，係以成為1～10ng/mL的濃度之方式添加此等細胞激素而進行培養。然而，已有報告：於活體內，此等細胞激素的濃度極低(非專利文獻3、4)。因此，於體外的培養中所觀察到的T細胞之增殖雖於高濃度之細胞激素條件下能夠實現，但預期在體內(活體內)則無法期待。對於此課題，作為提高T細胞的增殖性之方法，而已知使IL15留滯於細胞膜上的方法(非專利文獻5、6、專利文獻3)。為了探討此等之方法是否即使於在活體內所被預期的不含細胞激素之條件下亦會賦予充分的細胞增殖，而評價不含細胞激素之培養基中的體外細胞增殖性。

於本實施例中，係採用一邊使PBMC所包含的T細胞與抗CD3抗體進行反應一邊進行基因導入的方法。在最初，確認增殖之細胞中的T細胞之比例。將懸浮於IL2培養基之源自6供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，使其感染使用pLVSIN IRES-BFP(對照載體)而製備之慢病毒。於3日後及7日後回收細胞，按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，進行使用BFP之螢光訊號及螢光標識抗CD3抗體的抗體染色，評價BFP表現細胞中的CD3陽性細胞(即T細胞)之比例。

其結果，BFP陽性細胞及CD3陽性細胞之比例，係各自以中央值(第1四分位數-第3四分位數)計為97.8% (97.5%-98.8%)及99.6% (99.4%-99.8%)，顯示BFP陽性的(即經基因導入之)99%的細胞為CD3陽性(即T細胞)(圖1A)。亦即，確認培養3日後以後之基因表現細胞可視為T細胞。

其次，評價將表現留滯於細胞膜的細胞激素的T細胞以不含細胞激素之培養基進行培養時的細胞增殖能力。此外，於本說明書中，有時將留滯於細胞膜的細胞激素(即膜型細胞激素)於其細胞激素的基因名(基因符號(gene symbol))之後附加TM而表現(例如IL15TM)，有時將未留滯於細胞膜的一般的細胞激素於其細胞激素的基因名之前附加「s」而表現(例如sIL15)。

為了製作表現IL15TM(圖1B)作為膜型細胞激素的T細胞，將編碼於IL15TM之N末端附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)而成的多肽(序列識別號1)之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。又，為了製作「IL15-IL15Rα」(圖1B)表現T細胞，而將編碼於「IL15-IL15Rα」之N末端附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)而成的多肽(序列識別號2)之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體，且使用所製作之表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法而製作慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自6供體的PBMC各自添加至CD3Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC。從培養3日後(即從感染起3日後)起移至基礎培養基而進行培養，製備IL15TM表現T細胞及「IL15-IL15Rα」表現T細胞。又，作為對照，使包含空載體(pLVSIN IRES-BFP)之慢病毒感染6供體的PBMC，從培養3日後起，移至3種類之培養基(基礎培養基、IL2培養基、或IL15培養基)而進行培養，製備BFP表現對照T細胞。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，而使用流式細胞儀測定BFP陽性T細胞數，以將培養3日後作為基準之倍率變化來評價細胞數變化率。

其結果，BFP表現對照T細胞係相對於在基礎培養基中從7日後起細胞數減少，而在IL2培養基或IL15培養基中則可見到持續性的增殖(圖1C)。在另一方面，IL15TM表現T細胞及「IL15-IL15Rα」表現T細胞，係於基礎培養基中，於許多供體，增殖在培養11～14日後停止(圖1D)。 此結果顯示：於如在活體內所被預期的不含細胞激素之條件下，僅使IL15TM或「IL15-IL15Rα」在免疫細胞(T細胞)中表現，則無法賦予與細胞激素添加同等之細胞增殖性。

[表1] 不含細胞激素之培養基中的先前的膜型IL15表現T細胞之細胞數變化率

表現分子	培養培養基	培養終點之細胞數變化率中央值 (第1四分位數-第3四分位數)
BFP	基礎培養基	＜ 0.1
BFP	IL2培養基	411.2 (221.5-536.8)
BFP	IL5培養基	181.2 (141.8-321.4)
IL15TM	基礎培養基	14.5 (10.3-60.4)
IL15-IL15Rα	基礎培養基	0.2 (0.1-0.3)

〈實施例2：若使源自TNFRSF分子的細胞內域與膜型IL15連結，則T細胞在不含細胞激素之條件下會增殖〉 於T細胞的活化中，作為輔助對於TCR/CD3複合體的抗原特異性刺激之訊息，對於CD28或CD137而言，已知抗原非特異性共刺激(輔助刺激)及細胞激素履行重要的任務。然而，迄今為止並未探討對於細胞激素之增殖功能的共刺激之任務。發明人等認為CD28或CD137或許有輔助細胞激素之功能的可能性，而於其組合膜型IL15來進行探討。

將編碼使源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、及源自9種類之共刺激分子(7種類之TNFRSF分子[TNFR2〔序列識別號5〕、OX40〔序列識別號6〕、HVEM〔序列識別號7〕、CD27〔序列識別號8〕、CD137〔序列識別號9〕、CD30〔序列識別號10〕或DR3〔序列識別號11〕]、或2種類之CD28家族分子[CD28〔序列識別號12〕或ICOS〔序列識別號13〕])的細胞內域各自與於N末端側附加有源自IL2的訊息肽(序列識別號3)之IL15(序列識別號22)的C末端側連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體，且按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自6供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，從培養3日後起，以基礎培養基進行培養。又，針對BFP表現對照T細胞與為對照組之IL15TM表現T細胞，亦藉由實施例1中記載的方法來製作，同樣地進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定BFP陽性細胞數。試驗結果係以將BFP表現對照T細胞之增殖停止的培養8日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果，若使連結上述源自7種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27、CD137、CD30及DR3)的細胞內域而成的膜型IL15 (IL15TM-TNFR2、IL15TM-OX40、IL15TM-HVEM、IL15TM-CD27、IL15TM-CD137、IL15TM-CD30及IL15TM-DR3)在T細胞表現，則細胞增殖效率於全部的供體中比使先前之膜型IL15表現之情形更為改善，若以中央值作為基準，則高5～24倍(圖2及表2)。在另一方面，若使連結上述源自2種類之CD28家族分子(CD28及ICOS)的細胞內域而成的膜型IL15 (IL15TM-CD28及IL15TM-ICOS)在T細胞表現，則與使先前之膜型IL15表現之情形相比，細胞增殖效率最大也止於改善2倍之程度。亦即，細胞增殖效率充分地經改善的分子均屬於TNFRSF，改善程度弱的分子均為屬於CD28家族之分子。

