CN112292153A - 调节肝内皮细胞开窗的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供用于调节肝内皮细胞的开窗孔隙率、开窗频率或开窗直径的组合物和方法。特别地，包含量子点和治疗剂的缀合物的组合物用于调节肝内皮细胞的开窗孔隙率、频率或直径。

Description

调节肝内皮细胞开窗的组合物和方法
技术领域
本申请涉及量子点和治疗剂的缀合物用于调节肝窦状内皮细胞的开窗孔隙率和频率中的一个或两个的用途，例如用于治疗与年龄相关的功能减退。
相关申请
本申请基于并要求于2017年12月4日提交的澳大利亚临时专利申请号2017904879的优先权，其内容整体援引加入本文。
背景技术
大多数疾病随着年龄的增长呈指数增长，因此，衰老被确定为疾病的最重要危险因素。75岁以上的人中大约四分之三患有糖尿病或糖尿病前期和/或高脂血症。这些是确定的心血管预后危险因素，也被认为是老年性疾病如痴呆、肌肉减少症、虚弱和骨质疏松的危险因素。
肝脏的微循环具有独特的形态，可促进肝窦内肝细胞和血液之间底物的双向交换。肝窦状内皮细胞(LSEC)的细胞质延伸非常薄，并被称为窗孔的跨细胞孔穿孔。LSEC表面的2-20％被窗孔覆盖，它们散布在整个内皮表面，或者成簇并划分为筛板。由于没有隔膜或基底膜，窗孔将LSEC转变为高效的超滤系统或“筛”，从而可以无障碍地传输溶解的颗粒状底物。由于其高效率，窗孔对正常健康肝脏中底物转移的影响极小。
随着年龄的增长，肝窦的所有细胞(包括LSEC，星状细胞和Kupffer细胞)中的年龄相关的功能都会持续减退。最值得注意的是，老龄LSEC的孔隙率(窗孔穿孔的LSEC表面积的百分比)显著降低50％、LSEC的横截面厚度也增加类似的50％。这种与年龄相关的“伪毛细血管化”是衰老的特征，并且在小鼠，非人类灵长类动物和人类以及转基因维尔纳氏综合症(过早衰老)小鼠中都没有与年龄相关的肝细胞病理或星状细胞激活的情况下发生。
本发明人已经观察到许多药物可以用于调节肝窦状内皮细胞的开窗孔隙率和频率中的一个或两个。另外，本发明人已经开发靶向肝窦状内皮细胞的量子点，并且可以用于将药物靶向递送至肝窦状内皮细胞。
发明内容
在第一方面，本申请提供一种用于调节受试者内皮细胞的开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的组合物，所述组合物包含治疗缀合物，所述治疗缀合物包含量子点和治疗剂，所述治疗剂选自内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、钙通道阻滞剂、肌动蛋白破坏剂、脂质筏破坏剂、5-HT受体激动剂、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)或其组合。
量子点可以是Ag2S、InP/ZnS或CuInS/ZnS量子点。
受试者可以是老年受试者或患有与年龄相关的疾病或病况的受试者。
量子点的平均直径可以是约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8mn，9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm或20nm。治疗缀合物可以是单分散的。
内皮素受体拮抗剂可以选自波生坦(bosentan)、西他生坦(sitaxentan)、安利生坦(ambrisentan)、阿曲生坦(atrasentan)、齐泊替坦(zibotentan)、马西替坦(macitentan)、替唑生坦(tezosentan)和艾多南坦(edonentan)。
磷酸二酯酶(PDE)抑制剂可以选自西地那非(sildenafil)或其活性类似物、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、乌地那非(udenafil)和阿伐那非(avanafil)。
钙通道阻滞剂可以选自氨氯地平(amlodipine)、阿雷地平(aranidipine)、阿折地平(azelnidipine)、巴尼地平(barnidipine)、贝尼地平(benidipine)、西尼地平(cilnidipine)、氯维地平(clevidipine)、依福地平(efonidipine)、非洛地平(felodipine)、依拉地平(isradipine)、拉西地平(lacidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、马尼地平(manidipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、普拉地平(pranidipine)、芬地林(fendiline)。在另一个实施方案中，钙通道阻滞剂是氨氯地平。
肌动蛋白破坏剂可以选自细胞松弛素(cytochalasin)、latrunculin、jasplakinolid、鬼笔环肽(phalloidin)和swinholide。
脂质筏破坏剂可以选自非律平(filipin)、7-酮胆固醇(7-ketocholesterol,7KC)和甲基-β-环糊精。
5-HT受体激动剂可以选自2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine)(DOI)、氟哌啶醇(haloperidol)、阿立哌唑(aripiprazole)、阿塞那平(asenapine)、丁螺环酮(buspirone)、沃替西汀(vortioxetine)、齐拉西酮(ziprasidone)、哌醋甲酯(methylphenidate)、二氢麦角胺(dihydroergotamine)、麦角胺(ergotamine)、methysergide、阿莫曲普坦(almotriptan)、依来曲普坦(eletriptan)、夫罗曲普坦(frovatriptan)、那拉普坦(naratriptan)、利扎曲普坦(rizatriptan)、舒马曲坦(sumatriptan)、佐米曲普坦(zolmitriptan)、育亨宾(yohimbine)、lasmiditan、那拉普坦(naratriptan)、蟾毒色胺(bufotenin)、麦角新碱(egonovine)、麦角乙脲(lisuride)、LSD、麦斯卡林(mescaline)、肉豆蔻醚(myristicin)、二甲-4-羟色胺(psilocin)、赛洛西宾(psilocybin)、芬氟拉明(fenfluramine)、MDMA、去甲芬氟拉明(norfenfluramine)、哌醋甲酯(methylphenidate)、麦角新碱(ergonovine)、氯卡色林(lorcaserin)、tazodone、甲基5-HT、qipazine、西尼必利(cinitapride)、西沙必利(cisapride)、达佐必利(dazopride)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、莫沙必利(mosapride)、普卢卡必利(prucalopride)、伦扎必利(renzapride)、替加色罗(tegaserod)、扎考必利(zacopride)、麦角胺(ergotamine)和缬草烯酸(valerenic acid)。
在第二方面，本申请提供一种调节受试者的内皮细胞开窗、孔隙率、直径和频率中的一个或多个的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一方面的组合物。
受试者可以是老年受试者或患有与年龄相关的疾病或病况的受试者。与年龄有关的疾病或病况可以选自动脉粥样硬化、心血管疾病、关节炎、白内障、与年龄相关的黄斑变性、听力损失、骨质疏松、骨关节炎、2型糖尿病、高血压、帕金森氏病、痴呆、阿尔茨海默病、年龄相关的肝脏微循环改变、年龄相关的血脂异常、胰岛素抵抗、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。
受试者可以是患有与减少的内皮细胞的开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个有关的疾病或病况的受试者。
治疗剂或治疗缀合物可以与内皮细胞结合(associate)，例如治疗缀合物可以选择性地与内皮细胞结合。在一些实施方案中，内皮细胞是肝内皮细胞。
所述调节可以是内皮细胞的开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的增加。例如，增加可以是至少5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在第三方面，本申请提供包含量子点和治疗剂的治疗缀合物在制备用于调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的药物中的用途。
在第四方面，本申请提供一种调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、钙通道阻滞剂、肌动蛋白破坏剂、脂质筏破坏剂、5-HT受体激动剂、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)或其组合。
内皮素受体拮抗剂可以选自波生坦、西他生坦、安利生坦、阿曲生坦、齐泊替坦、马西替坦、替唑生坦和艾多南坦。
磷酸二酯酶(PDE)抑制剂可以选自西地那非或其活性类似物、他达拉非、伐地那非、乌地那非和阿伐那非。
钙通道阻滞剂可以选自氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、芬地林。在另一个实施方案中钙通道阻滞剂是氨氯地平。
肌动蛋白破坏剂可以选自细胞松弛素、latrunculin、jasplakinolid、鬼笔环肽和swinholide。
脂质筏破坏剂可以选自非律平、7-酮胆固醇(7KC)和甲基-β-环糊精。
5-HT受体激动剂可以选自2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)、氟哌啶醇、阿立哌唑、阿塞那平、丁螺环酮、沃替西汀、齐拉西酮、哌醋甲酯、二氢麦角胺、麦角胺、methysergide、阿莫曲普坦、依来曲普坦、夫罗曲普坦、那拉普坦、利扎曲普坦、舒马曲坦、佐米曲普坦、育亨宾、lasmiditan、那拉普坦、蟾毒色胺、麦角新碱、麦角乙脲、LSD、麦斯卡林、肉豆蔻醚、二甲-4-羟色胺、赛洛西宾、芬氟拉明、MDMA、去甲芬氟拉明、哌醋甲酯、麦角新碱、氯卡色林、tazodone、甲基5-HT、qipazine、西尼必利、西沙必利、达佐必利、甲氧氯普胺、莫沙必利、普卢卡必利、伦扎必利、替加色罗、扎考必利、麦角胺和缬草烯酸。
在第五方面，本申请提供磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、钙通道阻滞剂、肌动蛋白破坏剂、脂质筏破坏剂、5-HT受体激动剂、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)或其组合在制备用于调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的药物中的用途。
