JP7155011B2 - 細胞傷害性細胞及び幹細胞の治療効果を強化する新規なrna構築物及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年4月1日に提出された米国仮特許出願62/316,679号に対する優先権を主張し、その内容は参考として援用される。本明細書に引用される全ての参考文献は、参考として援用される。
NK細胞及び細胞傷害性T細胞においてパーフォリン及びグランザイムBのロードを増加させるであろうRIG-1に対して特に特異的であるRNA構築物が当該技術分野では必要であり、それによりNK細胞とCD8+T細胞の養子細胞移入の障害の1つを克服する。
材料及び方法
細胞培養
ヒトナチュラルキラー細胞株NK-92は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(ATCC、バージニア州マナッサス、カタログ番号CRL-2407TM)から購入した。細胞を、20%熱不活性FBS(インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド)及び1000U/ml Proleukin(ノバルティス、バーゼル・スイス)を含む幹細胞培地(CellGro;CellGenix、フライブルグ・ドイツ)で最初に解凍した。
以前に報告されたRIG-Iアゴニスト(M5及びM8)は、ジョン・ヒスコット(Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti、ローマ・イタリア)によって親切に共有された。残念なことに、移入されたM5配列ID番号2及びM8(配列ID番号3)組成物は非常に汚染されており、活性がM5又はM8分子に由来するかどうか、又は活性が未知の汚染物質に由来するかどうかは不明であった。(M5及びM8分子は、PCT公開WO2016/011324に記載されていると考える)。従って、RIG-IアゴニストA、M5及びM8構築物は合成され、RIG-IアゴニストA)精製され、品質管理された(Dharmacon(GEヘルスケア))。M5、M8及びRIAAを図5に示す。
GACGAAGACCACAAACCAGAUAAAAAUAAUUUUUAUCUGGUUGUUUGUCUUCGUC
M5配列ID番号2:
GACGAAGACCACAAAACCAGATAAAAAATAATTTTTTATCTGGTTTTGTGGTCTTCGTCC
M8配列ID番号3
GACGAAGACCACAAAACCAGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGTTTTGTGGTCTTCGTC
RIG-1アゴニストによるHEK293細胞株のトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞株293(HEK293)は、当該技術分野で周知の細胞株である。トランスフェクションは、HEK293に対して1mlのIMDM/ウェルで約2×105細胞/ウェルを使用して、12ウェルプレートの懸濁液の新しくトリプシン処理された細胞で行われた。各トランスフェクションに対して、1μlのLipofectamine2000(インビトロジェン)及び50ngのmRNAが使用された。細胞懸濁液に添加される前に、mRNA及びLipofectamine2000は100μlOPTI-MEMブランド最小必須培地(Gibco)で30分間インキュベートした。細胞及びLipofectamine2000-mRNA複合混合物を、余分な50μl/ウェルFMDMが添加される前に、HEK293に対して5×103細胞/ウェルで96ウェルプレートに直ちに分け、37℃、5時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞はOPTI-MEMのT-150フラスコにプールされた。上清が16、24、40、48時間で集められ、-20℃でエクソソーム精製のために凍結された。
トランスフェクションは上記のように行われた。簡潔には、骨髄間葉間質細胞(「BMMSC」)を3人の健康なドナーから入手した。Ficoll分離骨髄を、2mlのAlpha-MEM(インビトロジェン)の6ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を、5%CO2インキュベーターにおいて37℃で5日間インキュベートした。位相差顕微鏡で3日目の紡錘形細胞の出現と70~90%のコンフルエントを確認した後で、細胞をPBSで2回洗浄し、0.25%GMPグレードTrypLE Select CTS(サーモフィッシャー、マサチューセッツ州ウォルサム)2.5mLで、37℃、2分間ダイジェストした後、7.5mLの完全最小必須培地アルファ(「α-MEM培地」)で中和した。その後、1x106細胞を、フローサイトメトリーを用いた表現型CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD146、SSEA-1及びSSEA-4であることを確認するのに使用し、これらの細胞がCD31、CD34、CD45、CD80、CD86及びHLA-DRに対して陰性であることを確認した。パネルを以下の表1に記載する。残りの細胞を隔日継代し、継代5-7の間にトランスフェクトした。次いで、細胞をトランスフェクションのために5×105細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種した。トランスフェクションプロトコルは上記のように行われた。フローサイトメトリーを用いてトランスフェクション後24時間に細胞を特徴付け、上清TGF-BレベルをELISAによって評価した。
