JP2017511807A - Ｃｄ４４結合ペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるドメイン（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質、融合タンパク質および当該タンパク質の複合体に関し、そして特に、当該タンパク質と複合体化されたナノ粒子に関する。本発明は、さらに、前記タンパク質および前記それぞれの複合体化したナノ粒子を生成する方法ならびに種々の疾患、特に、癌疾患の処置および診断のための本発明のタンパク質およびペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるドメイン（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質、融合タンパク質および当該タンパク質の複合体に関し、特に、当該タンパク質と複合体化（ｃｏｎｏｊｕｇａｔｅ）されたナノ粒子に関する。本発明はさらに、前記タンパク質および前記それぞれの複合体化したナノ粒子を生成する方法、ＣＤ４４ｖ５由来のペプチドならびに種々の疾患、特に癌の処置および診断のための本発明のタンパク質およびペプチドの使用に関する。

癌転写様式の広範な研究が、悪性と良性とを区別するため、および最も進行性の癌とそれよりは進行性でない癌とを区別するための分子標的の発見をもたらした。癌は、しばしば一定の細胞表面の抗原（例えば、細胞表面の受容体）を含む多くのタンパク質を過剰発現させる。そのような過剰発現した細胞表面の抗原に結合する抗体は、そのような癌の検出および処置を容易にし得る。可能性のある診断または治療として使用され得る、癌細胞表面の受容体に対する抗体を生成するために、多くのアプローチが利用されてきた。過剰発現した細胞表面の受容体およびそれらに結合する抗体の同定は、癌治療、特に予後が悪くかつ伝統的な治療への抵抗を伴う癌サブタイプの治療に関する開発への道筋を提供する。ＣＤ４４、ＣＡ１９−９およびＣＥＡは、そのような過剰発現した細胞表面の受容体であり、腫瘍進行および悪性度に関連することが知られている。

ＣＤ４４（細胞外マトリックスにとっての主要なアドヘシン分子）は、白血球ホーミングならびに活性化、創傷治癒および細胞移動を含む多種多様な生理学的なプロセス、ならびに腫瘍細胞の浸潤および転移と関係があるとされてきた（Ｇｕｎｔｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｎａｇａｎｏ ａｎｄ Ｓａｙａ， ２００４； Ｐｏｎｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。

ＣＤ４４は、保存されたＮ末端細胞外ドメイン、保存されていない膜近位の領域、バリアントエキソンの種々の組み合わせを発現する可変領域、保存された膜貫通ドメインおよび保存された細胞質側末端を含む単鎖分子である。ＣＤ４４のゲノムマップは、５’末端における５個の定常エキソン（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｘｏｎ）および３’末端における５個の定常エキソンを含有する。マウスＣＤ４４遺伝子はまた、分子の中ほどにＶ１〜Ｖ１０と呼ばれる１０個のバリアントエキソンも含有し、全部で２０個のエキソンを含有することになる。ヒトＣＤ４４遺伝子は、これらの１０個のバリアントエキソンのうち９個のみ（Ｖ２〜Ｖ１０）を含み、したがって全部で１９個のエキソンを含む。差動選択的スプライシングは、バリアントエキソン（エキソンＶ_ｘと呼ばれ、ｘ＝１〜１０である）の種々の組み合わせを発現するＣＤ４４の多くのアイソフォームを生成し、それらは膜近位のドメインに挿入され、そして当該分子の可変領域を構成する。これらの分子は、ＣＤ４４バリアント（ＣＤ４４ｖ）と呼ばれる。現在までに、２０個のＣＤ４４のアイソフォームが知られている。

標準的なＣＤ４４アイソフォーム（ＣＤ４４ｓ）は主に造血性細胞および通常の上皮細胞サブセットにおいて発現している一方で、膜近位の細胞外領域に挿入を伴うＣＤ４４バリアントは、結腸、乳房、胃、膀胱、前立腺癌および種々の造血性新生物を含む種々のヒト腫瘍において豊富に存在することが見出された。さらなる報告は、バリアントＣＤ４４の発現と腫瘍進行、特に新生物形成細胞のリンパを介した拡散（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓｐｒｅａｄ）との間の緊密な相関関係を示唆した。

総合すると、これらの知見は、細胞接着および移動におけるＣＤ４４バリアントのより確立された機能に加えて、発癌開始（ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）および癌細胞の維持におけるＣＤ４４バリアントの重要な機能を指摘している。

癌におけるＣＤ４４の役割に加えて、ＣＤ４４はまた、自己免疫疾患における潜在的な標的としても示唆されてきた。ＣＤ４４タンパク質もしくはペプチドまたは誘導体の投与が種々の自己免疫疾患の処置のために使用され得ることが報告されている（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。

癌および自己免疫疾患におけるＣＤ４４の確立された役割に基づいて、ＣＤ４４の種々のバリアント領域に対するモノクローナル抗体もまた、ＣＤ４４関連障害の診断または治療のための可能性のある物質として生成されてきた。

Ｓｅｉｔｅｒらは、ラット膵臓腺癌の表面のタンパク質であるＣＤ４４の転移特異的バリアントに対するｍＡｂを説明する（Ｓｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。これらの抗体は、例えば、リウマチ型の疾患を含む免疫調節性障害の治療的処置のための免疫抑制を生成するために提案される。Ｔ細胞の増殖を阻害するＣＤ４４と反応するモノクローナル抗体はまた、種々の自己免疫疾患の処置のために提供された。エキソンｖ６ペプチドを含むＣＤ４４の形態に結合するモノクローナル抗体はまた、炎症性疾患の診断のために有用であると報告された（Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。

特許文献１（ＷＯ ９１／１７２４８）は、腫瘍の治療および診断のための抗ＣＤ４４ｖ抗体の使用に関する。特許文献２（ＷＯ ９５／００８５１）は、腫瘍の診断のためのＣＤ４４の可変エキソンに対する抗体の使用に関する。特許文献３（ＷＯ ９５／０４５４７）は、免疫療法および免疫シンチグラフィの目的のための、特にエキソンｖ５の配列内のエピトープに対する抗ＣＤ４４抗体の使用を開示する。エキソンｖ６に対する抗ＣＤ４４抗体は、特許文献４（ＷＯ ９５／３３７７１）によって開示される。さらに、特許文献５（ＥＰ ０ ５３８ ７５４）は、免疫抑制のためのＣＤ４４バリアントに対する抗体の使用を教示する。

先行技術の抗ＣＤ４４抗体は、いくつかの不利益を示す。それらは、組み換え産生法によって生成される必要がある大きくかつ複雑な分子を表す。それゆえ、製造プロセスは、手が込んでおり、費用がかかり、かつ厳密な規制要件を満たす必要がある。さらに、免疫原性の可能性を減少させる必要性によって、ヒト抗体またはヒト化抗体の生成が求められる。

国際公開第９１／１７２４８号 国際公開第９５／００８５１号 国際公開第９５／０４５４７号 国際公開第９５／３３７７１号 欧州特許第０５３８７５４号明細書

それゆえ、ＣＤ４４バリアント結合分子に対する必要性が依然として存在している。したがって、本発明の目的は、上記の不利益の少なくとも１つを克服するＣＤ４４バリアント結合物質を提供することである。

この課題は、特許請求の範囲の請求項１に記載のＣＤ４４バリアント結合タンパク質、ならびに診断および治療のための前記結合タンパク質の使用の提供によって、特に、前記タンパク質を用いてコーティングされたナノ粒子を使用することによって、解決される。本発明の特定の実施形態は、さらなる独立請求項または従属請求項の対象である。

（発明の概要）
第一の局面において、本発明は、ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチド（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質を提供し、当該タンパク質は、
ａ）配列番号１〜５によるアミノ酸配列；または
ｂ）配列番号１〜５において示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％そして最も好ましくは９５％の同一性を伴うアミノ酸配列；または
ｃ）配列番号６〜１０において表されたような配列：「ＰＹＹＧＫＸＬＸ_３ＹＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ＳＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ」によって規定されるＣＤ４４結合モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％または１００％の同一性を伴うアミノ酸配列であって、Ｘが任意のアミノ酸を意味する、アミノ酸配列；
を含むかまたは前記アミノ酸配列からなり、当該タンパク質は１００アミノ酸もしくはそれ未満の長さを有する。

酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実行することによって、本発明者らは、ＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチドとの特異的な結合を伴う５個の異なるペプチドを同定することができた。アミノ酸配列は、図３および以下の表において示され、配列番号１〜５と名付けられた。

さらなる分析により、コンセンサス配列は、以下のアミノ酸配列を表す、これらの配列由来であり得ることが明らかとなった：
ＰＹＹＧＫＸＬＸ_３ＹＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ＳＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ

これらのコンセンサス配列は、以下の表に表されるように配列番号６〜１０と名付けられ、それに従って、これらの５つの配列は任意の配列Ｘ_{１０〜１４}の長さが異なる。「Ｘ」が任意のアミノ酸と規定されることに注意されたい。

全ての別個の単離されたＣＤ４４相互作用ペプチドを包含する特有のコンセンサス配列を導き出す能力は、ツーハイブリッドスクリーニング法の結果をさらに有効にする。

その後の２種類の別個の親和性アッセイにおいて、配列番号１〜５のペプチドは、ＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチドへの結合に関して分析され、そして当該ペプチドの親和性順位付けが可能とされ、それによって当該ペプチドを以下のように名付けた：
配列番号１のペプチド：ペプチドＡ
配列番号２のペプチド：ペプチドＣ
配列番号３のペプチド：ペプチドＢ
配列番号４のペプチド：ペプチドＤ
配列番号５のペプチド：ペプチドＥ

両方の親和性アッセイ（偽性ヒットピッキング（ｐｓｅｕｄｏｈｉｔｐｉｃｋｉｎｇ）アッセイおよびフルオレセイン ジ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）に基づくアッセイ）は、同一の順位付けの順番を明示した。
Ｂ＞Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
Ｃ＞Ａ、Ｄ、Ｅ
Ｄ＞Ａ、Ｅ
Ｅ＞Ａ
Ａ＞

要約すると、ペプチドＢ（＝配列番号３）は、ＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチドに対する最も高い親和性を有し、そして本発明の文脈において好ましいペプチドとしてみなされる必要がある。このペプチドに関して、エピトープマッピングが実行され、それによって欠失分析およびアラニンスキャンが実行された。

さらに、ペプチドＡ、Ｃ、ＤおよびＥはまた、欠失アッセイにおいて分析され、コンセンサス配列の妥当性が確かめられた。

これらの分析に基づいて、本発明は、さらなる局面においてヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチド（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質を提供し、当該タンパク質は、
ａ）配列番号３９〜５２によるアミノ酸配列；または
ｂ）配列番号３９〜５２において示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％そして最も好ましくは９５％の同一性を伴うアミノ酸配列；または
ｃ）配列番号５３〜６２において表されたような配列：「ＰＧＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ ^Ｓ／_ＡＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ」によって規定されるＣＤ４４結合モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％または１００％の同一性を伴うアミノ酸配列であって、Ｘが任意のアミノ酸を意味する、アミノ酸配列；
を含むかまたは前記アミノ酸配列からなり、当該タンパク質は１００アミノ酸もしくはそれ未満の長さを有する。

当該ペプチドのエピトープマッピングに基づいて、上に開示されたコンセンサス配列が一通り確認された。しかしながら、より好ましいコンセンサス配列は、以下のアミノ酸配列を表すこれらの配列から由来し得る：
ＰＧＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ ^Ｓ／_ＡＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ

これらのコンセンサス配列は、以下の表において表されるように配列番号５３から６２と名付けられ、それに従って、これらの配列は１４位のアミノ酸交換（Ｓｅｒ−Ａｌａ）および任意の配列Ｘ_{１０〜１４}の長さが異なる。「Ｘ」が任意のアミノ酸と規定されることに注意されたい。

本発明のペプチドが、ＣＤ４４のエピトープに対する大きな抗体だけでなく、臨床的に関連のあるＣＤ４４ドメインに特異的かつ選択的に結合する３２アミノ酸と６６アミノ酸との間の長さの幾分小さなペプチドもまた生成され得ることを初めて示すことは、強調される必要がある。

先行技術の（モノクローナル）ＣＤ４４ｖ５抗体と対照的に、これらのペプチドは、いくつかの利点を示す。

前記ペプチドがコンプレックスまたは細胞内ジスルフィド架橋を形成する必要がない短いペプチドを表すため、それらは、産生および精製することが非常に容易である。

３２アミノ酸と６６アミノ酸との間の長さのペプチドであるため、（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる）固相合成法によって前記ペプチドを合成することが可能でさえある。このｅｘ ｖｉｖｏタンパク質合成は、組み換えタンパク質発現に関連する厳密な規制要件を考慮すると、特に有利である。

さらに、小さなペプチドであるため、前記ペプチドは、治療または診断に使用されるために、別のタンパク質、特定の化合物またはナノ粒子とさえ好都合に複合体化または融合され得る。

小さなペプチドであるため、前記ペプチドは血液脳関門および細胞膜を通過し得、化合物を抗体が対処し得ない区画に送達する。

本発明のタンパク質の小さなサイズによって、免疫応答を誘発する危険性が、強く減少される。抗体につきものである免疫原性の危険性が当該タンパク質の臨床用途を著しく損なうことが指摘される必要がある。

本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質がバリアントドメインｖ５のみを妨害することによって、通常のＣＤ４４の機能を無傷で残し、そしてそれゆえ特異的な干渉を可能にすることは、強調される必要がある。

要約すると、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、副作用の危険性が減少した治療および診断および癌のための新規な戦略への扉を開く。

（発明の詳細な説明）
本発明の一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチド（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質を提供し、当該タンパク質は、配列番号１から５および３９から５２において示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも（ｌｅａｓｔ）９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性、そして具体的には少なくとも９７．５％の同一性を伴うアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列からなる。

さらなる実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチド（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質を提供し、当該タンパク質は、配列番号６から１０において表されたような配列：「ＰＹＹＧＫＸＬＸ_３ＹＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ＳＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ」、および配列番号５３から６２において表されたような配列：「ＰＧＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ ^Ｓ／_ＡＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ」によって規定されるＣＤ４４結合モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７．５％、そしてよりいっそう好ましくは少なくとも１００％の同一性を伴うアミノ酸配列であって、Ｘが任意のアミノ酸配列を意味する、アミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列からなる。

添付の特許請求の範囲に記載されるようなタンパク質は、３００アミノ酸またはそれ未満の長さ、好ましくは２００アミノ酸またはそれ未満の、より好ましくは１００アミノ酸またはそれ未満の長さ、そしてよりいっそう好ましくは９０、８５、８０、７５、７０もしくは６６アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。

本発明のさらなる実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、ｋ_ｉ値が１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、そして最も好ましくは１０ｎＭ未満である、エキソン９によってコードされるポリペプチドへの高い親和性を有する。

本発明のさらなる実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、エキソン９によってコードされるポリペプチドに選択的に結合し、それは、当該タンパク質がＣＤ４４ｅｘ９結合についてのｋ_ｉ値よりも、好ましくは少なくとも１／１０倍、より好ましくは１／１００倍のｋ_ｉ値を伴う他の任意のタンパク質と結合する場合に示される。

一実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、エキソン９によってコードされるドメイン（「バリアント５」（ｖ５）とも呼ばれる）を含有するあらゆるＣＤ４４アイソフォームに結合することができる。

好ましい実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、ＣＤ４４ ｖ５、ＣＤ４４ ｖ５〜ｖ６、ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ６、ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ６、ＣＤ４４ ｖ２〜ｖ１０、ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ１０、ＣＤ４４ Ｖ４〜ｖ７およびＣＤ４４ ｖ４〜ｖ１０からなるリストから選択されるＣＤ４４アイソフォームと結合する。

特に、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質はまた、ドメインｖ５に加えて、他のバリアントドメイン（例えば、ｖ１、ｖ２、ｖ３、ｖ４、ｖ６、ｖ７、ｖ８、ｖ９および／またはｖ１０）も含むタンパク質にも結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、異種タンパク質もしくはポリペプチドと複合体化されるか、または融合される。この複合体化／融合は、当該結合タンパク質の薬力学的性質もしくは薬物動態学的性質を変化させ得るか、または潜在的な副作用を減少させるために役立ち得る。

前記タンパク質はさらに、当該結合タンパク質の検出を可能にするレポータータンパク質、またはタンパク質精製を可能にし、そして２つの切り離されたタンパク質の遊離を可能にするプロテアーゼまたは化学物質のための切断部位を用いてさらに操作され得るペプチドもしくはタンパク質として、使用され得る。

本技術は、ニッケルまたはコバルト樹脂を用いるアフィニティクロマトグラフィを使用することで単離され得るＧＳＴタンパク質、ＦＬＡＧペプチド、またはヘキサ−Ｈｉｓペプチド（６ × Ｈｉｓタグ）と融合することによって、タンパク質の同定および精製のためにしばしば使用される。

前記結合タンパク質は、抗体、毒素、免疫調節性ペプチドおよびサイトカインからなる群から選択されるタンパク質と好ましくは連結され得るか、または融合され得る。

好ましい実施形態において、複合体化された／融合されたタンパク質は、前駆体分子から細胞傷害性物質または細胞増殖抑制性物質の生成を触媒する酵素である。適切な酵素の非網羅的なリストは、アルデヒドオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ、チロシナーゼ、チミジレートシンターゼ、チミジンホスホリラーゼ、グルタチオン−Ｓ トランスフェラーゼ、デオキシシチジンキナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、システイン複合体ベータリアーゼ、およびニトロレダクターゼを包含する。