定义
以下是本领域中使用的术语的一些定义，其可能有助于理解本发明的描述。这些旨在作为一般定义，绝不应将本发明的范围限制为仅这些术语，而是为了更好地理解以下描述而提出的。
除非上下文另外要求或有相反的明确说明，否则本文中作为单数形式的整数、步骤或元素列举的本发明的整数、步骤或元素清楚地涵盖所列举的整数、步骤或元素的单数形式和复数形式。
本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的之外还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独地或集合地包括在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组成和化合物，以及所述步骤、特征、组成和化合物中的任何两个或更多个的任何和所有组合。
术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等，并且具有合理的获益/风险比。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1-19中详细描述药学上可接受的盐。有关适用盐的综述，请参见Stahl and Wermuth的Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(Wiley-VCH,2002)。制备本发明化合物的药学上可接受的盐的方法是本领域技术人员已知的。这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而分开制备。本发明化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。这种无机酸的实例有盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可以选自脂肪酸、脂环族酸、芳香酸、杂环羧酸和磺酸类的有机酸，其实例有甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、富马酸、马来酸、丙酮酸、烷基磺酸、芳基磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、甲基磺酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、醋酮酸、双羟萘酸、泛酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羟基丁酸、半乳糖酸和半乳糖醛酸。本发明化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括由锂、钠、钾、镁、钙、铝和锌制成的金属盐，以及由有机碱如胆碱、二乙醇胺、吗啉制成的有机盐。或者，由N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N甲基葡糖胺)、普鲁卡因、铵盐、季铵盐(例如四甲基铵盐)、氨基酸加成盐(例如与甘氨酸和精氨酸形成的盐)制成的有机盐。在固体化合物的情况下，本领域技术人员将理解，本发明化合物，试剂和盐可以以不同的结晶或多晶形式存在，所有这些均旨在落入本发明和指定式的范围内。
本文使用的术语“治疗”、“治疗”和“疗法”是指治愈性疗法，预防性(prophylactic)疗法、缓和疗法和预防性(preventative)疗法。因此，在本公开的上下文中，术语“治疗”涵盖治愈、改善或调节医学病症或其一种或多种相关症状的严重性。
术语“治疗有效量”或“药理有效量”或“有效量”是指足以在被治疗的受试者中产生期望的治疗或药理作用的试剂的量。这些术语是同义的，意在限定每种药物的量，这些量将达到改善疾病严重性的目的和/或使用每种药物单独治疗时的发病频率，并且优选地避免或最大程度地减少不良副作用，包括通常与其他疗法相关的副作用。本领域技术人员可以使用本领域已知的信息和常规方法确定有效剂量。
“药物载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于任何生理缓冲(即，pH 7.0-7.4)媒介，包括合适的水溶性有机载体、常规溶剂、分散介质、填料、固体载体、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。合适的水溶性有机载体包括但不限于盐水、右旋糖、玉米油、二甲基亚砜和明胶胶囊。其他常规添加剂包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、粘合剂如微晶纤维素、纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素、阿拉伯胶、明胶，崩解剂如羧甲基纤维素钠和润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁。
“受试者”包括任何人类或非人类哺乳动物。因此，本发明的化合物除了可用于人类治疗外，还可用于兽医治疗哺乳动物，包括伴侣动物和农场动物，例如但不限于狗、猫、马、牛、羊和猪。在优选的实施方案中，受试者是人。
在本说明书的上下文中，术语“给药(administering)”以及该术语的变体包括“给药(administer)”和“给药(administration)”，包括通过任何合适的方式与受试者接触、施加、递送或提供治疗剂、QD、治疗剂QD缀合物或组合物。
在本说明书的上下文中，术语“与...结合(associate with)”是指治疗剂、QD或QD-缀合物与另一种元素例如LSEC排列，以形成群组。例如，当QD或QD-缀合物接触LSEC或通过内吞作用被LSEC内化，将发生QD或QD-缀合物与LSEC的结合。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或诸如“包括”或“含有”的变体，应当理解为暗示包含所述的元素、整数或步骤或元素、整数或步骤组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或元素、整数或步骤组。
本说明书中已经包括的对文件、行为、材料、装置、条款等的任何讨论仅是为了提供本发明的上下文的目的。不应认为是承认这些事项在本说明书的每个权利要求的优先权日之前已经存在，使任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者是与本发明有关的领域中的公知常识。
附图说明
图1.在幼龄小鼠和老龄小鼠的LSEC窗孔和筛板上靶向NO依赖性途径的药物处理效果。比例尺为1μm。
图2.肌动蛋白或脂质筏破坏剂，死亡受体启动子和烟酰胺单核苷酸对幼龄小鼠和老龄小鼠窗孔的影响。比例尺为1μm。
图3.所有药物处理对(A)幼龄小鼠和(B)老龄小鼠的开窗孔隙率的影响。
图4.所有药物处理对(A)幼龄小鼠和(B)老龄小鼠的窗孔直径的影响。
图5.所有药物处理对(A)幼龄小鼠和(B)老龄小鼠的开窗频率(数目/μm2)的影响。
图6.对照组和NMN处理的小鼠的窗孔直径直方图的百分比频率。每个数据点代表从n＝2小鼠收集的3390-4440窗孔原始数据点的总和。
图7.Ag2S量子点的透射电子显微镜图像。比例尺为200nm。
图8.Ag2S QD的高分辨率透射电子显微镜图像显示框中发展良好的晶格(A)，平均直径约为7nm(B)。
图9.孵育15分钟(A)和1小时(B)后，用Ag2S量子点标记LSEC。比例尺为500nm。
图10.的Ag2S量子点(图中可视为黑点)标记肝脏切片。比例尺为500nm。
图11.药物处理对幼龄小鼠和年老小鼠LSEC开窗孔隙率和频率的影响。(A)幼龄小鼠中药物处理的样品SEM图像。显示的是1μm的比例尺。对照图显示窗孔以筛板(*)分组。波生坦、TRAIL、氨氯地平、西地那非和细胞松弛素D处理可维持筛板。(B)在幼龄小鼠(白色柱)和年老(灰色柱)小鼠中进行药物处理后，开窗％孔隙率和(C)频率(每1μm2的数量；灰色柱)的变化。
图12.各种药物处理对LSEC窗孔直径的影响。(a)在幼龄小鼠(白色柱)和老龄(灰色柱)小鼠中，各种药物处理引起的窗孔直径变化。药物处理：辛伐他汀、波生坦、TRAIL、西地那非、氨氯地平、NMN、7-酮胆固醇、细胞松弛素D和DOI。使用包含或不包含溶解的药物的RPMI，所有处理均在37℃，5％CO2下孵育30分钟。使用10,000x的SEM图像对窗孔直径进行手动计数。呈现相对于与对照基线相比％变化的数据。每个数据点代表8张图像的平均值±SD，其中每个处理使用616-3312窗孔原始数据点。所有小于30nm的窗孔和大于300nm的间隙不包括在分析中。*与幼龄对照组相比，P<0.05；#显示与老龄对照组相比P<0.05。使用Kruskal-Wallis和post-hoc Dunn检验进行统计，以比较各组，所有组的n＝3。(b)用NMN和7-酮胆固醇药物处理幼龄小鼠和老龄小鼠的样品SEM图像。显示1μm的比例尺。7-酮胆固醇处理存在间隙(#)(>300nm)。NMN处理维持筛板，而7-酮胆固醇处理减少脂质筏面积。(c)幼龄对照组(白色柱)，老龄对照组(黑色柱)，幼龄NMN(浅灰色)，老龄NMN(深灰色)，幼龄7-酮胆固醇(浅蓝色)和老龄7-酮胆固醇(蓝色)的窗孔直孔直方图。使用所示采集范围内的直径百分比频率显示数据。
图13.幼龄小鼠的孔隙率与频率、细胞活力和剂量反应曲线之间的相关性(a)幼龄小鼠和老龄小鼠的孔隙率百分比与频率之间的相关图。数据显示所有处理数据点(每组n＝3；20组)。(b)细胞活力相对于对照的百分比。重复三次，收集样品数据，误差线显示SD(c)相对于窗孔％孔隙率变化的剂量浓度曲线。显示幼龄小鼠的数据，药物浓度显示为对数函数。
图14.药物处理对肌动蛋白细胞骨架，一氧化氮合酶和环状GMP的影响。(A)dSTORM图像显示在幼龄小鼠中各种药物处理促进的肌动蛋白细胞骨架形态变化。收集40,000个图像之后生成图像，使用RapidSTORM软件处理(45)。比例尺显示为5μm，插入图显示肌动蛋白内的间隙和单独的窗孔。(B)在幼龄小鼠中由药物处理引起的肌动蛋白密度测定的变化。数据以每1μm2的像素密度的条形图表示(平均值±SD)。使用dSTORM显微镜捕获8张图像(样本图像显示在A中)；数据分析使用Image J软件进行。将图像转换为二进制数据，并在整个细胞中进行测量。(C)在幼龄小鼠中通过药物处理诱导的NOS光密度测定的变化。数据以每1μm2的像素密度的条形图表示(平均值±SD)。使用dSTORM显微镜捕获5张图像；数据分析使用Image J软件进行。将图像转换为二进制数据，并在整个细胞中进行测量。*使用Kruskal-Wallis和post-hoc Dunn检验进行组间比较时显示P<0.05，将数据复制到第二只小鼠中以确认观察结果。(D)细胞内cGMP，数据以pmol/106显示，误差线显示SD。生物学测定重复三次。***使用Kruskal-Wallis和post-hoc Dunn检验在两组之间进行比较，显示P<0.001。(E)LSEC的免疫荧光图像，染色的磷酸化NOS(绿色)和NOS(红色)。比例尺：30μm。对照，NMN和细胞松弛素D表现出最小的染色，西地那非处理促进磷酸化NOS和NOS的共定位(白色箭头)。