此結果顯示：於免疫細胞中，若使膜型IL15以與源自TNFRSF分子的細胞內域連結之狀態表現，則與僅使膜型IL15表現之免疫細胞或使膜型IL15與源自為TNFRSF分子以外的共刺激分子之CD28家族分子的細胞內域連結而表現之免疫細胞相比，在不含細胞激素的培養條件下之細胞增殖性係改善。於在體外的培養中，以改善T細胞的增殖性為目的而添加抗CD28抗體的手法已廣為人知，而且一般於CAR大多採用CD28或CD137，因此並非CD28家族分子，而是只有TNFRSF分子的訊息會輔助由細胞激素所致之T細胞的增殖性一事令人驚訝。

[表2] 連結源自共刺激分子的細胞內域而成的膜型IL15表現T細胞之細胞數變化率及 改善率 表中的「改善率」，係意指於終點，細胞數變化率比對照組更大，且細胞數變化率成為1以上的供體數之比例。

〈實施例3：TNFRSF分子係與膜型IL15共表現而發揮功能〉 為了評價對於改善在不含細胞激素的培養條件下之細胞增殖性是需要源自TNFRSF分子的細胞內域與膜型IL15物理性地連結，或是不需要該物理性的連結而只是使源自TNFRSF分子的細胞內域與膜型IL15同時於細胞內表現即為充分，將細胞激素與TNFRSF分子的表現樣式針對3種類之類型(圖3A)，使各個分子或融合蛋白質表現而解析細胞數變化率。該3種類之類型，具體而言，為分泌型IL15及源自TNFRSF分子的細胞內域各自獨立地表現之類型(I)；膜型IL15及源自TNFRSF分子的細胞內域各自獨立地表現之類型(II)；以及膜型IL15及源自TNFRSF分子的細胞內域連結且作為融合蛋白質而表現之類型(III)。

為了製作表現上述類型(I)之分子的T細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於C末端側使間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)、源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、FLAG標籤序列(序列識別號28)、源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及源自5種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27及CD137)的細胞內域(序列識別號5～9)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體(圖3B)。有將表現之此等多肽各自記述為sIL15/TNFR2、sIL15/OX40、sIL15/HVEM、sIL15/CD27及sIL15/CD137之情形。

又，為了製作表現上述類型(II)之分子的T細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於C末端側使源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)、源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、FLAG標籤序列(序列識別號28)、源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及上述源自5種類之TNFRSF分子的細胞內域(序列識別號5～9)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體(圖3B)。有將表現之此等多肽各自記述為IL15TM/TNFR2、IL15TM/OX40、IL15TM/HVEM、IL15TM/CD27及IL15TM/CD137之情形。

又，為了製作表現上述類型(III)之融合蛋白質的T細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於IL15(序列識別號22)的C末端側使源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及上述源自5種類之TNFRSF分子的細胞內域(序列識別號5～9)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體(圖3B)。有將表現之此等多肽各自記述為IL15TM-TNFR2、IL15TM-OX40、IL15TM-HVEM、IL15TM-CD27及IL15TM-CD137之情形。

使用所製作之表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作各種慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自5供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，從3日後起以基礎培養基進行培養。又，針對BFP表現對照T細胞與為對照組之sIL15表現T細胞及IL15TM表現T細胞，亦藉由實施例1中記載的方法來製作，同樣地進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定BFP陽性細胞數。試驗結果係以將BFP表現對照T細胞之增殖停止的培養6日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果，表現類型(I)之分子的(亦即，分泌型IL15及源自TNFRSF分子的細胞內域各自獨立地表現之)T細胞之增殖效率，係與表現分泌型IL15的T細胞之增殖效率比較，而於大多數的供體，以中央值作為基準而為1倍以下。另一方面，表現類型(II)之分子的(亦即，IL15TM及源自TNFRSF分子的細胞內域各自獨立地表現之)T細胞之增殖效率，係與表現IL15TM的T細胞之增殖效率比較，而依每種供體及所組合之源自TNFRSF分子的細胞內域的種類，可見到1倍以下至16倍為止的偏差，但在大致一半之程度的供體可見到細胞增殖的改善。再者，表現類型(III)之融合蛋白質的(亦即，IL15TM與源自TNFRSF分子的細胞內域連結而成的融合蛋白質)T細胞之增殖效率，係與表現IL15TM的T細胞之增殖效率比較，而於全部的供體可見到改善，高14～50倍(圖3C及表3)。 此等之結果顯示為了作為由細胞激素所致之免疫細胞(T細胞)增殖的輔助訊息之TNFRSF分子發揮功能，而IL15有並非分泌型而是作為膜型留滯之必要，並且顯示源自TNFRSF分子的細胞內域係即使於使其與膜型IL15獨立地在免疫細胞中表現之情形亦可見到一定的效果，但藉由與膜型IL15連結作成融合蛋白質，而更有效地發揮功能。

[表3] 表現類型(Ⅰ)～(Ⅲ)之分子的T細胞之細胞數變化率及改善率 表中的「改善率」，係意指於終點，細胞數變化率比對照組大，且細胞數變化率成為1以上的供體數之比例。

〈實施例4：IL2及IL7若作為與TNFRSF分子之嵌合配體而使其於免疫細胞中表現，則會改善免疫細胞之細胞增殖性〉 於IL15以外，作為使T細胞活化之細胞激素，亦已知IL15以外的γc細胞激素家族。因此探討：使此等細胞激素作為膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體而表現時是否亦同樣地可在不含細胞激素的培養條件下使T細胞增殖。