本発明の結合タンパク質はまた、癌細胞を阻害するか、障害するか、もしくは死滅させるか、または癌細胞をさらなる細胞傷害性化合物に対して感受性にするタンパク質と複合体化されるか、または融合され得る。当該タンパク質の非限定的な例は、シトシンデアミナーゼ、可溶性Ｆｍｓ様チロシンキナーゼリガンド、単純ヘルペスウイルス−１ チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１、網膜芽腫関連タンパク質、ｐ１６／ｃｄｋｎ２およびＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮである。ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮは、ホスホイノシチド（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｎｏｓｉｔｉｄｅ）３−キナーゼの負の調節因子として作用する。ＭＭＡＣ１は、Ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒｓ１を表す。

さらなる局面において、本発明は、炭水化物、色素分子、放射性同位元素、毒素、細胞増殖抑制性物質、サイトカイン、免疫調節性物質、またはそれらのプロドラッグからなる群から選択される化合物と直接的にまたはリンカーによって間接的に連結される本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を含む複合体を提供する。

本発明による複合体は、一般的に、癌細胞を障害するか、阻害するか、または死滅もさせる任意のタイプの薬物と連結され得る。それゆえ、細胞傷害性物質が、特に好ましい。細胞傷害性物質に関する非限定的な例としては、エモゾロミド（ｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、イリノテカンまたはこれらの物質の２つ以上の任意の組み合わせ物が挙げられる。

適切な癌インヒビターに関するさらなる例は、（−）−Ｃｉ−Ｃｄｐ１、（−）−Ｃｉ−Ｃｄｐ２、（−）−エピガロカテキンガラート、（＋）−Ｃｂｉ−Ｃｄｐｉ２、（＋）−Ｃｉ−Ｃｄｐ２、１０−デアセチルバッカチン ＩＩＩ、４−デメトキシダウノルビシン、５−アザシチジン／５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロウラシル、５−イミノドキソルビシン塩酸塩、６−メルカプトプリン、アクラルビシン、アコダゾール、アクチノマイシンＤ、アデニンホスフェート、アデノシン、アデルバシブ、アドゾレシン；Ｕ−７３、９７５、アフェレテカン、アレムツズマブ、アリトレニノイン（ａｌｉｔｒｅｎｉｎｏｉｎ）、塩酸アロセトロン、アルフィトール酸、アルトレタミン、アルベスピマイシン、アンバゾン、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、塩酸アムサクリン、アムシラロテン、アミグダリン、アナグレリド、アナストロゾール、アナキシロン、アンシタビン、アンノモンタシン、アンノムリシンＡ、（Ｃ１９／Ｃ２０−Ｅｒｙｔｈｒｏ）、アンノムリシンＢ、（Ｃ １ ０／Ｃ Ｉ Ｉ，Ｃ１９／Ｃ２０−Ｅｒｙｔｈｒｏ）、アンノムリシンＣ、（全Ｔｈｒｅｏ）アンノムリシンＥ、アンノナシン、アンノナシン−ＩＯ−オン、アンノナシン−Ａ−オン、アンノニジンＢ、アンノニンＶＩ、アンノスクアモシンＡ、アンノスクアモシンＢ、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ、アリストホリン、三酸化ヒ素、アルテミシニン、アスコマイシン、アスパラギナーゼ、アトシバン、アトリムスチン、アキシチニブ、塩酸アザセトロン、アザテパ、アザチオプリン、アゾトマイシン、バフェチニブ、バラマピモド、バノキサントロン、バタブリン、バチマスタット、Ｂｂｒ−３４３８４、ベカテカリン、ベロテカン、ベナキシビン、ベンダムスチン、ベンゾデパ、ベルビシン、ベツリン、ベツリン酸、ベツリンアルデヒド、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール、ビサントレン、ビストラミドＡ；ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレオマイシン、ブレオマイシンＡ２［スルフェート］、ブレオマイシンＡ５、ブレオマイシンスルフェート、ボルテゾミブ、ボセンタン、ボスチニブ、ブレキナルナトリウム、ブレキナル、ブロピリミン、ブロスタリシン、ブドチタン、ブラタシン、ブセレリン、ブスルファン、カバジタキセル、カルシウムホリナート、カルシウムレボホリナート、カルステロン、カンプトテシン、カネルチニブ、カンホスファミド、カンタリジン、カペシタビン、カラセミド、カルベチメル、カルボプラチン、カルボプロスト（カルボプロストトロメタミン）、カルボコン、カルフィルゾミブ、カルグルミル酸、カルモフール、カルゼレシン、セデフィンゴル、セマドチン、セツキシマブ、セビパブリン、クロラムブシル、クロロメチン（メクロレタミン）、クロロタモキシフェン、クロロトリアニセン、シオテロネル、シスプラチン、クラドリビン、クランフェヌル、クロファラビン、クロファジミン、クロミフェンシトレート、コルジセピン、コロソリン酸、クリスナトール、クルクミン、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジン、Ｄ−アミノレブリン酸、ダカルバジン、ダムシン、ダニキドン、ダヌセルチブ、ダポリナド、ダリナパルシン、ダサチニブ、ダウノブラスチン、ダウノルビシン／ダウノマイシン、デシタビン、デフェラシロクス、デホロリムス、デメコルシン、デニブリン、デトルビシン、デクスニグルジピン、デキソルマプラチン、デザグアニン、ジアンヒドロデュルシトラム（ｄｉａｎｈｙｄｒｏｄｕｌｃｉｔｏｌｕｍ）、塩化ジブロスピジウム、ジエノゲスト、ジフロモテカン、ジナリン、ジセルモリド、ドセタキセル、ドフェキダル、ドラセトロンメシレート、ドビチニブ、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、デュオカルマイシン、ダイネミシン、エコムスチン、エダトレキサート、エドテカリン、エドトレオチド、エフロルニチン、エラクリダール、エアシタラビン（ｅａｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エレスクロモール、エリナフィド、エロモテカン、エルサミトルシン、エミテフル、エンロプラチン、エノシタビン、エンプロメート、エンテカビル、エンチノスタット、エントリシタビン、エンザスタウリン、エピルビシン、エプタロプロスト、エリブリン、エルロチニブ、エソルビシン、エストラムスチン、エタロシブ、エタニダゾール、エトグルシド、エトポシド、エキサテカン、エキセメスタン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン、フィアシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオキシメステロン、フルオロシタビン、フルタミド、ホルメスタン、ホロデシン、ホスフルリジンチドキシル、ホスキドン、ホストリエシン、ホテムスチン、ホトレタミン、フルベストラント、フマギリン、ガラルビシン、ガロシタビン、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ オゾガマイシン、ゲロキノール、ギガンテトロネニン、ギガンテトロネニノン（ｇｉｇａｎｔｅｔｒｏｎｅｎｉｎｏｎｅ）、ギマテカン、ギメラシル、グロキサゾン、グルホスファミド、ゴニオタラミシン、ゴニオタラミシノン、ゴセレリン、塩酸グラニセトロン、グスペリムス、ヘキサレリン、ホモハルンゴニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｌｎｇｏｎｉｎｅ）、ヒドロカンプトテシン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア、ヒペリシン、イバンドロネートナトリウム、イバンドロン酸、塩酸イダルビシン、イドロノキシル、イホスファミド、イルモホシン、イマチニブ、イマチニブメシレート、イメキソン、イムプロスルファン、インカドロネート、インジブリン、インジスラム、イノリタゾン、インプロコン、インチキナチン、イントプリシン、イオベングアン、イロフルベン、イルソグラジン、イスピネシブ、イクサベピロン、ケトトレキサート、Ｌ−アラノシン、ラニキダール、ラパチニブジトシレート、ラロムスチン、ラロタキセル、レドキサントロン、レナリドミド、レンチナン、レスタウルチニブ、レトロゾール、ロイプロリドアセテート、ロイプロレリン、レキサカルシトール、リアロゾール、ロバプラチン、ロナファルニブ、ロニダミン、ロソキサントロン、Ｌｙ−８３５８３、リシプレッシン、マホスファミド、マンノムスチン、マンノスルファン、マリマスタット、マリノマイシンＡ、マシチニブ、マスリン酸、マソプロコール、メクロレタミン、メドルビシン、メゲストロール、メピチオスタン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルアミノレブリネート、メトミデート、メトプリン、メツレデパ、ミボプラチン、ミドスタウリン、ミファムルチド、ミラタキセル、ミプロキシフェン、ミリプラチン、ミソニダゾール、ミチンドミド、ミトフラキソン、ミトグアゾン、ミトマイシン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド、ミボブリン、ミゾリビン、モファロテン、モピダモール、モテサニブ、モテキサフィン、ムブリチニブ、ムリカペントシン、ムリカタシン、塩酸ムスチン、ミコフェノレートモフェチル、ミコフェノレール酸、ネダプラチン、ネルザラビン、ネモルビシン、ネオクプロイン、ネプタムスチン、ネラチニブ、ニゲリシン、ニロチニブ、ニルタミド、ニムスチン、ニノプテリン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノラトレキセド、ノルカンタリジン、ノルジヒドログアイアレチン酸、ノルトピキサントロン、ノベンビチン、オバトクラックス、オクトレオチド、オラパリブ、オレアノールアルデヒド、オマセタキシンメペスクシナート、オンブラブリン、オムトリポリド（ｏｍｔｒｉｐｏｌｉｄｅ）、塩酸オンダンセトロン、オルタタキセル、オテラシル、オテラシルカリウム、オキサリプラチン、オキシスラン、オキソフェナルシン、パクリタキセルセリバート、パリホスファミド、パロノセトロン、パミドロネート二ナトリウム、パミドロン酸、パニツムマブ、パノビノスタット、パツビロン、パゼリプチン、パゾパニブ、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペリチニブ、ペリトレキソール、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペレチノイン、ペルホスファミド、ペリホシン、臭化水素酸ピブロゼレシン、ピコプラチン、ピナフィド、ピポスルファン、ピラルビシン、ピルフェニドン、ピリトレキシム、ピロキサントロン、ピキサントロン、プレビトレキセド、プリカマイシン、プリチデプシン、プロメスタン、ポドフィロトキシン、ポマリドミド、ポルフィマーナトリウム、プララトレキセート、プリノマスタット、プロカルバジンＨＣ１、プロパミジン、塩化プロスピジウム、プミテパ、ピューロマイシン、ピラゾフリン、オウアルフロキシン（ｏｕａｒｆｌｏｘｉｎ）、ラルテグラビル、ラルチトレキセド、ラモセトロンＨＣ１，ラニムスチン、レタスピマイシン、レテリプチン、リボプリン、リトロスルファン、リツキシマブ、ロフルミラスト、ロミデプシン、ロピドクスウリジン、ロキニメックス、ロサブリン、ルビテカン、サバルビシン、サフィンゴール、サリラシブ、サパシタビン、サラカチニブ、サルドモジド、サトラプラチン、セブリプラチン、セリシクリブ、セマキサニブ；ＳＵ−５４１６、セムスチン、セルモレリン、シモタキセル、シムトラゼン、シタグリプチン、シゾフラン、ソブリトジン（ｓｏｂｌｉｔｏｄｉｎ）、ソブゾキサン、フェニルブチレートナトリウム、ソラフェニブ、スパルホシン酸、スパルソマイシン、スピロプラチン、スクアラミン、スクアモシン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン、スホスファミド、スロフェヌル、スニチニブ、スワインソニン、タセジナリン、タフルポシド、タラボスタット、タリソマイシン、タリムスチン、タロトレキシン、タルトブリン、タモキシフェンシトレート、タンズチニブ、タネスピマイシン、タリキダール、タシドチン、タシスラム、タウロムスチン、テガフール、テガフールウラシル、テランチニブ（ｔｅｌａｎｔｉｎｉｂ）、テロキサントロン、テモゾロミド、テニポシド、テヌアゾン酸、テラメプロコール、テリパラチド、テセタキセル、テストラクトン、テザシタビン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チモポエチン、チアゾフリン、チロミソール、チロロン、チムコーダー、チモナシック、チオグアニン、チラパザミン、トクラデシン、トムデックス、トポテカン塩酸塩、トレミフェンシトレート、トセドスタット、トシツモマブ、トキシパントロン（ｔｏｘｉｐａｎｔｏｒｏｎｅ）、トラスツズマブ、トレニモン、トレチノイン、トリシリビン、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート、トリプトリド、トリプトレリン、トロホスファミド、トロピセトロンＨＣ１、ツブロゾール、チロホリン、Ｕ−６７７８６、Ｕ−６８４１５、Ｕ−７１１８４、Ｕ−７６０７４、Ｕ−７８０５７、ウベニメクス、ウラムスチン、ウレデパ、ウレタン、ウリジン、ウルソール酸、ウルソールアルデヒド、バジメザン、バルルビシン、バルスポダール、バンデタニブ、バプレオチド、バタラニブ；ＰＴＫ−７８７、ベルテポルフィン、ビルダグリプチン、ビンブラスチンスルフェート、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビンフルニン、ビンホルミド、ビンホシルチン、ビンロイシノール、ビンロイロシン、ビノレルビン［塩基］、ビノレルビンタートレート、ビントリプトール、ビンゾリジン、ボリコナゾール、ボリノスタット、ボロゾール、ウィルホルリドＡ、キサントマイシンＡ、ザルシタビン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ジノスタチン、ゾレドロン酸、ゾルビシン、ゾスキダルなど、または前記癌インヒビターの少なくとも１つを含む組み合わせ物である。

さらに、抗血管新生薬もまた、本発明の複合体のために使用され得る。非限定的な例は、ベバシズマブ、アフリベルセプト、セジラニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、バタラニブ、イマチニブメシレート、シレンギチド、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板第４因子である。特に、当該抗血管新生薬は、列挙した例の２以上の任意の組み合わせにおいて使用され得る。

放射線増感剤は、本発明によるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を含む複合体に対するさらなる薬物クラスを表す。非限定的な例は、カルボプラチン、シレンギチド、ＣＧ８４１２５１、スタウロスポリン誘導体（例えば、ＭＫ−１７７５）、４−フェニルブチレート、化合物を含むガドリニウム（例えば、モテキサフィン−ガドリニウム）、タキサン誘導体（例えば、パクリタキセルもしくはドセタキセル）、またはそれらの組み合わせ物である。

他の局面において、本発明は、本発明によるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。

さらなる局面において、本発明は、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質、ＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらの融合タンパク質のヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。

なおさらなる局面において、本発明は、ＣＤ４４ｅｘ９タンパク質、ＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらの融合タンパク質のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ４４ｅｘ９タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドを生成する方法を提供し、当該方法は以下の工程：
１．）本発明のタンパク質またはそれぞれの融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現コンストラクトを用いて宿主細胞を形質転換する工程；および
２．）ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドを生成するために適切な条件下で宿主細胞を培養する工程
を含む。

本発明の一実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、自己免疫疾患（例えば、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、シェーグレン症候群または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））；皮膚疾患（例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎）；慢性炎症性疾患（例えば、関節リウマチまたは炎症性腸疾患）；組織傷害；アレルギー疾患および癌疾患からなる群から選択される疾患の診断または処置のために使用され得る。

炎症の診断または処置のための本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドの使用は、ＣＤ４４が炎症細胞を感染または組織破壊の部位に向ける役割を果たすという事実に基づく。これによって、活性化Ｔリンパ球、単球または活性化内皮細胞上のＣＤ４４は、細胞外マトリックス成分であるヒアルロナンと結合し、ケモカイン（例えば、その後に炎症細胞の炎症部位への移動を刺激するＣＣＲ２）を誘導する（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｒｕｆｆｅｌｌ，２００９）。ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質によるＣＤ４４の阻害またはＣＤ４４ｖ５ペプチドによるヒアルロナンの遮断は、このプロセスを妨げる。

例えば、ＣＤ４４発現は、関節リウマチ（ＲＡ）の患者において広範に研究されており、それによって、ＲＡの患者からの滑液中の単球性細胞上のＣＤ４４発現のレベルが向上すると示された。ＣＤ４４発現におけるこの増加は、ＲＡにおける滑液の炎症の程度と正の相関があった。さらに、ＣＤ４４欠損マウスは、より低い関節炎の度合いを有し、そして抗ＣＤ４４処置は、動物モデルにおける関節炎スコアを有効に減少させることが示された。それゆえ、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、ＲＡの診断または治療のために使用され得る。

本発明のさらなる実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、（例えば、Ｔ細胞増殖を阻害することによる移植拒絶の防止のための）免疫抑制を生成するために使用され得る。

本発明の好ましい実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、癌疾患の診断または処置のために使用され得る。この好ましい用途は、癌細胞に関するｖ５ドメインを含むＣＤ４４バリアントが記載されているという事実に基づく。

ＣＤ４４タンパク質のｖ５ドメインに対するＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の特異的な結合の結果、当該結合タンパク質は、ＣＤ４４と種々の細胞外マトリックスタンパク質との相互作用を阻害し、したがって腫瘍細胞の付着、移動および転移を阻害し、そして腫瘍細胞の増殖速度も減じ得る。

さらなる好ましい実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、癌幹細胞（ＣＳＣ）の診断または処置のために使用され得る。新しい概念は、癌幹細胞が後に再発および転移をもたらす長期生存集団に相当するため、ＣＳＣが最終的に癌処置の成功を決定することを示す（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＤ４４は、ＣＳＣ上に発現されることが示され、そしてそれぞれの腫瘍の当該長期生存および転移可能性の原因とされた。例として、乳癌のＣＳＣは、ＣＤ４４^＋／ＣＤ２４^ｌｏｗの発現によって特徴づけられ、このことは、ＣＤ４４を有望な抗ＣＬＣ標的として示す。

本発明の他の実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の診断または処置のために使用され得る。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）は、ＣＬＬ細胞はＣＤ４４の高発現を示すこと、さらに抗ＣＤ４４抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＣＬＬ細胞を死滅させることに有効であり、それによって異種移植モデルにおいて腫瘍が生体から完全に消滅したことを示し得る。