图15.Ag2S量子点在肝细胞中的定位。
具体实施方式
肝窦样内皮细胞的年龄相关性伪毛细血管化有助于血脂异常和胰岛素抵抗。健康的LSEC有效促进底物向肝细胞的转移，因此在肝功能和清除的生理模型中，血管系统的作用通常被忽略。历史上，已经在肝硬化和纤维化中研究了LSEC在底物转移中的作用，其中随着老龄，窗孔损失(与在老龄中未见的其他变化有关)。与肝病相关的窗孔损失会导致内皮转移减少，以及白蛋白、各种药物，胆汁盐和脂蛋白的肝清除率降低，这证实窗孔损失会影响底物转移。
窗孔的直径为50-150nm，允许较小的脂蛋白(包括乳糜微粒残留物)通过，而排除较大的颗粒(例如乳糜微粒和血小板)。老龄与乳糜微粒残留的肝清除功能受损及其餐后高甘油三酯血症的临床表现有关。后者与不良心血管和微血管临床结局密切相关。
图1显示一个实例，显示与经典血脂异常相比，老龄小鼠中LSEC心血管预后的窗孔和孔隙率与年龄相关的降低。在被灌注的大鼠肝脏中使用多指标稀释法，我们发现，在老龄小鼠的肝脏中，脂蛋白(平均直径53nm)在LSEC上的转移几乎完全被消除。这提供与年龄有关的血脂异常和餐后高脂血症的机制，其被认为是与年龄有关的高脂血症的重要因素。发明人认为，维持开窗孔隙率到老龄的策略可以减轻血脂异常，并提供预防老年人心血管和微血管疾病的手段。
老龄与胰岛素抵抗和糖尿病风险显著增加有关。在被灌注肝脏中的多指标稀释法已证实，在老龄小鼠中，跨LSEC的胰岛素转移受到损害。老龄小鼠肝脏的胰岛素分布量明显减少，这与胰岛素对血管空间的限制相一致。整个动物的胰岛素和葡萄糖摄取研究证实了这一点，该研究表明老龄小鼠的肝胰岛素摄取减少。蛋白质印迹和肝脏磷蛋白组学分析还显示，老龄的胰岛素受体(IRS-1)活化和胰岛素途径活化一致降低。对葡萄糖耐量、稳态模型评估指数(HOMA-IR)、胰岛素、C肽和胰高血糖素的血药水平的测量表明，肝脏中胰岛素作用的降低与胰岛素和葡萄糖代谢的系统性损伤有关。这些发现揭示窗孔在肝胰岛素转移中起着至关重要的作用，与其他对开窗过度(hyper-fenestrated)的PDGF-B缺陷小鼠的研究一致。这些小鼠的窗孔增加与跨内皮运输增加、循环胰岛素水平显著降低、胰岛素清除率增加和胰岛素敏感性提高有关。
总之，这些研究提供了令人信服的证据，证明窗孔促进肝脏中胰岛素的转移。相反地，与年龄相关的伪毛细血管化有关的窗孔损失，通过损害脂蛋白和胰岛素从窦状血液穿越内皮细胞到肝细胞的转移并增加了窗孔，导致与年龄相关的血管疾病的显著风险因素-血脂异常和胰岛素抵抗。
在没有其他衰老变化的情况下，窗孔的急性损失会导致血脂异常和胰岛素抵抗。衰老是一个复杂的过程，导致许多细胞途径受损。为了检验与年龄相关的窗孔损失导致血脂异常和胰岛素抵抗的假说，发明人旨在评估在没有其他衰老变化的情况下急性窗孔损失的影响。使用表面活性剂poloxamer 407(P407)进行测试，发现该表面活性剂在单次腹膜内注射后24小时内引起30-80％的窗孔损失(defenestration)。P407的使用引起循环脂蛋白(尤其是甘油三酯和乳糜微粒残留物)的10倍增加，同时阻止小乳糜微粒跨LSEC转移。在最近的胰岛素研究中，已经发现P407阻止胰岛素通过LSEC，从而导致胰岛素受体底物(IRS-1)的磷酸化降低，并伴有系统性胰岛素抵抗(HOMA-IR升高)。这些结果证实窗孔在衰老中对人类肝功能和系统性健康的关键作用。
肝窦状内皮中的窗孔受到脂质筏的调节。为了开发可成药的靶标，通过药物疗法维持窗孔进入老龄，我们进一步研究调节窗孔及其密度的邻近生物学过程。已知最有效的增加窗孔的药物是VEGF和各种肌动蛋白细胞骨架破坏剂，它们相互关联，因为VEGF通过其对肌动蛋白细胞骨架的作用而发挥作用。
包含窗孔的筛板插在膜的加厚区域(脂质筏)之间。使用脂质筏荧光染料(BodipyFL C5神经节苷脂GM1)进行的3D-SIM研究发现，筛板和脂质筏之间存在非常强的逆向分布，窗孔和筛板仅在非脂筏细胞膜中发现。
如本文所公开的，7-酮胆固醇(其消耗脂质筏)和/或细胞松弛素D(一种肌动蛋白破坏剂)增加窗孔并且减少筏，而Triton X-100减少窗孔并且增加筏。重要的是，Tricha X-100的共同施用消除细胞松弛素D对窗孔的作用，证明肌动蛋白破坏直接通过其对膜筏的作用而增加窗孔。VEGF消耗脂质筏并增加窗孔。
该结果与筛-筏相互作用模型一致，筛-筏相互作用模型中，一旦肌动蛋白细胞骨架和膜中的筏的膜稳定作用减弱，窗孔就在内皮细胞的非脂筏区域形成。
尽管不希望受到任何理论的束缚，但据信大多数影响窗孔的试剂要么是通过其对肌动蛋白细胞骨架(VEGF)的作用，诸如波生坦和DOI(2,5-二甲氧基-4碘安非他明)的血管活性剂，要么是通过对脂质筏的直接作用(7酮胆固醇，TritonX100)。因此，脂质筏或肌动蛋白细胞骨架对脂质筏的调节是影响窗孔的治疗靶标。
开发药物疗法的基本挑战是将活性剂靶向所需的细胞类型或组织。幸运的是，LSEC具有独特的特性，可以用作可成药的靶标。LSEC是体内最活跃，最有效的内吞细胞，是负责清除多种血液运输的废物大分子(例如透明质酸，免疫球蛋白)的主要细胞类型。LSEC密布有网格蛋白包被的囊泡和多种内吞性受体(例如甘露糖受体，稳定蛋白受体，Fcγ受体IIb2)。这种内吞机器在吸收和降解内源性和外源性废物(包括所有主要类别的生物大分子)方面非常高效。
发明人发现7nm的CdTe/CdS(碲化镉/硫化镉)量子点几乎在给药的几个小时内被LSEC吸收。然而，与基于镉的量子点有关的一个主要问题是它们的毒性。
如本文所公开的，基于硫属元素化物的银的量子点比CdTe/CdS量子点的毒性要小得多，该量子点已被用于标记或靶向LSEC。特别地，可以将改变LSEC中开窗孔隙率和频率的治疗剂与基于硫族化物的量子点结合，并靶向肝脏。
总之，本发明人已经建立方法，通过使用单独或与治疗剂结合的Ag2S量子点靶向LSEC来改变与LSEC及其窗孔中脂蛋白的年龄相关变化以及胰岛素活性的年龄相关变化。发明人还确定，各种未缀合的治疗剂可用于调节LSEC窗孔的年龄相关变化。
量子点
量子点(QD)是小的半导体颗粒，通常最大平均直径约为50nm，由于它们的小尺寸，其光学和电子特性不同于相同材料的较大颗粒。LSEC的独特功能是QD通过内吞作用被LSEC吸收。因此，在本文描述的方法和组合物中可以使用任何类型的QD。例如，量子点可以是核型量子点，核-壳型量子点或合金量子点。在一些实施方案中，QD优选对人无毒或毒性有限。
在一些实施方案中，QD不含重金属。例如，不含重金属的QD可以是Ag2S、InP/ZnS(磷化铟/硫化锌)或CuInS/ZnS(硫铟铜/硫化锌)QD。
核型量子点
量子点可以是具有均匀内部组成的单组分材料，例如诸如镉、铅或锌的金属的硫属元素化物(硒化物、硫化物或碲化物)，例如CdTe(碲化镉)或PbS(硫化铅)。
核-壳量子点
量子点可以是核-壳QD。核-壳QD可以通过本领域已知的任何方法来制备。这样的方法通常涉及在核周围生长具有更高带隙半导体材料的壳。例如，核-壳QD可具有在核中的CdSe和在壳中的ZnS。带有壳层的量子点涂层可通过钝化非辐射复合位点来提高量子产率，并使它们对处理条件更稳定。在一些实施方案中，无毒壳可以在包含有毒材料的核周围生长。
合金量子点
量子点可以是包含多种材料的合金QD。合金QD是通过将两种具有不同带隙能量的半导体合金化而形成的，它们具有不仅不同于其本体或其母体半导体特性的有趣性能。例如，组合物CdSxSe1-x/ZnS的合金量子点可用于本文所述的方法和组合物中。
QD的制备
可以提供或制备QD以用于本文所述的组合物和方法。可以使用任何方法来制备QD，包括胶体合成、等离子体合成、组装和电化学组装。
胶体合成
胶体合成包括将前体材料的溶液加热到足以使前体分解以形成单体的温度，该单体随后成核并产生纳米晶体。温度是确定QD形成和生长的最佳条件的重要因素，温度必须足够高以允许原子重排和退火，同时允许晶体生长。在晶体生长期间还必须控制单体的浓度。
有胶体方法可以生产硫化铅、硒化铅、硒化镉、硫化镉、碲化镉、砷化铟、磷化铟、硫化银和硫硒化镉的QD。这些QD可以包含少至100-100,000个原子，并且直径约为1、2、3、4、5、6、7、8、9或约10nm。
可以通过胶体合成来合成大批QD，从而允许以适合商业应用的量生产QD。
等离子体合成
也可以通过已知的等离子体技术(例如离子溅射和等离子体增强化学气相沉积(PECVD))来生产QD。例如，可以通过离子溅射来制造CuInSe2、ZnO、Si、SiC、GaAs、GaSb的QD，并且可以通过PECVD来制造Si、Ge、GaN和InP的QD。
组装
也可通过自组装产生可用于本文所述的组合物和方法的QD。在一些实施方案中，此类QD具有约5nm至约50nm的平均直径。在一些实施方案中，可以通过光刻图案化的栅电极或通过蚀刻半导体异质结构中的二维电子气来限定QD。
在一些实施方案中，QD可以自组装。例如，当在晶格不匹配的基板上生长材料时，在分子束外延(MBE)和金属有机气相外延(MOVPE)期间，QD可以在某些条件下自发成核。产生的应变在二维润湿层的顶部产生相干应变的岛。随后可以将这些岛掩埋以形成量子点。
单个量子点可以由存在于长程掺杂的量子阱或称为横向量子点的半导体异质结构中的二维电子或空穴气体产生。样品表面涂有一层薄薄的抗蚀剂。然后通过电子束光刻在抗蚀剂中限定侧向图案。然后可以通过蚀刻或沉积允许外部施加的金属电极，将该图案转移到电子或空穴气体中。
电化学组装
QD的有序阵列可以通过电化学技术自组装。在这些方法中，通过在电解质-金属界面处引起离子反应来创建模板，该模板反应导致纳米结构(包括量子点)自发组装到金属上，然后将其用作掩膜，用于在所选衬底上台面蚀刻纳米结构。
通过以上任何一种方法生产的QD也可以用无毒化合物包被或钝化。例如，硫化铅QD可以被油酸、油胺和羟基配体中的至少一种钝化。钝化还可用于提供可结合治疗剂的基团，以产生本文所述的QD-缀合物。
硫化银(Ag2S)量子点
硫化银(Ag2S)量子点对哺乳动物的毒性很小或没有毒性，也可能具有近红外荧光。Ag2S量子点是疏水的，并且应该被官能化(即，从疏水形式转变成亲水性)以用于治疗方法或与治疗剂结合。Ag2SA量子点具有难以修饰的超晶格结构。
QD可以通过两步法制备，包括：1)从银源和长链硫醇制备疏水性硫化银量子点；2)在极性有机溶剂中用等量或过量的有机硫化合物、硫醇或含巯基的亲水性试剂官能化量子点，使硫化银量子点的表面附着有亲水性基团。
使银源和长链硫醇反应以获得疏水性硫化银量子点。然后，所制备的疏水性硫化银量子点的表面官能化用含硫的亲水性试剂进行。
疏水性硫化银量子点的制备
疏水性硫化银量子点的制备包括以下步骤：
1)在密闭环境中，将含有银源和长链硫醇的混合反应体系加热至50-400℃的反应温度，使其反应时间约为1-10小时以上；以及
2)将混合反应体系冷却至室温，然后加入极性溶剂，离心洗涤，得到疏水量子点；
银源可以是二乙基二硫代氨基甲酸酯、硝酸银、二乙基二硫代氨基甲酸银、二烃基二硫代磷酸银、二辛基磺基琥珀酸银、硫代苯甲酸银、乙酸银、十二烷酸银、十四烷酸银和十八烷酸银中的一种或多种。
长链硫醇可以是辛烷硫醇、十一烷硫醇、十二烷硫醇、十三烷硫醇、十四烷硫醇、十五烷硫醇、十六烷硫醇、十八烷硫醇、二十烷硫醇、己硫醇、1,6-己二硫醇和1,8-辛二硫醇中的一种或多种。