為了製作表現先前型之膜型細胞激素的T細胞，而將編碼於6種類之細胞激素(IL2[序列識別號17]、IL4[序列識別號18]、IL6[序列識別號19]、IL7[序列識別號20]、IL9[序列識別號21]或IL21[序列識別號23])各個之N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於各個之C末端側使源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)及源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體(有將表現之此等多肽各自記述為IL2TM、IL4TM、IL6TM、IL7TM、IL9TM及IL21TM之情形)。又，為了製作表現膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的T細胞，而將編碼於先前型之膜型細胞激素的表現載體中之源自CD8α的跨膜域的C末端側使源自2種類之TNFRSF分子(TNFR2或OX40)的細胞內域(序列識別號5或序列識別號6)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體(有將表現之此等多肽各自記述為IL2TM-TNFR2、IL4TM-TNFR2、IL6TM-TNFR2、IL7TM-TNFR2、IL9TM-TNFR2、IL21TM-TNFR2、IL2TM-OX40、IL4TM-OX40、IL6TM-OX40、IL7TM-OX40、IL9TM-OX40及IL21TM-OX40之情形)。使用所製作之表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作各種慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自6供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，從3日後起以基礎培養基進行培養。又，針對BFP表現對照T細胞與為對照組之6種類之膜型細胞激素表現T細胞(IL2TM表現T細胞、IL4TM表現T細胞、IL6TM表現T細胞、IL7TM表現T細胞、IL9TM表現T細胞及IL21TM表現T細胞)，亦藉由實施例1中記載的方法來製作，同樣地進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定BFP陽性細胞數。試驗結果係以將BFP表現對照T細胞之增殖停止的培養8日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果，使5種類之膜型細胞激素(IL2TM、IL4TM、IL6TM、IL7TM及IL9TM)在T細胞中表現之情形，使用任一細胞激素，培養終點之細胞數變化率皆為1以下，無法維持細胞數(圖4及表4)。另一方面，該5種類之膜型細胞激素之中，即便使3種類之膜型細胞激素(IL4TM、IL6TM及IL9TM)作為與源自2種類之TNFRSF分子(TNFR2或OX40)的細胞內域之嵌合配體而在T細胞中表現，培養終點之細胞數變化率亦未改善為1以上，相對於此，若使2種類之膜型細胞激素(IL2TM及IL7TM)作為與上述源自2種類之TNFRSF分子的細胞內域之嵌合配體而在T細胞中表現，則培養終點之細胞數變化率改善為1以上，且維持細胞數(圖4及表4)。又，於將IL7與HVEM、CD27、CD137及CD30之細胞內域組合而成的嵌合配體中，亦確認到同樣的細胞數維持效果。 此結果顯示：若採用IL2及IL7作為膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體中的細胞激素，則與IL15同樣地可提升在不含細胞激素的培養條件下之免疫細胞的細胞增殖能力。此外，若使IL21TM作為與上述源自2種類之TNFRSF分子的細胞內域之嵌合配體而在T細胞中表現，則與僅使IL21TM在T細胞中表現之情形相比，培養終點之細胞數變化率反而有降低為1以下之傾向。

[表4] 表現包含各種膜型細胞激素的類型(Ⅲ)之分子的T細胞之細胞數變化率及改善率 表中的「改善率」，係意指於終點，細胞數變化率比對照組大，且細胞數變化率成為1以上的供體數之比例。

〈實施例5：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體不依賴於特定連接子肽或特定跨膜域而發揮功能〉 評價本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體中所包含的連接子肽的種類或長度或是跨膜域的種類對不含細胞激素之條件下的T細胞之增殖能力所造成的影響。具體而言，除了作為實施例2～4之類型(III)的融合蛋白質而採用之表現包含源自CD8α之連接子肽及跨膜域的IL15TM-TNFR2的T細胞以外，亦為了製作表現包含源自CD28之連接子肽及跨膜域的IL15TM-TNFR2的T細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於IL15(序列識別號22)的C末端側使源自CD28的連接子肽(序列識別號29)、源自CD28的跨膜域(序列識別號30)及源自TNFR2的細胞內域(序列識別號5)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。又作為對照組，除了表現包含源自CD8α之連接子肽及跨膜域的IL15TM的T細胞以外，亦為了製作表現包含源自CD28之連接子肽及跨膜域的IL15TM的T細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於IL15(序列識別號22)的C末端側使源自CD28的連接子肽(序列識別號29)及源自CD28的跨膜域(序列識別號30)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。又，為了製作表現包含62個胺基酸殘基之源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)的N末端側缺損之由30個胺基酸殘基所構成的源自CD8α的連接子肽(序列識別號31)或由15個胺基酸殘基所構成的源自CD8α的連接子肽(序列識別號32)的IL15TM-TNFR2的T細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於IL15(序列識別號22)的C末端側使2種類之源自CD8α的連接子肽(序列識別號31或序列識別號32)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及源自TNFR2的細胞內域(序列識別號5)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。使用所製作之此等表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作各種慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自5供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，從3日後起以基礎培養基進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定BFP陽性細胞數。又，針對BFP表現對照T細胞，亦同樣地進行培養。試驗結果係以將BFP表現對照T細胞之增殖停止的培養5日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果，表現包含源自CD28之連接子肽及跨膜域的IL15TM-TNFR2的T細胞，係與表現包含源自CD8α之連接子肽及跨膜域的IL15TM-TNFR2的T細胞同樣，在全部的供體顯示比BFP表現對照T細胞更良好的細胞增殖性(圖5A及表5)。 此結果顯示：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體係無關於該嵌合配體中所包含的連接子肽或跨膜域的種類，而有助於在不含細胞激素的培養條件下之免疫細胞的增殖能力改善。

[表5] 表中的「改善率」，係意指於終點，細胞數變化率比連接子肽及跨膜域相同的膜型IL15表現T細胞更大，且細胞數變化率成為1以上的供體數之比例。

又，表現包含胺基酸殘基長不同的3種類之源自CD8α的連接子肽(序列識別號15 [62aa]、序列識別號31 [30aa]或序列識別號32 [15aa])的IL15TM-TNFR2的T細胞，均在全部的供體顯示比BFP表現對照T細胞更良好的細胞增殖性(圖5B及表6)。 此等之結果顯示：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體係不依賴於連接子肽的長度，而有助於在不含細胞激素的培養條件下之免疫細胞的增殖能力改善。

[表6]