満期正常分娩(37~41週)から採取した臍帯血試料を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Gibco)で1:1に希釈した。続いて、400gで40分間Ficollの遠心分離により単核細胞を単離した。単核細胞を集め、2回洗浄し、0.5%ヒト血清アルブミン(「HSA」)を添加してPBSに再懸濁した。
ナノ粒子は、以前に報告されたプロトコル(非特許文献12)に従って、RNAフラグメント(Trilink)から合成された。RNAナノ粒子は、インビボでRNase分解に耐性をもたせるために、2-F U及びCヌクレオチドを含んだ。次いで、RNA複合物を、個々の鎖をPBS緩衝液に室温(RT)、化学量論比で混合することによって組み立てた。
雌雄C57BL/KaLwRijマウスをHarlan CPB(ホルスト・オランダ)から購入した。C57B1/6、C57B1/6 CD1-/-、C57B1/6 CO4-/-、C57B1/6 CD8-/-、C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)1Osb/J及びRag2-/-cγ-/-マウスは、カロリンスカ研究所微生物学及び腫瘍生物学センターから供給された。全ての動物は、水道水及び標準飼料の自由アクセスを含む従来条件下で、カロリンスカ研究所フッディンゲ大学病院臨床研究センターで動物施設に収容された。全マウスは、各実験の開始時に8-10週齢であった。本研究で行われた実験は、スウェーデン南ストックホルム地方倫理委員会によって承認された。
C57BL/KaLwRijマウス群に、マウス1匹あたり全量100μl滅菌PBSに懸濁された105個のeGFP-5T33 MM及び/又は非形質導入5T33 MM細胞で静注した。コントロールマウスには等量のPBSで静注された。動物は対麻痺の進展のために一日2回検査された。週間隔かつ疾患進行時に、マウスをCO2吸入により安楽死させ、脾臓、肝臓、胸腺及びリンパ節を切除し、単細胞懸濁液の調製処理までPBSに保持した。大腿骨及び脛骨からの骨髄は、PBSを骨の空洞に流すことによって得られた。
腫瘍細胞をPBSで3回洗浄し、137Cs Gammacell2000デバイス(Molsgaard Medical、ヘルスホルム・デンマーク)に60Gyでガンマ線を照射した。照射直後に、それらを皮下注射又は更なるインビトロ分析のために培養した。C57Bl/6及びC57Bl/KaLwRijに、標準プロトコルに従って免疫性を与えた。簡潔には、注射前に、洗浄、計数し、最終濃度、PBS(0.2ml)に腫瘍細胞を再懸濁した。27ゲージ針を備えた1ccツベルクリン注射器を用いて3週間隔で3回腫瘍細胞を注入し、マウスを週に2回腫瘍の存在も検査した。
脾臓断片に穏やかな圧力をかけるためホモジナイザーを用いて懸濁液をメッシュを通して濾過してことにより、マウスからの脾臓単細胞の懸濁液を無血清RPMI-1640培地にプールした。赤血球を、塩化アンモニウム溶液[0.15mol/L NH4Cl、10mmol/L KHCO3、0.1mmol/Lエデト酸(EDTA)、pH7.2]で溶解した。得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、完全RPMI-1640培地[10%不活性FCS、2mmol/L L-グルタミン、25mmol/L NaHCO3、1mmolピルビン酸ナトリウム、25mmol/LのN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸(HEPES)、100kU/LのペニシリンG及び100mg/Lのストレプトマイシン]で補充されたRPMI-1640培地とTrace Element A(Mediatech社、バージニア州ハーンドン)に再懸濁した。新鮮な完全RPMI培地のProleukin(登録商標)(rIL-2)を0日目及び1日おきに添加した。細胞を1×106細胞/mlの濃度で培養し、細胞密度を毎日測定した。
単細胞懸濁後で、マウス細胞を、製造者の指示に従って、CD8マウスマイクロビーズキット(ミルテニーバイオテク、ベルギッシュ・グラードバッハ・ドイツ)を使用して分離した。簡潔には、異なる器官からの単細胞懸濁液を上記のように調製し、細胞数を決定した。300gで10分間の細胞遠心分離後、上清を完全に除去した。細胞ペレットを90μlのすすぎ緩衝液(PBS、0.5%BSA、2mM EDTA)に再懸濁した。細胞を、107の全細胞あたり10μlのCD8マイクロビーズと混合し、4℃で15分間インキュベートした。磁気分離前に、細胞を107の細胞あたり2mlのすすぎ緩衝液で洗浄し、300gで10分間遠心分離して上清を除去し、500μlのすすぎ緩衝液に再懸濁した。一方、磁気カラムを適切なMACSセパレータの磁界に置き、3mlのすすぎ緩衝液で3回すすぐことによって選別のために調製した。最後に、細胞懸濁液をカラムに適用し、3mlのすすぎ緩衝液で3回リンスした。全ての非標識(陰性)細胞をすすぎ洗いし、15mlのファルコンチューブに集めた。標識エフェクター細胞を集めるために、カラムを磁界から除去し、5mlのすすぎ緩衝液をカラムに適用し、プランジャーを用いて陽性細胞画分を清浄な15mlのファルコンチューブに洗い流した。