反应温度可以是约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或约400℃。
可以以约5-50℃/min的速率将混合反应体系加热至反应温度。例如，加热速率可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50℃/min。
步骤2中添加的极性溶剂可以为乙醇、甲醇、丙酮和1-甲基-2-吡咯烷酮中的任一种或它们的任意组合。
在一个实施方案中，在加热之前将氧气从混合反应体系中基本上除去。例如，这可以通过将反应体系置于真空下，用氮气或其他气体吹扫或两者结合来实现。在一个实施方案中，将混合反应体系在氮气或其他气体下保持反应时间。
反应时间可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时或更长时间。
通过本文所述的方法制备的疏水性Ag2S量子点具有单斜晶结构，并且平均直径为约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8mn、9nm或10nm。
官能化
本文公开的Ag2S QD可以通过附着在其表面的亲水基团进行官能化。亲水基团衍生自含巯基或硫醇的亲水试剂或有机硫化合物，例如α-硫辛酸(硫辛酸)、半胱氨酸或蛋氨酸。亲水试剂可以是含巯基的亲水试剂，例如巯基乙酸、巯基丙酸、半胱氨酸、半胱胺、硫辛酸和巯基乙酸铵或它们的任何组合。在另一个实施方案中，亲水试剂可以是含硫醇的亲水试剂，例如烷硫醇。烷硫醇可以是辛硫醇、十二烷硫醇、叔十二烷硫醇、二十烷硫醇或其任何组合。在另一个实施方案中，亲水剂可以是有机硫化合物、巯基和含硫醇的亲水试剂的任何组合。在另一个实施方案中，亲水剂是硫辛酸。
在一个实施方案中，亲水试剂的摩尔数大于或等于疏水硫化银量子点的摩尔数。可以根据制备过程中的实际需要调节亲水性试剂与疏水性硫化银量子点的摩尔比。
官能化发生在极性溶剂中。例如，极性有机溶剂可以是环己烷、乙醇、甲醇、丙酮和1-甲基-2-吡咯烷酮中的任何一种或其任何组合。
在一个实施方案中，将疏水QD分散在极性有机溶剂中，并加入亲水试剂，并使该混合体系在约1-80℃下反应约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小时或更长时间。
反应温度可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80℃。
在一些实施方案中，可以在反应期间连续或间歇地超声处理混合体系。
通过本文所述的方法制备的官能化的Ag2S QD是单分散的、不聚集的、亲水的、稳定的并且可以用于标记或靶向肝细胞。特别地，并且参考实施例7，Ag2S QD靶向肝脏，特别是LSEC。在一些实施方案中，Ag2S QD特异性标记LSEC。
治疗缀合物
已知某些化合物(例如7-酮胆固醇和细胞松弛素D)会增加LSEC开窗孔隙率。另外，本文证明诸如西地那非和氨氯地平的其他治疗剂还调节开窗孔隙率、频率和直径中的至少一种。在通过修饰LSEC窗孔来治疗与年龄有关的疾病或衰老的情况下，此类化合物的全身给药可能与不必要或不希望的治疗效果相关。因此，使用治疗剂和Ag2S QD的缀合物靶向治疗剂LSEC是有利的，以避免不必要或不希望的治疗副作用。
标准的缀合化学可用于将官能化的Ag2S QD与治疗剂缀合。治疗剂QD缀合物的制备包括以下步骤：提供QD、提供偶联剂、提供其治疗剂或衍生物，并将混合物孵育以形成粗品治疗剂QD缀合物。或者，可以在添加治疗剂之前使官能化的Ag2S QD与偶联剂反应。
然后可以例如通过过滤或离心来纯化粗品治疗剂QD缀合物，以获得适用于本文所述方法的治疗剂QD缀合物。
在一些实施方案中，治疗剂直接缀合至疏水性Ag2S QD。在其他实施方案中，治疗剂经由有机层与官能化的Ag2S QD缀合，该有机层用于使QD具有亲水性、生物相容性或两者。
可以通过酰胺或酯键将治疗剂与官能化的Ag2S QD偶联。但是应当理解，可以形成其他键(例如，共价和非共价的)。在一个实施方案中，治疗剂以共价、物理、离子配对或范德华相互作用与官能化的Ag2S QD偶联。该键可以由酰胺、酯、硫代酯或硫醇基形成。
可以采用将治疗剂与官能化的Ag2S QD缀合的标准条件。例如，可以在缓冲溶液中在约5分钟至约12小时的时间内发生(官能化的Ag2S QD与偶联剂的偶联或官能化的Ag2S QD与偶联剂和治疗剂的偶联)。例如，偶联可以发生在约5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或约10小时。偶联条件的温度可以为约1℃至约100℃。例如，温度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100℃。
在反应过程中，缀合条件可以是恒定的或变化的。例如，反应可以在恒定温度下进行，或者温度可以在整个反应中变化，或者反应可以在一种或多种条件下逐步改变条件进行。
可以使用偶联剂在QD上的羧基官能团与治疗剂上的羧基或胺基端基之间形成酰胺或酯基。连接剂或偶联剂可包括苯并三唑基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)和碳二亚胺，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲基-氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰胺和磺基-N-羟基琥珀酰胺(NHS)。
在一个实施方案中，偶联剂是NHC、EDC或两者。
在一个实施方案中，可以将带有羧基端基的量子点和治疗剂混合在溶剂中。可以将诸如NHS的偶联剂添加到混合物中。反应混合物可以在高温下孵育。粗品治疗剂QD缀合物可以进行纯化以获得可以在本文的制剂和方法中使用的治疗剂QD缀合物。
可以使用标准的固态纯化方法从未使用的试剂中分离治疗剂QD缀合物。例如，可能需要过滤和用合适的溶剂洗涤，循环几次，以去除过量的未反应的治疗剂和NHS。替代地或另外地，可通过离心将治疗剂QD缀合物沉淀并重新悬浮于合适的溶剂中。
合适的溶剂包括任何生物相容性液体，例如水或缓冲盐水，例如磷酸盐缓冲溶液。
治疗剂
任何治疗剂均可与疏水性Ag2S QD或官能化的Ag2S QD结合。
治疗剂可以是内皮素受体拮抗剂。例如内皮素受体拮抗剂可以选自包括以下的组：波生坦
Figure BDA0002614773870000151
西他生坦、安利生坦、阿曲生坦、BQ-123、齐泊替坦、马西替坦、替唑生坦、BQ-788、192621和艾多南坦。在一个实施方案中内皮素受体拮抗剂是波生坦。
治疗剂可以是磷酸二酯酶(PDE)抑制剂。例如，PDE抑制剂可以选自包括以下的组：氨茶碱、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、对黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱、茶碱、甲基化黄嘌呤、长春西汀、EHNA(赤型9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤)、BAY 60-7550(2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲基]-7-[(1R)-1-羟乙基]-4-苯基丁基]-5-甲基咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4(1H)-酮)、吲哚酮、PDP(9-(6-苯基-2-氧代己基-3-基)-2-(3,4-二甲氧基苄基)-嘌呤-6-酮)、依那美酮、米力农、依诺西酮、阿那格雷、西洛他唑、匹莫苯、美辛苯酮、咯利普兰、异丁司特、匹拉米司特、木犀草素、屈洛维林、鲁氟司特、apremilast、crisaborole、西地那非、西地那非的活性类似物、他达拉非、伐地那非、乌地那非、阿伐那非、双嘧达莫、icariin、4-甲基哌嗪和吡唑并嘧啶7-1和罂粟碱。
在一个实施方案中，PDE抑制剂是西地那非、他达拉非、伐地那非、乌地那非、阿伐那非中的一种或多种。在另一个实施方案中，PDE抑制剂是西地那非。
治疗剂可以是钙通道阻滞剂。例如，钙通道阻滞剂可以选自包括以下的组：氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、芬地林、加洛帕米、维拉帕米、地尔硫卓、咪拉地尔、贝普地尔、氟硝利嗪和氟司必林。
在一个实施方案中，钙通道阻滞剂可以选自包括以下的组：氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、芬地林。在另一个实施方案中，钙通道阻滞剂是氨氯地平。
治疗剂可以是肌动蛋白破坏剂或脂质筏破坏剂。合适的肌动蛋白破坏剂的实例有细胞松弛素、latrunculin、jasplakinolid、鬼笔环肽、swinholide。在一些实施方案中，细胞松弛素选自细胞松弛素A、B、C、D、E、F、H、G、J或其任何组合。在一个实施方案中，细胞松弛素是细胞松弛素D。
脂质筏破坏剂的合适实例有非律平、7-酮胆固醇(7KC)、甲基-β-环糊精。
其他合适的治疗剂包括TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)和烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)。
治疗剂可以是5-HT受体激动剂。例如5-HT受体激动剂治疗剂可以选自包括以下的组：2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)、维拉唑酮(viibryd)、氟西诺聚糖、吉哌隆、氟哌啶醇、伊沙匹隆、喹硫平、曲唑酮、育亨宾、丹多螺酮、阿立哌唑、阿塞那平、丁螺环酮、沃替西汀、齐拉西酮、哌醋甲酯、二氢麦角胺、麦角胺、methysergide、阿莫曲普坦、依来曲普坦、夫罗曲普坦、那拉普坦、利扎曲普坦、舒马曲坦、佐米曲普坦、育亨宾、lasmiditan、那拉普坦、蟾毒色胺、麦角新碱、麦角乙脲、LSD、麦斯卡林、肉豆蔻醚、二甲-4-羟色胺、赛洛西宾、芬氟拉明、MDMA、去甲芬氟拉明、哌醋甲酯、麦角新碱、氯卡色林、tazodone、甲基5-HT、qipazine、西尼必利、西沙必利、达佐必利、甲氧氯普胺、莫沙必利、普卢卡必利、伦扎必利、替加色罗、扎考必利、麦角胺和缬草烯酸。
治疗用途
肝脏内皮细胞有明显的年龄相关变化。例如，肝脏的微循环具有独特的形态，可促进肝窦中肝细胞和血液之间底物的双向交换。肝窦状内皮细胞(LSEC)的细胞质延伸非常薄，并被称为窗孔的跨细胞孔穿孔。LSEC表面的2-20％被窗孔覆盖，它们散布在整个内皮表面，或者成簇并划分为筛板。由于没有隔膜或基底膜，窗孔将LSEC转变为高效的超滤系统，因此成为“筛”，可在尺寸阈值内无阻碍地传输溶解的和颗粒状的底物。由于其高效率，窗孔对正常健康肝脏中底物转移的影响极小。