〈實施例6：與TNFRSF分子連結的配體分子，係藉由與該受體之結合而活化TNFRSF分子〉 針對膜型IL15與源自TNFRSF分子的細胞內域為獨立地表現之類型(II)的表現樣式，探討細胞增殖性更為改善的方法。具體而言，探討膜型IL15、與使膜型配體分子與TNFRSF分子連結而成者(即「本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體」)為獨立地表現之類型(IV)的表現樣式(圖6A)。為了製作表現類型(IV)之分子的T細胞，而將編碼使源自IL2的訊息肽(序列識別號3)、IL15(序列識別號22)、源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)、源自IL2的訊息肽(序列識別號3)、2種類之配體分子(IL7[序列識別號20]或IL21[序列識別號23])、源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及源自5種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27或CD137)的細胞內域(序列識別號5～9)依序連結而成的多肽(IL15TM/IL7TM-TNFR2、IL15TM/IL7TM-OX40、IL15TM/IL7TM-HVEM、IL15TM/IL7TM-CD27、或IL15TM/IL7TM-CD137；IL15TM/IL21TM-TNFR2、IL15TM/IL21TM-OX40、IL15TM/IL21TM-HVEM、IL15TM/IL21TM-CD27或IL15TM/IL21TM-CD137)之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體(圖6B)。成為比較對照的類型(II)及(III)之分子的表現載體，係按照上述實施例3中記載的方法而製作。使用所製作之表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作各種慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自7供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，從培養3日後起以基礎培養基進行培養。又，針對作為比較對照之BFP表現對照T細胞，亦同樣地進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定BFP陽性細胞數。試驗結果係以將BFP表現對照T細胞之增殖停止的培養7日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果，表現類型(IV)之分子(具體而言，膜型IL15、與經連結膜型IL7或膜型IL21的源自5種類之TNFRSF分子[TNFR2、OX40、HVEM、CD27、或CD137]的細胞內域之組合)的T細胞之增殖效率，係與表現對應類型(IV)之分子的類型(II)之分子(具體而言，膜型IL15、與並未連結膜型IL7或膜型IL21的上述源自5種類之TNFRSF分子的細胞內域之組合)的T細胞之增殖效率比較，而均可見到改善(圖6C及表7)。由於膜型IL7及膜型IL21單獨並不會改善T細胞之增殖(圖4及表4)，因此認為藉由此等細胞激素(配體分子)與該受體之結合，而TNFRSF分子的訊息傳遞被強化的可能性高。亦即，於先前之膜型IL15表現的條件下，與源自TNFRSF分子的細胞內域連結的細胞外域若為存在於免疫細胞之受體的配體分子，則認為能以任一者替代，可預期藉由彼等之配體與受體的結合而下游的TNFRSF分子會活化之機制。

[表7] 表現類型(Ⅳ)之分子的T細胞之細胞數變化率及改善率 表中的「改善率」，係意指於終點，細胞數變化率比對照組大，且細胞數變化率成為1以上的供體數之比例。

〈實施例7：表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的T細胞於體內亦顯著地增殖〉 表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的T細胞，係如實施例2～6所示，於體外顯示良好的增殖，因此探討此增殖是否在體內也會再現。即使將人類T細胞移植到正常動物也會因宿主側的免疫而被排除，因此使用為超免疫不全小鼠之NOG小鼠。又，於人類T細胞往NOG小鼠的移植中，已知移植細胞會與作為宿主之小鼠反應而活化，因此導致移植物抗宿主病(GvHD)，且因認為對T細胞增殖有利，而亦一併探討以減少GvHD的方式所設計之NOG-ΔMHC小鼠。

將上述實施例2中使用的4種類之T細胞(BFP表現對照T細胞、IL15TM表現T細胞、「IL15TM-CD137」表現T細胞及「IL15TM-HVEM」表現T細胞)，按照上述[體內增殖試驗]之項目中記載的方法，對2種類之小鼠(NOG小鼠或NOG-ΔMHC小鼠)各自移植1×10 ⁶個，測定10日後之脾臟中所包含的BFP陽性細胞數。

其結果，若對上述2種類之小鼠投予「IL15TM-CD137」表現T細胞或「IL15TM-HVEM」表現T細胞，則與投予BFP表現對照T細胞或IL15TM表現T細胞之情形相比，可見到移植10日後之脾臟中所包含的BFP陽性細胞數大幅地增加(圖7A)。 此結果顯示：若將表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的免疫細胞移植到活體內，則於活體內可良好地維持生存及細胞增殖。

其次，為了確認於NOG小鼠活體內，表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的T細胞會效率良好地增殖一事並不依賴於成為此等T細胞之來源的供體，而從源自3種類之供體之PBMC製作3種類之T細胞(BFP表現對照T細胞、IL15TM表現T細胞及「IL15TM-HVEM」表現T細胞)，且按照上述[體內增殖試驗]之項目中記載的方法，各自將2×10 ⁶個細胞移植到NOG小鼠，於9日後測定脾臟中所包含的BFP陽性細胞數。

其結果，若將「IL15TM-HVEM」表現T細胞對NOG小鼠進行投予，則針對任一源自供體之細胞，皆與投予BFP表現對照T細胞或IL15TM表現T細胞之情形相比，移植9日後之脾臟中所包含的BFP陽性細胞在小鼠活體中的細胞增殖效率高(圖7B)。 此結果顯示：表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的免疫細胞係不依賴於成為免疫細胞之來源的供體，而於活體內可良好地維持生存或細胞增殖。

〈實施例8：表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的CAR-T細胞顯示良好的細胞毒殺活性〉 作為表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的治療用T細胞之例，可為CAR-T細胞。現在，用於治療者雖主要為被稱為第二代的CAR，但於為類型(III)的表現樣式的本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體中，已使用共刺激分子(TNFRSF分子)而傳遞訊息。因此，作為表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的T細胞，而採用表現被稱為第一代之不包含共刺激分子的CAR之CAR(CD3ζ)的T細胞。首先，為了製作作為第二代CAR之CAR(CD3ζ-CD137)表現T細胞，而將編碼使源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、FLAG標籤(序列識別號28)、間隔子序列(GSG)、辨識CD19之scFv(序列識別號26)、可動性連接子肽(序列識別號27)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、源自CD137的細胞內域(序列識別號9)及CD3ζ細胞內域(序列識別號24)依序連結而成的多肽(圖8B之「CD137-CD3ζ」)之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。又，為了製作作為類型(III)的表現樣式之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體、與CAR(CD3ζ)共表現的T細胞，而將編碼使源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、FLAG標籤序列(序列識別號28)、辨識CD19之scFv(序列識別號26)、可動性連接子肽(序列識別號27)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、CD3ζ細胞內域(序列識別號24)、間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)、源自IL2的訊息肽(序列識別號3)、IL15(序列識別號22)、源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及源自5種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27或CD137)的細胞內域(序列識別號5～9)依序連結而成的多肽(各自為「CAR(CD3ζ)/IL15TM-TNFR2」、「CAR(CD3ζ)/IL15TM-OX40」、「CAR(CD3ζ)/IL15TM-HVEM」、「CAR(CD3ζ)/IL15TM-CD27」及「CAR(CD3ζ)/IL15TM-CD137」)之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。使用所製作之表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作慢病毒。將懸浮於IL2培養基之源自3供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，針對「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞，係以IL2培養基進行培養，CAR(CD3ζ)及5種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-TNFR2」、「IL15TM-OX40」、「IL15TM-HVEM」、「IL15TM-CD27」或「IL15TM-CD137」)的共表現T細胞係從培養3日後起以基礎培養基進行培養。又，為比較對照之BFP表現對照T細胞，係使用IL2培養基而製備。於培養7日後回收細胞，按照上述[細胞毒殺活性評價]之項目中記載的方法，評價對於2種類之癌細胞株(RAJI細胞株及CD19+HeLa細胞株)的細胞毒殺活性(圖8C)。

