KR20220143151A - 신규 rna 구축물 및 세포독성 세포 및 줄기 세포의 치료 효과를 증진시키기 위한 그의 사용 방법 - Google Patents

신규 rna 구축물 및 세포독성 세포 및 줄기 세포의 치료 효과를 증진시키기 위한 그의 사용 방법 Download PDF

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에브렌 알리시
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바이셀릭스, 인크.
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Abstract

본 발명은 세포독성 세포 및 줄기 세포의 효과를 증진시키기 위한 Rig I 효능제를 포함한다. Rig I 효능제는 소분자 치료제로서 생체내에서 또는 입양 세포 전달을 위한 세포를 증진시키기 위해 시험관 내에서 사용될 수 있다. 적용은 암 요법, 면역계 강화, 만성 바이러스 감염 및 바이러스 유도된 염증의 치료 및 바이러스 기반 요법의 강화를 포함한다.

Description

신규 RNA 구축물 및 세포독성 세포 및 줄기 세포의 치료 효과를 증진시키기 위한 그의 사용 방법{NOVEL RNA CONSTRUCT AND METHODS OF USE THEREOF FOR ENHANCING THE THERAPEUTIC EFFECTS OF CYTOTOXIC CELLS AND STEM CELLS}
우선권 및 참조로 포함
본 출원은 2016년 4월 1일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/316,679에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용이 참조로 포함된다. 본원에 인용되는 모든 참고문헌은 참조로 포함된다.
자연 킬러 (NK) 세포 및 세포독성 T 세포 ("CD8 세포")를 사용하는 치료의 효능은 상기 세포독성 세포 내 그랜자임 B 및/또는 퍼포린의 상대량 ("로드")에 의해 영향을 받는다. 집합적으로, NK 세포 및 CD8 T 세포는 "세포독성 세포"로서 지칭된다. 입양 세포로서 지칭된 것들, 종양 침윤 림프구 세포 (TIL), 키메라 항원 수용체 (CAR) 변형된 세포, 및 줄기 세포를 포함한 세포독성 세포 (본원에 집합적으로 입양 세포 전달로서 지칭됨)는 현재 치유적 치료로서 다양한 임상 시험에서, 예컨대 수많은 암 유형에 대하여 실험되고 있다. 입양 세포 전달로의 치유적 치료의 성공을 위한 결정적인 인자 중 하나는 NK 세포 및 CD8 T 세포 내 그랜자임 B 및 퍼포린의 로드이다.
세포독성 세포는 악성 형질전환된 세포에 대한 초기 선천성 반응에서 결정적인 역할을 한다. 세포독성 세포는 그의 세포 표면 상의 다양한 활성화 수용체 또는 종양 세포 상의 자기-인간 백혈구 항원 (HLA)의 부재를 통해 활성화된다 (Karre et al., 1986; Lanier, 2001).
NK 및 CD8+ T 세포 둘 다의 세포독성은 주로 그랜자임 B 및 퍼포린의 방출 또는 사멸 수용체 리간드 예컨대 FasL 및 TNF-관련 아폽토시스-리간드 (TRAIL)의 발현을 통해 매개된다. 활성화 시, 용해 과립은 이펙터 및 표적 세포에 의해 형성된 세포내 접합부로 전달될 것이다 (Henkart, 1985). TIL 및 CAR 유전적으로 변형된 세포독성 세포를 포함한 입양 세포 전달을 위한 표준 실시는 현재 입양 전달 전에 시험관내 시토카인 노출로 세포를 활성화시키는 것이다. 그러나, 제한 인자는 각각의 세포독성 세포에 의한 충분한 연속 사멸을 수득하는 것이며, 이는 퍼포린 및 그랜자임 B로의 전체적인 로드에 고도로 의존된다. 더욱이, 형질감염 프로세스에서 및/또는 생체내에서 바이러스에 대한, 세포 내성, 또는 내성의 결여는 결정적인 인자이다.
세포용해 과립의 로드를 위한 중심 단계는 세포내 RNA 인식 부위 예컨대 MDA-5 (흑색종 분화 인자 5) 및 Rig-I (레티노산-유도성 유전자 I)의 활성화이며, 이는 활성화된 세포의 직접 반응으로 이어진다.
5'-트리포스페이트 말단 (5'ppp) 및 <100개 뉴클레오티드의 크기를 갖는 바이러스 RNA 또는 합성된 dsRNA 분자는 RIG-I를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Goubau et al., 2014; Hornung et al., 2006). 게다가 5'-말단에서 평활 말단 염기 쌍형성 및 최소 20개 뉴클레오티드의 길이는 RIG-I의 최적 결합 및 활성화에 중대하였다 (Goubau et al., 2014; Hornung et al., 2006). 활성화된 RIG-I는 그의 CARD 도메인을 통해 미토콘드리아 어댑터 단백질 MAVS와 상호작용한다. MAVS의 활성화는 IKK 관련된 키나제 TBK1 및 IKKε의 활성화로 이어지며, 이는 결과적으로 IRF-3 및 IRF-7을 인산화시킬 뿐만 아니라 NF-κB 경로를 활성화시킨다. 게다가, 이는 직접적으로 유형 I IFN (IFN-β 및 IFN-α) 면역 반응 뿐만 아니라 염증유발 시토카인 및 선택된 항바이러스 유전자, 예컨대 IFN-자극된 유전자 15 (ISG15) 및 다른 ISG의 전사 및 분비를 직접적으로 유도하고 있다 (Grandvaux et al., 2002; Kawai et al., 2005; Liu et al., 2011; Takeuchi et al., 2010).
NK 세포 및 세포독성 T 세포 내 퍼포린 및 그랜자임 B의 로드를 증가시킬 RIG-I에 고도로 특이적이며 그에 의해 NK 세포 및 CD8+ T 세포의 입양 세포 전달의 장애물 중 하나를 극복하는 RNA 구축물에 대한 관련 기술분야에서의 필요가 있다.
RIG I는 또한 줄기 세포에서의 생존율 및 생존율의 길이에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. RIG I의 활성화가 초기 줄기 세포 사멸로 이어지는 프로세스를 하향 조절하는 것으로 여겨진다. 생존율을 개선시키고 줄기 세포의 생착 잠재력을 증가시킬 RIG I 효능제에 대한 관련 기술분야에서의 필요가 있다.
개선된 종양용해 바이러스 암 요법에 대한 관련 기술분야에서의 필요가 남아있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 세포독성 세포 내 퍼포린의 양을 증가시키는 RNA 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 세포독성 세포 내 그랜자임 B의 양을 증가시키는 RNA 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 소분자를 투여함으로써 세포독성 세포 내 퍼포린의 양을 증가시키는 것이다.
본 발명의 목적은 키메라 항원 수용체 (CAR) 기술을 포함한, 입양 세포 요법의 증진을 위해, 생체외 프로세스에서 (즉, 자가 또는 동종 세포가 신체의 외부에 있는 동안) RNA 분자를 세포독성 세포 및/또는 줄기 세포를 포함한 세포에 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 생체내 프로세스를 통해 (즉, 세포가 신체에 남아있는 동안) RNA 분자를 세포독성 세포 및/또는 줄기 세포를 포함한 토착 세포에 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 소분자를 투여함으로써 세포독성 세포 내 그랜자임 B의 양을 증가시키는 것이다.
본 발명의 목적은 줄기 세포를 형질감염시키는 능력을 개선시키는 것이다.
본 발명의 목적은 RIG I에 결합하는 RNA 분자를 투여함으로써 줄기 세포의 생존율 및 생착률을 연장하는 것이다.
본 발명의 목적은 생체외 형질감염 프로세스 동안 바이러스에 노출될 때 세포독성 세포의 생존율을 증가시키는 것이다.
본 발명의 목적은 생체내 바이러스에 노출될 때 세포독성 세포의 생존율을 증가시키는 것이다.
본 발명의 목적은 세포독성 세포의 연속 사멸 능력을 증가시키는 것이다.
본 발명의 목적은 만성 바이러스 감염을 포함한 바이러스 감염을 치료하는 것이다.
본 발명의 목적은 암을 치료하는 것이다.