肝窦的所有细胞(LSEC，星状细胞和Kupffer细胞)都存在着与年龄相关的剧烈但持续的功能退化和结构变化：LSECs,stellate cells and Kupffer cells(Le Couteur,DG,et al.2008.old age and the hepatic sinusoid.Anat Rec(Hoboken)291:672-83)。最值得注意的是，老龄的LSEC的孔隙率(窗孔穿孔的LSEC表面积的百分比)显著降低50％，LSEC的横截面厚度也增加类似的50％。这些形态学改变伴随着许多血管蛋白表达的改变，包括von Willebrands因子、ICAM-1、层粘连蛋白、caveolin-1和各种胶原蛋白。这种与年龄相关的“伪毛细血管化”是大鼠、小鼠、非人类灵长类动物和人类以及转基因维尔纳氏综合征(Werner’s syndrome)(过早衰老)小鼠中衰老的特征。
可以将QD、缀合物或其组合物施用于受试者以调节内皮细胞，特别是肝窦状内皮细胞(LSEC)中的开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个。因此，在一个实施方案中，本申请提供一种调制开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的方法。
在一个实施方案中，本申请提供一种治疗与一种或多种降低的LSEC开窗孔隙率、直径和频率中一个或多个有关的疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的Ag2S QD-治疗缀合物或其组合物。
在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者患有与年龄有关的疾病或病况。
与年龄有关的疾病是随年龄增加而频频出现的任何疾病或病况，并且可能包括衰老过程的后果，例如一个或多个器官的功能下降。年龄相关疾病的例子包括动脉粥样硬化、心血管疾病、关节炎、白内障、与年龄相关的黄斑变性、听力损失、骨质疏松、骨关节炎、2型糖尿病、高血压、帕金森氏病、痴呆、阿尔茨海默病、年龄相关的肝脏微循环改变、年龄相关的血脂异常、胰岛素抵抗、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。
本文所述的QD、治疗剂和治疗缀合物可以以包含药学有效量的化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂(包括载体、媒介物和稀释剂)结合的制剂的形式给药。
术语“赋形剂”在本文中是指用作稀释剂、佐剂或媒介物的任何物质，其本身不是治疗剂，用于将治疗剂递送至受试者或添加至药物组合物中以改善其处理或储存特性或允许或促进形成适合于口服、肠胃外、皮内、皮下或局部应用的固体剂型，例如片剂、胶囊剂或溶液剂或混悬剂。赋形剂可以包括但不限于稀释剂、崩解剂、粘合剂、粘合剂、湿润剂、聚合物、润滑剂、助流剂、稳定剂以及为掩盖或抵消令人讨厌的味道或气味而添加的物质、调味剂、染料、香料以及为改善组合物外观而添加的物质。可接受的赋形剂包括(但不限于)硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、碳酸镁、滑石粉、明胶、阿拉伯胶、藻酸钠、果胶、糊精、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素材料(例如链烷酸和纤维素烷基酯的纤维素酯)、低熔点蜡、可可脂或粉末、聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇和聚乙二醇)，以及其他药学上可接受的材料。赋形剂及其使用的实例在(Remington'sPharmaceutical Sciences第20版(Lippincott Williams&Wilkins，2000)中有所描述。赋形剂的选择在很大程度上取决于多种因素，例如特定的给药方式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响以及剂型的性质。
本文所述的QD、治疗剂和治疗缀合物可以配制用于口服、注射、直肠、肠胃外、皮下、静脉内或肌内递送。特定制剂类型的非限制性实例包括片剂、胶囊剂、囊片、散剂、颗粒剂、注射剂、安瓿、小瓶、即用溶液或混悬剂、冻干材料、栓剂和植入物。固体制剂例如片剂或胶囊剂可包含任何数量的上述合适的药学上可接受的赋形剂或载体。缀合物也可以配制成用于持续递送。
口服的片剂和胶囊剂可以单位剂量呈递形式，并且可以含有常规的赋形剂，例如粘合剂，例如阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉；或可接受的润湿剂，例如十二烷基硫酸钠。可以根据常规制药实践中众所周知的方法将片剂包衣。
口服液体制剂可以是例如水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式，或者可以作为干燥产品存在，以在使用前用水或其他合适的媒介物重构。此类液体制剂可包含常规添加剂，例如助悬剂，例如山梨糖醇、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水媒介物(可能包括食用油)，例如杏仁油、油酸酯，例如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸；以及常规的调味剂或着色剂，如果需要的话。
对于肠胃外给药，包括静脉内、肌肉内、皮下或腹膜内给药，可以通过将QD、缀合物和/或治疗剂与无菌媒介物(通常是无菌水溶液、优选与受试者的血液等渗的无菌水溶液)组合来制备流体单位剂型。根据所用的媒介物和浓度，可以将治疗剂或缀合物悬浮或溶解在媒介物或其他合适的溶剂中。在制备溶液时，可将治疗剂或缀合物溶解在注射用水中，并在装入合适的小瓶或安瓿瓶中并密封之前进行灭菌过滤。有利地，诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂之类的试剂可以溶解在媒介物中。为了增强稳定性，可将组合物填充到小瓶中后冷冻，并在真空下除去水。然后可以将干燥的冻干粉末密封在小瓶中，并且可以在使用前提供随附的小瓶注射用水以重构液体。肠胃外混悬剂的制备基本相同，不同之处在于将缀合物悬浮在载体中而不是溶解在其中，并且灭菌不能通过过滤来完成。缀合物可以在悬浮于无菌载体中之前通过暴露于环氧乙烷进行灭菌。表面活性剂或湿润剂可以包含在组合物中以促进化合物的均匀分布。
可以局部或通过透皮途径，例如通过使用透皮皮肤贴剂来施用治疗剂、QD或QD-治疗缀合物。在一些实施方案中，透皮给药用于在整个剂量方案中实现连续剂量。合适的透皮制剂可以通过将治疗剂、QD或QD-治疗缀合物掺入触变或凝胶状载体例如纤维素介质，例如甲基纤维素或羟乙基纤维素中来制备，然后将得到的制剂包装在适于固定在与受试者的皮肤接触的透皮装置中。
使用本发明的缀合物和/或药物组合物给予的治疗有效的治疗剂或缀合物的量以及用于治疗疾病的剂量方案取决于多种因素，包括年龄、体重、性别和受试者的医疗状况、疾病的严重程度、给药途径和频率、所采用的特定缀合物以及所治疗个体的药代动力学特性(例如，吸附、分布、代谢、排泄)，因此可能差异很大。这样的治疗可以根据需要由主治医师决定，并且可以在需要的时间内进行治疗。本领域技术人员将理解，可能需要针对每个个体优化待施用化合物的剂量方案或治疗有效量。
组合物可包含约0.1mg-2000mg，典型地约0.5mg-500mg，更典型地约1mg-200mg的治疗剂或缀合物。取决于给药途径和给药频率，约0.01mg/kg-100mg/kg体重的日剂量，通常在约0.1mg/kg-约50mg/kg体重之间，可能是合适的。每日剂量通常将以每天一剂或多剂，例如两剂、三剂或四剂给药。
如上所述，提供一种通过施用本文所述的治疗剂或缀合物来调节内皮细胞，特别是肝窦状内皮细胞(LSEC)中开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的方法。
在一个实施方案中，本文公开的方法将诸如LSEC的内皮细胞中开窗孔隙率与处理前的平均孔隙率相比，增加5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％。
在另一个实施方案中，将诸如LSEC的内皮细胞中窗孔的频率与处理前开窗频率相比，增加5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％。
在一个实施方案中，将诸如LSEC的内皮细胞中窗孔的平均直径与处理前平均窗孔直径相比，增加5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％。
在一些实施方案中，将老年受试者开窗孔隙率、直径和频率中的至少一种恢复至或维持在健康非老年受试者中所见的水平。
老年受试者是年龄为45岁或更老的受试者。在一些实施方案中，老年受试者是40岁或更老。
本文所述的治疗剂或缀合物可以与如上所述的药物载体、稀释剂或赋形剂一起施用。替代地或另外地，治疗剂或缀合物可以与其他试剂例如其他治疗剂组合施用。
在定义本文所述的治疗剂或治疗缀合物和一种或多种其他药物的用途中的术语“联合疗法”或“辅助疗法”旨在包括以提供药物组合的有益作用的方案以顺序方式给予每种药物，并且还旨在包括以基本上同时的方式，例如以具有固定比例的这些活性剂的单一制剂，或以每种试剂的多个分开的制剂的方式共同施用这些试剂。
根据各种实施方案，更多的缀合物可以与一种或多种其他治疗剂组合配制或施用。因此，在一些实施方案中，一种或多种缀合物可以与其他已知治疗或治疗剂和/或佐剂或预防剂一起包含在联合治疗方案中。
许多药物可用于商业用途、临床评估和临床前开发，可以选择用于治疗衰老或与年龄相关的疾病。
可以在联合疗法中使用的合适试剂将被本领域技术人员所认识。合适的试剂例如在Merck Index,An Encyclopaedia of Chemicals,Drugs and Biologicals,12th Ed.,1996中列出，其内容整体援引加入本文。
例如，当用于治疗与年龄有关的疾病或其他因窗孔损失而引起的疾病时，本文所述的治疗缀合物或治疗剂可与其他药物一起给药。
组合方案可以包括在每种情况下视情况适当地将活性剂一起、顺序或间隔地施用。包括本文所述的QD和缀合物的活性剂的组合可以是协同的。
本文所述的QD或缀合物的共同给药可通过与另一种活性剂处于相同单位剂量的QD或缀合物来实现，或QD或缀合物和一种或多种其他活性剂可以根据给药方案或时间表，在相同或相似的时间或不同的时间以单独和离散的单位剂量存在。顺序给药可以按照要求的任何顺序进行，并且在给药第二种或以后的化合物时，特别是在需要累积或协同作用的情况下，并可能需要第一种或初始化合物的持续生理作用的存在。
现在将参考实施例更详细地讨论本发明的实施方案，所述实施例仅出于示例性目的提供，并且不应以任何方式视为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：LSEC窗孔形态的可视化
为了研究体外LSEC的形态，使用了扫描电子显微镜(SEM)。使用SEM对从幼龄小鼠和老龄小鼠培养的初代LSEC中的LSEC窗孔和筛板进行解析，样品图像显示在图1和2的对照图像中。
幼龄小鼠和老龄C57Bl6小鼠(n＝3只幼龄小鼠小鼠，3-4个月，n＝3只老龄小鼠，20-24个月)维持在完全SPF条件下并随意喂养。该研究获得悉尼西南地区卫生服务动物福利委员会的批准。20-24个月的小鼠会衰老。用CO2处死动物，并通过插入门静脉的23G针立即灌注固定肝脏。用PBS(0.1M蔗糖)中的1％戊二醛/4％低聚甲醛固定肝组织。