本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドによる乳癌の診断または処置は、ＣＤ４４ｖ５が乳癌において最も多量に発現するＣＤ４４バリアントに相当する（ＣＤ４４ｖ６について２４％およびＣＤ４４ｖ８について１５％であるのに対して、ＣＤ４４ｖ５について５６％）という事実によって支持される。さらに、ＣＤ４４ｖ５バリアントの発現は、乳癌のより短い生存期間と関連する：５年生存期間が、ＣＤ４４ｖ５陰性患者においては８６％であるのに対して、ＣＤ４４ｖ５癌患者においては７１％である（Ｔｅｍｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）。

ＣＤ４４ｖ５（およびＣＤ４４ｖ６）が大腸癌における予後の悪さと関連していることが実証されたため、好ましい実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、大腸癌の診断または処置のために使用され得る。これによって、腫瘍サンプル中により高いＣＤ４４ｖ５またはＣＤ４４ｖ６含有量を伴う患者は、相当に短い無再発生存期間を有した（Ｖｉｚｏｓｏ ｅｔ ａｌ．２００４）。

頭頸部扁平上皮細胞（ＨＮＳＣＣ）腫瘍がＣＤ４４の高発現を示し、そして高いＣＤ４４発現を伴う亜集団は放射線および化学療法に対する感受性がより低い（Ｌａ Ｆｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ，２０１２）ため、他の好ましい実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドは、頭頸部扁平上皮細胞腫瘍の診断または処置のために使用され得る。

ＣＤ４４由来のペプチドが黒色腫腫瘍モデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を示した（Ｐｉｏｔｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ，．２０１１）ため、さらなる実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質および特にＣＤ４４ｖ５ペプチドは、黒色腫の診断または処置のために使用され得る。

本発明の好ましい実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、医学的使用のための造影剤を調製するために使用される。

さらなる好ましい実施形態において、前記造影剤は、ｉｎ ｓｉｔｕの細胞において癌細胞または癌腫を識別できる。

具体的な実施形態において、前記結合タンパク質または任意の誘導体、複合体、融合タンパク質あるいはナノ粒子に結合されるタンパク質としての結合タンパク質は、腺癌細胞、胸腺上皮細胞、子宮頸癌細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、肺細胞癌腫細胞（ｌｕｎｇ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）、膵臓腺癌および癌幹細胞からなるリストから選択される癌細胞を識別できる。

本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、任意の種類のナノ粒子と結合され得る。ナノ粒子のいくつかのクラスは、先行技術において知られており、そして当業者は、具体的な治療要件または診断要件にしたがって適切なタイプのナノ粒子を選択し得る。

ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質とカップリングされるナノ粒子についての例は、量子ドット、貴金属クラスタ、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）、ブロック共重合体ミセル、ナノセル、デンドリマー、ナノチューブ、ポリマーソーム、ＸＰｃｌａｄ（登録商標）ナノ粒子、および結晶性の発光性カルシウムホスフェート層によって囲まれた非晶質シリカからなるナノ粒子（例えば、ＯＲＭＯＢＥＡＤ（登録商標））である。

ＯＲＭＯＢＥＡＤ粒子は、表面上で、アミン基もしくは６−アミノヘキサン酸（ＡＨＡ）をもたらすポリエチレンイミンもしくはＴＲＩＡＭＯを用いて、またはカルボキシル基をもたらすアジピン酸を用いて適切に改変され得る。これらの基は、本発明のタンパク質とカップリングするために使用され得る。ＯＲＭＯＢＥＡＤ技術は、Ｄｅｍｂｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって開示され、そして当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。

本発明の一実施形態において、直径が１００ｎｍ未満のＳｉＯ_２／Ｚｎ_２ＳｉＯ_４：Ｍｎ^２＋およびＳｉＯ_２／Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６ＯＨ：Ｅｕ^３＋コアシェルナノ粒子は、本発明のタンパク質とカップリングするためのナノ粒子として使用される。これらの粒子は、Ｄｅｍｂｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１ａ、２０１１ｂ）によって開示され、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。

さらなる実施形態において、発光色素で標識されたハイブリッドナノ粒子が、使用され得る。これらのナノ粒子は、共有結合的に付着された有機フルオロフォアを伴うＳｉＯ_２を基にした粒子マトリックスからなる。それらは、有機色素分子の光学的性質と無機粒子マトリックスの性質とを組み合わせる。結果として、それらは、光退色に対する増加した低抗および減少した色素漏出を示す。それぞれのナノ粒子は、Ｐｒｏｂｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）によって開示され、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにこれらの特許出願の全体内容は参照される。

他の実施形態において、カドミウムを含まない量子ドットが、使用され得る。これらのナノ粒子は、スペクトルの可視および近赤外領域において明るい発光を示す。それぞれのナノ粒子は、Ｎａｎｏｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）によって開発され、そしてＷＯ０７／０２０４１６、ＷＯ０８／１００２７６、ＷＯ１０／５２４５５、ＷＯ１０／１５８２４、ＷＯ１０／１０３２９およびＷＯ１３／９３６３１において開示され、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにこれらの特許出願の全体内容は参照される。

本発明の一実施形態において、Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｏｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）によって開発されたような（ＩＩ族と合金化された（ｇｒｏｕｐ ＩＩ−ａｌｌｏｙｅｄ））Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ族半導体量子ドット、ＩＩＩ−Ｖ族量子ドットまたは微粒子化された半導体ナノ結晶コンプレックスが、使用され得る。これらのナノ粒子は、ＷＯ０７／１１８１１８、ＷＯ０８／９４２９２、ＷＯ０６／１７１２５またはＷＯ０５／１１０９１６においてそれぞれ開示され、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。

他の実施形態において、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）、ブロック共重合体ミセル、ナノセル、デンドリマー、ナノチューブ、ポリマーソームおよびＸＰｃｌａｄ（登録商標）ナノ粒子が、使用され得る。それぞれのナノ粒子は、Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｌｉｌｌａｒｄ（２００９）およびＸｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって開示され、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。

本発明のさらなる実施形態において、コア領域の反射防止コーティングに相当するシェル領域によって覆われているコア領域を含み、Ｃｄを含まないナノ粒子が、使用され得る。それぞれのナノ粒子は、ＵＳ ２００８／０２８６８２６ Ａ１（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）によって開示され、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。

本発明の他の実施形態において、標的化薬物送達に特に適している磁性ナノ粒子が、使用され得る。好ましい実施形態において、当該磁性粒子は、超常磁性金属酸化物および／または金属からなり、そして本発明のペプチドおよび必要に応じて１以上のさらなる薬物で覆われている。それぞれの磁性粒子は、ＥＰ １ ２６７ ８４３ Ｂ１（ＥＵＣＲＯ）によって開示され、当該磁性粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。

改変されたナノ粒子は、好ましくは、ＣＲＣ細胞を検出するためにｉｎ ｖｉｖｏで造影剤として利用され得る。ＷＯ ２００７／０５７１８２ Ａ３は、好都合なナノ粒子を開示し、当該ナノ粒子の調製および使用の開示のためにその全体内容は参照される。当該ナノ粒子は特に、流体力学的直径が１５ｎｍを超えないナノ粒子および生物学的システム（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）において非不活性なナノ粒子である。

本発明のナノ粒子は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合物質および／または細胞傷害性物質とさらに複合体化され得る。

本発明の好ましい実施形態において、前記ナノ粒子は、ＣＥＡに対する抗体、ＣＡ−１９−９に対する抗体およびアドヘシンまたはそれらの任意の組み合わせ物からなるリストから選択される腫瘍抗原結合物質とさらに複合体化される。

好ましい実施形態において、ナノ粒子と複合体化されたアドヘシンは、そのアミノ酸配列を改変され、そしてより好ましくは、本明細書において参考として援用され、その結果近い将来に当該開示が本願の一部になるＷＯ ２００９／１０６１０２ Ａ１にしたがって改変される。

本発明の好ましいナノ粒子は、少なくとも３つの構造（すなわち、無機コアであって、当該無機コアはイミダゾール成分を含有する層を含む層（以下において、「不動態化層」ともいう）によって覆われ、次いで、当該層は特異的リガンドを保持する、無機コア）を含み、当該特異的リガンドはまた当該層の一部でもあり得る。当該リガンドは、生物学的システムの標的に特異的に結合するナノ粒子を生じる。

好ましいナノ粒子において、無機コアを囲う不動態化層を含む当該無機コアは、１５ｎｍ以下、可能であれば、好ましくは１０ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。８ｎｍ以下または５ｎｍ以下の流体力学的直径が、特に好ましい。これは、特に球形のナノ粒子に適用される。この大きさのナノ粒子は、腎臓を介して照らされ得、それゆえ体内に蓄積しないか、または多くても許容できる量で体内に蓄積する。これは、ｉｎ ｖｉｖｏで適用することを可能にする。これは、特に５ｎｍ以下の流体力学的直径を有するナノ粒子に適用される。

別の実施形態において、ナノ粒子はまた、棒状であり得る。この実施形態において、棒の直径が上記制限の１５ｎｍを超えない場合が、好都合である。ここでも同様に、身体からの排出を容易にする５、８または１０ｎｍの範囲の直径が、好ましい。したがって、例えば、本発明によって利用可能なナノ粒子は、８×１５ｎｍの縦／横（長さ／幅）の寸法を有し得る。

本発明によって利用可能なナノ粒子は、好ましくは６００ｎｍと７００ｎｍとの間（例えば、６２０と６６０との間）、特に好ましくは約６２５ｎｍまたは約６５５ｎｍの波長において最大発光を有する。当該発光は、人の眼で容易に見ることが出来、それゆえそのようなナノ粒子は、医療行為のための造影剤として直接使用され得る。その結果として、いくらかの状況において、補助の光学機器が、不要になり得る。

別の実施形態において、上記流体力学的直径を超えるナノ粒子は、当該ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで非不活性であることが保証される限り、本発明によって利用され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで非不活性であることは、当該粒子が生分解性であり、結果として、そこで微粒子として最初に結合される金属（例えば、Ｃｄ）がイオン形態に変換されるための必須条件である。分解生成物は、腎臓を介して照らされ得る。

イミダゾール成分を含む不動態化層を有する無機ナノ粒子は、以前に実証されたように、実際にｉｎ ｖｉｖｏで非不活性であるが、それらは、これらの条件下で分解される。それゆえ、当該ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用に特に関連のある生分解性および分解生成物の腎臓移動の基準を満たす。これは、驚くべき発見であった、なぜなら、不動態化層は特にナノ粒子の化学的および／または物理的安定性を増加させるためにも働くからである（この文脈において、以下のさらなるコメントも参照されたい）。したがって、一方で良好な診断のために必要とされるナノ粒子の安定性と、他方で「大きな」粒子の腎臓移動のために必要とされる生分解性との間の関係は、ｉｎ ｖｉｖｏでの造影剤としての用途に適している。

不動態化層の主要なタスクは、蛍光強度ならびに無機コアの化学的および物理的安定性を増加させることである。不動態化層によって覆われた無機コアは、少なくとも１０％の量子収量、好都合には少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも７０％さえもの量子収量によって特徴づけられる。ここで、量子収量は、サンプルによって放出される光の量とサンプルによって吸収される光の量との比を意味する。好都合なことに、不動態化層は、１ｎｍ以下の厚さを有する。この場合において、不動態化されたコアの直径は、多くても２ｎｍだけ増加した。

好都合なことに、いずれの場合においても、ナノ粒子はまた、特に生物学的な環境との適合性を改善するために、改変剤を提供される。好ましくは、改変剤の使用による流体力学的半径の増加は、２ｎｍを超えない。特定の場合において、不動態化層および改変剤の厚さはまた、２つの構造どうしおよび２つの構造と無機コアに関する関係に依存する。

好ましく使用される本発明のナノ粒子は、上記のように大きさが制限されるとき、生きている患者における診断薬としての用途が特に適している。したがって、大きさの減少は、拡散速度および組織への浸透の深さを増加させる。これは、局所投与後に、ナノ粒子が生物学的な環境において均等かつ急速に広がること、およびナノ粒子ができる限り遠い組織（例えば、腫瘍）に浸透することも可能にする。本発明のナノ粒子は同様に、注射を介しても行われ得る全身投与を可能にする。しかしながら、局所投与、例えば、腫瘍の処置のための局部的な適用または腫瘍内投与もしくは腫瘍周囲への投与もまた可能である。

本発明のタンパク質とカップリングされるナノ粒子を含む本発明の特に好都合な実施形態は、８ｎｍ以下の流体力学的直径、特に好ましくは４ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。このオーダーの大きさのナノ粒子は、腎臓を介してすでに照らされ得、それゆえ体内に蓄積しないか、または体内に明確に低い程度で蓄積する。結果として、本発明のナノ粒子は、公知の量子ドットとおそらく関連のある長期毒性の問題を相当に減少させる。

ナノ粒子は、６００ｎｍと７００ｎｍとの間、特に好ましくは６００ｎｍと６６０ｎｍとの間で最大発光を伴い、特に好ましくは６２０ｎｍと６６０ｎｍとの間の蛍光スペクトルを好都合に放出する。当該放出スペクトルは、ヘモグロビンおよび（水を含む）生体システム中の他の光吸収物質による吸収がわずかであるため、非常に高い組織伝導という利点を有する。これらの波長の光は、人の眼によってなお感知され得、それゆえ処置を担当している医師が、さらなる複雑な技術的な検出補助器具（例えば、ＣＣＤカメラ）を何ら用いることなく標識された組織を識別することを可能にする。これは、外科的処置中にＣＤ４４、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９−９発現細胞を識別するため、特に発癌性の組織と健常組織を区別するための造影剤として本発明のナノ粒子を使用する場合に、特に好都合である。

一実施形態において、好ましい利用可能なナノ粒子は、例えば、科学刊行物の参照を伴うＵＳ ２００４／０２４７８６１において記載されるような、例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳまたはＣｄＴｅのコアを有する公知のナノ粒子である。この出版された刊行物はまた、コア材料の調製に関する文献を（例えば、ＵＳ ６，１７９，９１２を）参照する。これらの公知のナノ粒子の性質およびその調製の開示に関するこれらの文献の全体内容が、参照される。ナノ粒子を調製する方法はまた、開示のために参照もされるＵＳ ７，１４７，７１２ Ｂ２においてさらに開示される。

特に好都合なことに、ナノ粒子の無機コアは、本質的に半導体からなる。これらのコアは、それらの個々の大きさおよび／または組成に依存して種々の色の光を放出するが、それらの全ては、光スペクトルの同一の範囲（ＵＶからＶＩＳの範囲）内の広い帯域にわたって吸収する。高いストークスシフトのため、励起および放出スペクトルは、遠く離れており、種々のナノ粒子の単純かつ同時の励起を可能にする。それらは、少しだけ重複するかまたは全く重複しない、狭くかつ対称的な放出スペクトルを有する。特に改善された濾過の深度およびｉｎ ｖｉｖｏでの標識のために非常に重要な他の有益な性質は、最高で８０％の高量子収率および高い光安定性である。

好ましいナノ粒子は、例えば、ＷＯ ２００５／００１８８９において開示されている。したがって、それらは、少なくとも２種の半導体の合金でできている無機コアを含み、その半導体は、均一に分布されるか、またはそれぞれの場合において合金内に濃度勾配があるかいずれかである。当該ナノ粒子の性質および調製の開示に関して、上に挙げられたＷＯ ２００５／００１８８９は参照される。コアは、それぞれの場合において、その大きさに関して５％までずれてもよい。

したがって、ナノ粒子の無機コアは、少なくとも２種の半導体の合金を含み得、当該コアは均質な組成を有し、２種の半導体のモル比と非線形な「バンドギャップエネルギー」によって特徴づけられる。

あるいは、前記コアは、当該コアの中心部から当該コアの表面へ徐々に増加する第一の半導体の濃度、および当該コアの中心部からその表面へ徐々に減少する第二の半導体の濃度を伴う、不均質であってもよい。

両方のコアに関して、半導体の少なくとも１つは、ＩＩ族−ＶＩ族半導体またはＩＩＩ族−Ｖ族半導体である（族の定義は元素周期表の族と一致する）。例えば、前記合金は、以下の合金の群から選択され得る：ＣｄＳｅＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳＴｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＡｌＡｓ、ＩｎＧａＮ。これらのコアは、無機材料（例えば、ＺｎＳなどの半導体）のコーティングをさらに保有し得る。このさらなる層は、「キャッピング」または「シェル」として当業者に知られている。

ＩＩ族−ＶＩ族およびＩＩＩ族−Ｖ族半導体は、一般的に公知であり、例えば、ＣｄＳ_１−ｘＳｅ_ｘ、ＣｄＳ_１−ｘＴｅ_ｘ、ＣｄＳｅ_１−ｘＴｅ_ｘ、ＺｎＳｅ_１−ｘＴＥ_ｘ、Ｚｎ_１−ｘＣｄ_ｘＴｅ、Ｃｄ_１−ｘＨｇ_ｘＳ、Ｃｄ_１−ｘＨｇ_ｘＴｅ、Ｉｎ_１−ｘＧａ_ｘＡｓ、Ｇａ_１−ｘＡｌ_ｘＡｓおよびＩｎ_１−ｘＧａ_ｘＰを包含する。半導体であるＣｄＳｅ_１−ｘＴｅ_ｘ、ＣｄＳ_１−ｘＴｅ_ｘ、ＺｎＳｅ_１−ｘＴｅ_ｘ、Ｚｎ_１−ｘＣｄ_ｘＴｅ、Ｃｄ_１−ｘＨｇ_ｘＳ、Ｃｄ_１−ｘＨｇ_ｘＴｅ、Ｉｎ_１−ｘＧａ_ｘＡｓ、Ｉｎ_１−ｘＧａ_ｘＰを使用することが好ましく、ここでｘは０から１の小数である。