其結果可知：上述5種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞，係於採用任一TNFRSF分子之情形皆顯示強的細胞毒殺活性(圖8D)，並且效率良好地細胞增殖(圖8E)。尤其是上述5種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞，於第2次添加癌細胞之情形，顯示比現存之第二代CAR-T細胞(即「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞)更強的癌細胞毒殺活性，暗示具有持續性的癌細胞毒殺活性。

〈實施例9：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞顯示良好的抗腫瘤活性〉 於實施例8中，在體外系統確認到本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞具有比先前型之CAR-T細胞更強的癌細胞毒殺活性，因此評價是否在體內亦會發揮該效果。具體而言，使用2種類之CAR-T細胞(「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞、或「CAR(CD3ζ)/IL15TM-OX40」表現T細胞)，按照上述[抗腫瘤活性之評價]之項目中記載的方法，解析抗腫瘤效果。

其結果，若對經移植螢光素酶表現CD19+HeLa細胞之擔癌模式小鼠，移植作為本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞的「CAR(CD3ζ)/IL15TM-OX40」表現T細胞，則與移植作為先前型之CAR-T細胞的「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞之情形相比，源自螢光素之發光程度係顯著地降低(圖9)。 此結果顯示：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞具有比先前型之CAR-T細胞更強的抗腫瘤活性。

〈實施例10：嵌合配體表現細胞顯示濃縮效果〉 於製造作為治療用的CAR-T細胞時，作為品質管理的一環而有基因表現之比例為一定以上之必要，於低於基準值時，存在無法作為治療藥出貨之製造不良，所以存在未達到治療的事例。本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞係於使用基礎培養基的體外培養中顯著地增殖，但在另一方面，未導入基因之T細胞並不增殖，因此使用此增殖性之差，評價是否可提高基因表現之細胞在細胞集團中所占的比例。

首先，為了製作作為第二代CAR之CAR(CD3ζ-CD137)表現T細胞，而將編碼使源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、FLAG標籤(序列識別號28)、間隔子(GSG)、辨識CD19之scFv(序列識別號26)、源自CD28的連接子肽(序列識別號29)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、源自CD137的細胞內域(序列識別號9)及CD3ζ細胞內域(序列識別號24)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。又，為了製作本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞，而將編碼使源自CD8α的訊息肽(序列識別號4)、FLAG標籤(序列識別號28)、間隔子(GSG)、辨識CD19之scFv(序列識別號26)、源自CD28的連接子肽(序列識別號29)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)、CD3ζ細胞內域(序列識別號24)、間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)、源自IL2的訊息肽(序列識別號3)、IL15(序列識別號22)、源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及源自3種類之TNFRSF分子(OX40、CD27或CD137)的細胞內域(序列識別號6、8、或9)依序連結而成的多肽之基因，導入pLVSIN IRES-BFP的多重選殖位，製作表現載體。將懸浮於IL2培養基之源自5供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC，本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞係從3日後起以基礎培養基進行培養，CAR(CD3ζ-CD137)表現T細胞係使用IL2培養基進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的T細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定BFP陽性細胞數。試驗結果係以將BFP表現對照T細胞之增殖停止的培養5日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果顯示：對於細胞整體而被檢測為BFP陽性細胞的「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞之比例，係即使培養15日亦在約32%前後幾乎不變，相對於此，對於細胞整體而被檢測為BFP陽性細胞的3種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-OX40」、「IL15TM-CD27」或「IL15TM-CD137」)表現CAR-T細胞之比例，係藉由15日以上的培養而增加至約96%以上(圖10及表8)。 此結果顯示：藉由將包含本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞之細胞集團在細胞激素(具體而言，IL15、IL2及IL7)不存在下進行培養，而可使本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞在該細胞集團中所占的比例增加。

[表8] 由本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體所致的本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現CAR-T細胞之濃縮效果

〈實施例11：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現T細胞可縮短在體外的培養期間〉 於製造作為治療用的CAR-T細胞時，一般達到需要的細胞數為止需要約14日程度的培養期間。為了不僅改善患者可近性(patient access)且迅速地開始治療，希望縮短培養期間。本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現T細胞，係由於自身表現增殖所需要的細胞激素，而評價是否在對活體內進行投予前不進行數日培養亦可於活體內增殖到需要的細胞數。

使用實施例2中為了製作「IL15TM-OX40」表現T細胞所使用的表現載體，按照上述[慢病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作慢病毒。將懸浮於IL2培養基之1×10 ⁷個源自3供體的PBMC各自添加至CD3 Ab/RetroNectin塗覆盤，按照上述[目的基因表現T細胞之製備]之項目中記載的方法，使所製作之慢病毒感染該PBMC。又，針對為比較對照之BFP表現對照T細胞，亦同樣地使其感染PBMC。於翌日(16小時後)回收細胞，懸浮於200μL之PBS後，按照上述[體內增殖試驗]之項目中記載的方法，移植到NOG小鼠，於9日後測定脾臟中所包含的BFP陽性細胞數。又，分取上述投予液的一部分(1μL)而接種於96孔盤，以IL2培養基進行培養，於5日後按照上述[流式細胞測量術]之項目中記載的方法，測定經基因導入之活T細胞(BFP陽性細胞)數。

首先，確認到BFP表現對照T細胞及「IL15TM-OX40」表現T細胞的基因導入效率為相同程度(表9)。另一方面，若將未事前培養的「IL15TM-OX40」表現T細胞移植到NOG小鼠，則與將BFP表現對照T細胞移植到NOG小鼠之情形相比，移植9日後之脾臟中所包含的BFP陽性細胞在小鼠活體中的細胞增殖效率高(圖11)。 此結果顯示：表現本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體的免疫細胞並無如CAR-T細胞地進行超過10日的事前培養之必要，且藉由培養至少16小時而於活體內中可良好地維持生存或細胞增殖。