幼龄小鼠(3个月)的窗孔范围为30-300nm，平均直径为136nm，老龄小鼠(24个月)的窗孔范围为124nm。
窗孔被划分为筛板(图1中的*所示)，其在幼龄小鼠中含有10-100个窗孔，在老龄小鼠中含有5-50个窗孔。与老龄小鼠相比，幼龄小鼠的开窗孔隙率和频率增加，而老龄小鼠表现出更大的间隙(图1中以#表示)(直径大于300nm的孔)。
实施例2：药物处理
药物处理和剂量(叠加在图1和2的相应图像上)是通过使用含或不含溶解药物的RPMI在37℃，5％CO2下孵育肝细胞30分钟来进行的。所有图像均由两名不知情的研究人员使用SEM以10,000x拍摄，显示1μm的比例尺。
对照图像显示窗孔以筛板(*)分组。在幼龄小鼠和老龄小鼠之间观察到窗孔减少。间隙(#)(>300nm)存在于老龄小鼠对照组中，并在被辛伐他汀处理时得到促进。波生坦、2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)、氨氯地平和西地那非处理可保持幼龄小鼠和老龄小鼠的筛板和增加的窗孔密度。细胞松弛素D、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和烟酰胺单核苷酸(NMN)处理可提高窗孔密度并维持筛板窗孔成簇。
用细胞松弛素D、TRAIL和NMN处理后，老龄小鼠表现出更大的窗孔筛板分组。7-酮胆固醇(7KC)处理促进窗孔的增加，但限制了明显可定义的筛板。7KC和NMN处理可观察到窗孔直径的增加。
药物处理对开窗孔隙率、直径和频率的影响如图3-5所示。从这些图中可以看出，幼龄小鼠的开窗孔隙率为4.8±0.4％，(平均数±SD)平均直径为135.9±11.1nm，频率为3.1±0.6(数量/100μm2)。与幼龄小鼠相比，老龄小鼠的孔隙率(2.4±0.1％；P<0.05)和频率(1.8±0.3；P<0.05)显著降低，但直径没有显着差异(老龄小鼠：124.4±6.2nm；P＝0.20)。
图3-5显示辛伐他汀、波生坦、氨氯地平、西地那非、TRAIL、7KC、NMN、DOI和细胞松弛素D对LSEC开窗孔隙率的影响。每个数据点代表8张图像的平均±SD(如图1和2所示)，每次处理收集616-3312个窗孔原始数据点。小于30nm的窗孔和大于300nm的间隙不包括在分析中。*使用配对t检验显示P<0.05，除对照组，波生坦(1μM)，TRAIL组和细胞松弛素D外，所有组的n＝2，这些组的n＝3。
细胞松弛素D(0.5μg/ml)、DOI(0.1μg/ml)和7KC(9μM)处理显示，幼龄小鼠(DOI除外)和老龄小鼠的孔隙率增加(图3)。仅在老龄小鼠中，在7KC(4.5μM)处理的LSEC中观察到窗孔直径增加(图4)。细胞松弛素D处理后，幼龄小鼠和老龄小鼠的开窗频率均增加，而老龄小鼠的开窗频率仅由于DOI和7KC(9μM)处理而增加(图5)。
一氧化氮(NO)途径促进剂波生坦(0.1μM)和西地那非(300ng/ml)促进幼龄小鼠(5.4±0.1％；P<0.05，7.1±2.2％；P<0.05)和老龄小鼠(4.2±0.4％；P<0.05，5.4±1.9％；P<0.05)的开窗孔隙率均增加。在幼龄小鼠和老龄小鼠中，开窗频率均显示出相似的显著增加。没有报告窗孔直径的变化。Ca2+抑制剂氨氯地平(20ng/ml)与波生坦和西地那非类似，可增加幼龄小鼠和老龄小鼠的开窗孔隙率和频率。仅在幼龄小鼠中观察到窗孔直径减小(123.8±1.6nm；P<0.05)(图4)。辛伐他汀(通过Kruppel样因子2的NO途径促进剂)并未显著改变开窗孔隙率或频率，但是辛伐他汀处理均能促进老龄小鼠的窗孔直径增加(152.0±19.2nm)(图4)。
死亡受体4/5促进剂TRAIL(1μg/ml)增加幼龄小鼠(7.2±1.5％；P<0.05，4.5±0.4；P<0.05)的开窗孔隙率和频率，而老龄小鼠只增加孔隙率(2.7±0.1％；P<0.05)。没有观察到直径变化。
通过处理检验，NMN最大程度地增加开窗孔隙率和频率。幼龄小鼠的剂量为5mg/ml，老龄小鼠的剂量为50μg/ml，效果最佳。在幼龄小鼠中，NMN处理可将孔隙率提高到9.1±2.0％(P<0.05)，频率提高到5.9±0.1(P<0.05)。在老龄小鼠中，孔隙率增加到6.6±2.2％(P<0.05)，频率增加到4.4±1.6(P<0.05)。老龄小鼠的窗孔直径明显增加(133.4±0.9nm；P<0.05)；该直径在视觉上类似于在幼龄小鼠中观察到的直径(图2)。
比较在幼龄小鼠和老龄小鼠中的对照和NMN处理，生成窗孔直径的直方图频率(图6)。在老龄小鼠中，NMN处理在101-125nm采集范围具有的峰值频率为24％。这个结果类似于幼龄对照小鼠，其峰值频率在此范围内为22％。老龄对照小鼠在76-100nm的采集范围内具有24％的峰值频率。
实施例3：制备Ag2S量子点的实验方案
制备水溶性NIR-Ag2S量子点(约5-10nm的纳米颗粒)用于体外和体内研究。
使用的材料：二乙基二硫代氨基甲酸银Ag(DDTC)、1-十二烷硫醇、环己烷、合成的α-硫辛酸(硫辛酸)、无水乙醇、去离子水。
所使用的设备：离心机、称重机、Corning Spin-X UF浓缩器离心过滤器、平底烧瓶、橡胶隔垫、磁性加热板、磁性搅拌棒(混合量子点分散液)、N2气氛、超声仪。
根据以下方案制备Ag2S量子点。
步骤1：疏水性硫化银量子点的制备如下：
1.在室温下，将0.02561g二乙基二硫代氨基甲酸银(溶于吡啶P.T.)和10g十二烷硫醇(溶于水中)在烧瓶中混合。
2.在真空下剧烈磁力搅拌5分钟以除去氧气。
3.应将溶液以15℃/min的加热速率加热至200℃，并在N2气氛下于200℃保持1h。
4.使溶液自然冷却至室温。随后将50ml乙醇倒入溶液中。
5.然后将所得混合物在6729g离心20分钟，洗涤沉淀并将其分散在环己烷中。
环己烷分散体包含单斜Ag2S量子点，可以使用X射线衍射和透射电子显微镜(TEM)进行鉴定。参见图7和8。
步骤2：制备亲水性硫化银量子点
1.将0.15g的硫辛酸和15ml的乙醇加入到0.05mmol的来自步骤1的环己烷分散体中，并将得到的混合物在超声清洁器中超声处理4小时。(硫辛酸可溶于乙醇)。
2.将超声处理的混合物在2691g下离心20分钟，用去离子水洗涤并再分散在去离子水中。样品包含直径约5–10nm的水溶性Ag2S颗粒(量子点)。颗粒在1100-1200nm处具有很强的荧光发射，入射波长为785nm。
实施例4：量子点与治疗剂的缀合
根据以下方案将量子点缀合至治疗剂(细胞松弛素D)：
1.将0.1mg实施例1的Ag2S量子点(QD)分散在200μL二甲基亚砜(DMSO)中。
2.将溶解在50μL DMSO中的1.15mg(0.01mmol)的磺基-N-羟基琥珀酰胺(NHS)加入到步骤1的混合物中，并搅拌混合。
3.将1.91mg(0.01mmol)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)样品溶于50μL DMSO中，并加入到步骤2中的QD-NHS/DMSO溶液中。
4.将来自步骤3的混合物在黑暗中搅拌下保持1小时。
5.将步骤4中产生的表面活化的Ag2S QD离心并用DMSO洗涤两次，然后进一步分散在DMSO中。
6.将PBS缓冲液中的2x10-9mol细胞松弛素D蛋白与步骤5中的EDC/NHS活化的Ag2SQD缀合。
实施例5：Ag2S QD标记LSEC
将分离的LSEC接种在96孔板中(每孔1×104个细胞)，然后在37℃下孵育24h。将细胞与来自实施例1的25微克Ag2S QD在37℃下孵育15分钟或24小时。
孵育后，将细胞用PBS(pH 7.0)洗涤3次，以去除未结合的QD，然后准备进行电子显微镜检查。在室温下，使用2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液固定细胞2小时，用0.1M二甲胂酸盐缓冲液洗涤，然后在四氧化锇中固定1小时。使用增加浓度的乙醇去除细胞的水，最后将其替换为Spurr树脂进行包埋。使用超薄切片机切割70-nm超薄切片。用FEI/PhilipsCM-200电子显微镜检查切片以检测QD的存在
标记有量子点的LSEC的电子显微照片如图9所示。
实施例6：完整肝脏中的Ag2S QD标记细胞
麻醉后，使用含有250微克QD的Krebs Henseleit碳酸氢盐缓冲液(1％白蛋白，10mM葡萄糖，pH 7.4)通过门静脉灌注小鼠肝脏。
用QD灌注5分钟后，用固定液灌注肝脏，并使用透射电子显微镜分析肝脏的QD分布。
肝脏在0.1M甲藻酸钠缓冲液中灌注3％戊二醛和2％多聚甲醛，然后进行处理并包埋在Spurrs树脂中，然后进行超薄切片和使用FEI/Philips CM-200电子显微镜检查。
标记有量子点的肝脏切片的电子显微照片如图10所示。
实施例7：量子点(QD)制备论文草稿方法
Ag2S QD合成
如上所述，Ag2S QD的合成是在剧烈磁力搅拌下，将0.1-0.3g二乙基二硫代氨基甲酸银与12ml 1-十二烷硫醇混合而成。创建N2真空以从混合物中除去氧气，然后使用Ar真空以除去N2。将Ag2S QD溶液以每分钟10-15℃的速度加热到180-210℃，并在此温度下保持1-60分钟。合成后，将50-100ml EtOH添加到溶液中，并在4000-28000RPM下将Ag2S QD离心30分钟。
Ag2S QD洗涤
将Ag2S QD重新悬浮于环己烷中，用丙酮洗涤两次，用EtOH洗涤两次。每次洗涤均导致以4000RPM的速度沉淀Ag2S QD。或者，可以通过将等体积的MQ与EtOH或丙酮混合而分离，从而在环己烷层中生成两层不可混溶的溶液，并带有Ag2S QD。
Ag2S QD的放射性标记
如上所述，合成Ag2S QD，将其洗涤分散在环己烷中。将QD(50mg)在室温下与5μCi3H油酸在氩气中剧烈搅拌下孵育48小时。孵育后，将QD用丙酮洗涤3次以沉淀QD，以3000RPM离心5分钟，然后再分散在环己烷中。
水相转移
在磁力搅拌下，将环己烷中的放射性标记QD与丙酮1：1(v/v)混合。每50mg Ag2SQD加入1ml 3-MPA。将Ag2S QD在室温下孵育1小时，与50ml乙醇混合，并以3000RPM离心5分钟。将沉淀用70％的乙醇水溶液洗涤3次并分散在MQ中。相转移后，将QD稀释至10mM溶液，在黑暗中于4℃储存。
FSA涂层
在剧烈混合下，将10mM Ag2S QD与10mM EDC和10mM NHS在反应瓶中混合1小时。此后，pH值增加至9，并将10mM成纤维细胞表面抗原(FSA)，FSA-488或FSA-647添加到溶液中。将该混合物在室温下孵育4小时。将该混合物转移至蛇皮透析管3500-10000分子量的过滤器中，并用PBS透析2-3、5-6，并在黑暗中于4℃过夜。透析后，从管中收集溶液，并在4℃下储存直至使用。
Ag2S QD具有以下特征：
表1：QD表征
量子点 1 2 3
基础材料 Ag<sub>2</sub>S Ag<sub>2</sub>S Ag<sub>2</sub>S
大小 4.04±1.56 6.0±1.67 30.0±1.34