前記半導体のモル比は、任意のモル比であり得る。しかしながら、合金がＣｄＳＳｅを含む場合、分子式ＣｄＳ_１−ｘＳｅ_ｘを有する合金が好ましい。合金がＣｄＳＴｅを含む場合、分子式ＣｄＳ_１−ｘＴｅ_ｘを有する合金が好ましい。合金がＺｎＳｅＴｅを含む場合、分子式ＺｎＳｅ_１−ｘＴｅ_ｘを有する合金が好ましい。合金がＺｎＣｄＴｅを含むとき、分子式ＣｄＴｅのみを有する合金が好ましい。これらの場合のいずれにおいても、ｘは、０と１との間の小数である。

ナノ粒子のこれらの好ましい無機コアは、以下の工程を使用して調製され得る：（ｉ）ナノ結晶を形成できる条件下で、第一の溶液を調製する工程、（ｉｉ）ナノ結晶を形成できない条件下で、あるモル比の半導体の前駆体を含む第二の溶液を調製する工程、（ｉｉｉ）ナノ粒子を形成できる、第二の溶液を第一の溶液に加える工程、および（ｉｖ）ナノ結晶の成長および形成を止める、当該条件を変える工程。コアを調製する方法は、ＷＯ ２００５／００１８８９において示され、それは本発明のナノ粒子の無機コアのこの好ましい実施形態の調製の開示に関して参照される。

別の実施形態において、前記無機コアは、本質的に、好ましくは２および２７個の貴金属原子を含む貴金属クラスタからなり得る。好ましい実施形態において、貴金属は、金、銀、銅、白金、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウム、およびロジウムからなる群から選択された。クラスタは、様々な電荷を有し得る。

これらのコアは、それらの強い吸収および放出のため、弱い水銀ランプ励起を使用することで、それらが個々の「ナノドット」として容易に検出され得るという利点を有する。これらのコアを含有する本発明のナノ粒子は、蛍光性の個々の分子標識および質量標識として好都合に使用され得る。

元素の族に対する用語「貴金属」は、金、銀、および銅ならびに白金族金属（ＰＧＭ）、白金、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウムおよびロジウムからなる群から選択した。本発明の好ましい実施形態において、貴金属は、金、銀および銅からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、貴金属は、銀または金である。

用語「クラスタ」は、２〜２７原子の金属の化合物に関する。クラスタは、化学触媒、セラミック、半導体技術および材料科学の分野から特に知られている。それゆえ、当業者は、それらの調製に精通している。ＷＯ ２００４／００３５５８は、貴金属クラスタの調製を特に記載し、加えて、この主題に関する広範な更なる参照を含む。より具体的には、それは、有機分子と会合した貴金属ナノクラスタの調製を開示する。本明細書で会合の用語は、結合（したがって、例えば、共有結合、非共有結合、静電結合またはファンデルワールス結合）の化学的または物理的性質とは独立して、任意の形態の結合を意味する。本発明のナノ粒子のコアとしてのナノクラスタの調製に関して、ＷＯ ２００４／００３５５８が、参照される。

本発明によって好ましく利用可能なナノ粒子は、蛍光強度を増加させ、かつ無機コアの化学的および物理的安定性を改善する不動態化層を有する。結果として、ナノ粒子は、好ましくは１０％を超える量子収率で、好ましくは５０％を超える量子収率で光を放出する。

前記ナノ粒子は、好ましくは、４℃で水性環境において少なくとも１２カ月間の貯蔵安定性を有し、可能であるならば、ｐＨ５からｐＨ１０、好ましくはｐＨ７からｐＨ１０のｐＨ範囲にわたって安定であり、すなわち、それらは、それらの具体的なスペクトル特徴（例えば、量子収率、最大発光の位置、発光スペクトルの半値幅）に関して、５０％未満の偏差を示す。好ましい粒子は、これらの具体的なスペクトル特徴に関して１０％未満の偏差を示す。

本発明の他の実施形態によって利用可能なナノ粒子は、生物学的（すなわち、生理学的）条件下またはｉｎ ｖｉｖｏでも、少なくとも３日の期間にわたって、（コアを囲む不動態化層を含む）コアの性質の定常性／安定性を本質的に示す。好ましい粒子は、当該性質のある定常性の少なくとも５０％未満を保持する安定性として、７〜１４日間、この種の定常性／安定性を示す。この情報は、実際の標的臓器におけるナノ粒子の安定性に特に言及する。主に異化機能を有する臓器におけるナノ粒子の安定性は、明確に、より不安定になり得ること（例えば、肝臓において）は、注目すべきである。これは、明確に望ましくさえあり得る。

ナノ粒子は上記の意味において安定であるが、それにもかかわらずそれらは、ｉｎ ｖｉｖｏで基本的に分解可能であり、その結果、非不活性である。この意味において、「非不活性」は、少なくとも５０％のナノ粒子が投与１２週間以上後にすでに分解されていることを意味する。少なくとも５０％の分解が８、６または４週間後にすでに検出可能であることが、好ましい。体内に残留する粒子の検出は、この目的に関して体の器官中および血漿中の検出を含む。したがって、「不活性」は、５０％を超える（ほとんど１００％にさえいたるまでの）粒子が投与４週間後の患者の体内において依然として検出可能であることを意味する。

ナノ粒子の分解可能性は、当業者に知られているアッセイによって（すなわち、例えば、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって）検出され得、サンプルが適切な場合、当該アッセイはまた蛍光分光測定によって補足され得る。

不動態化層は、少なくとも１つのイミダゾール成分を含有する。そのような化合物は、金属元素または金属イオン（例えば、亜鉛イオン、水銀イオンまたはカドミウムイオン）を配位させることができる。好ましい実施形態において、イミダゾール基は、分子の構造に基づいて末端の位置にある。不動態化層はさらに、架橋剤または環状もしくは直鎖状のイミダゾール成分を有し得、当該成分はまた架橋剤として作用し得る。架橋剤は、アルカリ性であり得る。

金属原子または金属イオンを含む配位化合物は、キレート化、ルイス塩基の配位または電子供与性によって、蛍光性の無機コアと機能的に結合し得、対応して複合体化された部分／基を有し得る。当該分子は、水溶液中で当該分子によって覆われたコアに水溶性または水和性を与える部分をさらに含み得る。

イミダゾール成分は、ホスフィン化合物、好ましくはアルキルホスフィン化合物によって適切に架橋される。

用語「イミダゾール成分」は、本記載の目的に関して、少なくとも１つのイミダゾール基（イミダゾール誘導体を含む）を含み、無機コア、あるいは金属（例えば、カドミウム、亜鉛、ガリウム）または金属カチオンもしくはそのようなカチオンを含む基質を有する不動態化層の結合に利用可能な複素環または複素芳香環の分子を意味する。この連結において、好ましくは少なくとも１つのイミダゾール基が、分子の構造に基づいて末端の位置にあるべきである。イミダゾール成分は、その機能的な形態で、非局在化された分子起動を含む環を介して蛍光性ナノ結晶に結合する。通常、イミダゾール環の窒素原子は、金属イオン（例えば、カドミウムまたは亜鉛）に機能的に結合する配位リガンドとして働く。

一実施形態において、イミダゾール成分は、反応性官能基（例えば１つまたは２つのアミノ酸（例えば、ヒスチジン、カルノシン、アンセリン、バレイン（ｂａｌｅｉｎｅ）、ホモカルノシン、ヒスチジルフェニルアラニン、シクロヒスチジルフェニルアラニン）、５−アミノ−４−イミダゾール−カルボキシアミド、ヒスチジルロイシン、２−メルカプトイミダゾール、ｂｏｃ−ヒスチジン、ヒドラジド、ヒスチノール、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、イミダゾリジン、イミダゾール含有オルニチン（例えば、５−メチルイミダゾール）、イミダゾール含有アラニン（例えば、（ベータ）−（２−イミダゾリル）−Ｌ−（アルファ）アラニン）、カルジニン（ｃａｒｚｉｎｉｎｅ）、ヒスタミン）を含む。これらのヒスチジンを基にした分子またはイミダゾール含有アミノ酸は、一般的に公知の方法で合成され得る。

用語「ホスフィン」は、本発明の目的に関して、非金属（例えば、Ｓｅ、Ｓもしくは他の非金属）またはそのような原子を含む基質と結合またはキレート化するための少なくとも１つのホスフィン基（それらの誘導体を含む）を有し、隣接する分子との反応のための少なくとも１つの官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、カルボキシアミド基など）を提供する分子を意味する。

本発明の好ましい実施形態において、イミダゾール成分は、少なくとも１つのヒスチジル残基を含むペプチドであり、好ましくは１つまたは２つのＨｉｓ残基を含むジペプチドである。

さらなる好ましい実施形態において、イミダゾール成分は、種々のヒスチジル含有ジペプチドの混合物である。

好ましくは、少なくとも１つのホスフィン基は、分子の構造に基づいて末端の位置に位置すべきである。ホスフィン部分は、蛍光コアまたは被覆層からの化合物を伴うその機能的な形態で、非金属またはイオン（例えば、ＳｅまたはＳ）と結合するための配位リガンドとして働く。

好ましい実施形態において、ホスフィン含有化合物は、（例えば、ポリマー形態において）互いにカップリングされる１つ、または２つ以上のホスフィン基を含み、当該化合物としてはヒドロキシメチルホスフィン化合物等が挙げられるが、それらに限定されない。ホスフィン含有化合物は、一般的に公知の方法によって合成され得る。さらに、アルキルホスフィン含有化合物は、１以上のさらなる官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、カルボキシアミド基など）も有し得ることが知られている。誘導体の例は、当該誘導体が本明細書において記載されるコーティングとしてのホスフィンの機能に適合する限り、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、アミドまたはエステルである。

本発明のナノ粒子の蛍光性無機コアを覆うために、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィンおよびベータ−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン］プロパン酸が、特に好ましい。架橋されたホスフィン含有化合物は、金属原子および／またはイオン（例えば、ＺｎまたはＣｄ）とさらに機能的に結合することができることが周知である。この点において、官能化されたイソシアネートまたはアルキルシアノアシレートは、リガンド、および蛍光性コアを伴う付加物の形成のための架橋剤としてさらに有用であり得る。当該架橋剤はまた、塩基性であり得る。

本発明によって存在する不動態化層の不動態化効果は、イミダゾール成分を伴うコンプレックス形成による表面のカドミウムまたは亜鉛原子などの被覆、およびホスフィン含有化合物を伴うコンプレックス形成を介する対原子（ｃｏｕｎｔｅｒａｔｏｍ）（ＳｅまたはＳなど）の被覆に基づく。

本発明のナノ粒子の不動態化層は、ＵＳ ２００４／０２４７８６１ Ａ１において開示されている。この公開出願は、不動態化層で覆われている無機コア（例えば、量子ドット）の調製を記載している。それゆえ、本発明によって利用される不動態化層およびそれで覆われている無機コアの調製の開示のためにＵＳ ２００４／０２４７８６１は、参照される。

不動態化層の分子は、標的分子および細胞（特異的リガンド）に結合および架橋するために化学基をさらに有するか、または保有し得る。然るべく適切な試薬（例えば、ＺｎＳＯ_４およびＮａ_２Ｓ）の存在下において、当該分子または化合物は、蛍光性コア（「キャッピング」または「シェル」）上に当該分子を伴う不動態化層を形成し得る。これらの試薬はまた、蛍光性ナノ結晶上の原子またはイオンと機能的に結合し得、そして、結果として、このさらなる不動態化層はまた、当該コアの表面上に直接形成され得る。

好都合な実施形態において、本発明のナノ粒子は、有機および／または無機部分からなり得る改変剤をさらに有し得る。それらは、液体または懸濁媒体、特に生理学的環境における当該ナノ粒子の適合性、効力および／または溶解性を改善するために使用される。この表面改変は、生物学的システム、特に人体における非常に低い非特異的吸着および適合性の増加の達成のために特に好都合である。

１つの可能性は、ナノ粒子が小さい全体の大きさを維持するために、特に低分子量形態の、特定の医学的応用がすでに承認されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて表面を改変することである。それによって、ナノ粒子の生物適合性と血液循環時間の両方および細胞への取り込みの効率もまた、増加し得る。低分子量ＰＥＧ層とビタミンなどの他の物質（例えば、葉酸）を組み合わせることは、当該ナノ粒子のマクロファージへのより低い取り込みを達成し得る。なぜなら、それによって減少するナノ粒子へのタンパク質吸着は、免疫系による当該ナノ粒子の認識をより難しくするためである。

改変剤を使用することによる他の考えられる好都合な表面改変は、１つのタイプの単糖または種々の単糖からなる低分子量多糖までにおいて、単糖、二糖または三糖を用いるコーティングである。１つの考えられるタイプの発展は、ポリグルコースを用いる（例えば、血液代替物として医学的に証明されているデキストランが使用され得る）改変である。それは、良好な生物適合性／耐性を示す。他の実施形態は、起こり得る分解を打ち消すための糖類の立体異性形態（Ｄ／Ｌ）の使用である。

他の実施形態は、生物学的に適合する親水性ビタミン（例えば、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、コバラミン、パントテン酸、アスコルビン酸および葉酸）の改変剤としての使用である。したがって、例えば、葉酸は、癌細胞に対するナノ粒子の好ましい結合をもたらし得る。このビタミンは、低い免疫原性しか示さず、それゆえ高い生物適合性を示す。ナノ粒子の内部移行は、膜結合葉酸受容体に結合することによって促進される。

表面改変はまた、親油性ビタミン（例えば、レチノール、コレカルシフェロール、トコフェロールおよびフィロキノン）を用いることが可能である。したがって、例えば、ビタミンＥは、ナノ粒子の細胞内取り込みを増加させ得る。

脂肪酸（例えば、１−オクタデセンまたは１８−メチルエイコサン酸およびそれらの誘導体など）は、コロイドの水溶性および安定性を増加させ得、かつその後の特異的リガンドの結合のために使用され得る末端の官能性カルボキシル基を有し得る。それゆえ、脂肪酸を改変剤として含むことは、有用である。

表面改変の他の実施形態は、非特異的タンパク質吸着を特に良好に減少させるポリアルコール（例えば、ジエチレングリコール（ＤＥＧ）など）を用いるコーティングである。同じことが、（特にその低分子量形態の）ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、Ｔｅｆｌｏｎ）にあてはまり、それは減少したタンパク質吸着を達成し得る。ポリテトラフルオロエチレンは、心臓外科的な応用においてしばしば使用される。

表面改変は同様に、タンパク質を構成する（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸とタンパク質を構成しない（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸の両方を含む１以上の天然に生じるアミノ酸、および合成アミノ酸を使用して行われ得る。両方の立体異性体（Ｄ型およびＬ型）が、本発明で使用され得る。上記アミノ酸のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、小さなポリペプチドまでは、免疫系をほとんど刺激せず、それゆえ薄い適合層に同様に適している。それらは、生物学的なタンパク質からの配列のみならず人工のアミノ酸配列であり得る。天然のタンパク質（例えば、フィトケラチンなど）のペプチド誘導体は同様に、表面改変のために使用され得る。ＴａｔペプチドおよびＴａｔペプチド含有ペプチドを用いる表面改変は、生物医学的応用における使用のためにナノ粒子を利用可能にする他の可能性である。Ｔａｔペプチドは、例えば、細胞膜を通り過ぎて核にまで金ナノ粒子を送達するために有効な分子である。

考えられる改変剤の他の実施形態は、ホスホリルコリンコーティングの形成である。ホスホリルコリンは、（例えば、コンタクトレンズ上で）起こり得る非特異的タンパク質吸着を減少させる。その非血栓形成性の性質によって、ホスホリルコリン改変は、生物学的システムにおいて容易に利用され得、高い貯蔵安定性によって区別される。

ポリラクテートが生物適合性であるため、この物質は、種々の医学的応用において使用される。より具体的には、低分子量形態のポリラクテートは、本発明のナノ粒子の他の考えられる表面改変を構成する。両方の立体異性体（Ｄ型／Ｌ型）は、起こりうる生分解を減少させるために本発明で利用され得る。

言及された表面改変以外に、ナノ粒子に対する非特異的なタンパク質のタンパク質分解によって切断可能な結合もまた、考えられる。これは、生物適合性／適合性を増加させ得る。標的位置において、大きなタンパク質は、組織内でナノ粒子を放出しながら除去され得る。当該除去はまた、適切な滞留時間の後にも起こり得る。これに適切なものは、好ましくは、非特異的吸着を減少させる他のタンパク質に加えて、一般的に使用されるタンパク質（例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、セルロプラスミン、エラスチンおよびアルブミンなど）である。したがって、例えば、ポリペプチドとエラスチンとの組み合わせ物から構成される表面コーティングは、所望されない凝固形成を妨げ得、それゆえ、ナノ粒子の生物適合性を増加させ得る。

主要な血清タンパク質であるアルブミンは、形質膜との非特異的な相互作用を減少させ得る。さらに、適切に改変されたナノ粒子は、粒子表面に同時に結合する特異的リガンドによる標的細胞と特異的な相互作用を発揮する能力を保持する。血清アルブミンを用いるコーティングは、静脈投与後のミクロファージによる急速な取り込みを妨げることによって、覆われていないナノ粒子を用いる場合より実質的に長い血液循環時間を生じ得る。

言及されたより速い拡散速度および灌流速度を生じる減少した流体力学的直径と、上記の性質および改善ならびに（特に、可視赤色光の範囲の）高い蛍光強度とを一緒に組み合わせることは、本発明のナノ粒子を、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織形態の選択的かつ正確な区別のための多様な方法において利用され得る単純な診断薬にする。これらの可能性は、抗原特異的バイオマーカーと組み合わせて、ＣＤ４４ｖ５、ＣＥＡおよび／またはＣＡ−１９−９発現細胞を識別するために、特に、正常な組織から異常な（前）発癌性の組織を区別し、外科的処置中のより正確な腫瘍切除のための視覚的評価を助けるために、特に使用される。