[表9] 供應動物試驗之基因導入細胞的基因導入效率

〈實施例12：嵌合配體使NK細胞增殖〉 為了確認本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體於T細胞以外的免疫細胞中亦可改善細胞增殖性，而評價對於NK細胞的細胞增殖性之改善效果。

為了製作5種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-OX40」、「IL15TM-TNFR2」、「IL15TM-HVEM」、「IL15TM-CD137」及「IL15TM-CD27」)表現NK細胞，而將編碼於IL15(序列識別號22)的N末端側附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)且於IL15(序列識別號22)的C末端側使源自CD8α的連接子肽(序列識別號15)、源自CD8α的跨膜域(序列識別號16)及上述源自5種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27、或CD137)的細胞內域(序列識別號5～9)依序連結而成的多肽之基因，與編碼間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)及GFP之基因連結，插入pMSGV1的啟動子之下游，製作表現載體，且按照上述[反轉錄病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作反轉錄病毒。又，為了製作IL15TM表現NK細胞，而使編碼於IL15TM之N末端附加源自IL2的訊息肽(序列識別號3)而成的多肽(序列識別號1)之基因，與編碼間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)及GFP之基因連結，插入pMSGV1的啟動子之下游，製作表現載體，且按照上述[反轉錄病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作反轉錄病毒。又，為了製作GFP表現對照NK細胞，而將編碼間隔子(GSG)、自切割肽T2A(序列識別號14)及GFP之基因插入pMSGV1的啟動子之下游，製作表現載體，且按照上述[反轉錄病毒之製備]之項目中記載的方法，而製作反轉錄病毒。按照上述[目的基因表現NK細胞之製備]之項目中記載的方法，由7供體各自製備CD56陽性細胞，添加至CD16 Ab/RetroNectin塗覆盤，使所製作的反轉錄病毒感染該CD56陽性細胞，從3日後起以NK培養基進行培養。按照上述[不含細胞激素之條件下的NK細胞增殖試驗]之項目中記載的方法，隨時間經過地進行採樣，使用流式細胞儀測定NK細胞(CD3陰性CD56陽性)中的GFP表現細胞數。試驗結果係以將GFP表現對照NK細胞之增殖停止的培養5日後作為基準之倍率變化，來評價細胞數變化率。

其結果，針對5種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-OX40」、「IL15TM-TNFR2」、「IL15TM-HVEM」、「IL15TM-CD137」及「IL15TM-CD27」)表現NK細胞之任一者，皆為細胞數變化率於大多數的供體中比IL15TM表現NK細胞更為改善，若以中央值作為基準，則改善8～50倍(圖12及表10)。 此結果顯示：本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體可改善免疫細胞全般之細胞增殖性。

[表10] 本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體表現NK細胞之細胞數變化率及改善率 表中的「改善率」，係意指於終點，細胞數變化率比對照組大，且細胞數變化率成為1以上的供體數之比例。 [產業上利用之可能性]

本發明有助於使用治療或預防用免疫細胞的疾病之治療或預防。

[序列表非關鍵詞文字]