K細胞の脱顆粒する能力を分析するために、細胞を96ウェルプレートで1×106細胞/mlの密度で培養し、単独又はK562と1:1の比又はPMA及びIono(0.5μg/ml、会社、場所)で4-6時間インキュベートした。インキュベーションの1時間後、ゴルジストップ(BD)を培養液に添加して、タンパク質輸送を阻害した。続いて、細胞をCD56及びCD107aに対して4℃で30分間染色した。
C57Bl/6マウスに、尾静脈又は皮下を介して106の5T33MM細胞でそれらを接種することによって腫瘍誘発を行った。インビボでCD4細胞を枯渇させるために、マウスを、免疫化の2日前から抗CD4mAbの200μgの腹腔内注射し、その後5日毎に、実験終了まで抗CD4mAbの200μgの腹腔内注射した。コントロールマウスには、同量(0.2ml)及び同用量のマウスIgG抗体(Sigma)をアイソタイプコントロールとして注射した。エンドポイントで脾臓細胞のフローサイトメトリー分析により、CD4+細胞の枯渇の有効性をモニターした。脾臓において1.0%未満のCD4+細胞を示す動物を研究から除外した(n=2)。
CD2(RPA-2.10)、CD11b(ICRF44)CD57(NK-1)DNAM1(DX11)、Kp44(p44-8.1)Kp46(9E2)、NKp30(p30-15)、CD107a(H4A3)、NKG2D(1D11)(BD、ニュージャージー州フランクリン・レイクス)、NKG2C(134591)(R&Dシステムズ、英国アビングドン)、CD56(HCD56)、NKp80(5d12)、CD161(HP-3G10)、CD319(162.1)、CD352(NT-7)、(バイオレジェンド、カリフォルニア州サンディエゴ)、CD244(C1.7)(ベックマンコールター、カリフォルニア州ブレア)、Siglec7(REA214)(ミルテニー、ベルギッシュ・グラードバッハ・ドイツ)に対する蛍光色素結合抗体を用いて、表現型を分析し、製造手順に従って処理した。パーフォリン(dG9)、グランザイムB(GB11)(BD)の細胞内染色のために、細胞をPBSで洗浄し、次いでCytofix/Cytoperm(BD)で固定・透過化し、+4℃で20分間インキュベートした。固定・透過化の後で、細胞を洗浄し、製造プロトコルに従って、Permwashで染色した。
非パラメトリックKruskal Wallis検定を用いて、全培養液の絶対細胞数、NK細胞パーセンテージ及び細胞傷害性を比較した。生存曲線の統計的有意性(p<0.05)を分析するために、MacOSXのGraphPad Prismバージョン6(グラフ・パッド・ソフトウェア、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いてログランク検定を行った。
パーフォリン及びグランザイムB含量
RIAA、M5又はM8で別々に処理したNK細胞の3つのバッチのトランスフェクションの4時間後、我々は上記のようにフローサイトメトリーを用いてNK細胞のグランザイムB及びパーフォリンロードを分析した。RIAAで処理したIL2刺激NK細胞では、IL2刺激M5及びM8コントロールと比較して、パーフォリン含量が1600~2000倍増加し、グランザイムB含量が800~1100倍増加した(図2)。M5は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が141~921倍増加し、M8は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が110~783倍増加していた。M5は、未処理細胞よりもグランザイムB含量が70~460倍増加し、M8は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が55~391倍増加したことを示した。図2のデータを以下の表3及び表4に更に示す。
K562標的に対するNK細胞の連続細胞傷害性能力を、上述したように実施した(非特許文献2)。RIAA運搬ナノ粒子と同様に、M5及びM8アゴニストをIL-2によって活性化されたNK細胞に一夜越しインキュベーションでトランスフェクトした。その後、細胞傷害性分析を行った。M5及びM8によってトランスフェクトされたNK細胞は、連続死滅能力に有意差がなかった。しかし、RIAAによってトランスフェクトされた細胞は、連続細胞傷害性活性の有意な増加を有した(図3及び4)。
5T33MM腫瘍は、上記のように確立された。RNA運搬ナノ粒子を腫瘍細胞注射後5日目に投与した。粒子は2時間毎に6回(1μg/g;500μlのPBS)注射した。比較腫瘍生着は、RIAA粒子を投与したマウスはMM生着が遅れていることを示した(図4)。更なる研究は、HEK293由来EVの皮下投与が同一実験モデルにおいて用量依存的に生存を遅延させることを示した(図9)。