それゆえ、本発明で利用可能な発明のナノ粒子は、造影剤として働く。これは、特に癌診断および手術において使用するために適用される。

本発明によるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を保有するナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでの診断薬、セラノスティック薬（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）および／または治療薬として利用され得る。この目的のために、それらは、局所的に（例えば、腫瘍内に、筋肉内に、または外科的に接近可能な組織／臓器内に）投与され得、またはそのほかに全身に（例えば、静脈内に）も投与され得る。局所的／局部的投与は、液剤、噴霧溶液、泡沫、クリーム剤または活性貼付剤として提供され得る。これは、特に、大腸癌の場合のように中空臓器の処置／診断のために好まれ得る。経口摂取もまた、例えば、シロップ剤として、または錠剤もしくはカプセル剤の形態で、考えられる。吸入は、同様に考えられる（例えばスプレー剤）。坐薬による経肛門投与は、考えられ得る。一変形において、当該ナノ粒子は、デポ形態で埋め込まれ得る。

本発明の好ましい実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、標的化薬物送達のために使用され得る。本発明の文脈において、標的化薬物送達は、目的の組織に薬剤を集中させ、他方で残りの組織中の薬剤の相対濃度を減少させる方法と定義される。この目的のために、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、単独または融合タンパク質もしくは（好ましくは、ナノ粒子と複合体化された）複合体として、薬物送達ビヒクルと結合される。例えば、重合体ミセル、リポソーム、リポタンパク質を基にした薬物担体、ナノ粒子薬物担体、デンドリマーなどの、当業者に公知であり、具体的な目的にしたがって当業者が選択し得る多数のタイプの薬物送達ビヒクルが存在する。理想的な薬物送達ビヒクルは、非毒性であり、生物適合性であり、免疫原性がなく、生分解性である必要があり、かつ宿主の防御機構による認識を回避する。

本発明の好ましい実施形態において、脂質誘導体化ビスホスホン酸を含むリポソームは、標的化薬物送達のために、とくに骨構造への送達のために使用され得る。それぞれの脂質誘導化ビスホスホン酸は、ＷＯ ２００５／０７０９５２ Ａ２（ＭＣＳ Ｍｉｃｒｏ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）によって開示され、当該ビスホスホン酸の調製および使用の開示のためにそれらの全体内容は参照される。

本発明の好ましい実施形態において、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断薬として使用され得る。ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断上の使用は、患者由来のサンプル中のＣＤ４４ｖ５タンパク質の検出に関する。分析されるサンプルは、組織、臓器およびそれらの生検または体液（例えば、血液、血清、尿、唾液もしくは大脳液（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｌｉｑｕｏｒ））を含む任意のタイプであり得る。

診断上の使用のために、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、検出のために標識される。適切な標識は、先行技術において知られており、色素（例えば、発光もしくは蛍光色素）、放射性同位元素、酵素、タンパク質タグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグもしくはＨｉｓタグ）またはナノ粒子が挙げられる。

標識の組み入れに関して、スルフヒドリル基、アミン基、またはカルボキシル基の無作為な改変に依存するいくつかの先行技術の方法が知られている。あるいは、遺伝子工学が、さらなる反応基（例えば、システイン残基）を導入または除去するために使用され得る。

別の方法として、短いペプチドタグは、標識受容体部位として機能する前記タンパク質に付着され得る。本発明で、標識は、タグの固有の活性、または追加される酵素のトランスでの活性のいずれかを介して付着される。活性関連標識に関する例としては、タグ付けされたタンパク質が広範囲のアビジン／ストレプトアビジン試薬と組み合わせられることを可能にする、ビオチンホロ酵素シンセターゼＢｉｒＡによって触媒されるような部位特異的ビオチン化が挙げられる。ＬＵＭＩＯタグ（テトラシステインモチーフを含むヘキサペプチド）と融合されたタンパク質は、２つのヒ素原子を含む色素を用いて直接染色され得る。

本発明の好ましい実施形態において、ヒトＤＮＡ修復酵素であるＯ（６）−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ；ＳＮＡＰタグとしても知られる）の遺伝子操作された変形物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）は、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質と融合される。Ｏ（６）−ベンジルグアニンを含む基質は、急速かつ非常に特異的な自己標識反応おいて安定なチオエステル結合を介して当該融合タンパク質と共有結合的に結合される。この標識技術および診断上の目的のためのその用途は、Ｋａｍｐｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）およびＸｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって開示され、当該標識の調製および使用の開示のためにそれらの全体内容は参照される。

好ましい実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、ナノ粒子と結合される。種々のタイプのナノ粒子が、先行技術において知られており、本願においてもまた開示される。

さらなる好ましい実施形態において、（好ましくは、ナノ粒子と結合される）標識されたＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、水性浸漬浴（ａｑｕｅｏｕｓ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｂａｔｈ）内に含められる。サンプルを浸漬浴に浸すことによって、標識されたＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、サンプルのＣＤ４４ｖ５タンパク質を特異的に標識し、それは調査者によって可視的に直接評価され得る。この手順は、特に手術に適しており、それにより、取り出された組織は手術中に腫瘍マーカーの存在について分析され得る。結果として、外科医は、腫瘍切除の正確性に関する即時のフィードバックを得る。

用語「診断薬」は、本発明の文脈において、「造影剤」の同義語として使用され、すなわち、それは医学的処置を補助するための、生物学的システムにおける、特に生きている人における形態学的または機能的構造の識別力のある可視化のために役立つ。

前記ナノ粒子は、特に外科的処置において診断薬として利用され得る。それらは同様に、低侵襲な方法（例えば、内視鏡法、腹腔鏡法）において使用され得る。イメージング法（例えば、ＰＥＴ、ＭＲＴ、ＣＴなど）と組み合わせることは、有意義である。

すでに上で述べられたように、局所的投与の形態における本発明による使用は、特に好都合である。この関係において局所的投与に関して利用されるＣｄの量は、好都合なことに、高齢かつ通常の生活様式の人の肝臓および腎臓において一生の間に通常どのようにしても蓄積する総曝露量の１０分の１を超えない。これらの臓器の総曝露量は、約１８ｍｇである。したがって、局所投与においてナノ粒子の量が限定され、その結果少なからず追加されるＣｄの量が実質的に２ｍｇを超えないことは好都合である。特に好ましい実施形態において、腫瘍可視化は、総量で０．６ｍｇ、特に好ましくは０．２ｍｇのカドミウムを超えない造影剤の量でさえ可能である。

「局所的投与」は、本発明の目的に関して、投与の様式に依存して、身体の区別される領域において造影剤の量または用量の増加が期待され得る任意の投与を意味する。したがって、個人への投与に対する付随手段（例えば、結紮を求心性または遠心性の脈管に適用させることなど）が、造影剤が本質的に無妨害な様式で身体の血管系にわたって広がることを妨げる場合、造影剤の血管投与はまた、局所的投与である。

この実施形態の特有の利点は、生きている人への医学的応用においてナノ粒子の使用がそれゆえ、考えられることである。なぜなら、別の方法では（すなわち、全身投与のように）、それらに関連する毒性のために、これが排除されるからである。これは、局所的投与が、十分な可視化のために必要なナノ粒子の用量を減少させるためである。

ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を可視化するために、１ｃｍ^３の腫瘍組織あたり０．００２から０．０２ｍｇまでのＣｄの量に対応する用量で、Ｃｄ含有造影剤が本発明によって好都合に利用されることが、明らかになっている。１ｃｍ^３の腫瘍組織あたり０．００２から０．０１５ｍｇまでのＣｄの量に対応する用量、特に１ｃｍ^３あたり０．００２と０．０１０ｍｇとの間のＣｄの量に対応する用量の造影剤の投薬量は、特に好都合である。この好都合な投薬量を用いて、それによって人における曝露の通常許容可能な上限を超えることなく、ｉｎ ｖｉｖｏで約１５０ｃｍ^３までの体積を伴う腫瘍を可視化することが、可能である。５０ｃｍ^３までの体積を伴う腫瘍の可視化は、特に好ましい。

調査は、患者の、特に皮膚、中空臓器の（例えば、消化管、尿生殖路、呼吸器における）全ての接近可能な組織／臓器、またはそのほかに感覚器官の外部から接近可能な領域そしてそのうえ心血管系に関し得る。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断薬としての用途（例えば、免疫組織化学法またはＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ）もまた、考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏの診断の組み合わせ（例えば、生検材料）は、特に好都合である。

本発明によるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、ナノ粒子と結合されたままであり得るか、または除去可能または検出可能または放出可能であり得る。

さらなる局面において、本発明は、以下の表において載せられ、かつ配列番号１１から３８と指定されたＣＤ４４ ｖ５ペプチドを提供する。これらのペプチドは、ヒトＣＤ４４の完全なｖ５ドメインをカバーする重複した配列を伴う１２量体である。

一実施形態において、本発明は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端欠失を有する配列番号１１から３８と指定されたペプチドにも関する。

他の実施形態において、本発明は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端伸長を有する配列番号１１から３８と指定されたペプチドにも関し、これらの追加のアミノ酸はそれぞれのＣＤ４４ｖ５アミノ酸配列のアミノ酸である。

好ましい実施形態において、前記ペプチドは、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を遮断するために使用され得る。この拮抗的な活性のために、これらのペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４４標識の特異性を実証するために使用され得る。

さらに、前記ペプチドは、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の治療上の使用のためのアンタゴニストとして使用され得る。この文脈において、当該ペプチドは、ＣＤ４４ｅｘ９関連治療の効果を調節し、減少させ、または打ち消すために使用され得る。

治療環境において、本発明のＣＤ４４ｖ５ペプチドは、ＣＤ４４受容体の内在性リガンドに直接結合し得る。これは、これらのリガンドの中和（それらをＣＤ４４受容体として利用不可能にさせること）をもたらし得、そしてマクロファージによる急速なクリアランスももたらし得る。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、配列番号１１から３８によるこれらのペプチドの１以上は、ｖ５ドメインを発現するＣＤ４４バリアントに対する適応免疫を発達させるように個人の免疫系を刺激するためのワクチンとして使用され得る。ワクチンとして、当該ペプチドは、癌の予防のためまたは癌の免疫療法のために使用され得る。

ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の同定をもたらすツーハイブリッドスクリーニングの首尾よい結果によって、ぞれぞれのペプチドは、免疫学的に関連のあるエピトープとして検証されている。したがって、それらは、ワクチンとしての使用に適している。

癌の予防または処置における薬剤として使用するために、配列番号１１から３８による単離されたタンパク質もしくはこれらのペプチド断片または当該タンパク質もしくは当該ペプチド断片をコードする核酸を含むワクチン組成物を提供することはまた、本発明の一局面である。

さらなる局面において、本発明は、（好ましくはナノ粒子に結合される）本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質もしくはＣＤ４４ｖ５ペプチドまたは標識されたＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質もしくはＣＤ４４ｖ５ペプチド、および薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物に関する。

本発明のペプチドは比較的小さい分子であるため、そのような組成物において、当該ペプチドと種々の材料（例えば、（ワクチンを作製するための）アジュバント、免疫原性組成物など）を組み合わせることは、要求され得る。（広く定義される）アジュバントは、免疫応答を促進する物質である。しばしば、好ましいアジュバントは、例えば、ミョウバン沈降された抗原と組み合わせて使用されるフロイント完全または不完全アジュバント（つまり、死滅されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ生物）である。アジュバントの一般的な考察は、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８６）の６１〜６３ページにおいて提供されている。Ｇｏｄｉｎｇによると、目的の抗原が低分子量であるか、または免疫原性が乏しい場合、免疫原性の担体と連結することが推奨される。そのような担体分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンおよび家禽免疫グロブリンが挙げられる。種々のサポニン抽出物はまた、免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であると示唆されている。最近、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（周知のサイトカイン）をアジュバントとして使用することが、提案されている（ＷＯ ９７／２８８１６）。

本発明によるワクチン組成物は、好ましくは、アジュバントおよび／または担体を含む。有用なアジュバントおよび担体の例は、本明細書の以下に示される。

したがって、組成物中に存在するＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらのペプチド断片は、担体（例えば、タンパク質など）またはＣＤ４４ｖ５ペプチドもしくはそれらの断片をＴ細胞に提示することができる抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ））と対合し得る。

アジュバントは、ワクチン組成物へのその混合が本発明のＣＤ４４ｖ５タンパク質への免疫応答を増大させるかまたは別なように改変する、任意の物質である。担体は、ＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらの断片が対合することができる足場構造体（例えば、ポリペプチドまたは多糖）である。

アジュバントは、例えば：ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＡ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＨ_４（ＳＯ_４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルヌラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ｎｏｒ−ＭＯＰともいわれる）、Ｎ−アセチルムラミウル（ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｕｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロクスホスホリルオキシ（ｈｙｄｒｏｘｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチル−アミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥともいわれる）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０−ＲＴＭ−エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含むリポ多糖およびその種々の誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワックス０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびｇｅｎｕｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａのメンバーにおいて見出される物質、リポソームまたは他の脂肪乳剤、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、ＱｕｉｌＡ、ＡＬＵＮ（ＵＳ ５８７６７および５，５５４，３７２を参照されたい）、リピドＡ誘導体、コレラトキシン誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＳＰ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１からなる群から選択され得る。本発明と共に使用される好ましいアジュバントとしては、油／界面活性剤を基にしたアジュバント（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）が挙げられる。他の好ましいアジュバントは、バクテリアのＤＮＡを基にしたアジュバント（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバント）である。さらに他の好ましいアジュバントは、ウイルスのｄｓＲＮＡを基にしたアジュバント（例えば、ポリＩ：Ｃ）であり、イミダゾキニリン（ｉｍｉｄａｚｏｃｈｉｎｉｌｉｎｅ）は好ましいアジュバントのさらなる他の例である。さらに、好ましいアジュバントは、リポソームである。最も好ましいアジュバントは、ヒトの使用に適するアジュバントである。

Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（全てＳｅｐｐｉｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−２５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７０８、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７６３Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−２０７、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−２６４、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−２７、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−３５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１ Ｆ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−０１６０およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳからなる群から選択され得、好ましくは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳおよびＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７２０からなる群から選択され得、より好ましくは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１からなる群から選択され得る。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）は、異なる界面活性剤が代謝可能でない鉱物油、代謝可能な油またはその２つの混合物と組み合わせられた、油／界面活性剤を基にしたアジュバントである。それらは、ＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらの断片を含む水溶液を伴う乳剤として使用するために調製される。当該界面活性剤は、マンニドオレエートである。ＯＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は、水溶液のように扱える高度に精製された、水溶性のサポニンである。ＯＳ−２１およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１アジュバントは、無菌の、単回使用のバイアルにおいて提供され得る。

本発明によるワクチン組成物は、１つより多い異なるアジュバントを含み得る。さらに、本発明は、上記のものまたはその組み合わせ物のいずれかを含む任意のアジュバント物質をさらに含む治療組成物を包含する。ＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらの断片と、当該アジュバントとが、任意の適切な順序で別々に投与され得ることがまた、企図される。

担体は、アジュバントと独立して存在し得る。担体の機能は、例えば、ペプチドまたはそれらの断片の活性または免疫原性を増加させるため、安定性を与えるため、生物学的活性を増加させるため、または血清半減期を増加させるために、当該ペプチドまたはそれらの断片の分子量を増加させることであり得る。さらに、担体は、ＣＤ４４ｖ５ペプチドまたはそれらの断片をＴ細胞に提示することを助け得る。担体は、当業者に知られている任意の適切な担体（例えば、タンパク質または抗原提示細胞）であり得る。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、血清タンパク質（例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブリンもしくはオボアルブミン）、免疫グロブリン、またはホルモン（例えば、インスリンもしくはパルミチン酸）であり得るが、これらに限定されない。人の免疫化のために、担体は、ヒトに許容可能な生理学的に許容可能な担体であり、かつ安全である必要がある。しかしながら、破傷風トキソイドおよび／またはジフテリアトキソイドは、本発明の一実施形態において適切な担体である。あるいは、担体は、デキストラン（例えば、セファロース）であり得る。

したがって、本発明は、上記のものまたはそれらの組み合わせ物のいずれかを含むアジュバント物質をさらに含む治療組成物を包含する。抗原、すなわち、本発明のペプチドとアジュバントとは、同時に投与され得るか、または任意の適切な順序で別々に投与され得ることがまた、企図される。

本発明によって調製された薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体と一緒に、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドを含む。用語「薬学的に許容可能な」は、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドの生物学的活性の有効性を妨げず、かつ投与される宿主に対して有毒でない任意の担体を含む。

本発明の一実施形態として、組成物は、ヒト血清アルブミンを用いて安定化されたＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドを使用して調製される。この目的のために、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドの調製物は、バイアルにおいてヒト血清アルブミンを用いて凍結乾燥される。

ある実施形態において、薬学的組成物は、毒素、サイトカイン、細胞増殖抑制性物質または免疫調節性物質として作用する１以上の他の薬物をさらに含む。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」との語は、薬学的投与と適合する任意および全ての溶媒、可溶化剤、充填剤、安定薬、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、放出制御ビヒクル（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｖｅｈｉｃｌｅ）、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、分散媒、コーティング、抗菌剤または抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むと意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および物質の使用は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または物質が活性化合物と適合しないような場合を除いて、組成物におけるそれらの使用は、企図される。追加の物質はまた、当該組成物中に組み入れられ得る。