본 발명의 목적은 간암을 치료하는 것이다.
본 발명의 목적은 다발성 골수종을 치료하는 것이다.
본 발명의 목적은 C형 간염을 치료하는 것이다.
본 발명의 목적은 HIV를 치료하는 것이다.
본 발명의 목적은 바이러스 저장소로서 작용하는 세포를 소거하는 것이다.
본 발명의 목적은 세포주 NK-92 내 그랜자임 B 및 퍼포린을 증가시키기 위해 소형 RNA 분자를 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 세포주 TALL-104 내 그랜자임 B 및 퍼포린을 증가시키기 위해 소형 RNA 분자를 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 원발성 인간 세포독성 림프구 예컨대 자연 킬러 세포 및 T 세포 내 그랜자임 B 및 퍼포린을 증가시키기 위해 소형 RNA 분자를 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 RIG I 효능제 A 처리된 HEK 293 세포 또는 NK 세포로부터 단리된 세포외 소포를 사용하여 암을 갖는 포유동물에서 생존 시간을 연장하는 것이다.
본 발명의 목적은 신규 RNA RIG I 효능제를 RNA 바이러스 벡터에 코딩하거나 또는 종양용해 RNA 바이러스를 사용함으로써 생체내에서 또는 시험관내에서 신규 RNA RIG I 효능제를 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 세포의 활성화를 부스팅하기 위해 신규 RNA RIG I 효능제를 이중특이적 킬러 세포 결속체 ("BIKE"), 삼중특이적 킬러 세포 결속체 ("TRIKE") 및 모노클로날 항체와 함께 상승작용적으로 투여하는 것이다.
본 발명의 목적은 표적화된 나노입자, 리포솜, 종양용해 바이러스, 바이러스 벡터, 모노클로날 항체 또는 운반 및/또는 세포 침투 펩티드를 사용하여 RIG I 효능제 A를 전달함으로써 종양 미세환경에서 면역 반응을 증가시키는 것이다.
본 발명의 목적은 본 발명의 Rig I 효능제를 체크포인트 억제제 예컨대 항-KIR 항체, 항-TIGIT, 항-TIM3, 항-PD1, 항-PDL-1, 및/또는 항-CTLA4와 조합하는 것이다.
본 발명의 목적은 진단 도구로서 이펙터 세포의 무반응을 이해하기 위해 본 발명의 Rig I 효능제를 사용하는 것이다.
발명의 간단한 설명
본 발명자들은 "Rig I 효능제 A" ("RIAA")로서 본원에 확인된 56개 RNA 서브유닛을 포함하는 RNA 구축물을 생성하였다. RIAA는 RIG I에 고도로 특이적이고 세포독성 세포 내 퍼포린 및 그랜자임 B 로드를 증가시킨다. 이는 세포독성 세포의 생존율, 사멸력 및 효능을 증가시키고, NK 세포, CD8 T-세포 및 줄기 세포의 입양 세포 전달의 다양한 장애물을 극복한다.
RIAA는 NK 세포, CD8 T-세포 및 시험관내 줄기 세포를 포함한 세포를 환자에게 투여하기 전에 상기 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 소형 RNA 분자이다. 세포는 자가 또는 동종일 수 있다. RIAA는 또한 환자의 내인성 세포를 처리하기 위해 생체내 투여될 수 있다. 더욱이, RIAA는 입양 세포의 시험관내 프로세싱에 대한 필요 없이 치료 소분자로서 환자에게 투여될 수 있으며, 더욱이 RIAA는 단일요법 및/또는 조합 요법으로서 투여될 수 있다.
본 발명의 적용은 악성 흑색종, 난소암, 방광암, 요로상피암, 간암, 자궁경부암, 두경부암, EGFR+ 종양, HER1+ 종양, HER2+ 종양, 췌장암, 편평 세포 암종, 육종, 비소세포 폐암, 메르켈 세포 암종, 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 다형성 교모세포종, 미만성 대 B-세포 림프종, 외투 세포 림프종, 형질 세포 백혈병, 비-호지킨 림프종, CD-20 양성 B-세포 악성종양, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 및 간을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고형 종양 및 혈액암, C형 간염 및 HIV를 포함하나 이에 제한되지는 않는 만성 바이러스 및/또는 감염, 이식후 림프증식성 질환의 성인 및 소아 치료 및 줄기 세포를 사용하는 임의의 요법을 포함한다.
도 1은 실험 프로토콜의 개략적 도면이다.
도 2는 Rig I 효능제 A의 투여 후에 NK 세포의 퍼포린 및 그랜자임 B 로드의 증가를 제시하는 한 쌍의 막대 그래프이다.
도 3은 RIAA로의 자극 후에 NK 세포의 연속 세포독성 능력을 제시하는 선 그래프이다.
도 4는 동계 면역적격 종양 보유 마우스에의 RIAA 및 다른 RIG I 효능제의 피하 투여를 제시하는 선 그래프이다.
도 5는 기지의 RIG I 자극제, M5 및 M8과 비교한 RIAA의 2차 RNA 구조의 개략적 개관이다.
도 6은 M5, M8 및 Rig I 효능제 A의 서열 비교이다.
도 7은 RIG I 효능제 A 처리의 존재 및 부재 하의, 중간엽 기질 세포 내 공여자당 CD90 수용체 밀도에서의 변화를 제시하는 선 그래프이다.
도 8은 Rig I 효능제 A의 투여 후의 CD90 세포에서의 증가를 제시하는 막대 그래프이다.
도 9는 RIG I 효능제 A 처리를 사용한 T 세포 내 퍼포린 및 그랜자임 B의 증가를 제시하는 막대 그래프이다.
본 발명자들은 NK 세포 및 줄기 세포의 형질감염을 개선시키는데 있어서 유용한 RNA Rig I 효능제의 새로운 패밀리를 밝혔내었다. 이들 효능제는 그 자체에 결합하여 헤어핀 및 루프를 포함하는 2차 구조를 생성하는 RNA의 단일 가닥을 포함한다. 본 발명자들은 헤어핀 및 루프 사이의 분자에 따른 거리 ("결합 영역")가 RIG I 결합 및 활성화에 결정적이라는 것을 발견하였다.
결합 영역 내에서, 헤어핀 및 루프 사이의 거리는 7-80개 염기 사이여야 한다. 7개 미만의 염기는 구조가 RIG I 상의 결합 홈에 피팅하도록 폴딩될 수 없다고 여겨진다. 결합 영역이 80개 초과의 염기이면, 분자는 RIG I 결합 부위에 폴딩 및 피팅될 수 있지만, 이러한 큰 분자는 실제로 RIG I의 활성화를 경감시킬 것으로 여겨진다. 헤어핀 및 루프 사이의 결합 영역은 루프 구조를 안정시키기 위해 루프의 각 측의 2-5개 염기 거리 내에서 GC 상보적 염기 쌍을 포함할 필요가 있다. 추가적으로, 루프 면적에서의 적어도 1개의 AU 상보적 쌍의 존재는 루프의 형성을 용이하게 한다.
소형 RNA 분자의 대표적인 이러한 패밀리는 RIAA (서열식별번호: 1)로서 확인된 신규 RNA 구축물이다. RIAA는 NK 세포 및 세포독성 T 세포 내 퍼포린 및 그랜자임 B의 크게 증가된 로드로 이어지는 RIG I에 고도로 특이적이다.
RIAA는 NK 세포, CD8 T-세포 및 시험관내 줄기 세포를 포함한 세포를 환자에게 투여하기 전에 상기 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 소형 RNA 분자이다. 세포는 자가 또는 동종일 수 있다. RIAA는 또한 생체내에서 내인성 세포를 처리하기 위해 생체내 투여될 수 있다. 더욱이, RIAA는 입양 세포의 시험관내 프로세싱에 대한 필요 없이 소분자 치료로서 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 구축물 및 방법을 사용하여 활성화된 세포독성 세포는 증진된 사멸 기능을 갖는 세포독성 세포가 목적되는 임의의 적용에 유용하다. 본 발명의 적용은 다발성 골수종 및 간을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 암, 뿐만 아니라 만성 바이러스 감염 예컨대 C형 간염 및 HIV를 포함하나 이에 제한되지는 않는 바이러스 감염의 치료를 포함한다.