本研究では、我々はナチュラルキラー細胞及び細胞傷害性Tリンパ球等の細胞傷害性リンパ球におけるパーフォリン及びグランザイムB産生の最適誘導因子を同定することを目的とした。RIG-I依存性誘導を誘導しようとする際に、我々は、以前に発表されたRIG-1アゴニスト(M5及びM8)を用いることにより、より良好なパーフォリン及びグランザイムB発現を導くRIG-I誘導の仮説を最初に試験した。以前に報告したようにI型インターフェロン分泌の増加を観察することもできるが、細胞傷害性顆粒のいずれかの有意な増加は観察されなかった。これに対応するために、以前に定義された構築物とははるかに短く構造的に異なる新しい構築物を試験した。トランスフェクション又はEV媒介送達を用いてナチュラルキラー細胞及びT細胞にこの構築物を導入すると、パーフォリン及びグランザイムBの発現が有意かつ迅速に増加した。我々が知る限り、これは、RNA構築物の最初の報告であり、このような細胞傷害性リンパ球のプロテオームプロファイルの劇的な差異をもたらす。
本発明のRNA構築物は、構築物を発現する細胞を移入/投与することによって又は小分子として患者に投与可能である。そのような細胞又は小分子は、患者に注射するか、従来の経路を介して投与することができるだろう。次いで、RNA構築物を受ける細胞は、細胞の連続死滅能力を改善するために、グランザイムB及び/又はパーフォリンの産生及び貯蔵を増加させるであろう。
RIG-Iアゴニストがトランスフェクトされた本発明の細胞の強化された死滅能力は、高いウイルスロードを有する感染細胞を除去する強化された能力をそれに与えるだろう。このように、本発明は、これらの感染細胞の他の細胞を感染又はそれらの含有を放出する能力を排除するウイルスリザーバの除去を可能にする。本発明のRNA構築物は、構築物を発現する細胞を移入/投与することによって、又は小分子として患者に投与することができる。そのような細胞又は小分子は、患者に注射又は従来の経路を介して投与することができた。RNA構築物を受ける細胞は、細胞の連続死滅能力を改善するために、グランザイムB及び/又はパーフォリンの産生及び貯蔵を増加させるであろう。
本発明のRNA構築物は、幹細胞の寿命を延ばすために使用可能である。RIG-Iは、幹細胞におけるDNA修復機構を媒介することが知られている。本発明の投与は、RIG-I活性を強化すること、そのため本発明で処理された幹細胞の生存性を延長することが期待される。
最も好ましい使用では、患者への養子細胞移入前に細胞を処置するためにRIG-Iアゴニストが使用される。上記プロトコルを使用して、RIAAは、エクスビボ操作中に任意の時点で使用することができる。培養範囲におけるRIG-Iアゴニストの好ましい濃度は、約0.4mMから約10mMである。最も好ましくは、0.5mMから6mMである。これらの細胞は、それにより、当該技術分野で周知のプロトコルを使用して、後の注入時間点で直ちに注入又は凍結することができる。RIG-Iアゴニスト投与は、インビボ及びエクスビボの両方で、単回用量として、又はインヒビターの血清濃度が0.4~6μMの間、好ましくはより低い用量であり得る用量ウィンドウを繰り返し使用して行うことができる。上記実施例3に記載の条件を治療するために、そのような養子細胞移入を使用することができる。
本発明は、筋炎、心筋炎、ウイルス性関節炎、ウイルス性脳炎及び髄膜炎等のウイルス感染によって引き起こされる炎症を患っている患者を治療するために使用することもできる。このような疾患において、免疫系によるウイルスの認識を低減又は停止し、それによって炎症を軽減、予防又は排除するために、RIG-Iアゴニストを抗ウイルス療法と同時投与することができる。これは、免疫応答に依存しない又は完全に利用しない抗ウイルス療法と共に使用可能である。そのような抗ウイルス剤は、アマンダチン及びリマンチジン等のアダマンタン抗ウイルス剤、リトナビル及びコビシスタット等の抗ウイルスブースター、マラビロク等のケモカイン受容体アンタゴニスト、マラビロク、ドルテグラビル及びエルビテグラビル等のインテグラーゼ鎖転移阻害剤、ソホスブビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン等のその他の抗ウイルス剤、ペルミビル、オセルタミビル及びザナミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン及びリルピビリン等の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)、ダクラタビル等のNS5a阻害剤、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン及びエンテカビル等のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(RTIS)、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホサンプレナビル、チプラナビル及びダルナビル等のプロテアーゼ阻害剤、リバビリンバラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドフォビル等のプリンヌクレオシドを含む。これらの薬物の単独又は組み合わせの用量指示は、当該技術分野において周知である。