本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局部的投与）、経粘膜的投与および直腸投与が挙げられる。非経口での適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌希釈剤（例えば、注射のための水、食塩水、不揮発性油または他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸またはナトリウムビスルフェート）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）および浸透圧の調節のための物質（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）。ｐＨ値は、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨ての注射器または複数容量のバイアル中に封入され得る。

注射可能な用途に適する薬学的組成物としては、無菌の注射可能溶液または分散液の即時調製のための無菌の水性溶液または水性分散液および無菌粉末剤が挙げられる。静脈内投与に関して、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，ＢＲＤ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、注射可能組成物は、無菌であるべきであり、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。それは、製造および貯蔵条件下において安定である必要があり、微生物（例えば、バクテリアおよび真菌）の混入作用から保護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノールなどを含む溶液または分散媒、およびそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子の大きさの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。

微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウム）を含めることが、好ましい。注射可能組成物の延長された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質（例えば、アルミニウムモノステアレート）を含めることによってもたらされ得る。

無菌の注射可能溶液は、適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物（例えば、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチド）を、必要に応じて、上に列挙された成分の１つまたは組み合わせ物と共に組み入れ、その後に濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を塩基性の分散媒および上に列挙されたものから必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライであり、これは、活性成分の粉末に加えてそれらの前記濾過滅菌溶液から任意のさらなる所望の成分をもたらす。

経口組成物は、一般的に、不活性の希釈剤または食用の担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、または錠剤内に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み入れられ得、そして錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流動性担体を用いて調製され得、当該流動性担体中の化合物は、経口的に適用され、そして口の中ですすがれ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース）；賦形剤（例えば、デンプンもしくはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、ナトリウムデンプングリコレート（例えば、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（登録商標））、もしくはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、マグネシウムステアレート）；滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味料（例えば、スクロースもしくはサッカリン）；または香料（例えば、セイヨウハッカ、メチルサリシレートもしくはオレンジ香料）。

吸入による投与のために、前記化合物は、適切な高圧ガス（例えば、二酸化炭素などの気体）を含む圧力容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与はまた、経粘膜的または経皮的な手段によるものであり得る。経粘膜的または経皮的な投与のために、バリアが浸透されるようにするために適切な浸透剤は、製剤化において使用される。そのような浸透剤は、当該分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜的投与に関して、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は、鼻腔用スプレーまたは坐薬の使用を介して成し遂げられ得る。経皮投与のために、生物活性化合物は、当該分野で一般的に知られるような軟膏剤、軟膏またはクリーム剤の中に製剤化される。

前記組成物はまた、直腸送達のために（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐薬の基剤を伴う）坐薬または停留浣腸剤の形態で調製され得る。

一実施形態において、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはＣＤ４４ｖ５ペプチドを含み得る治療部分は、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む、化合物が身体から急速に排出されることを防ぐ担体（例えば、放出制御製剤）を伴って調製される。そのような製剤の調製のための方法は、当業者には明白である。材料はまた、例えば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に得られ得る。（腫瘍抗原に対する抗体を用いて癌細胞を標的にしたリポソームを含む）リポソームの懸濁液はまた、薬学的に許容可能な担体として使用され得る。これらは、当業者に知られる方法にしたがって調製され得る。

投与の容易性および投薬量の一様性のために、投薬単位形態で経口または非経口組成物を製剤化することは、特に好都合である。投薬単位形態は、本明細書において使用される場合、処置される患者のための単位投薬量として適した物理的に分離した単位を含む；それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性タンパク質を含む。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性タンパク質の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置に関するそのような活性タンパク質の調剤の分野における固有の制限によって規定され、かつ直接的に依存する。

本発明のタンパク質の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、そしてそれは、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表現され得る。大きな治療指数を示すタンパク質は、好ましい。有毒な副作用を示すタンパク質が使用され得るが、癌でない細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、そのようなタンパク質を冒された組織の部位へ向ける送達システムを設計するように注意されるべきである。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量の製剤化において使用され得る。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないかまたは毒性を伴わないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変わり得る。本発明の方法において使用される任意の化合物に関して、治療上有効な用量は、初期的に細胞培養アッセイから見積もられ得る。細胞培養物において決定されたようなＩＣ_５０（例えば、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、ある用量が、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿におけるレベルは、（例えば、高速液体クロマトグラフィによって）測定され得る。

薬学的組成物は、投与のための指示書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサー内に含まれ得る。

他の局面において、本発明は：ａ）個々に服用される薬品、ならびにｂ）患者に投与される薬品の作用、副作用、相互作用、代謝、吸収、分散、代謝および排出に関連する患者固有の性質に関する診断指示システムを含む、薬品／線量計の組み合わせパッケージを提供し、当該患者特異的な性質は、内在性物質、調節機構、遺伝子または指示システムからなる群から選択される。上記組み合わせ物パッケージにおいて、薬品または診断指示システムは、単離されたＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはその任意の融合タンパク質もしくは複合体であり得る。上記の目的のために、本発明のＣＤ４４ｖ５ペプチドも、薬品または診断指示システムとして使用され得る。

適切な組み合わせ物パッケージは、ＥＰ １ ５４２ ６４４ Ｂ１（ＭＣＳ Ｍｉｃｒｏ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）によって開示され、前記薬品／線量計の組み合わせ物の調製および使用の開示のためにそれらの全体内容は参照される。

本発明の他の局面は、本発明のタンパク質の発現または活性を調節するための薬学的組成物を調製するための方法を含む。そのような方法は、本発明のタンパク質の発現または活性を調節する物質と共に薬学的に許容可能な担体を製剤化することを含む。そのような組成物は、追加の活性物質をさらに含み得る。したがって、本発明は、本発明のタンパク質の発現または活性を調節する物質および１以上の追加の生物活性物質と共に薬学的に許容可能な担体を製剤化することによって薬学的組成物を調製するための方法をさらに含む。

定義
本発明の文脈において、用語「ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質」は、ヒトＣＤ４４遺伝子のエキソン９によってコードされるポリペプチドと結合する、３００アミノ酸またはそれ未満の長さのタンパク質について使用される。本明細書において、「結合タンパク質」または「活性化合物」ともいわれる。

本発明の文脈におけるタンパク質は、アミノ酸から構成される分子と定義される。用語タンパク質は、それゆえ、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、へプタペプチド、オクタペプチド、より長いオリゴペプチドおよびアミノ酸鎖を包含する。アミノ酸鎖は、直鎖形態または分岐鎖形態であり得る。

本発明の文脈におけるアミノ酸は、タンパク質内でアミド結合を形成する少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つのカルボキシル基を含む有機化合物である。

タンパク質の一部であるアミノ酸は、２０種の標準的なアルファアミノ酸、またはセレノシステイン、ピロリシン、ランチオニン、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルアタメート、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニンのような非標準的なアミノ酸から選ばれ得る。さらに、ベータアミノ酸（例えば、ベータアラニン）、ガンマアミノ酸またはより高いアミノ酸のような他のアミノ酸は、タンパク質の一部であり得る。

例えば、２つの立体異性体（Ｄ型およびＬ型）として存在するアルファアミノ酸についてのように、あるアミノ酸に関して、異なる鏡像異性形態または立体異性形態が、選択され得る。

タンパク質は、（人工であっても人工でなくてもよいリボソームシステムを利用する細胞を含まないシステムにおける有機合成の方法によって）合成的に生産され得るか、あるいは、遺伝子操作されても遺伝子操作されなくてもよい細胞によって、または単細胞生物によって（例えば、細菌もしくは酵母細胞によって）もしくは多細胞生物によって自然に生産され得る。

タンパク質は、多くの方法において改変され得る。代表的な改変は、脂質、アセテート基、ホスフェート基または炭水化物を含める翻訳後修飾である。タンパク質はまた、例えば、ビオチン基を用いて化学的に改変され得る。

タンパク質は、共有結合的な結合または非共有結合的な相互作用によって一緒にまとめられた同一のサブユニットからなる多量体（ホモマー）または異なるタンパク質からなる多量体（ヘテロマー）であり得る。

本明細書において使用される用語「結合親和性」は、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質とＣＤ４４ｖ５ドメインとの間の親和性の強度をいい、解離定数Ｋ_Ｄによって説明される。ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質とＣＤ４４ｖ５ドメインとの間の結合親和性についてのＫ_Ｄ値は、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫沈着法（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または動態学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ分析）によって決定され得る。

「Ｋ_Ｄ」は、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質とＣＤ４４ｖ５ドメインとの間の相対的な結合親和性をいう。高いＫ_Ｄ値は、低い結合親和性を表す。

本発明の文脈において、用語「急性期処置」は、通常は病院における、急性の病気もしくは損傷を有するか、または手術から回復している患者のための短期間の医学的処置をいう。用語「急性期後処置」は、通常は病院における、急性の病気もしくは損傷を有するか、または手術から回復している患者のための中期間の医学的処置をいう。

用語「処置すること」または「処置」は、それらを必要とする哺乳動物、特にヒトの生理学的障害を予防、軽減、緩和、または治療するための任意の医学的手段をいう。本発明によると、処置はまた、標的化薬物送達も包含する。

「治療上有効な量」は、神経性疾患または神経変性疾患（例えば、脳卒中）と関連する症状を軽減させる活性成分の量と定義される。「治療上有効な」はまた、未処置と比較して、障害重症度また発生頻度の任意の改善をいう。用語「処置」は、治療または治癒のいずれか、ならびに緩和、寛解または予防を包含する。

用語「発現ベクター」は、異質な細胞に異種性のＤＮＡ断片を組み入れ、そして異質な細胞において異種性のＤＮＡ断片を発現させる能力を有するベクターをいう。多くの原核生物および真核生物の発現ベクターが公知であり、そして／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内にある。

本発明の文脈において、用語「ナノ粒子」は、１μｍ未満の大きさ、そして好ましくは１ｎｍと１００ｎｍとの間の大きさの粒子をいう。したがって、用語「ナノ粒子」は、貴金属クラスタからなるナノ粒子、希土類を基にした無機蛍光ナノ粒子、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）、ブロック共重合体ミセル、ナノセル、デンドリマー、ナノチューブ、ポリマーソーム、ＸＰｃｌａｄ（登録商標）ナノ粒子および結晶性の発光性カルシウムホスフェート層によって囲まれた非晶質シリカからなるナノ粒子（例えば、ＯＲＭＯＢＥＡＤ（登録商標））のみならず、半導体材料から作られたナノ結晶（いわゆる量子ドット）を包含する。

文献

ＣＤ４４のゲノム構造およびタンパク質ドメイン。 （Ａ）酵母ツーハイブリッドスクリーニングの方策の図式概要。（Ｂ）Ｙ２Ｈスクリーニングに関して使用したベクター。 ＣＤ４４と相互作用する陽性クローンのアミノ酸配列およびそれから派生するコンセンサス配列。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３を用いるＨＴ２９細胞の標識。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−５を用いるＨＴ２９細胞の標識についてのネガティブコントロール。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３またはネガティブコントロールのＭＢＰナノ粒子を用いるＨＴ２９細胞標識の定量化。 増加する量の遊離標的ＣＡ１９−９の添加によるナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３を用いるＨＴ２９細胞標識の競合。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３を用いるＣｏｌｏ２９細胞の標識。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−５を用いるＣｏｌｏ２９細胞の標識についてのネガティブコントロール。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３を用いるＳＷ１１６細胞の標識。 ナノ粒子複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−５を用いるＳＷ１１６細胞の標識についてのネガティブコントロール。 抗ＣＥＡ抗体および抗ＣＡ−１９−９抗体と複合体化された二重特異性ナノ粒子Ｑ＿ＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿１２を用いる粘液性腺癌組織（サンプル番号３５）の標識。４つの象限において、以下の条件が分析された：上部左：Ｑ＿ＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿１２を用いる標識上部右：遊離標的ＭＢＰ−ＣＥＡ（２５μＭ）の添加によるＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿１２を用いる標識下部左：遊離標的Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ_ａ（２５０μＭ）の添加によるＱ＿ＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿１２を用いる標識下部右：遊離標的ＭＢＰ−ＣＥＡ（２５μＭ）およびＳｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ_ａ（２５０μＭ）の添加によるＱ＿ＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿１２を用いる標識 ペプチドＡからＥに関する親和性順位付け実験：偽性ヒットピッキングアッセイＩの結果 ペプチドＡからＥに関する親和性順位付け実験：ＦＤＧアッセイＩの結果 ペプチドＡからＥに関する親和性順位付け実験：偽性ヒットピッキングアッセイＩＩの結果 ペプチドＡからＥに関する親和性順位付け実験：ＦＤＧアッセイＩＩの結果 ペプチドＡからＥに関する親和性順位付け実験の全体概要 ペプチドＡ、Ｃ、ＤおよびＥに関する欠失変異体を示す図表 ペプチドＢに関する欠失変異体（左側）およびＦＤＧアッセイにおけるそれらの親和性分析の結果（右側）を示す図表 ペプチドＢに関するアラニンスキャニング変異体およびＰＨＰアッセイおよびＦＤＧアッセイ（いずれも２回行った）におけるそれらの親和性分析の結果を示す表。 結合分析のために生成された別のＣＤ４４コンストラクトを示す図表。 蛍光ナノ粒子とカップリングされたＣＤ４４ｖ５結合ペプチドＡ、ＢまたはＣを用いて行ったｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞化学的実験の概観を示す図表。

実施例１：ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の単離
ＣＤ４４のｖ５ドメインに結合するタンパク質またはタンパク質断片の単離のために、競合的ツーハイブリッドスクリーニングを、ＥＰ １ ７２１ ９７４ Ａ１において開示された方法にしたがって実行した。ベイトとして、ｖ５断片をＧＡＬ４結合ドメインと融合した。それぞれのＯＲＦを、プラスミドベクターにクローン化し、ｐＧＢＫＴ７と指定した（図２を参照されたい）。ＧＡＬ４活性化ドメインと融合した断片についてのヒトｃＤＮＡライブラリーを、プレイとして使用した（ベクター ｐＧＡＤＴ７−ＲｅｃＡＢ；図２を参照されたい）。

ストリンジェントな択条件下でスクリーニングを実行し、３９個の陽性クローンの同定に至った。ベイトプラスミドおよびプレイプラスミドの選択的共形質転換後、３９個のクローンのうち２１個は陽性のままであった。２１個のクローンを、配列決定し、ＢＬＡＳＴ検索によって分析した。４個の配列が二重に同定され、１個の配列は４クローン存在したため、結果として、２１個の配列は、１２個の異なる配列に減少され得た。

さらに、配列比較から、これらの５個の配列ファミリーがコンセンサス配列の形成を可能にする広範な配列相同性を示すことが明らかになった（図３を参照されたい）。

実施例２：抗原発現腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出
２．１ 背景および目的
タンパク質−量子ドット複合体の抗原発現腫瘍細胞を特異的に検出する能力を実証するために、腫瘍検体またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した腫瘍細胞を、それぞれの抗原の発現に関して、蛍光によって、そして並行して免疫組織化学法によって分析した。第一の抗原として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を、分析した。ＣＥＡは、細胞接着に関与する糖タンパク質である。検出リガンドとして、抗ＣＥＡ抗体を、量子ドットであるＱＤＢＰ−６５５（＃７７３７８０を購入）と複合体化した。さらに、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）を、分析した。ＣＡ１９−９は、シアル酸付加されたＬｅｗｉｓ（ａ）抗原であり、膵癌の管理において主として使用される腫瘍マーカーを表す。

２．２ サンプル
２．２．１ 細胞培養サンプル
第一の一連の実験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したヒト癌細胞株ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２５およびＳＷ１１６を使用した。ＨＴ２９は、接着性結腸直腸腺癌細胞株であり、Ｃｏｌｏ２５は、ヒト結腸癌細胞株であり、およびＳＷ１１６は、結腸直腸癌細胞株である。

２．２．２ 腫瘍サンプル
個々の一連の実験において、ヒト腫瘍から得られたサンプルを使用した。２０１１年に腫瘍サンプル番号３５を盲腸から切除し、膠様腺癌と診断した。それを、ＴＮＭ分類にしたがって、ｐＴ４Ｎｏ（０／１８）Ｇ３Ｒｏと分類した。他に前処理していないこのサンプルを以下のように調製し、そして固定した。

組織切片の調製および固定
−７０℃で保存した、切除された腫瘍サンプルを、ＨＭ５６０ ＭＶクライオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して５μＭの厚さの凍結切片を調製するために使用した。当該切片を室温で６０から１２０分間乾燥させ、冷アセトン（−２０℃）を用いて１０分間インキュベーションした。室温で１０分間のさらなる乾燥工程の後、当該切片を−７０℃で一晩保存した。

前記切片を、室温で３０分間、閉ざされた箱の中で解凍した。ｐＨ８．０の２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に２０ｍｇ／ｍｌ ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）および２０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む溶液内でインキュベーションすることによって固定を実行した。その後、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４および２００ｍＭ グリセリンを含む緩衝液における２０分間のクエンチング工程までに、当該切片を５分間、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４および０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＤ−ＰＢＳ−Ｔ緩衝液中で洗浄した。最後の工程において、当該切片をＤ−ＰＢＳ−Ｔ中で５分間洗浄した。