실시예 1: 세포를 증진시키기 위한 Rig I 효능제의 생체외 사용
물질 및 방법
세포 배양
인간 자연 킬러 세포주 NK-92를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (ATCC, 버지니아주 마나사스, cat#: CRL-2407™)으로부터 구입하였다. 세포를 처음에 20% 열 불활성화된 FBS (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 및 1000 U/ml 프로류킨 (노파르티스(Novartis), 스위스 바젤)을 함유하는 줄기 세포 배지 (셀그로(CellGro); 셀제닉스(CellGenix), 독일 프라이부르크) 중에서 해동시켰다.
인간 T 세포주 TALL 104를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (ATCC, 미국 버지니아주 마나사스, cat#: CRL-2407™)으로부터 구입하였다. 세포를 처음에 20% 열 불활성화된 FBS (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 및 1000 U/ml 프로류킨 (노파르티스, 스위스 바젤)을 함유하는 IMDM 중에서 해동시켰다.
NK 세포 활성을 평가하기 위해, 만성 골수 백혈병 환자로부터의 인간 적모구 세포주 K562 (엘지씨 프로모켐(LGC Promochem)/ATCC, 버지니아주 마나사스)를 51-크로뮴 방출 및 탈과립화 검정에서 표적으로서 사용하였다. K562 세포를 RPMI, 글루타맥스(GlutaMAX) 1640 (인비트로젠)과 함께 배양하고 10% FBS로 보충하였다.
세포를 37℃ 및 5% CO2에서 95%의 습도 하에 인큐베이션하고, 세포 수를 트리판 블루 스테이닝 및 카운테스 세포 계수기 (인비트로젠)에 의해 2일마다 결정하였다.
NK-92 세포를 0.5-1x106개 세포/ml의 세포 밀도로 배양하고, 매일 IL-2로 보충하였다.
모든 세포 배양을 엄격한 무항생제 조건 하에 BSL2 환경에서 수행하였다.
TALL-104 세포주를 10% 소 태아 혈청 ("FCS")로 보충된 이스코브 변형된 둘베코 배지 ("IMDM") 중에서 0.05-0.1x106개 세포/ml의 세포 밀도로 사용하였다. 세포를 재조합 500U/ml IL-2로 보충하였다.
RNA 구축물
이전에 보고된 RIG-I 효능제 (M5 및 M8)는 존 히스코트(John Hiscott) (인스티튜토 파스퇴르-폰다지온 센시 볼로그네티(Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti), 이탈리아 로마)에 의해 친절하게 공유되었다. 불행하게도, 전달된 M5 (서열식별번호: 2) 및 M8 (서열식별번호: 3) 조성물은 고도로 오염되어 활성이 M5 또는 M8 분자에서 유래하였는지 여부 또는 활성이 미지의 오염물로부터 유래하였는지 여부를 불확실하게 만들었다. (M5 및 M8 분자는 PCT 공개 WO/2016/011324에 기재된 것으로 여겨짐). 따라서, Rig I 효능제 A, M5 및 M8 구축물을 합성하고 Rig I 효능제 A를 정제하고 품질 제어하였다 (다마콘(Dharmacon) (지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의함). M5, M8 및 RIAA는 도 5에 제시된다.
RIAA 서열식별번호 1:
Figure pat00001
M5 서열식별번호 2:
Figure pat00002
M8 서열식별번호: 3
Figure pat00003
RIG-I 효능제를 사용한 HEK293 세포주의 형질감염
인간 배아 신장 세포주 293 (HEK 293)은 관련 기술분야에 널리 알려진 세포주이다. 형질감염을 HEK293에 대해 1 ml IMDM/웰에서 대략 2x105개 세포/웰을 사용하여, 12-웰 플레이트에서 현탁액 중 새롭게 트립신처리된 세포 상에서 수행하였다. 각각의 형질감염을 위해, 1 μl 리포펙타민 2000 (인비트로젠) 및 50ng mRNA를 사용하였다. mRNA 및 리포펙타민 2000을, 세포 현탁액에 첨가하기 전에 100 μl OPTI-MEM 브랜드 최소 필수 배지 (깁코(Gibco)) 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 및 리포펙타민 2000-mRNA 복합체 믹스를 HEK293에 대해 5x103개 세포/웰로, 96-웰 플레이트에 즉시 분할하고, 여분의 50 μl/웰 IMDM을 첨가하기 전에 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 형질감염 후에, 세포를 OPTI-MEM에서 T-150 플라스크에 풀링하였다. 상청액을 16, 24, 40, 48시간에서 수집하고 엑소솜 정제를 위해 -20℃에서 동결시켰다.
RIG-I 효능제를 사용한 BMMSC의 배양 및 형질감염
형질감염을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 골수 중간엽 기질 세포 ("BMMSC")를 3명의 건강한 공여자로부터 획득하였다. 피콜 분리된 골수를 2 ml의 알파-MEM (인비트로젠) 중에서 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 이어서 세포를 5% CO2 인큐베이터 내 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 위상-대조 현미경검사에서 제3일에 스핀들-형상 세포의 외관, 및 70-90%의 전면생장률을 확증한 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 37℃에서 2분 동안 2.5 mL의 0.25% GMP 등급 TrypLE 셀렉트 CTS (써모피셔(ThermoFisher), 매사추세츠주 월섬)로 소화시키고, 이어서 7.5 mL 완전 최소 필수 배지 알파 ("α-MEM 배지")로 중화시켰다. 그후에 1x106개 세포를, 유동 세포측정법을 사용하여 하기 표현형: CD44, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, SSEA-1 및 SSEA-4를 확증하면서, 이들 세포가 CD31, CD34, CD45, CD80, CD86 및 HLA-DR에 대해 음성이라는 것을 확증하기 위해 사용하였다. 패널은 하기 표 1에 기재되어 있다. 남아있는 세포를 격일로 계대시키고, 계대 5-7 동안 형질감염시켰다. 이어서 세포를 형질감염을 위해 5x105개 세포/웰로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 형질감염 프로토콜을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포를 유동 세포측정법을 사용한 형질감염으로부터 24시간 후에 특징화하고, 상청액 TGF-B 수준을 ELISA에 의해 평가하였다.
표 1
MSC
Figure pat00004
조혈 줄기 세포 ("HSC")의 형질감염
만기 정상 분만 (37-41주)으로부터 수집된 제대혈 샘플을 포스페이트-완충된 염수 (PBS) (깁코)로 1:1 희석하였다. 후속적으로, 단핵 세포를 40분 동안 400g에서 피콜 상에서의 원심분리에 의해 단리하였다. 단핵 세포를 수집하고, 2회 세척하고, 0.5% 인간 혈청 알부민 ("HSA")이 첨가된 PBS 중에 재현탁시켰다.
CD34+ 분획을 제조업체 권장에 따라 오토MACS(AutoMACS) (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotech)) 및 CD34 직접 단리 키트 (밀테니 바이오텍)를 사용하여 면역자기적으로 단리하였다. 간략하게, FcR 차단 시약을 첨가한 후에, 세포를 6-12℃에서 30분 동안 MACS CD34 마이크로비드로 표지하였다. 후속적으로, 표지된 세포를 자기장에서 배치된 칼럼을 통해 세포 현탁액을 통과시킴으로써 풍부화시켰다. 칼럼을 자기장으로부터 제거한 후에 양성적으로 선택된 세포를 칼럼으로부터 세척 제거하고 수집하였다. CD34+ 세포 집단의 순도를 단리 직후에 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
세포를 성장 인자: 줄기 세포 인자 (SCF) (20 ng/ml; 페프로테크(PeproTech) EC), 트롬보포이에틴 (TPO) (50 ng/ml; 페프로테크 EC) 및 태아 간 티로신 키나제-3 리간드 Flt-3 리간드 (Flt-3L) (50 ng/ml; 페프로테크 EC)로 보충된 조혈 줄기 및 전구 세포 (셀그로 SCGM, 셀제닉스)에 대해 무혈청 배지 중에서 1x105/ml의 세포 밀도로 25 cm2 플라스크에서 배양하였다. 5% CO2의 가습 분위기 하에 37℃에서 48시간 인큐베이션 후에, 세포를 20% HSA로 보충된 셀그로 SCGM 배지 중에 1x 105/ml로 재현탁시켰다.