Zeta -25.8±0.8 -31.2±1.3 -28.5±0.5
涂层 FSA-488荧光团 FSA-488荧光团 FSA-488荧光团
小鼠管饲
3-4个月的老龄雄性C57/B16小鼠是从西澳大利亚珀斯的动物资源中心获得的。将动物以12小时的明/暗周期安置在ANZAC研究所的动物舍中，并提供自由进食的食物和水。在用100ml 10mM 3H-Ag2S-FSA-488QD进行管饲之前，小鼠未禁食。在灌胃后0、10、20和30分钟收集血液，在灌胃后30-60分钟，通过一次腹膜内注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪使小鼠安乐死。从肝脏、脾脏、肾脏、肺和小肠中收集200-250mg的组织。称重组织样品，并在反应小瓶中与1ml可溶解溶液混合，并在60℃孵育2小时以溶解组织。将0.2ml 30％H2O2添加到样品中以减少深色饱和度。将样品与10ml闪烁液混合。
LSEC分离
小鼠肝细胞、LSEC、HSC和Küpffer细胞的分离是通过用胶原酶灌注肝脏来进行的。通过在50x g非实质的条件下进行3次10分钟离心来去除肝细胞，并通过单独的两步Percoll梯度从肝细胞和LSEC组分中去除死细胞，并通过选择性粘附到塑料上，从LSEC组分中去除Küpffer细胞。将细胞悬浮于PBS中，然后进行细胞计数、离心和称重，然后(i)在反应小瓶中与1ml可溶解溶液混合并按上述方法进行放射性标记检测或(ii)在流式细胞仪中不变进行分析(流式细胞仪样品未进行放射性标记)。
流式细胞仪
在BD-Accuri流式细胞仪(BD Biosciences，澳大利亚)上进行流式细胞术，并在FlowJo(v10，FlowJo LLC，ON，美国)上分析数据。用另外的2个系列的半稀释液将样品稀释至1.0x106细胞/ml。除了上述分离准备工作外，还采用尺寸执行标准。每个稀释液收集100,000个事件，且事件限于尺寸标准。图15A中的数据显示执行尺寸后的样本数据。
3H放射性放射活性分析
使用闪烁计数器(Tricarb 2100TR)(每个样品5分钟，5-10ml闪烁液)测量放射性。图15B中的数据显示相对于单独的放射性标记的Ag2S QD，血液中存在的放射性水平。Ag2SQD清除率通过基于组织重量的每ug/ml器官和血液样品之间的放射性表达来确定。所有样品均重复三次。
本领域技术人员应当理解，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是说明性的而不是限制性的。
实施例7：药剂对幼龄小鼠和老龄小鼠分离的LSEC中窗孔的影响
进行本实施例以研究几种试剂对幼龄小鼠(3-4个月)和老龄小鼠(18-24个月)分离的LSEC中窗孔的作用，以：(1)描述调节窗孔的不同机制和；(2)确定减少与年龄有关的窗孔损失的药物。我们利用扫描电子显微镜(SEM)和dSTORM研究在小鼠中作用于以下途径的药物：影响NO(西地那非、氨氯地平、辛伐他汀、血清素能途径/磷脂酶C(DOI)、内皮素受体(波生坦)、死亡受体(TRAIL)和NAD+(尼古丁酰胺单核苷酸NMN))的途径。用已确定促进开窗的作用于肌动蛋白细胞骨架和脂质筏(分别为细胞松弛素D和7-酮胆固醇)的窗孔活性剂作为阳性对照。结果表明，通过靶向NO途径并诱导肌动蛋白重塑，在老龄小鼠中促进窗孔重新开放。改善与年龄有关的窗孔的药物可能具有与年龄有关的血脂异常和胰岛素抵抗的治疗潜力。
原料和方法
从西澳大利亚州珀斯的动物资源中心获得3-4和18-24个月的雄性C57/B16小鼠。将动物以12小时的明/暗周期安置在ANZAC研究所的动物舍中，并提供自由进食的食物和水。在通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪的生理盐水安乐死之前，小鼠未禁食。该研究得到悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准，并根据《澳大利亚动物护理和科学研究实践守则》(AWC 2016/009)进行。提供的所有信息均符合ARRIVE准则。
试剂包括：胶原酶(Type 1,cat no:47D17410A,ProSciTech,AUS)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich,AUS)、percoll(Sigma-Aldrich,AUS)、细胞松弛素D(cat no:c8273,Sigma-Aldrich,AUS)、TRAIL(cat no:375-TL-010,R&D systems,AUS)、波生坦(cat no:S4220,Selleckchem,TX,USA)、7-酮胆固醇(cat no:c2394,Sigma-Aldrich,AUS)、2,5-二氢-4-异安非他明(cat no:13885,Cayman Chemicals,AUS)、辛伐他汀(cat no:S6196,Sigma-Aldrich,AUS)、枸橼酸西地那非(cat no:PZ0003,Sigma-Aldrich,AUS)、烟酰胺单核苷酸(Dr Lindsay Wu,UNSW,AUS赠与)、苯磺酸氨氯地平(cat no:A5605,Sigma-Aldrich,AUS)和VEGF(cat no:V4512,Sigma-Aldrich,AUS)。染色剂包括Alexa Fluor 488鬼笔环肽(cat no:A12379 Thermo Fisher,AUS)、磷酸化eNOS(cat no:9571,Cell signallingTechnology,AUS)、eNOS(cat no:610296,BD Biosciences,AUS)、Alexa Fluor488羊抗兔、Cy3山羊抗小鼠(cat no:R-37116,A-11003；Thermo Fisher,AUS)。使用基于MTT的体外毒理学检测试剂盒(cat no:TOX1-1KT,Sigma-Aldrich,AUS)和循环GMP ELISA试剂盒(cat no:581021,Cayman Chemicals,AUS)进行检测。
如先前所述(Cogger et al.J e52698,2015https://dx.doi.org/10.3791/52698)，通过用胶原酶灌注肝脏来进行小鼠LSEC分离。通过两步Percoll梯度去除非实质细胞，并通过选择性粘附于塑料去除Kupffer细胞。使用前，将LSEC(以0.5x106个细胞/cm2接种)在无血清RPMI-1640中培养(37℃，5％CO2)3.5小时。
用各种试剂处理细胞30分钟，以确定对窗孔的作用。将所有试剂溶解在无血清的RPMI培养基中。所有实验均对幼龄小鼠和老龄小鼠进行三次重复。肌动蛋白用0.5μg/ml的细胞松弛素D破坏，脂质筏被3.6和1.8μg/ml的7-酮胆固醇破坏；选择剂量。西地那非(0.6、0.3、0.15、0.05和0.015μg/ml)、氨氯地平(40、20、10、5和1ng/ml)和辛伐他汀(1和0.1μg/ml)促进NO途径的发展。用DOI(0.1μg/ml)促进血清素能/磷脂酶C途径，通过波生坦(550、55和5.5ng/ml)抑制内皮素受体。用TRAIL(100、10、1、0.1和0.01ng/ml)促进死亡受体4并且NMN(5000、50、10、1和0.1μg/ml)促进NAD+。
如先前所述进行SEM(Corbin et al J Biol Chem 274:13729-13732,1999.)。将LSEC固定在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的2.5％戊二醛中，进行渗透，在分级乙醇和六甲基二硅氮烷中脱水，安装在短管上，溅射镀铂并使用JEOL 6380扫描电子显微镜(JEOL Ltd,Japan)进行检查。由不知晓研究的观察者收集10,000x放大率的图像，并使用Image J(NIH,MD,USA)测量窗孔直径和LSEC孔隙率。每次处理对616-3312个窗孔进行计数。小于30nm的窗孔和大于300nm的间隙不包括在分析中。孔隙率定义为被窗孔覆盖的细胞膜的百分比。频率定义为每1μm2的窗孔数。
使用内部显微镜进行dSTORM成像。通过用PBS洗涤两次并用4％多聚甲醛固定30分钟来为dSTORM准备LSEC。然后将LSEC用PBS洗涤两次，用Triton-X透化90秒钟，用5％牛血清白蛋白封闭1小时，并在成像前用Alexa Flour phalloidin 488(1:40)染色20分钟。使用含0.1％Tween的PBS洗涤细胞，并将其置于OxEA缓冲液(30)中，以进行dSTORM可视化和图像捕获。dSTORM使用来自二极管泵浦激光器(Coherent Inc,CA,USA)的488和647nm激发。激发是通过1.49NA 60x油浸TIRF物镜(Olympus Australia,AUS)进行的。荧光是在两个单独的sCMOS相机(Imaging Development Systems GmbH,Germany)捕获的。大约以75fps的速度收集多达40,000张图像的数据。由不知晓研究的观察者针对每种处理剂量收集5-8个全细胞图像，并使用rapidSTORM开源软件处理(Wolter et al.Nat Methods 9:1040,2012.)。检查每个图像的所有筛板和肌动蛋白结构。使用5-8张dSTORM图像进行光密度测量，并使用Image J软件(NIH,MD,USA)进行数据分析。
对用4％低聚甲醛固定的LSEC进行免疫荧光检验。用Triton-X将LSEC透化90秒，用5％正常山羊血清封闭1小时，然后在4℃下与(1：100)磷酸化的eNOS和(1：100)eNOS孵育过夜。LSEC用PBS洗涤两次，并与Alexa Fluor anti-rabbit 488和Alexa Fluor anti-mouseCy3二抗孵育。用PBS洗涤细胞，并使用带有DAPI的Vector Mount进行固定。使用具有F型浸油(cat:11513859)的Leica SP8倒置扫描共聚焦显微镜以63X放大倍数检查载玻片，并由不知晓研究的观察者使用LAS软件(Leica Microsystems CMS GmbH,Germany)捕获图像。使用ImageJ(NIH,MD,USA)分析图像。
按照试剂盒的说明进行MTT和cGMP测定。简而言之，在药物处理之后进行MTT测定。用PBS洗涤细胞，并与含有100μg MTT溶液的RPMI培养基一起孵育。将细胞在37℃下孵育4小时，然后用200μl增溶溶液裂解，随后30分钟显色，并使用分光光度计在570nm下进行测量。药物处理后也进行cGMP测定。用PBS洗涤细胞，并用0.1M HCl溶解。样品收集后，将样品乙酰化并用试剂盒试剂制备。样品在4℃下孵育18小时，然后用分光光度计在410nm处检查。
使用Kruskal-Wallis检验和post-hoc Dunn方法(SPSS v21,IBM Analytics,AUS)比较多个组，进行药物处理实验与肌动蛋白/NOS密度测定之间的统计分析，P<0.05被认为是显著的；P<0.1也会在结果中突出显示。由于本研究中使用的小鼠数量以及对先前数据的分析，使用非参数统计，表明该样本量可产生80-95％的统计学功效以区分干预措施。图例中描述分析的各个规范。所有数据均以平均值±SD表示。实验设计和分析是根据Curran-Everett and Benos DJ.Adv Physiol Educ 31:295-298,2007中描述的APS指南进行的。