組織切片の対比染色
Ｄａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、以下のプトロコルにしたがって対比染色を実行した：
− Ｄ−ＰＢＳ−Ｔ緩衝液を用いるすすぎ
− Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中の１％ ＢＳＡ／５％ ヤギ血清を用いる６０分間のブロッキング
− ブローオフ
− ２×１００μｌの複合体（Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中の１％ ＢＳＡ／５％ ヤギ血清において２０ｎＭ）を用いる６０分間のインキュベーション
− Ｄ−ＰＢＳ−Ｔを用いる３回のすすぎ
− ブローオフ
− ２×１００μｌの一次抗体（Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中の１％ ＢＳＡ／５％ ヤギ血清において２０ｎＭ）を用いる６０分間のインキュベーション
− Ｄ−ＰＢＳ−Ｔを用いる３回のすすぎ
− ブローオフ
− ２×１００μｌの二次抗体（Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中の１％ ＢＳＡ／５％ ヤギ血清において２０ｎＭ）を用いる６０分間のインキュベーション
− Ｄ−ＰＢＳ−Ｔを用いる３回のすすぎ
− ブローオフ
− ３×２００μｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｄ−ＰＢＳ緩衝液において２μｇ／ｍｌ）を用いる１０分間のインキュベーション
− Ｄ−ＰＢＳ−Ｔを用いる３回のすすぎ
− Ｍｏｗｉｏｌ／トリエチレンジアミン（ＤＡＢＣＯ）に包理

顕微鏡評価
上記のように調製した切片を、Ａｘｉｏｃａｍ ＨｒＭおよびＡｘｉｏｃａｍ Ｈｒｃ ＣＣＤカメラシステムを伴う倒立顕微鏡（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）であるＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００、ＨＸＰ １２０ Ｃ照射装置を用いて評価した。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ４．８；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。

２．３ タンパク質−量子ドット複合体
抗原検出のために、以下の表に載せた量子ドットを調製した：

複合体Ｑ５６１は、量子ドットＱＤＢＰ−６５５（バッチ ＃７７３７８０）とリガンドＳＩ６１６６との間の複合体である。ＱＤＢＰ−６５５は、６ｎｍの流体力学的直径を有し、Ｎｉ−ＮＴＡリガンドを保有する。リガンドＳＩ６１６６は、２．１ｎｍの流体力学的直径を有するＣＥＡ結合タンパク質であり、最終複合体は、１０．１ｎｍの流体力学的直径を示す。抗ＣＥＡタンパク質を、量子ドットとカップリングした。

量子ドットＱ＿ＣＡ１９−９−ｘは、量子ドットＱＤＢＰ−６５５（バッチ ＃７７３７８０）と抗ＣＡ１９−９抗体「ＭＢＰ−ＮＳ−１９−９−ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ６」との間の複合体である。重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）からなる組み換え型抗体ミメティックであるこの抗ＣＡ１９−９抗体は、「可変領域の単一鎖断片」、ｓｃＦＶと記載され得る。このｓｃＦＶ断片を、量子ドットとカップリングするために使用されるＨｉｓタグと融合する。抗ＣＡ１９−９抗体「ＭＢＰ−ＮＳ−１９−９−ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ６」はまた、ＳＩ６９５０と称される。

量子ドットＱ＿ＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿ｘは、二重特異性複合体であり、それによって抗ＣＥＡ抗体ＳＩ６１６６を持つ量子ドットＱ５６１は、抗ＣＡ１９−９抗体ＳＩ６９５０とさらに複合体化される。

複合体Ｑ＿ＣＥＡ／ＣＡ１９−９＿ｘの種々のバッチを、量子ドットとリガンドの比によって異なるように調製した（表の最後の列を参照されたい）。

３． ＣＡ１９−９と結合されるナノ粒子の結果
３．１ ＨＴ２９細胞
図４の上部左パネルおいて示されるように、複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３は、ＨＴ２９細胞の細胞膜を標識する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光によって検出される抗ＣＡ１９−９抗体を用いる細胞の染色（上部右パネル）は、複合体結合の特異性を示すシグナルの完全な共局在を示す。下部右パネルにおいて、細胞を微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡によって示す。

ネガティブコントロールにおいて、ＭＢＰと複合体化された量子ドット（ＭＢＰ−Ｈｉｓ／ＱＤＰ６５５）を使用した。図５の上部左パネルにおいて示されるように、標識を検出し得なかった。ＣＡ１９−９抗原の存在を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光によって検出される抗ＣＡ１９−９抗体を用いる細胞の染色によって検証した（上部右パネル）。

ＣＡ１９−９抗原の特異的標識を、滴定実験によっても示した。図６において示されるように、増加する量の複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９＿３は、相対蛍光が増加することによって実証されるように、ＨＴ２９細胞の標識の増加をもたらす。それに対して、ネガティブコントロールのＭＢＰ−Ｈｉｓ／ＱＤＰ６５５は、より高い複合体濃度でも大幅な増加を示さない希薄な蛍光標識のみをもたらす。

図７において示されるように、ＣＡ１９−９標識の特異性を、競合実験によってさらに検証した：標識混合物に加える増加する量の遊離ＣＡ１９−９抗原は、ＣＡ１９−９標識の減少をもたらす。

３．２ Ｃｏｌｏ２９細胞
図８の上部左パネルにおいて示されるように、複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３は、Ｃｏｌｏ２９細胞の細胞膜を標識する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光によって検出される抗ＣＡ１９−９抗体を用いる細胞の染色（上部右パネル）は、複合体結合の特異性を示すシグナルの完全な共局在を示す。下部右パネルにおいて、細胞を微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡によって示す。

ネガティブコントロールにおいて、ＭＢＰと複合体化された量子ドット（ＭＢＰ−Ｈｉｓ／ＱＤＰ６５５）を使用した。図９の上部左パネルにおいて示されるように、標識を検出し得なかった。ＣＡ１９−９抗原の存在を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光によって検出される抗ＣＡ１９−９抗体を用いる細胞の染色によって検証した（上部右パネル）。

３．３ ＳＷ１１６細胞
図１０の上部左パネルにおいて示されるように、複合体Ｑ＿ＣＡ１９−９−３は、Ｃｏｌｏ２９細胞の細胞膜を標識する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光によって検出される抗ＣＡ１９−９抗体を用いる細胞の染色（上部右パネル）は、複合体結合の特異性を示すシグナルの完全な共局在を示す。下部右パネルにおいて、細胞を微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡によって示す。

ネガティブコントロールにおいて、ＭＢＰと複合体化された量子ドット（ＭＢＰ−Ｈｉｓ／ＱＤＰ６５５）を使用した。図１１の上部左パネルにおいて示されるように、標識を検出し得なかった。ＣＡ１９−９抗原の存在を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光によって検出される抗ＣＡ１９−９抗体を用いる細胞の染色によって検証した（上部右パネル）。

４． 二重特異性複合体化ナノ粒子の結果
所定の標的において両方の抗原と相互作用する二重特異性複合体化ナノ粒子の能力を試験するために、この実験を実行した。この目的のために、抗ＣＡ１９−９抗体と抗ＣＥＡ抗体の両方と複合体化されたナノ粒子を使用し、上記サンプル番号３５の腫瘍細胞上のそれぞれの抗原を検出した。特異性を、遊離標的ＭＢＰ−ＣＥＡおよび１９−９を用いる阻害によって実証した。

図１２の上部左部分において示されるように、二重特異性ナノ粒子は、腫瘍組織の細胞膜を標識した。抗ＣＡ１９−９抗体または抗ＣＥＡ抗体を用いる腫瘍組織の染色は、それぞれの場合において、ナノ粒子の完全な標識プロフィールに結びつく部分的な共局在を示した。

二重特異性ナノ粒子を遊離標的ＭＢＰ−ＣＥＡと組み合わせて使用するとき、抗ＣＡ１９−９抗体の染色と完全な共局在を示す標識を観察し得る（図１２、上部右象限を参照されたい）。したがって、遊離標的は、細胞結合性ＣＥＡとの相互作用を阻害するが、ＣＡ１９−９の標識は依然として可能である。

図１２の下部左象限において示されるように、遊離標的Ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅｗｉｓ_ａの添加は、細胞のＣＡ１９−９抗原との相互作用を阻害するが、ＣＥＡ標識は維持する。

最後の実験において、二重特異性ナノ粒子を、ＭＢＰ−ＣＥＡとＳｉａｌｙｌ−Ｌｅｗｉｓ_ａの両方の遊離標的と組み合わせた（図１２の下部右象限を参照されたい）。結果として、標識は、完全に阻害された（象限の上部左隅）。両方の抗原の共局在された発現を、抗ＣＥＡ抗体および抗ＣＡ１９−９抗体のそれぞれを用いる染色によって検証した。

実施例３． 親和性順位付けによるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の特徴付け
序論：
実施例１の競合的ツーハイブリッドスクリーニングにおいて同定されたようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を、２種の異なる親和性アッセイによってさらに分析し、親和性順位付けを確立した。

方法：
第一のアッセイとして、偽性ヒットピッキングアッセイを使用し、それを以下のように実行した：２個の異なるペプチドの親和性を比較するために、第一のペプチドまたは第二のペプチドを発現するコロニーを、それぞれ、寒天プレートの第一の半分または第二の半分にプレーティングした。次いで、コロニーを「ヒット」と定義することについての閾値を、プレートの参照領域における、あらかじめ定義される第一のペプチドのコロニーのある割合を「ヒット」として選ぶことと決定した。同一の実験において、第二のペプチドのコロニーを、走査し、選ぶ。次いで、第二のペプチドのコロニーの数を、第一のペプチドのコロニーの数と比較し、割合として表す。この割合に基づいて、相対相互作用強度（すなわち、ＣＤ４４ペプチドに対する親和性）を、得ることができる。

ＦＤＧアッセイは、ツーハイブリッドスキャニングシステムのレポーターシステムに基づく。それによって、ＣＤ４４ｖ５ペプチドを伴うＧＡＬ４結合ドメインは、ＧＡＬ４活性化ドメインと融合されたそれぞれのペプチドと相互作用する。コンプレックス形成後、２個の独立したレポーター遺伝子が活性化され、第一のレポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードし、第二のレポーター遺伝子が酵素ベータガラクトシダーゼをコードし、その酵素活性は蛍光発生基質であるフルオレセイン ジ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）を使用することによって決定され得る。

偽性ヒットピッキングアッセイにおいて、両方のレポーターシステムが、検討される：最初は、内在性レポーター遺伝子の蛍光であり、蛍光基質と共にインキュベーションした後は、酵素をコードする第二のレポーター遺伝子の活性である。それとともに、１つの実験中に２個の異なるレポーター遺伝子の結果を決定し得る。

図１３から１６において示されるように、配列番号１から５の５個のペプチドのうちの２個についての、１０個の異なる組み合わせを、並行して実行した偽性ヒットピッキングアッセイおよびＦＤＧアッセイにおいて比較した。これによって、図１３から１６において示されるように、２回の独立した実験を行った。

結果：
両方の実験は、ペプチドＢ（配列番号３）がＣＤ４４ｖ５ペプチドに対する最も高い親和性を有し、その後にペプチドＣおよびペプチドＤが続くことを示した。親和性順位付けアッセイの全体要約は、図１７において示される。

実施例４：欠失によるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の特徴付け
序論：
５個のペプチドに関して、これらのペプチドの結合部位を同定し、特徴づけるために、欠失を基にしたエピトープマッピングを実行した。当該結果は、ＣＤ４４ｖ５関連治療および診断の発展を助け得る重要な情報を示す。

方法：
ペプチドＡからＥの５個全てに関して、欠失変異体を生成し、ＰＨＰアッセイおよびＦＤＧアッセイにおいて試験した。ペプチドＡ、Ｃ、ＤおよびＥに関して、Ｎ末端またはＣ末端欠失断片を生成し、ペプチドＡ１、Ｃ１、Ｄ１およびＥ１と命名した。ペプチドＡ、Ｃ、ＤおよびＥに関する欠失変異体の配列を、図１８に表す。

ペプチドＢに関して、全部で４種の欠失変異体、すなわち図１９において示されるようにペプチドＢ１からＢ４を生成した。

前記ペプチドを、ＰＨＰアッセイおよびＦＤＧアッセイにおいて、比較して試験した。

結果：
ペプチドＢに関して、１８アミノ酸のＮ末端欠失（ペプチドＢ１）によって、活性がわずかに減少したペプチドを生じた（図１９、右側を参照されたい）。それによって、このＮ末端領域は、ＣＤ４４ｖ５ペプチドとの相互作用に決定的でなく、それゆえ、ペプチドＢ１はＣＤ４４ｖ５と相互作用するためのコア配列を表す。

図１９において示されるように、Ｎ末端欠失およびＣ末端欠失を伴うペプチド（ペプチドＢ４）、Ｃ末端欠失のみを伴うペプチド（ペプチドＢ２）およびコア配列「ＱＬＳＦＥＶＱＷＥＴＳ」の欠失を伴うペプチド（ペプチドＢ３）は、ＣＤ４４ｖ５と結合する能力を完全に失う。この結果は、少なくともコア配列がＣ末端部分と共にＣＤ４４ｖ５結合のために必要とされることを示すペプチドＢ１の特性と完全に一致する。

ペプチドＡ１およびＣ１は、コンセンサス配列のモチーフである「ＡＩＥ」を含むＣ末端の３または８アミノ酸の長さの配列が欠失していることによって、それらの親ペプチドＡおよびＣと異なる。両方の場合において、ＣＤ４４ｖ５への結合は、ほとんど完全に消え、コンセンサス配列のこの部分の関連性を示す。

ペプチドＤ１およびＥ１は、コンセンサス配列のモチーフである「ＰＹＹＧＫＸＬＸＸ」を含むＮ末端の配列が欠失していることによって、それらの親ペプチドＤおよびＥと異なる。両方の場合において、ＣＤ４４ｖ５への結合は、減少されない。ペプチドＤ１は同様の親和性であるのに対して、ペプチドＥ１は親ペプチドＥと比較して、ＣＤ４４ｖ５に対するより強い結合さえ示す。

これらの結果は、上記のペプチドＢに関する結果と完全に一致する。Ｎ末端領域は、ＣＤ４４ｖ５結合に関して必須ではなく、短くされたペプチドおよびコア配列としてのそのそれぞれのコンセンサス配列は、ＣＤ４４ｖ５関連診断および治療に関する好ましいペプチドモチーフを表す。

実施例５：アラニンスキャニングによるＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の特徴付け
序論：
最も親和性の（ａｆｆｉｎｅ）ペプチドＢに関して、ＣＤ４４ｖ５結合に決定的なそれらのアミノ酸を同定するために、コア配列のアラニンスキャニングを実行した。変異導入したペプチドＢ３によって示されるように、コア配列「ＱＬＳＦＥＶＱＷＥＴＳ」の存在は、ＣＤ４４ｖ５結合に必須である。

方法：
ペプチドＢを使用し、全部で１１種の変異体を生成し、それによってコア配列「ＱＬＳＦＥＶＱＷＥＴＳ」の全てのアミノ酸を、アミノ酸のアラニンによって独立して置換した（図２０を参照されたい）。ＰＨＰアッセイおよびＦＤＧアッセイにおいて、これらの変異体をペプチドＢと比較して試験した。ペプチドＡからＤの５個全てに関して、欠失変異体を生成し、ＰＨＰアッセイおよびＦＤＧアッセイにおいて試験した。

結果：
図２０において示されるように、コア配列の最初の１０個のアミノ酸の置換は、ＣＤ４４ｖ５に対する親和性の有意な変化をもたらさない。しかしながら、下線を引いたコア配列の１１番目のアミノ酸であるセリンのアラニンによる交換は、より高い親和性を伴うペプチドを生じた。

したがって、コア配列内にＣＤ４４ｖ５結合に決定的な単一のアミノ酸は存在しないが、これらのアミノ酸が同等な様式で標的に結合すると推定される必要がある。

しかしながら、前記結果に基づき、いっそう改善されたペプチドＢおよび１１番目のアミノ酸のＳｅｒ−Ａｌａ交換を伴う改善されたコンセンサス配列を同定した（配列番号５８から６２のコンセンサス配列を参照されたい）。

実施例５：種々のＣＤ４４バリアントに対するＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の結合分析
図２１において示されるように、種々のドメインと組み合わせて、ｖ５ドメインを含む全部で４個の異なるＣＤ４４バリアントを生成した。ＰＨＰアッセイおよびＦＤＧアッセイによって明らかにされたように、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、これらのＣＤ４４バリアントにも結合することができた。ネガティブコントロールとして、ドメイン１から５および１５、１６のみをコードするＣＤ４４バリアントｐＧＫＴ７＿ＣＤ４４を使用した（本明細書では示さず）。期待したように、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、このＣＤ４４タンパク質に対していかなる結合も示さない。

実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＣＤ４４ｖ５発現腫瘍細胞に対するＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質とカップリングされたナノ粒子の結合分析
ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質の診断上および治療上の有効性を強調するために、ペプチドＡ、ＢおよびＣを、Ｈｉｓタグを含むＭＢＰ融合タンパク質として発現させ、量子ドットとカップリングし、ＣＤ４４発現腫瘍細胞の免疫細胞化学的分析のために使用した。

方法：
前記ペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＭＢＰ−（ＹＴＨ＿ｖ５＿Ａ／Ｂ／Ｃ）−Ｈｉｓ_６融合タンパク質として発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィを使用して精製し、そしてＨｉｓ_６タグを介してＱＤＢＰ−６５５量子ドットとカップリングした。これらの量子ドットは、ＣｄＳｅコア、ＺｎＳシェルおよびイミダゾール化合物を含む不動態化層を保有する。

本明細書のようなＱＤＢＰ−６５５ナノ粒子の特質は、以下のように要約され得る：当該ナノ粒子は、セレン化カドミウム［ＣｄＳｅ］コアおよび硫化亜鉛［ＺｎＳ］シェルを有する。当該シェルは、グリシン−ヒスチジン、ヒスチジン−ロイシン、カルノシンからなるジペプチドコーティング、ならびにアミノベンゾフェノンおよび３−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスホニオ］プロピオネート（ＴＨＰＰ）を介して架橋されるアミノＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によって囲まれる。当該ジペプチドコーティングは、そのイミダゾール環を介してシェル構造の亜鉛イオンに協調的に結合される。遊離第一級アミノ基は、カップリング反応のためにジペプチドコーティングにおいて利用可能である。ジペプチドコーティングに関するさらなる情報は、米国特許出願ＵＳ２００３／００５９６３５ Ａ１において開示される。