CD34-풍부화 세포를 동일한 크기의 분취물 (분취물당 2-5 105개 세포)로 분할하고, 형질감염시키지 않거나, RNA 없이 형질감염시키거나 (모의), 또는 RIG-I 효능제로 형질감염시켰다. 형질감염 큐벳을 1 ml IMDM으로 2회 헹굼으로써, 형질감염된 세포를 15-ml 플라스틱 튜브로 옮기고, 10 ml의 IMDM의 총 부피로 세척하였다. 펠릿화된 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 가습 분위기 하에 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 이들을 초기-작용 시토카인 (태아 간 티로신 키나제-3 리간드 [FLT3L], 줄기 세포 인자 [SCF], 트롬보포이에틴 [TPO], 각각 10 ng/ml 최종 농도 [모두 페프로테크, 인크., 뉴저지주 록키 힐])으로 보충된 1 ml의 미엘로컬트 H5100 배지 (스템 셀 테크놀로지스 인크(Stem Cell Technologies Inc), 캐나다 밴쿠버) 중에 재현탁시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 가습 분위기 하에 일반 카스파제 억제제 Z-V AD-FMK (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 독일 하이델베르크)의 존재 하에, 1x105개 세포/ml의 밀도로 배양하였다.
본 발명자들은 론자(Lonza), 제조업체로부터의 형질감염 지침서, (http://bio.lonza.com/fileadmin/groups/marketing/Downloads/Protocols/Generated/Optimized_Protocol_71.pdf)를 사용하고, 뉴클레오펙션 프로그램 U08을 사용하고, 5x105개 초과의 CD34-풍부화 세포를 사용하였다. RNA를 상기 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 이어서 세포를 표 2에서의 패널을 사용하여 상세한 유동 세포측정법에 의해 특징화하였다.
표 2
HSC
Figure pat00005
RNA 나노입자 및 세포외 소포의 구축
나노입자를 이전에 보고된 프로토콜 (Shu et al., 2011)에 따라 RNA 단편 (트리링크(Trilink))으로부터 합성하였다. RNA 나노입자는 2-F U 및 C 뉴클레오티드를 함유하여 그들에게 생체내 RNase 분해에 대한 내성을 제공하였다. 이어서 RNA 복합체를 PBS 완충제 중에서 실온 ("RT")에서 화학량론적 비로 개별 가닥을 혼합함으로써 어셈블리하였다.
12 ug (브래드포드 검정에 의해 측정됨) 및 16 ug의 RNA의 총 단백질 농도의 NK92 또는 HEK 293 유래된 엑소솜을 400 ul의 전기천공 완충제 (1.15 mM 인산칼륨 pH 7.2, 25 mM 염화칼륨, 21% 옵티프렙) 중에서 혼합하고, 4 mm 큐벳에서 전기천공하였다. 생체내 실험을 위해, 전기천공을 400 μl에서 수행하고, 그후에 풀링하였다.
엑소솜을 50 ml 조건화 배지 (48시간 동안 OptiMem에서 NK-세포 S72)를 사용하여 생성하고, 5분 동안 300 g에서 회전시켜 세포 파편을 제거하고, 0.2 μm 멸균 필터를 통해 여과하고, 이어서 90분 동안 110,000g에서 초원심분리하였다. 펠릿을 PBS 중에, 총 부피 300 μl로 재현탁시켰다. 문헌 [Liguni et al., JI 2012, Immune Surveillance Properties of Human NK Cell-Derived Exosomes] 참조.
마우스
암컷 및 수컷 C57BL/KaLwRij 마우스를 하를란 CPB (네덜란드 호르스트)로부터 구입하였다. C57Bl/6, C57Bl/6 CD1-/-, C57Bl/6 CD4-/-, C57Bl/6 CD8-/-, C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)1Osb/J 및 Rag2 -/- cγ -/- 마우스를 미생물학 및 종양 생물학 센터, 카롤린스카 연구소로부터 공급받았다. 모든 동물을 수돗물 및 표준 사료에 자유로운 접근을 포함한 통상적인 조건 하에 후딩에 대학 병원, 카롤린스카 연구소의 임상 연구 센터에서의 동물 시설에 수용하였다. 모든 마우스는 각각 실험의 초기에 8-10주령이었다. 이러한 연구에서 수행된 실험은 스웨덴 남쪽 스톡홀름의 지역 윤리 위원회에 의해 승인받았다.
MM 세포 주사 및 다발성 골수종의 유도
C57BL/KaLwRij 마우스의 군에 마우스당 100 μl 멸균 PBS의 총 부피로 현탁된 105개 eGFP-5T33 MM 및/또는 비-형질도입된 5T33 MM 세포를 i.v. 주사하였다. 대조군 마우스에 동등 부피의 PBS를 i.v. 주사하였다. 동물을 하반신마비의 발생에 대해 1일 2회 검사하였다. 매주 간격 및 질환 발생의 시점에서, 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 비장, 간, 흉선 및 림프절을 절제하고, 단세포 현탁액의 제조를 위한 프로세싱까지 PBS에 유지하였다. PBS를 골의 공동에 플러싱함으로써 대퇴골 및 경골로부터의 골수를 수득하였다.
종양 세포의 조사 및 접종
종양 세포를 PBS로 3회 세척하고 137Cs 감마셀 2000 장치 (몰스가드 메디칼(Molsgaard Medical), 덴마크 회르스홀름)에서 60 Gy로 감마-조사하였다. 조사 직후에, 이들을 추가의 시험관내 분석을 위해 피하로 주사하거나 또는 배양하였다. C57Bl/6 및 C57Bl/KaLwRij를 하기 표준 프로토콜에 따라 면역화하였다. 간략하게, 주사 전에, 종양 세포를 세척하고, 카운팅하고 그의 최종 농도로 PBS (0.2ml) 중에 재현탁시켰다. 27-게이지 바늘을 갖는 1cc 투베르쿨린 시린지를 사용하여 종양 세포를 3회, 3주 간격으로 주사하고, 마우스를 또한 종양 존재에 대해 1주 2회 확인하였다.
이펙터 세포의 제조
마우스로부터의 비장 단세포의 현탁액을 비장 단편 상에 완만한 압력을 가하기 위한 균질화기의 도움으로 메쉬를 통해 현탁액을 여과함으로써 무혈청 RPMI-1640 배지에 풀링하였다. 적혈구를 염화암모늄 용액 [0.15 mol/L NH4Cl, 10 mmol/L KHCO3, 0.1 mmol/L 에데트산 (EDTA), pH 7.2] 중에서 용해시켰다. 수득된 세포를 포스페이트-완충된 염수 (PBS)로 2회 세척하고, 미량 원소 A (미디어테크 인크.(Mediatech inc.), 버지니아주 헌던)를 함유하는 완전 RPMI-1640 배지 [10% 불활성화된 FCS, 2 mmol/L L-글루타민, 25 mmol/L NaHCO3, 1 mmol/L 피루브산나트륨, 25 mmol/L N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 100 kU/L 페니실린 G, 및 100 mg/L 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지] 중에 재현탁시켰다. 신선한 완전 RPMI 배지 중 프로류킨® (rIL-2)을 제0일 및 격일로 계속 첨가하였다. 세포를 1x106개 세포/ml의 농도로 배양하고, 세포 밀도를 매일 결정하였다.