無

圖1中圖1A顯示以抗CD3抗體刺激PBMC並使其感染BFP表現慢病毒，於3日後及7日後採樣，進行使用抗CD3抗體的流式細胞測量術解析之結果。左圖為等高線圖(X軸：BFP，Y軸：CD3)，右圖表示BFP陽性細胞群中的CD3陽性率(表現BFP的CD3陽性細胞[T細胞]之比例)。圖1B係IL15TM及「IL15-IL15Rα」的表現樣式之示意圖。圖1C係顯示將BFP表現對照T細胞以3種類之培養基(基礎培養基[-]、IL2培養基[+IL2]或IL15培養基[+IL15])培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。圖1D係顯示將IL15TM表現T細胞及「IL15-IL15Rα」表現T細胞以基礎培養基(-)培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。圖1C及1D之各散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)中的符號(□、◇、△、×、○、+)表示各供體。 圖2係顯示將表現源自7種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27、CD137、CD30、或DR3)的細胞內域或源自2種類之CD28家族分子(CD28或ICOS)的細胞內域、與膜型IL15連結而成之分子(後述之類型(III)之分子)的T細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。各散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)中的符號(□、◇、△、×、○、+)表示各供體。 圖3中圖3A係源自細胞激素的細胞外域(圖中之「細胞激素」)與源自TNFRSF分子的細胞內域(圖中之「TNFRSF分子」)之表現樣式的類型(I)、(II)及(III)之示意圖。具體而言，類型(I)的表現樣式係未留滯於細胞膜的一般的細胞激素(以下，有時稱為「分泌型細胞激素」)與源自TNFRSF分子的細胞內域為獨立地表現者，類型(II)的表現樣式係膜型細胞激素與源自TNFRSF分子的細胞內域為獨立地表現者，類型(III)的表現樣式為膜型細胞激素與源自TNFRSF分子的細胞內域係連結且作為融合蛋白質(以下，有時稱為「膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體」)而表現者。圖3B係用以表現類型(I)～(III)之上述分子的構築體之示意圖。圖3C係顯示將表現IL15作為類型(I)～(III)中之細胞激素且表現5種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27及CD137)作為TNFRSF分子的T細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。各散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)中的符號(□、◇、△、×、○)表示各供體。以「/」表示分泌型IL15(可溶性IL15：sIL15)或膜型IL15(跨膜IL15：IL15TM)與源自共刺激分子的細胞內域為獨立地表現，以「-」表示連結而表現。 圖4係顯示將表現IL15以外的6種類之細胞激素(IL2、IL4、IL6、IL7、IL9及IL21)作為類型(III)的表現樣式中之細胞激素的T細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。各散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)中的符號(□、◇、△、×、○、+)表示各供體。 圖5中圖5A係顯示將2種類之IL15TM(包含源自CD8α之連接子肽及跨膜域的IL15TM[圖中之「IL15TM CD8α連接子/TM」]；或包含源自CD28之連接子肽及跨膜域的IL15TM[圖中之「IL15TM CD28連接子/TM」])表現T細胞、或2種類之IL15TM-TNFR2(包含源自CD8α之連接子肽及跨膜域的IL15TM-TNFR2[圖中之「IL15TM-TNFR2 CD8α連接子/TM」]；或包含源自CD28之連接子肽及跨膜域的IL15TM-TNFR2[圖中之「IL15TM-TNFR2 CD28連接子/TM」])表現T細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。圖5B係顯示將包含3種類之源自CD8α的連接子肽(序列識別號15[圖中之「62aa」]、序列識別號31[圖中之「30aa」]、或序列識別號32[圖中之「15aa」])的IL15TM-TNFR2表現T細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。各散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)中的符號(□、◇、△、×、○)表示各供體。 圖6中圖6A係源自細胞激素的細胞外域(圖中之「細胞激素」)與源自TNFRSF分子的細胞內域(圖中之「TNFRSF分子」)之表現樣式的類型(IV)之示意圖。具體而言，膜型細胞激素與本件膜型配體分子-TNFRSF分子之嵌合配體係共表現。圖6B係用以表現類型(IV)之上述分子的構築體之示意圖。圖6C係以散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)顯示將表現IL15作為類型(IV)中之細胞激素、表現2種類之細胞激素(IL7或IL21)作為配體分子、且表現5種類之TNFRSF分子(TNFR2、OX40、HVEM、CD27及CD137)作為TNFRSF分子的T細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。作為比較對照，亦一併表示針對此等源自細胞激素的細胞外域與源自TNFRSF分子的細胞內域之表現樣式的類型(II)及(III)亦同樣地進行解析之結果。各散布圖中的符號(□、◇、△、＊、×、○、+)表示各供體。以「/」表示膜型細胞激素與源自TNFRSF分子的細胞內域為獨立地表現，以「-」表示連結而表現。 圖7中圖7A係顯示將BFP表現對照T細胞(圖中之「BFP」)、IL15TM表現T細胞(圖中之「IL15TM」)、及2種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-CD137」或「IL15TM-HVEM」)表現T細胞各自移植到2種類之小鼠(NOG小鼠或NOG-ΔMHC小鼠)，且於10日後將該小鼠之脾臟中所包含的BFP陽性活細胞數(各種分子表現T細胞數)進行流式細胞測量術解析的結果之圖。圖7B係顯示將BFP表現對照T細胞(圖中之「BFP」)、先前型之膜型IL15表現T細胞(圖中之「IL15TM」)、及本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-HVEM」)表現T細胞移植到NOG小鼠，且於10日後將該小鼠之脾臟中所包含的BFP陽性活細胞數(各種分子表現T細胞數)進行流式細胞測量術解析的結果之圖。圖中的符號(□、△、○)表示T細胞(PBMC)的供體種類。 圖8中圖8A為「CAR(CD137-CD3ζ)」(採用CD137作為共刺激分子而成的CAR)及「CAR(CD3ζ)/IL15TM-CD137」(CAR、與由IL15TM及源自CD137的細胞內域所構成的嵌合配體的共表現)之樣式圖。圖8B係用以表現「CAR(CD137-CD3ζ)」及「CAR(CD3ζ)/IL15TM-CD137」的構築體之示意圖。圖8C顯示CAR-T細胞對於2種類之癌細胞株(RAJI細胞株及CD19+HeLa細胞株)的細胞毒殺活性評價系統之概要。具體而言，顯示對於CAR-T細胞添加上述2種類之癌細胞株(圖中之「第1次癌細胞添加」)，且於3日後在流式細胞測量術解析(圖中之「FCM」)後再度添加癌細胞後(圖中之「第2次癌細胞添加」)，於7、12、14日後進行流式細胞測量術解析。圖8D係顯示針對6種類之表現CAR(「CAR(CD137-CD3ζ)」、「CAR(CD3ζ)/IL15TM-CD137」、「CAR[CD3ζ]/IL15TM-TNFR2」、「CAR[CD3ζ]/IL15TM-OX40」、「CAR[CD3ζ]/ IL15TM-CD27」或「CAR[CD3ζ]/IL15TM-HVEM」)的T細胞(6種類之CAR-T細胞)或BFP表現對照T細胞(圖中之「BFP」)，解析對於上述2種類之癌細胞株的細胞毒殺活性的結果之圖。圖中的符號(□、△、○)表示各供體。圖8E係以散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)顯示將細胞毒殺活性評價系統中的上述6種類之CAR-T細胞或BFP表現對照T細胞(圖中之「BFP」)之細胞數變化率進行解析的結果之圖。 圖9係顯示對經移植螢光素酶表現CD19+HeLa細胞之擔癌(cancer-bearing)模式小鼠投予2種類之CAR-T細胞(「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞、或「CAR(CD3ζ)/IL15TM-OX40」表現T細胞)，以源自螢光素之發光程度為指標而解析該小鼠中的螢光素酶表現CD19+HeLa細胞之存在程度的結果之圖。 圖10係顯示針對以IL2培養基(+IL2)培養的「CAR(CD137-CD3ζ)」表現T細胞(「CAR(CD137-CD3ζ)」)、與以基礎培養基(-)培養的3種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-CD137」、「IL15TM-OX40」或「IL15TM-CD27」)表現CAR-T細胞(「CAR(CD3ζ)/IL15TM-CD137」、「CAR(CD3ζ)/IL15TM-OX40」或「CAR(CD3ζ)/ IL15TM-CD27」)，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。上段的散布圖表示細胞數變化率，下段的散布圖表示BFP陽性活細胞數(各種分子表現T細胞數)之比例。符號(□、◇、△、×、○)表示各供體。 圖11係顯示將BFP表現對照T細胞(圖中之「BFP」)及2種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-OX40」)表現T細胞，不進行前培養而移植到NOG小鼠，且於9日後將該小鼠之脾臟中所包含的BFP陽性活細胞數(「IL15TM-OX40」)表現T細胞數)進行流式細胞測量術解析的結果之圖。 圖12係顯示將GFP表現對照NK細胞(圖中之「GFP」)、IL15TM表現NK細胞、及5種類之本件膜型細胞激素-TNFRSF分子之嵌合配體(「IL15TM-OX40」、「IL15TM-TNFR2」、「IL15TM-HVEM」、「IL15TM-CD137」及「IL15TM-CD27」)表現NK細胞以基礎培養基培養，將細胞數進行流式細胞測量術解析的結果之圖。各散布圖(X軸：日數，Y軸：細胞數變化率)中的符號(□、◇、△、×、-、○、+)表示各供體。

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無。

Claims (38)