ＱＤＢＰ−６５５は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）によって販売されている。それは、緩衝液中の赤みがかったコロイド状懸濁液として送達される。当該ナノ粒子は、以下の生成物特質示す：

外観： 赤みがかった透明の液体
流体力学的半径： ６．５ｎｍ以下（サイズ排除クロマトグラフィによって決定される）
分子量： １０００ｋＤａ
最大発光： ６５５ｎｍ±４ｎｍ

カップリング：
発現され、親和性精製したペプチドＡ、ＢまたはＣを、２時間にわたってｐＨ＝８．３の５０ｍＭ ナトリウムボレート（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔ−１０ＫＤａ；（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）に対する透析をする。その後、タンパク質濃度を決定し、溶液を必要とされる濃度に希釈する。以下の表において要約されるように、ＱＤＢＰ−６５５量子ドットおよびタンパク質を、無菌のボロシリケートバイアルにおいて、１：１２．５、１：２５、１：５０、１：７５、および１：１００のＱＤＢＰ−６５５／リガンドの比で０．３μＭ（ＱＤＢＰ−６５５）の終濃度になるように一緒に混合する：

首尾よいカップリングがＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動によって示され、それによって、１：５０またはそれより大きい比は、首尾よいカップリング反応を示す分子量の劇的な増加をもたらす。

免疫細胞化学分析

腫瘍細胞の免疫細胞化学分析を以下のように実行した：
・ コーティングガラス上のそれぞれ５×１０^５個の腫瘍細胞
・ ３７℃、５％ ＣＯ_２で４８時間の培養
・ １ｍＬのＤ−ＰＢＳを用いる３×１分間の細胞の洗浄
・ １ｍｌのジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）溶液（２５０ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおいて２０ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳ、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ８．０）を用いる２０分間の固定
・ １ｍＬのＤ−ＰＢＳを用いる１×１分間の細胞の洗浄
・ Ｄ−ＰＢＳ中の０．２％グリシンにおいて２０分間インキュベーションすることによるクエンチング
・ Ｄ−ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ／５％ヤギ血清において６０分間インキュベーションすることによるブロッキング
・ 室温で５０μｌのあらかじめインキュベーションしたＱｄｏｔ−ペプチド複合体（１００ｎＭ）と共にインキュベーション
・ １ｍＬのＤ−ＰＢＳを用いる３×５分間の細胞の洗浄
・ ５０μｌの一次抗体（抗ＣＤ４４ｖ５：ＶＦＦ−７，１：２５）と共にインキュベーション
・ １ｍＬのＤ−ＰＢＳを用いる３×５分間の細胞の洗浄
・ ５０μｌの二次抗体（ＧＡＭ−Ａ４８８，１：１００）と共にインキュベーション
・ １ｍＬのＤ−ＰＢＳを用いる３×５分間の細胞の洗浄
・ ３００μｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｄ−ＰＢＳにおいて２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて１０分間の対比染色（Ｃｏｎｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ）
・ １ｍＬのＤ−ＰＢＳを用いる３×５分間の細胞の洗浄
・ Ｍｏｗｉｏｌ ４−８８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）に包理

結果：
ペプチドＡ、ＢまたはＣとカップリングされたナノ粒子を、ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６を用いて試験した（図２２を参照されたい）。ペプチド複合体化ナノ粒子を使用するとき、ポジティブコントロールとして抗ＣＤ４４ｖ５抗体によって生成されたような標識と共局在する腫瘍細胞の標識を観察し得た。

要約すると、本発明のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質は、副作用の危険性が減少した治療および診断および癌のための新規な戦略への扉を開く。
特定の実施形態では、本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチド（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質であって、該タンパク質が
（ｉ）配列番号１〜５および配列番号３９〜５２に記載のアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号１〜５および配列番号３９〜５２において示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％そして最も好ましくは９５％の同一性を伴うアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号６〜１０において表されたような配列：「ＰＹＹＧＫＸＬＸ _３ ＹＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ _２ ＳＸＱＸ _{１０〜１４} ＡＩＥ」によって規定されるか、もしくは配列番号５３〜６２において表されたような配列：「ＰＧＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ _２ ^Ｓ ／ _Ａ ＸＱＸ _{１０〜１４} ＡＩＥ」によって規定されるＣＤ４４結合モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を伴うアミノ酸配列であって、Ｘが任意のアミノ酸を意味する、アミノ酸配列；
を含むかまたは前記アミノ酸配列からなり、該タンパク質が１００アミノ酸もしくはそれ未満の長さを有する、タンパク質。
（項目２）
項目１に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質であって、該タンパク質がエキソン９によってコードされるドメインを含むＣＤ４４アイソフォームに結合する、タンパク質。
（項目３）
項目２に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質であって、前記ＣＤ４４アイソフォームが：
ａ）ＣＤ４４ ｖ５、
ｂ）ＣＤ４４ ｖ５〜ｖ６、
ｃ）ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ６、
ｄ）ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ６、
ｅ）ＣＤ４４ ｖ２〜ｖ１０、
ｆ）ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ１０、
ｇ）ＣＤ４４ Ｖ４〜ｖ７、
ｈ）ＣＤ４４ ｖ４〜ｖ１０
からなるリストから選択される、タンパク質。
（項目４）
異種タンパク質またはポリペプチドと複合体化したまたは融合した項目１〜３に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質であって、該ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質が好ましくは前駆体分子からの細胞傷害性物質もしくは細胞増殖抑制性物質の生成または該タンパク質への標識の付着を触媒する酵素である、タンパク質。
（項目５）
ａ）項目１〜４に記載のＣＤｅｘ４４ｅｘ９結合タンパク質；
ｂ）炭水化物、色素分子、放射性同位元素、毒素、細胞増殖抑制性物質、サイトカイン、免疫調節性物質、またはそれらのプロドラッグからなる群から選択される化合物
を含む複合体であって、該化合物が直接的にまたはリンカー分子を介して該ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質と連結される、複合体。
（項目６）
項目１〜４に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
（項目７）
項目６に記載のヌクレオチド配列を包含する発現ベクター。
（項目８）
項目７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目９）
項目１〜４に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を生成する方法であって、該方法が：
ａ）項目１〜４に記載のタンパク質をコードする核酸分子を含む発現コンストラクトを用いて宿主細胞を形質転換する工程；および
ｂ）該ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはそれぞれの融合タンパク質を生成するために適切な条件下で該宿主細胞を培養する工程
を含む、方法。
（項目１０）
項目１〜３に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質と複合体化されたナノ粒子。
（項目１１）
項目４または５に記載の複合体または融合タンパク質と複合体化されたナノ粒子。
（項目１２）
項目１０または１１に記載のナノ粒子であって、少なくとも１つの腫瘍抗原結合物質および／または細胞傷害性物質とさらに複合体化された、ナノ粒子。
（項目１３）
項目１２に記載のナノ粒子であって、前記腫瘍抗原結合物質が、ＣＥＡに対する抗体、ＣＡ−１９−９に対する抗体、アドヘシンであって好ましくは改変されたアドヘシン、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、ナノ粒子。
（項目１４）
項目１０〜１３に記載のナノ粒子であって、該ナノ粒子が、量子ドット、貴金属クラスタ、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）、ブロック共重合体ミセル、ナノセル、デンドリマー、ナノチューブ、ポリマーソーム、ＸＰｃｌａｄ（登録商標）ナノ粒子、結晶性の発光性カルシウムホスフェート層によって囲まれた非晶質シリカからなるナノ粒子、直径が１００ｎｍ未満のＳｉＯ _２ ／Ｚｎ _２ ＳｉＯ _４ ：Ｍｎ ^２＋ およびＳｉＯ _２ ／Ｃａ _１０ （ＰＯ _４ ） _６ ＯＨ：Ｅｕ ^３＋ コアシェルナノ粒子および発光色素で標識されたハイブリッドナノ粒子からなる群から選択される、ナノ粒子。
（項目１５）
項目１０〜１３に記載のナノ粒子であって、該ナノ粒子が無機コアおよびイミダゾール成分を含むコーティング層を有し、該コーティング層を含めた該無機コアの最小の直径が１５ｎｍ以下である、ナノ粒子。
（項目１６）
項目１５に記載のナノ粒子であって、前記イミダゾール成分が少なくとも１つのヒスチジル残基を含むペプチドであり、好ましくはジペプチドである、ナノ粒子。
（項目１７）
項目１６に記載のナノ粒子であって、前記イミダゾール成分が種々のヒスチジルを含有するジペプチドの混合物である、ナノ粒子。
（項目１８）
項目１０〜１７のいずれか１項において記載されるようなナノ粒子であって、該ナノ粒子が非不活性である、ナノ粒子。
（項目１９）
自己免疫疾患（例えば、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、シェーグレン症候群または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））；乾癬またはアトピー性皮膚炎のような皮膚疾患；慢性炎症性疾患（例えば、関節リウマチまたは炎症性腸疾患）；組織傷害；アレルギー疾患および癌疾患からなる群から選択された疾患の診断または処置において使用するための項目１〜４のいずれか１項において記載されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質または項目１０〜１８のいずれかにおいて記載されるようなナノ粒子。
（項目２０）
造影剤を調製するための使用のための項目１９に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子。
（項目２１）
項目２０において記載されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子であって、前記造影剤がｉｎ ｓｉｔｕの細胞において癌細胞または癌腫を識別するために使用される、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子。
（項目２２）
項目２１において記載されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子であって、識別される前記癌細胞が：
ａ）線癌細胞；
ｂ）胸腺上皮腫瘍細胞；
ｃ）子宮頸癌細胞；
ｄ）非ホジキン（ｎｏｎ−Ｈｏｄｋｉｎ）リンパ腫細胞；
ｅ）肺細胞癌腫細胞；
ｆ）膵臓癌細胞；および
ｇ）癌幹細胞
からなるリストから選択される、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子。
（項目２３）
項目１〜４のいずれか１項において記載されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質または項目１０〜１８のいずれか１項において記載されるようなナノ粒子、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目２４）
ａ）個々に服用される薬品、および
ｂ）患者に投与される該薬品の作用、副作用、相互作用、代謝、吸収、分散、代謝および排出に関連する患者固有の性質に関する診断指示システム
を含む薬品／線量計の組み合わせパッケージであって、
該患者固有の性質が、内在性物質、調節機構、遺伝子または指示システムからなる群から選択され、
該薬品または該診断指示システムが、項目１〜４に記載のＣＤ４４ ｅｘ９結合タンパク質または項目１〜１８のいずれか１項において記載されるようなナノ粒子を含む、薬品／線量計の組み合わせパッケージ。

Claims (24)

1. ヒトＣＤ４４のエキソン９によってコードされるポリペプチド（ＣＤ４４ｅｘ９）に結合するタンパク質であって、該タンパク質が
   （ｉ）配列番号１〜５および配列番号３９〜５２に記載のアミノ酸配列；または
   （ｉｉ）配列番号１〜５および配列番号３９〜５２において示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％そして最も好ましくは９５％の同一性を伴うアミノ酸配列；または
   （ｉｉｉ）配列番号６〜１０において表されたような配列：「ＰＹＹＧＫＸＬＸ_３ＹＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ＳＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ」によって規定されるか、もしくは配列番号５３〜６２において表されたような配列：「ＰＧＬＱＰＳＦＡＶＱＶＸ_２ ^Ｓ／_ＡＸＱＸ_{１０〜１４}ＡＩＥ」によって規定されるＣＤ４４結合モチーフと少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％もしくは１００％の同一性を伴うアミノ酸配列であって、Ｘが任意のアミノ酸を意味する、アミノ酸配列；
   を含むかまたは前記アミノ酸配列からなり、該タンパク質が１００アミノ酸もしくはそれ未満の長さを有する、タンパク質。
2. 請求項１に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質であって、該タンパク質がエキソン９によってコードされるドメインを含むＣＤ４４アイソフォームに結合する、タンパク質。
3. 請求項２に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質であって、前記ＣＤ４４アイソフォームが：
   ａ）ＣＤ４４ ｖ５、
   ｂ）ＣＤ４４ ｖ５〜ｖ６、
   ｃ）ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ６、
   ｄ）ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ６、
   ｅ）ＣＤ４４ ｖ２〜ｖ１０、
   ｆ）ＣＤ４４ ｖ３〜ｖ１０、
   ｇ）ＣＤ４４ Ｖ４〜ｖ７、
   ｈ）ＣＤ４４ ｖ４〜ｖ１０
   からなるリストから選択される、タンパク質。
4. 異種タンパク質またはポリペプチドと複合体化したまたは融合した請求項１〜３に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質であって、該ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質が好ましくは前駆体分子からの細胞傷害性物質もしくは細胞増殖抑制性物質の生成または該タンパク質への標識の付着を触媒する酵素である、タンパク質。
5. ａ）請求項１〜４に記載のＣＤｅｘ４４ｅｘ９結合タンパク質；
   ｂ）炭水化物、色素分子、放射性同位元素、毒素、細胞増殖抑制性物質、サイトカイン、免疫調節性物質、またはそれらのプロドラッグからなる群から選択される化合物
   を含む複合体であって、該化合物が直接的にまたはリンカー分子を介して該ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質と連結される、複合体。
6. 請求項１〜４に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
7. 請求項６に記載のヌクレオチド配列を包含する発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
9. 請求項１〜４に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質を生成する方法であって、該方法が：
   ａ）請求項１〜４に記載のタンパク質をコードする核酸分子を含む発現コンストラクトを用いて宿主細胞を形質転換する工程；および
   ｂ）該ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはそれぞれの融合タンパク質を生成するために適切な条件下で該宿主細胞を培養する工程
   を含む、方法。
10. 請求項１〜３に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質と複合体化されたナノ粒子。
11. 請求項４または５に記載の複合体または融合タンパク質と複合体化されたナノ粒子。
12. 請求項１０または１１に記載のナノ粒子であって、少なくとも１つの腫瘍抗原結合物質および／または細胞傷害性物質とさらに複合体化された、ナノ粒子。
13. 請求項１２に記載のナノ粒子であって、前記腫瘍抗原結合物質が、ＣＥＡに対する抗体、ＣＡ−１９−９に対する抗体、アドヘシンであって好ましくは改変されたアドヘシン、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、ナノ粒子。
14. 請求項１０〜１３に記載のナノ粒子であって、該ナノ粒子が、量子ドット、貴金属クラスタ、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）、ブロック共重合体ミセル、ナノセル、デンドリマー、ナノチューブ、ポリマーソーム、ＸＰｃｌａｄ（登録商標）ナノ粒子、結晶性の発光性カルシウムホスフェート層によって囲まれた非晶質シリカからなるナノ粒子、直径が１００ｎｍ未満のＳｉＯ_２／Ｚｎ_２ＳｉＯ_４：Ｍｎ^２＋およびＳｉＯ_２／Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６ＯＨ：Ｅｕ^３＋コアシェルナノ粒子および発光色素で標識されたハイブリッドナノ粒子からなる群から選択される、ナノ粒子。
15. 請求項１０〜１３に記載のナノ粒子であって、該ナノ粒子が無機性のコアおよびイミダゾール成分を含むコーティング層を有し、該コーティング層を含めた該無機性のコアの最小の直径が１５ｎｍ以下である、ナノ粒子。
16. 請求項１５に記載のナノ粒子であって、前記イミダゾール成分が少なくとも１つのヒスチジル残基を含むペプチドであり、好ましくはジペプチドである、ナノ粒子。
17. 請求項１６に記載のナノ粒子であって、前記イミダゾール成分が種々のヒスチジルを含有するジペプチドの混合物である、ナノ粒子。
18. 請求項１０〜１７のいずれか１項において請求されるようなナノ粒子であって、該ナノ粒子が非不活性である、ナノ粒子。
19. 自己免疫疾患（例えば、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、シェーグレン症候群または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））；乾癬またはアトピー性皮膚炎のような皮膚疾患；慢性炎症性疾患（例えば、関節リウマチまたは炎症性腸疾患）；組織傷害；アレルギー疾患および癌疾患からなる群から選択された疾患の診断または処置において使用するための請求項１〜４のいずれか１項において請求されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質または請求項１０〜１８のいずれかにおいて請求されるようなナノ粒子。
20. 造影剤を調製するための使用のための請求項１９に記載のＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子。
21. 請求項２０において請求されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子であって、前記造影剤がｉｎ ｓｉｔｕの細胞において癌細胞または癌腫を識別するために使用される、ナノ粒子。
22. 請求項２１において請求されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子であって、識別される前記癌細胞が：
    ａ）線癌細胞；
    ｂ）胸腺上皮腫瘍細胞；
    ｃ）子宮頸癌細胞；
    ｄ）非ホジキン（ｎｏｎ−Ｈｏｄｋｉｎ）リンパ腫細胞；
    ｅ）肺細胞癌腫細胞；
    ｆ）膵臓癌細胞；および
    ｇ）癌幹細胞
    からなるリストから選択される、ＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質またはナノ粒子。
23. 請求項１〜４のいずれか１項において請求されるようなＣＤ４４ｅｘ９結合タンパク質または請求項１０〜１８のいずれか１項において請求されるようなナノ粒子、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
24. ａ）個々に服用される薬品、および
    ｂ）患者に投与される該薬品の作用、副作用、相互作用、代謝、吸収、分散、代謝および排出に関連する患者固有の性質に関する診断指示システム
    を含む薬品／線量計の組み合わせパッケージであって、
    該患者固有の性質が、内在性物質、調節機構、遺伝子または指示システムからなる群から選択され、
    該薬品または該診断指示システムが、請求項１〜４に記載のＣＤ４４ ｅｘ９結合タンパク質または請求項１〜１８のいずれか１項において請求されるようなナノ粒子を含む、薬品／線量計の組み合わせパッケージ。

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