이펙터 세포의 생체외 분리
단세포 현탁 후에, 마우스 세포를 제조업체의 지침서에 따라 CD8 마우스 마이크로비드 키트 (밀테니 바이오텍, 독일 베르기쉬 글라트바흐)를 사용하여 분리하였다. 간략하게, 상이한 기관으로부터의 단세포 현탁액을 상기 기재된 바와 같이 제조하고, 세포 수를 결정하였다. 10분 동안 300g에서 세포 원심분리 후에, 상청액을 완전히 제거하였다. 세포 펠릿을 90μl의 헹굼 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA) 중에 재현탁시켰다. 세포를 107개 총 세포당 10μl의 CD8 마이크로비드와 혼합하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 자기 분리 전에, 세포를 107개 세포당 2ml의 헹굼 완충제로 세척하고, 10분 동안 300g에서 원심분리하여 상청액을 제거하고, 500μl의 헹굼 완충제 중에 재현탁시켰다. 한편, 자기 칼럼을 적합한 MACS 분리기의 자기장에 배치하고, 3ml의 헹굼 완충제로 헹굼으로써 분류를 위해 준비하였다. 최종적으로, 세포 현탁액을 칼럼에 적용하고, 이를 3ml의 헹굼 완충제로 3회 헹궜다. 모든 비표지된 (음성) 세포를 헹궈내고, 15ml 팔콘 튜브에 수집하였다. 표지된 이펙터 세포를 수집하기 위해, 칼럼을 자기장으로부터 제거하고, 5ml의 헹굼 완충제를 칼럼 상에 적용하고, 플런저를 사용하여 깨끗한 15ml 팔콘 튜브에 양성 세포 분획을 플러싱하였다.
음성 분획을 24-웰 플레이트 (BD)에서 50 유닛/ml IL-2로 1:1 이펙터:표적 (E:T) 비에서 시험관내 자극하였다. 시험관내 자극의 5일 후에, 세포를 수확하고, 51Cr-방출 검정에 사용하였다.
탈과립화 및 세포독성 검정
탈과립화하는 NK 세포 능력을 분석하기 위해, 세포를 96 웰 플레이트에 1x106개 세포/ml의 밀도로 배양하고, 단독으로 또는 K562와 함께 1:1의 비로 또는 PMA&Iono (0.5μg/ml, 회사, 소재지)와 함께 4-6시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간의 인큐베이션 후에, 골지스톱(GolgiStop) (BD)을 배양물에 첨가하여 단백질 수송을 억제하였다. 후속적으로, 세포를 4℃에서 30분 동안 CD56 및 CD107a에 대해 염색하였다.
세포독성 기능을 18시간 51Cr-방출 검정에서 삼중으로 측정하였다. 간략하게, 1x106개 표적 세포를 100μl 51Cr (1mCi/ml의 비활성)로 표지하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 5T33 및 LPS 블라스트를 표적으로서 사용하였다. CTL 세포를 100:1의 최대 E:T 비로, 삼중으로 제조된 표적 세포 연속 희석물과 함께 공동-인큐베이션하였다. RPMI 배지를 음성 대조군으로서 사용하고, 양성 대조군의 경우에 세포를 1%의 트리톤 X과 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 18시간 동안 V-바닥 형상 96-웰 플레이트에서 인큐베이션 후에, 70μl의 상청액을 각각의 웰로부터 흡인하고, 팩커드 코브라 오토-감마 5000 시리즈 카운팅 시스템 (메리덴(Meriden), 미국 코네티컷주)을 사용하여 카운팅하였다. 자발적 방출의 백분율을 하기 식으로부터 계산하였다: % 특이적 51Cr 방출 = (샘플 방출-자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출) x 100.
마우스 CD4 + 및 CD8 + 세포의 생체내 고갈
106개 5T33 MM 세포를 C57Bl/6 마우스에게 접종함으로써 그들을 꼬리 정맥을 통해 또는 피하로 종양 시험감염시켰다. 생체내 CD4 세포를 고갈시키기 위해, 마우스에 면역화 2일 전에 시작하여 200 μg i.p.의 항-CD4 mAb를 주사하고, 그후에 5일마다, 실험의 종결까지, 200 μg i.p.의 항-CD4 mAb를 주사하였다. 대조군 마우스에 이소형 대조군으로서 유사한 부피 (0.2 ml) 및 용량의 마우스 IgG 항체 (시그마)를 주사하였다. CD4+ 세포의 고갈의 효능을 종점에서 비장 세포의 유동 세포측정 분석에 의해 모니터링하였다. 비장에서 >1.0% CD4+ 세포를 나타내는 동물을 연구로부터 제외하였다 (n = 2).
병행하여, CTL의 생체내 고갈을 정제된 항-CD8 MAb (클론 2.43)를 사용하여 수행하고; 종양의 확립 동안 고갈할 때, 마우스당 0.5 mg의 항체를 제-2일부터 5일마다 종점까지, 복강내로 주사하였다.
마우스를 하반신마비 또는 피하 종양의 발생에 대해 모니터링하고, 그의 생존 동역학을 비교하였다.
유동 세포측정법
표현형결정을 CD2 (RPA-2.10),CD11b (ICRF44) CD57 (NK-1) DNAM1 (DX11),NKp44 (p44-8.1) NKp46 (9E2), NKp30 (p30-15), CD107a (H4A3), NKG2D (1D11) (BD, 뉴저지주 플랭클린 레이크스); NKG2C (134591) (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 영국 애빙던); CD56 (HCD56), NKp80 (5d12), CD161 (HP-3G10), CD319 (162.1), CD352 (NT-7), (바이오레전드(Biolegend), 캘리포니아주 샌디에고); CD244 (C1.7) (베크만 쿨터(Beckman Coulter), 캘리포니아주 브레아); Siglec 7 (REA214) (밀테니, 독일 베르기쉬 글라트바흐)에 대하여 형광색소-접합된 항체로 분석하고 제조업체의 절차에 따라 취급하였다. 퍼포린 (dG9), 그랜자임 B (GB11) (BD)의 세포내 염색을 위해, 세포를 PBS로 세척하고, 이어서 시토픽스/시토펌 (BD)으로 고정화 및 투과화하고, 20분 동안 +4℃에서 인큐베이션하였다. 고정화 및 투과화 후에, 세포를 세척하고 제조업체의 프로토콜에 따라 펌워쉬에서 염색하였다.
모든 세포를 파르텍 시플로우 ML 또는 BD LSR 포르테사 유동 세포측정기 (BD)에 의해 획득하고, 플로우조 소프트웨어 (플로우조 엘엘씨(FlowJo LLC), 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여 분석하였다.
통계
비-파라미터 크루스칼 왈리스 시험을 사용하여 모든 배양물의 절대 세포 카운트, NK 세포 백분율 및 세포독성을 비교하였다. 로그 순위 검정을 MacOSX (그래프 패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 대한 그래프패드 프리즘 버전 6을 사용하여 수행하여 생존 곡선의 통계적 유의성 (p<0.05)을 분석하였다.
결과
퍼포린 및 그랜자임 B 함량
RIAA, M5 또는 M8로 개별적으로 처리된 NK 세포의 3개 배치를 형질감염으로부터 4시간 후에, 본 발명자들은 상기 기재된 바와 같은 유동 세포측정법을 사용하여 NK 세포의 그랜자임 B 및 퍼포린 로드를 분석하였다. RIAA로 처리된 IL2 자극된 NK 세포에서, 본 발명자들은 IL2 자극된 M5 및 M8 대조군과 비교 시 퍼포린 함량에서 1600 - 2000배 증가 및 그랜자임 B 함량에서 800 - 1100배 증가를 보았다 (도 2). M5는 비처리된 세포에 비해 퍼포린 함량에서 141-921배 증가를 제시하였고, M8은 비처리된 세포에 비해 퍼포린 함량에서 110-783배 증가를 제시하였다. M5는 비처리된 세포에 비해 그랜자임 B 함량에서 70-460배 증가를 제시하였고, M8은 비처리된 세포에 비해 퍼포린 함량에서 55-391배 증가를 제시하였다. 도 2에서의 데이터는 하기 표 3 및 4에 추가로 제시된다.