RIG-Iアゴニストは、インビボ投与されると、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカウイルス、ECHOウイルス、例えば、膀胱癌、脳腫瘍、婦人科腫瘍、肝細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、前立腺癌、軟部組織肉腫及び固形腫瘍のような適応症のためのRIGVIR等のRNAウイルスベースの腫瘍溶解性ウイルス療法のインビボ有効性を増加させるのにも有用である。RIG-Iアゴニストは、細胞内抗ウイルス防御メカニズムを阻害し、腫瘍内の腫瘍溶解性ウイルスの分布有効性を高めるのに役立つであろう。RIG-Iアゴニストのインビボ投与のための標的血清レベルは、0.2乃至6mMである。
Claims (27)
- 配列ID番号1のRNA分子。
- 細胞傷害性細胞にRIG-Iアゴニストを投与することを有し、前記RIG-Iアゴニストは、配列ID番号1、配列ID番号2又は配列ID番号3から選択されるRNA分子の少なくとも1つであることを特徴とする、細胞傷害性細胞におけるグランザイムBのレベルをエクスビボで増加させる方法。
- 前記RIG-IアゴニストがIL2と共に投与されることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 細胞傷害性細胞にRIG-Iアゴニストを投与することを有し、前記RIG-Iアゴニストは、配列ID番号1、配列ID番号2又は配列ID番号3のRNA分子の少なくとも1つから選択されることを特徴とする、細胞傷害性細胞におけるパーフォリンのレベルをエクスビボで増加させる方法。
- 前記RIG-Iアゴニストは配列ID番号1であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記RIG-IアゴニストはIL2と共に投与されることを特徴とする請求項4または5に記載の方法。
- 細胞傷害性細胞に、配列ID番号1、配列ID番号2又は配列ID番号3から選択される少なくとも1つのRNA分子を投与することを有することを特徴とする、細胞傷害性細胞におけるパーフォリン及びグランザイムBのレベルをエクスビボで増加させる方法。
- 前記RNA分子はIL2と共に投与されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記RNA分子は配列ID番号1であることを特徴とする請求項7または8に記載の方法。
- 前記細胞傷害性細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記ナチュラルキラー細胞はNK92細胞であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記細胞傷害性細胞はCD8細胞であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 配列ID番号1を含むことを特徴とする細胞傷害性細胞。
- 配列ID番号1のRNA分子からなり、癌又は慢性感染症を有する患者に投与されることを特徴とする投与物。
- 配列ID番号1のRNA分子である細胞内防御機構を阻害する際に有効なRIG-Iアゴニストで処置された細胞からなり、養子細胞移入による治療において患者に投与されることを特徴とする投与物。
- IL2とともに患者に投与されることを特徴とする請求項16に記載の投与物。
- 請求項14に記載の細胞傷害性細胞からなり、癌又は慢性感染症を有する患者に投与されることを特徴とする投与物。
- 配列ID番号1のRNA構築物からなる投与物であって、幹細胞に接触させることで、前記幹細胞の生存性又は生着を増加させる及び/又は幹細胞の増殖、送達又は治療効果を強化する投与物。
- 前記投与物はIL2と同時投与されることを特徴とする請求項19に記載の投与物。
- 配列番号1のRNA分子であるRIG-Iアゴニストによって処置された細胞傷害性細胞から単離された細胞外小胞からなり、癌を有する哺乳動物の生存時間を延長するために投与される投与物。
- IL2とともに前記哺乳動物に投与されることを特徴とする請求項21に記載の投与物。
- 前記細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項21または22に記載の投与物。
- 前記ナチュラルキラー細胞はNK92細胞であることを特徴とする請求項23に記載の投与物。
- 前記細胞傷害性細胞はCD8細胞であることを特徴とする請求項21または22に記載の投与物。
- 前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項21または22に記載の投与物。
- 配列ID番号1のRNA分子であるRIG-Iアゴニストの投与を有することを特徴とする、間葉系間質細胞におけるCD90発現をエクスビボで増加させる方法。
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