1. 一種多核苷酸，其含有編碼細胞外域之細胞外域編碼區、及編碼細胞內域之細胞內域編碼區，其中 該細胞外域含有源自於配體蛋白質的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNF受體超家族(TNFRSF)分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM(基於免疫受體酪胺酸之活化模體(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif))細胞內訊息傳遞區， 該多核苷酸係 (a)被設計為：藉由前述細胞外域及前述細胞內域透過跨膜域連結，而作為以同一多肽表現之含有細胞外域-細胞內域的分子基因，能夠於免疫細胞中表現；或 (b)被設計為：藉由前述細胞外域及前述細胞內域各自與第一細胞膜結合域及第二細胞膜結合域連結，而作為以由第一多肽及第二多肽所構成的組合多肽表現之含有細胞外域的分子基因及含有細胞內域的分子基因，能夠於免疫細胞中表現。
2. 如請求項1之多核苷酸，其中IL15、IL2、IL7及TNFRSF分子源自於人類、小鼠或大鼠。
3. 如請求項1或2之多核苷酸，其中含有源自於會與IL15之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域係含有具有與序列識別號22所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL15受體結合之活性；含有源自於會與IL2之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域係含有具有與序列識別號17所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL2受體結合之活性；含有源自於會與IL7之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域係含有具有與序列識別號20所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL7受體結合之活性。
4. 如請求項1或2之多核苷酸，其中TNFRSF分子為TNFR2、OX40、HVEM、CD27或CD137。
5. 如請求項1或2之多核苷酸，其中免疫細胞為T細胞或自然殺手細胞。
6. 如請求項1或2之多核苷酸，其中跨膜域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。
7. 如請求項1或2之多核苷酸，其中細胞外域及跨膜域透過連接子(linker)肽而連結。
8. 如請求項7之多核苷酸，其中連接子肽為源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽。
9. 如請求項1或2之多核苷酸，其中第一細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域，第二細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。
10. 如請求項1或2之多核苷酸，其中細胞外域及第一細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結，且細胞內域及第二細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結。
11. 如請求項1或2之多核苷酸，其中第一多肽及第二多肽透過自切割肽(self-cleaving peptide)而連結。
12. 如請求項11之多核苷酸，其中自切割肽為自切割肽T2A。
13. 如請求項1或2之多核苷酸，其中第二多肽具有包含以下胺基酸序列的細胞外域之多核苷酸，該胺基酸序列源自於存在於進行基因導入前述多核苷酸的免疫細胞之受體的配體分子。
14. 如請求項13之多核苷酸，其中配體分子為IL7或IL21。
15. 如請求項1或2之多核苷酸，其進一步編碼包含單鏈抗體、跨膜域及ITAM細胞內訊息傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)。
16. 一種載體，其包含啟動子、及可操作地(operably)連結於該啟動子之下游的如請求項1或2之多核苷酸。
17. 一種免疫細胞，其經導入如請求項16之載體。
18. 一種醫藥，其含有如請求項17之免疫細胞。
19. 如請求項18之醫藥，其中免疫細胞係於將如請求項16之載體進行基因導入至前述免疫細胞後、10日以內被投予至治療或預防對象。
20. 一種多肽，其包含細胞外域、跨膜域及細胞內域，其中 該細胞外域含有源自於配體蛋白質的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNF受體超家族(TNFRSF)分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM(基於免疫受體酪胺酸之活化模體)細胞內訊息傳遞區。
21. 一種組合多肽，其係由含有細胞外域及第一細胞膜結合域之第一多肽、以及含有第二細胞膜結合域及細胞內域之第二多肽所構成， 該細胞外域含有源自於配體蛋白質的胺基酸序列，該配體蛋白質為會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞， 該細胞內域含有源自於TNF受體超家族(TNFRSF)分子之細胞內域的區域，且不含有ITAM(基於免疫受體酪胺酸之活化模體)細胞內訊息傳遞區。
22. 如請求項20或21之多肽，其中IL15、IL2、IL7及TNFRSF分子源自於人類、小鼠或大鼠。
23. 如請求項20或21之多肽，其中含有源自於會與IL15之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域，係含有具有與序列識別號22所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL15受體結合之活性；含有源自於會與IL2之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域，係含有具有與序列識別號17所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL2受體結合之活性；含有源自於會與IL7之受體結合之配體蛋白質的胺基酸序列之細胞外域，係含有具有與序列識別號20所示胺基酸序列之至少80%序列同一性的胺基酸序列，且保持與IL7受體結合之活性。
24. 如請求項20或21之多肽，其中TNFRSF分子為TNFR2、OX40、HVEM、CD27或CD137。
25. 如請求項20之多肽，其中跨膜域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。
26. 如請求項20之多肽，其中細胞外域及跨膜域透過連接子肽而連結。
27. 如請求項26之多肽，其中連接子肽為源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽。
28. 如請求項21之多肽，其中第一細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域，第二細胞膜結合域為源自CD8α的跨膜域或源自CD28的跨膜域。
29. 如請求項21之多肽，其中細胞外域及第一細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結，且細胞內域及第二細胞膜結合域透過源自CD8α的連接子肽或源自CD28的連接子肽而連結。
30. 如請求項21之多肽，其中第一多肽及第二多肽透過自切割肽而連結。
31. 如請求項30之多肽，其中自切割肽為自切割肽T2A。
32. 如請求項21之多肽，其中第二多肽具有包含以下胺基酸序列的細胞外域，該胺基酸序列源自於存在於表現前述多肽的免疫細胞之受體的配體分子。
33. 如請求項32之多肽，其中配體分子為IL7或IL21。
34. 一種免疫細胞，其中如請求項20之多肽係於細胞膜上表現。
35. 一種免疫細胞，其中如請求項21之多肽中之第一多肽及第二多肽係於細胞膜上表現。
36. 如請求項35之免疫細胞，其經導入搭載有第一多肽及第二多肽之載體、或是經導入搭載有第一多肽之載體及搭載有第二多肽之載體。
37. 一種製備包含如請求項17之免疫細胞的細胞集團的方法，其包含以下之步驟(A)及(B)： (A)將如請求項16之載體進行基因導入至免疫細胞的步驟； (B)將經基因導入之免疫細胞於基因導入後培養5日以上的步驟。
38. 如請求項37之方法，其中於步驟(B)中，將經基因導入之免疫細胞在以下配體蛋白質不存在下進行培養，該配體蛋白質係會與IL15、IL2或IL7之各個受體結合之配體蛋白質，且藉由該配體蛋白質與受體的結合，而與該細胞激素的結合訊息同樣之訊息會透過受體往免疫細胞內傳遞。