표 3
Figure pat00006
표 4
Figure pat00007
RIAA 및 M8 중 어느 하나로의 TALL-104 세포주의 형질감염으로부터 2, 4 및 6시간 후에, 이러한 감마-델타 T 세포주의 그랜자임 B 및 퍼포린 로드를 상기 기재된 동일한 패널을 사용하여 평가하였다. 본 발명자들은, 유사한 방식으로 RIAA로 처리된 아암에서 그랜자임 B 및 퍼포린의 상향조절 (도 9)을 관찰하였다. RIAA로 처리된 세포는 퍼포린에서 270-1722의 증가를 제시하였다. M8은 비처리된 세포에 비해 퍼포린 함량에서 190-381배 증가를 제시하였다. M8은 비처리된 세포에 비해 퍼포린 함량에서 224-365배 증가를 제시하였다. 이러한 데이터는 또한 하기 표 5 및 6에 제시된다.
표 5
Figure pat00008
표 6
Figure pat00009
연속 세포독성 검정
K562 표적에 대한 NK 세포의 연속 세포독성 능력을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Bhat et al., 2007). M5, 및 M8 효능제 뿐만 아니라 RIAA 운반 나노입자를 밤새 인큐베이션 하에 IL-2 활성화된 NK 세포 상에 형질감염시켰다. 그후에 세포독성 검정을 수행하였다. M5 및 M8 형질감염된 NK 세포는 연속 사멸 능력에서 유의한 차이를 갖지 않았다. 그러나, RIAA 형질감염된 세포는 연속 세포독성 활성에서 유의한 증가를 가졌다 (도 3 및 4).
생체내 종양 거부 검정
5T33MM 종양을 상기에 정의된 바와 같이 확립하였다. RNA 운반 나노입자를 종양 세포 주사로부터 5일 후에 투여하였다. 입자를 2시간마다 6회 주사하였다 (1 μg/g; 500 μL의 PBS). 비교 종양 생착은 RIAA 입자 투여된 마우스가 지연된 MM 생착을 갖는다는 것을 제시하였다 (도 4). 추가의 연구는 HEK293 유래된 EV의 피하 투여가 동일한 실험 모델에서 용량 의존성 방식으로 생존을 지연시켰다는 것을 제시하였다 (도 9).
논의
이러한 연구에서, 본 발명자들은 세포독성 림프구 예컨대 자연 킬러 세포 및 세포독성 T 림프구에서의 퍼포린 및 그랜자임 B 생산의 최적 유도제를 확인하는 것을 목표로 하였다. RIG-I 의존성 유도를 유도하기 위한 시도에서, 본 발명자들은 이전에 공개된 RIG-I 효능제 (M5 및 M8)를 사용함으로써 더 우수한 퍼포린 및 그랜자임 B 발현으로 이어지는 RIG-I 유도의 가설을 처음으로 시험하였다. 본 발명자들이 또한 이전에 보고된 바와 같은 유형 I 인터페론 분비에서의 증가를 관찰할 수 있을지라도, 본 발명자들은 세포독성 과립 중 어느 하나에서의 유의한 증가를 관찰한 바 없다. 이를 수용하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 이전에 정의된 구축물보다 훨씬 더 짧고 구조적으로 상이한 새로운 구축물을 시험하였다. 형질감염 또는 EV 매개된 전달을 사용한 자연 킬러 세포 및 T 세포에 대한 이러한 구축물의 도입은 퍼포린 이어서 그랜자임 B의 발현에서 유의하고 신속한 증가를 유발하였다. 본 발명자들이 아는 바로는, 이는 세포독성 림프구의 프로테옴 프로파일에서의 이러한 급격한 차이로 이어지는 RNA 구축물의 최초 보고서이다.
본 발명자들은 그후에 이러한 RNA 구축물을 이전에 보고된 동계 면역적격 실험적 다발성 골수종 (MM) 모델에 투여하였으며, 여기서 본 발명자들은 활성화된 NK 세포가 용량 의존성 방식으로의 MM 주사에 결정적이라는 것을 제시하였다. 이러한 경우에, NK 세포의 입양 전달은 전혀 없었지만 단지 최소 잔류 질환의 확립 직후에 비교적 짧은 기간 동안 RNA 투여만이 있었다. 구축물은 모든 다른 시험된 치료와 비교하여 종양 발생에서 유의한 지연을 유발하였다. 본 발명자들은 이러한 현상이 세포의 연속 세포독성 능력에서의 증가로 인한 가능성이 있다고 여긴다. 본 발명자들은 임의의 오프-타겟 효과 또는 심각한 유해 사건을 관찰한 바 없다. 그러나, RNA 분자의 생체내 전달은 준최적이었고 추가의 연구는 최적 항종양 활성을 위한 전달의 최상의 플랫폼 및 방법을 밝히도록 요구된다.
시토졸 RNA 인식 수용체 RIG-I 및 MDA-5의 자극 및 활성화는 활성화된 세포의 면역 반응을 부스팅하는데 매우 매력적이다. 활성화는 면역 세포의 프라이밍, 확장 및 분극화에 중대한 역할을 갖는 광범위한 항바이러스 이펙터, 시토카인 및 케모카인의 합성을 자극할 것이다 (Beljanski et al., 2015). 이는 RIG-I의 5'pppRNA로의 활성화가 염증유발 및 항바이러스 유전자의 견고한 발현으로 이어진다는 것으로 이전에 제시된 바 있다 (Chiang et al., 2015). 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 구축물의 길이가 항바이러스 반응의 강도에 결정적인 영향을 갖는 것처럼 보이며, 구축물이 59-뉴클레오티드 내지 99-뉴클레오티드이면 항바이러스 반응은 더 짧은 구축물과 비교하여 증대되었다 (Chiang et al., 2015). 추가적으로, K562의 크게 증가된 연속 사멸은 생체내에서 제시되었고 (도 2 및 3), 또한 종양 거부 검정으로 시험관내에서 확증될 수 있었다 (도 4). 이러한 크게 증가된 세포독성 활성은 부스팅된 퍼포린 및 그랜자임 B 수준의 직접 효과이다.
RIAA의 RNA 서열 및 2차 구조는 이전에 공개된 RIG-I 효능제 M5 및 M8과 전적으로 상이하다. RIAA는 다른 RNA 분자 둘 다보다 유의하게 더 짧고, 유의한 서열 상동성을 전혀 공유하지 않는다 (도 6). M5는 한쪽 측 상에 헤어핀을 갖는 선형 분자이고 M8은 1개의 헤어핀을 갖는 양측 dsRNA 가닥이다. 대조적으로, RIAA 구조는 헤어핀 및 루프 구조로 무장된 것이다 (도 5). 이들 구조적 차이는 다른 알려진 RIG I 효능제에 비해 RIAA의 크게 증가된 활성을 설명하는 것이다.
요약하면, 본 발명자들은 RIAA RNA 구축물이 증가된 퍼포린 및 그랜자임 B 발현을 유도하며, 이는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 더 높은 연속 선택적 세포독성 능력으로 이어진다는 것을 입증하였다. 이러한 군의 분자의 잠재적 적용은 입양 전달 또는 직접 투여 전의 세포의 단순한 생체외 처리일 수 있다. 이들 구축물의 안전성 및 효능 프로파일을 이해하기 위한 추가의 연구가 정당화된다.
실시예 2: 생체내 용도
본 발명의 RNA 구축물은 구축물을 발현하는 세포를 이식/투여함으로써 또는 소분자로서 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 세포 또는 소분자는 환자에 주사되거나 또는 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 이어서 RNA 구축물을 제공받은 세포는 그랜자임 B 및/또는 퍼포린의 생산 및 저장을 증가시켜 세포의 연속 사멸 능력을 개선시킬 것이다.
본 발명의 RNA 구축물은 관련 분야에 알려진 기술을 사용하여 주사, 경구, 비강 또는 점막 전달을 통해 투여될 수 있다. 잠재적인 치료 적용은 암, 간 유전자 요법, 단일 유전자 장애, 저장 장애 뿐만 아니라 종양 재표적화 유전자를 포함한다.
본 발명에 의해 치료가능한 암은 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 및 모세포종: 급성 림프모구성 백혈병 (all), 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, aids-관련 암, 항문암, 성상세포종, 기저-세포 암종, 간외 담관암 (담관암종), 방광암, 골 종양 (골육종/악성 섬유성 조직구종), 뇌간 신경교종, 뇌암, 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 림프종, 중추 신경계 림프종, 자궁경부암, 연골육종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 t-세포 림프종, 결합조직형성 미세 원형 세포 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 안내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위 (위장) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (gist), 두개외, 고환외, 또는 난소 배세포 종양, 임신성 영양막 종양, 뇌간의 신경교종, 소아기 뇌 성상세포종 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간) 암, 호지킨 림프종, 안내 흑색종, 도세포 암종 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암 (신세포암), 급성 림프모구성 백혈병 (또한 급성 림프구성 백혈병으로도 명명됨), 급성 골수성 백혈병 (또한 급성 골수 백혈병으로도 명명됨), 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병 (또한 만성 골수성 백혈병으로도 명명됨), 모발상 세포 백혈병, 구순 및 구강 암, 지방육종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 마크로글로불린혈증, 발덴스트룀병, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 수모세포종, 흑색종, 안내 (눈) 흑색종, 메르켈 세포암, 중피종, 잠재성 원발성인 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 만성 골수 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종 (골수암), 골수증식성 장애, 점액종, 비강 및 부비동 암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비소세포 폐암, 핍지교종, 구강암, 구인두암, 골육종/골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암 (표면 상피-기질 종양), 난소 배세포 종양, 난소 저 악성 잠재 종양, 췌장암, 췌장암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 선종, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종 (신장암), 신우 및 요관 이행 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 연부 조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 흑색종 및 비-흑색종 피부암, 메르켈 세포 피부 암종, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 편평 세포 암종, 잠재성 원발성을 동반하는 편평 경부암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, t-세포 림프종 (균상 식육종 및 세자리 증후군), 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 영양막 종양, 요관 및 신우 이행 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트룀병 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양 (신장암)을 포함한다.
본 발명은 또한 유전 장애 예컨대 21-히드록실라제 결핍, 연골무형성증, 급성 간헐성 포르피린증, 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍, 부신백질이영양증, 알라질 증후군, 알렉산더병, 알스트룀 증후군, 불완전 사기질형성증, 비오티니다제 결핍, CGD 만성 육아종성 장애, 디 조지 증후군, 판코니 빈혈, G6PD 결핍, 지단백질 리파제 결핍, 근육 이영양증, 뒤시엔느 유형, PHF8 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된 시데리우스 X-연결 정신 지체 증후군, X-연결 중증 복합 면역결핍 (X-SCID), X-연결 철적혈모구성 빈혈 (XLSA)을 치료하는데 유용하다.
본 발명으로 치료가능한 대사 장애는 니만-픽 질환, 테이-삭스 질환, 고셔병, 파브리병을 포함한다.
실시예 3: 만성 바이러스 감염을 포함한 바이러스 감염 셋팅에서의 용도
본 발명의 Rig I 효능제 A 형질감염된 세포의 증진된 사멸 능력은 높은 바이러스 로드를 갖는 감염된 세포를 소거하는 능력을 증진시킬 것이다. 이와 같이 본 발명은 다른 세포를 감염시키거나 또는 그의 내용물을 방출하는 이들 감염된 세포의 능력을 제거하는 바이러스 저장소의 소거를 허용할 것이다. 본 발명의 RNA 구축물은 구축물을 발현하는 세포를 이식/투여함으로써 또는 소분자로서 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 세포 또는 소분자는 환자에 주사되거나 또는 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 이어서 RNA 구축물을 제공받은 세포는 그랜자임 B 및/또는 퍼포린의 생산 및 저장을 증가시켜 세포의 연속 사멸 능력을 개선시킬 것이다.
실시예 4 줄기 세포에서의 RIAA 용도
본 발명의 RNA 구축물을 사용하여 줄기 세포의 수명을 연장시킬 수 있다. RIG I는 줄기 세포에서 DNA 복구 메카니즘을 매개하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 투여는 RIG I 활성을 증진시키는 것으로 예상되고 따라서 본 발명으로 처리된 줄기 세포의 생존율을 연장시킨다.
진행중인 실험에서, cd90 골수 샘플을 정형외과 수술을 받은 10명의 건강한 인간 공여자로부터 수득하였다. 각각의 샘플을 행크 평형 염수 용액 (HBSS)에 희석하고 70-μm 세포 필터를 통해 통과시켰다.
단세포 현탁액을 이전에 적정된 항체 믹스: CD105, CD90, CD73, CD44, CD31, CD45, CD34, CD11b, HLA-DR 및 CD14 (모두 BD 바이오사이언시스로부터)와 함께 인큐베이션하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, 세포를 20x106/ml의 농도로 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 세포를 405, 488, 561 및 633 레이저가 장착된 아리아(Aria) III (BD 바이오사이언시스)으로 분류하였다. 세포를 회수하고, DMEM, 20% FCS에서 전면생장률로 성장시켰다.
RIAA를, 플라스크에 그들을 시딩한 후에 MSCS 상에 시딩한지 24시간 후에 형질감염시켰다. 이들을 정의된 바와 같은 293 시스템으로 엑소솜에 의해 생산하였다.
생체내 상처 모델 생체에서의 중간엽 줄기 세포 ("MSC")의 치유 잠재력이 평가될 것이다. 계대 8에서, 선택된 MSC 세포주가 RIAA 처리의 존재 또는 부재 하에 이전에 기재된 바와 같이 폴리비닐 알콜 스폰지 상에 로딩되고 NOD/SCID 면역결핍 마우스에 이식될 것이다 (Deskins DL, Ardestani S, Young PP. The polyvinyl alcohol sponge model implantation. J Vis Exp. 2012;(62):3885.). 간략하게, 스폰지가 수화되고 염수 용액에 살균될 것이다. MSC 세포주당 3개의 스폰지가 25 μl의 포스페이트-완충된 염수에 7.5 x 106개 세포로 로딩될 것이다. 각각의 마우스가 3개의 스폰지로 이식될 것이며, 각각의 스폰지는 상이한 MSC 균주를 함유하고 있다. 모든 스폰지가 이식한지 21일 후에 제거되고 24시간 동안 10% 완충된 포르말린에 보존되기 전에 절반으로 절단될 것이다. 포르말린 침지 후에, 스폰지가 파라핀에 절단 측 아래로 포매되고 염색을 위해 절편화될 것이다.
도 7 및 8을 참조하면, RIAA 처리된 MSC 세포주가 대조군보다 유의하게 더 큰 성장을 나타낼 것으로 여겨진다. 이들 세포에서의 CD90의 상향조절은 종양 억제에서 RIAA 처리된 세포의 직접 또는 대용 역할을 시사한다 (참고문헌 1). 문헌 [Abeysinghe HR, Cao Q, Xu J, Pollock S, Veyberman Y, Guckert NL, Keng P, Wang N (2003). "THY1 expression is associated with tumor suppression of human ovarian cancer". Cancer Genet. Cytogenet. 143 (2): 125-32. doi:10.1016/S0165-4608(02)00855-5. PMID 12781446]. CD90이 세포의 증가된 부착, 혈관외유출 및 귀소와 명백하게 연루되었으므로 RIAA 자극으로의 MSC 및 HSC의 증가된 생착 및 부착의 가능성이 또한 중요하다. 문헌 [Rege TA, Hagood JS (2006). "Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis". FASEB J. 20 (8): 1045-54. doi:10.1096/fj.05-5460rev. PMID 16770003. Wetzel A, Chavakis T, Preissner KT, Sticherling M, Haustein UF, Anderegg U, Saalbach A (2004). "Human Thy-1 (CD90) on activated endothelial cells is a counterreceptor for the leukocyte integrin Mac-1 (CD11b/CD18)" (abstract page). J. Immunol. 172(6): 3850-9. doi:10.4049/jimmunol.172.6.3850. PMID 15004192].
실시예 5. 입양 세포 전달
가장 바람직한 용도에서, Rig I 효능제는 환자에게 입양 세포 전달 전에 세포를 처리하는데 사용된다. 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 RIAA는 생체외 조작 동안 임의의 시간에서 사용될 수 있다. 배양 범위에서 Rig I 효능제의 바람직한 농도는 약 0.4mM 내지 약 10mM이다. 0.5mM 내지 6mM이 가장 바람직하다. 이들 세포는 그에 의해 즉시 주입될 수 있거나 또는 관련 분야에 널리 알려진 프로토콜을 사용하여 추후의 주입 시점 동안 냉동될 수 있다. Rig I 효능제 투여는 단일 용량으로서 또는 반복적으로 억제제의 혈청 농도가 0.4-6 uM, 우선적으로는 더 낮은 용량일 수 있는 경우에 용량 창을 사용하여 생체내 및 생체외 둘 다에서 수행될 수 있다. 이러한 입양 세포 전달은 상기 실시예 3 하에 기재된 병태를 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 6. 바이러스 염증의 치료
본 발명은 또한 바이러스 감염에 의해 야기된 염증 예컨대 근염, 심근염, 바이러스 관절염, 바이러스 뇌염 및 수막염을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환에서 Rig I 효능제는 항바이러스 요법과 공-투여되어 면역계에 의한 바이러스의 인식을 감소 또는 정지시켜 그에 의해 염증을 감소, 방지 또는 제거할 수 있다. 이는 단지 면역 반응에 의존하지 않거나 또는 면역 반응을 완전히 활용하지 않는 항바이러스제 요법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 항바이러스제는 아다만탄 항바이러스제 예컨대 아만다틴드 및 리만티딘; 항바이러스제 부스터 예컨대 리토나비르 및 코비시스타트; 케모카인 수용체 길항제 예컨대 마라비록; 인테그라제 가닥 전달 억제제 예컨대 마라비록, 돌루테그라비르 및 엘비테그라비르; 기타 항바이러스제 예컨대 소포스부비르, 엔푸비르티드, 포스카르넷 및 포미비르센; 뉴라미니다제 억제제 예컨대 페라미비르, 오셀타미비르 및 자나미비르; 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제 (NNRTI) 예컨대 파비렌즈, 네비라핀, 델라비르딘, 에트라비린 및 릴피비린; NS5a 억제제 예컨대 다클라타스비르; 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제 (NRTI) 예컨대 지도부딘, 디다노신, 스타부딘, 라미부딘, 아바카비르, 엠트리시타빈 및 엔테카비르; 프로테아제 억제제 예컨대 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 로피나비르, 아타자나비르, 포스암프레나비르, 티프라나비르 및 다루나비르; 및 퓨린 뉴클레오시드 예컨대 리바비린, 발라시클로비르, 팜시클로비르, 아시클로비르, 간시클로비르, 발간시클로비르 및 시도포비르를 포함한다. 단독 또는 조합된 이들 약물에 대한 투약 지침서가 관련 기술분야에 널리 알려져 있다.
실시예 7: RNA 바이러스 요법의 생체내 효능에서의 증가
Rig I 효능제는 또한 생체내 투여될 때 방광 암종, 뇌 종양, 부인과 종양, 간세포성 암종, 흑색종, 다발성 골수종, 전립선 암종, 연부 조직 육종 및 고형 종양과 같은 적응증에 대하여 수포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스, 레오바이러스, 세네카바이러스, ECHO 바이러스와 같은 RNA 바이러스 기반 종양용해 바이러스 요법 예컨대 리그비르의 생체내 효능을 증가시키는데 유용하다. Rig I 효능제는 세포내 항바이러스 방어 메카니즘을 억제하는데 도움이 되며 따라서 종양 내에 종양용해 바이러스의 분포 효능을 증가시킬 것이다. Rig I 효능제의 생체내 투여를 위한 표적 혈청 수준은 0.2 내지 6mM이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에 적용된 바와 같은 본 발명의 근본적인 신규 특색들이 제시되고 기재되고 언급되었지만, 예시된 분자의 형태 및 세부사항에서, 및 그의 작동에서, 및 기재된 사용 방법에서의 다양한 생략 및 치환 및 변경이 본원에 광범위하게 개시된 바와 같은 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
참고문헌
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Claims (22)

  1. 서열식별번호: 1의 RNA 분자를 포함하는 Rig I 효능제.
  2. 제1항의 Rig I 효능제로 처리된 세포독성 세포.
  3. 제2항에 있어서, HEK293 세포, 자연 킬러 세포, 바람직하게는 NK-92 세포, CD8 세포 또는 림프구인 세포독성 세포.
  4. 제1항의 RIG I 효능제, 또는 중앙 헤어핀 및 내부 루프를 갖고 루프와 헤어핀 사이에 7-80개 염기가 있는 RNA 분자를 포함하는 Rig I 효능제를 세포독성 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포독성 세포 내 퍼포린 또는 그랜자임 B의 수준을 증가시키는 시험관내 방법.
  5. 제4항에 있어서, RNA 분자의 루프의 각 측 상에 적어도 1개의 GC 상보적 염기 쌍이 있는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상보적 GC 염기 쌍이 루프의 각 측의 2-5개 염기 쌍 내에 있는 것인 방법.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, Rig I 효능제가 IL2와 함께 투여되는 것인 방법.
  8. 제4항 또는 제5항에 있어서, 그랜자임 B 수준이 비처리된 세포의 수준보다 800-1100배 증가되고/되거나, 퍼포린 수준이 비처리된 세포의 수준보다 1600-2000배 증가되는 것인 방법.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서, 세포독성 세포가 자연 킬러 세포, 바람직하게는 NK-92 세포, CD8 세포 또는 림프구인 방법.
  10. 만성 바이러스 감염을 포함한 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항의 Rig I 효능제.
  11. 암 또는 만성 감염성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항의 Rig I 효능제.
  12. 암 또는 만성 감염성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제2항 또는 제3항의 세포독성 세포.
  13. 암 또는 만성 감염성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제4항 또는 제5항의 방법으로 생산된 세포독성 세포.
  14. 입양 세포 전달로 치료가능한 질환의 치료시 IL-2와 함께 사용하기 위한, 적어도 하나의 제1항의 Rig I 효능제로 처리된 세포.
  15. 줄기 세포를 제1항의 Rig I 효능제, 또는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 RNA 구축물과 시험관내 접촉시키는 것을 포함하는, 줄기 세포의 생존율 또는 생착을 증가시키고/거나 줄기 세포 확장, 전달 또는 치료 이익을 증진시키는 방법.
  16. 세포를 이중특이적 킬러 세포 결속체 ("BIKE"), 삼중특이적 킬러 세포 결속체 ("TRIKE") 또는 모노클로날 항체 중 적어도 하나와 함께 제1항의 Rig I 효능제, 또는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3과 시험관내 접촉시키는 것을 포함하는, 세포독성 세포의 활성화를 부스팅하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 세포독성 세포가 HEK 293 세포, 자연 킬러 세포, 바람직하게는 NK 92 세포, CD8 세포 또는 림프구인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 이식후 림프증식성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 Rig I 효능제.
  19. 제1항에 있어서, 21-히드록실라제 결핍, 연골무형성증, 급성 간헐성 포르피린증, 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍, 부신백질이영양증, 알라질 증후군, 알렉산더병, 알스트룀 증후군, 불완전 사기질형성증, 비오티니다제 결핍, CGD 만성 육아종성 장애, 디 조지 증후군, 판코니 빈혈, G6PD 결핍, 지단백질 리파제 결핍, 근육 이영양증, 뒤시엔느 유형, PHF8 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된 시데리우스 X-연결 정신 지체 증후군, X-연결 중증 복합 면역결핍 (X-SCID), 및 X-연결 철적혈모구성 빈혈 (XLSA)로부터 선택된 유전 장애를 치료하는데 사용하기 위한 Rig I 효능제.
  20. 제1항에 있어서, 니만-픽 질환, 테이-삭스 질환, 고셔병, 및 파브리병으로부터 선택된 대사 장애를 치료하는데 사용하기 위한 Rig I 효능제.
  21. 제1항에 있어서, 나노입자, 리포솜, 종양용해 바이러스, 바이러스 벡터 또는 모노클로날 항체, 또는 운반 및/또는 세포 침투 펩티드 내로 제제화하기 위한 Rig I 효능제.
  22. 제1항에 있어서, 경구, 비강 또는 점막 전달, 또는 주사를 위해 제제화하기 위한 Rig I 효능제.
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