结果
幼龄小鼠和老龄小鼠对照
从幼龄小鼠和老龄小鼠分离的LSEC的SEM证实LSEC制备的技术成功，如图11A所示。正如预期的那样，与幼龄小鼠LSEC相比，老龄小鼠LSEC的孔隙率有所降低(孔隙率：幼龄小鼠4.6±0.3％，老龄小鼠2.4±0.1％；P＝0.023，每组N＝3，图11B)，具有更大数量的间隙(直径大于300nm，在图11D中用#表示)。窗孔直径随年龄的变化没有显著差异(幼龄小鼠130.9±7.2nm与老龄小鼠：124.4±6.2nm；P＝0.20，图2)。开窗频率随年龄的增加而降低(幼龄小鼠：每1μm2有3.1±0.6窗孔，而老龄小鼠1.8±0.3；P＝0.033，图11C)。这表明在这些小鼠中与年龄相关的窗孔在很大程度上是开窗频率降低而不是直径减小所致。在图11中，虚线显示幼龄小鼠和老龄小鼠对照组水平。药物处理：辛伐他汀、波生坦、TRAIL、西地那非、氨氯地平、NMN、7-酮胆固醇、细胞松弛素D和DOI。使用或不使用溶解药物的RPMI，所有处理均在37℃，5％CO2下孵育30分钟。SEM图像由两名不知晓研究的观察者以10,000x拍摄(样品图像显示在A，D面板中)，并用于手动计算开窗孔隙率和频率。每个数据点代表每次处理使用616-3312窗孔原始数据点的8张图像的平均值±SD。所有小于30nm的窗孔和大于300nm的间隙不包括在分析中。*与幼龄小鼠对照组相比，显示P<0.05；#与老龄小鼠对照组相比，显示P<0.05。使用Kruskal-Wallis和post-hoc Dunn检验进行统计，以比较各组，所有组的n＝3。(D)在老龄小鼠中药物处理的SEM图片。显示的是1μm的比例尺。对照组中存在间隙(#)(>300nm)，并在辛伐他汀1μM处理中增加。
窗孔处理效果
用西地那非、NMN和7-酮胆固醇处理导致幼龄小鼠和老龄小鼠LSEC的孔隙率和开窗频率显著增加(图11B-C，表2、3)。细胞松弛素D显著增加幼龄小鼠和老龄小鼠LSEC中的频率，但没有增加孔隙率(图11B-C，表2、3)。来自老龄小鼠的LSEC仅对波生坦和DOI有反应。在TRAIL和氨氯地平处理后，来自幼龄小鼠的LSEC仅显示出孔隙率和频率显著增加。与幼龄小鼠相比，老龄小鼠的LSEC的孔隙率和频率的整体变化倍数更大。NMN 50μg/ml处理促进老龄小鼠的最大变化，孔隙率增加2.5倍，频率增加2.25倍(图11B-D)。
表2幼龄小鼠数据：**显示P<0.01，*显示P<0.05，#显示P<0.1；将Kruskal-Wallis与post-hoc Dunn检验进行比较，以比较各个组。所有数据均显示为平均值±SD
Figure BDA0002614773870000301
表3老龄小鼠数据：**显示P<0.01，*显示P<0.05，#显示P<0.1；将Kruskal-Wallis与post-hoc Dunn检验进行比较，以比较各个组。所有数据均显示为平均值±SD
Figure BDA0002614773870000311
LSEC对不同药物和剂量的反应存在显著差异。在幼龄小鼠中，西地那非(0.3μg/ml)、氨氯地平(20ng/ml)和TRAIL(1ng/ml)表现出增加的窗孔数和总开窗细胞面积，并且对筛板的形成有一定的破坏作用(图1)；较高剂量的西地那非、TRAIL不能促进开窗孔隙率或频率的更大变化。在用氨氯地平、7酮胆固醇和NMN处理后，明显形成间隙(在图11A和图12B中用#表示)。NMN处理后，维持一些正常的筛板，但是筛板之间的细胞质区域显著减少，从而导致超穿孔的形态，类似于本研究中使用7-酮胆固醇所见的效果。7-酮胆固醇与幼龄小鼠和老龄小鼠的窗孔直径增加有关(P<0.05；图12A。)
药物对窗孔直径频率分布有影响。NMN与幼龄小鼠的筛板边缘较小的窗孔(小于75nm)相关(图12B和12C)，而老龄小鼠则没有。在幼龄小鼠中，NMN(5000μg/ml)诱导增加30-100nm和226-500nm窗孔，而减少126-200nm窗孔(图2C)。在老龄小鼠中，NMN处理使窗孔的直径从76-100nm的峰值移动到101-125nm，并与较小的窗孔(直径30-100nm)的减少相关(图12C)。在7-酮胆固醇(3.6μg/ml)处理中未观察到这种效果，相反，在幼龄小鼠中发生向右移动，窗孔直径减少30-125nm，而150-3000的窗孔增加。在老龄小鼠中，与NMN相似，7-酮胆固醇(3.6μg/ml)在101-125nm处有一个峰，窗孔增加150-300nm。
孔隙率的增加主要是由于数量增加而不是窗孔的大小所致(图13A)。通过MTT测定法评估细胞生存力，并证明最大药物剂量不会诱导细胞毒性(图13B)。在幼龄小鼠中进行剂量反应实验，研究所有对调节开窗孔隙率具有活性的药物(图13C)。TRAIL与NMN具有最大的活性和最大的功效，但作用更强(图13C)。但是，西地那非、氨氯地平和TRAIL的剂量范围有限，对开窗孔隙率有正面的影响，而NMN的范围很广。NMN处理导致幼龄小鼠LSEC中开窗孔隙率的最大增幅，从4.6％增加到8.1％。
药剂对肌动蛋白和一氧化氮合酶的影响
对照组LSEC显示在质膜和细胞质内有中等程度的肌动蛋白染色，包括宽大的圆形管状结构(图14A)。没有观察到LSEC中肌动蛋白密度的变化(图14B)。在治疗组之间观察到肌动蛋白细胞结构模式的变化(表4)，而细胞中肌动蛋白的总量未改变。
表4肌动蛋白和一氧化氮合酶随药物处理的变化
Figure BDA0002614773870000321
用细胞松弛素D处理的LSEC在质膜上有广泛的肌动蛋白染色(图14A)。拉伸纤维存在于核周区域内。用细胞松弛素D、氨氯地平、NMN和西地那非处理后，细胞质周围的光滑纤维丢失。
西地那非、氨氯地平和NMN表现出相似的表型，其质膜上无序密集的肌动蛋白染色，细胞质内肌动蛋白聚集(图14A)。关键特征是：(1)纤维向各个方向突出，(2)肌动蛋白簇，(3)间隙形成，以及(4)在某些筛板上可见的单个窗孔(图14A插图)。TRAIL与西地那非、氨氯地平和NMN相似，除了不存在强烈的肌动蛋白聚集(表4，图14A)。
与对照组类似，7-酮胆固醇处理与整个细胞质中的组织化肌动蛋白结构有关(图14A)。然而，整个肌动蛋白的细胞结构中都出现较大的间隙，肌动蛋白纤维保持连续且相互连接的外观，但失去圆形管状结构。在质膜上看到中等程度的染色。在胞质肌动蛋白中也观察到较大的间隙(图14A，插图)。
肌动蛋白细胞骨架的变化与开窗孔隙率和频率增加有关；但是，在所有处理中，似乎都没有显示出与窗孔增加有关的细胞骨架变化的任何特定模式。
TRAIL、氨氯地平和西地那非(图14C)观察到NOS密度增加。西地那非和TRAIL处理后，细胞内cGMP升高3倍(p＝0.001)；在NMN或氨氯地平处理的细胞中未观察到任何变化(图14D)。对照组LSEC和用NMN处理的LSEC表现出最少的NOS染色和未磷酸化的NOS(图14E)。TRAIL和氨氯地平在细胞质上显示出NOS染色，但没有磷酸化的NOS(图14E)。西地那非和VEGF(100ng/ml，4小时处理)显示NOS和磷酸化NOS都染色(图14E，白色箭头)。
讨论
LSEC中窗孔的形态对多种药理干预措施有反应，并且这种反应性大部分维持到老龄。在这项研究中，从老龄小鼠中分离出的LSEC具有降低的开窗孔隙率和频率，这与先前在小鼠以及大鼠、人类和非人类灵长类动物中的研究一致。NMN、西地那非和7-酮胆固醇增加幼龄小鼠的开窗孔隙率和频率，在老龄小鼠的LSEC中观察到相似或更大的作用(汇总数据见表5)。这表明年龄相关的窗孔损失可以在体外逆转，并且可能是体内研究的有效治疗靶标。此外，在老龄小鼠的LSEC中确定这些防渗透剂的最佳浓度，为体内研究提供潜在的目标剂量。
dSTORM研究的结果表明，窗孔重新开放与肌动蛋白的显著重组有关。在用氨氯地平、西地那非和TRAIL处理的LSEC中也观察到NOS蛋白表达增加，而西地那非是与磷酸化NOS增加有关的唯一药物。总体而言，我们的研究表明窗孔增加的试剂与肌动蛋白细胞骨架的改变有关，在某些情况下与NO的释放有关；重要的是，这种反应性在老龄得以维持。
表5各种药物和药剂促进的开窗孔隙率、直径和频率中的变化。↑＝增加(P<0.05)；(ns)＝(P<0.1)。
Figure BDA0002614773870000341
在老龄小鼠中，NMN(50μg/ml)使开窗孔隙率和频率增加最大。NMN是一种生物合成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)代谢产物，对于通过NAD+挽救途径调节NAD+生物合成至关重要。NMN通过NMN乙酰基转移酶转化为NAD+，并在烟酰胺磷酸核糖基转移酶存在下由NAD+分解产物烟酰胺产生。这种挽救过程发生在细胞核、线粒体和细胞质中，并在肝脏中维持高水平的NAD+。在雌性小鼠中一次腹膜内注射500mg/kg NMN后15分钟，NAD+升高。在老龄小鼠中，已证明该剂量是无毒的，并能改善葡萄糖耐量。在饮食和年龄诱发的2型糖尿病小鼠模型中，连续7天连续服用相似的剂量也能改善胰岛素的作用和分泌。本文提供的数据表明，NMN影响葡萄糖/胰岛素代谢的一种机制可能涉及老龄小鼠LSEC的窗孔重新开放，从而导致肝脏中胰岛素敏感性增加。在幼龄小鼠LSEC中，NMN(浓度为5000μg/ml)产生开窗孔隙率和频率增加并伴随直径分布的变化。窗孔直径直方图(图12C)突出显示在处理30分钟后存在小的30-100nm窗孔和较大的125-300窗孔。NMN大大增加开窗频率，这表明小窗孔比例的增加可能代表新窗孔的形成。在老龄小鼠中，随着窗孔直径的增加，NMN处理使窗孔直径向右移动。因此，用NMN处理的老龄小鼠的平均窗孔直径与幼龄小鼠(老龄小鼠NMN：132±2nm vs幼龄小鼠：131±7nm)相似。
如使用dSTORM所显示的，这些药物对肌动蛋白细胞骨架也有不同的作用。用细胞松弛素D、氨氯地平、西地那非和NMN处理后，肌动蛋白的凝结和聚集似乎相似。然而，用7-酮胆固醇处理可产生弥散性的肌动蛋白网络，这可能是由锚定在肌动蛋白细胞骨架上的脂质筏的缩回(retraction)所产生的，这与窗孔直径显著增加15nm有关。这表明在肌动蛋白细胞骨架上游起作用的物质将极大地影响窗孔的频率，而直接对脂质筏起作用的物质可能会进一步增加窗孔的直径，可能是由于非脂质筏细胞膜增加所致。
LSEC窗孔的调节最近已被研究，主要调节途径被认为是由VEGF和NO介导的。研究三种影响NOS和NO的药物：氨氯地平、西地那非和辛伐他汀。在幼龄小鼠和老龄小鼠中，只有西地那非影响LSEC，氨氯地平在窗孔变化中表现出相似的模式，但无统计学意义。西地那非通过抑制PKE5促进cGMP和PKG，导致NO利用率增加。氨氯地平通过cGMP对NO产生双重作用，并抑制Ca2+通道。西地那非不抑制Ca2+流入。辛伐他汀通过Akt依赖性途径促进内皮细胞NO的释放，并抑制Rho GTP激酶以间接促进cGMP和PKG活化。辛伐他汀不促进Ca2+流。这项研究表明，西地那非以及较小程度的氨氯地平促进开窗孔隙率和频率的变化，并增加NOS的表达。相比之下，辛伐他汀促进窗孔直径不明显的增加。这些发现支持提出的NO-cGMP-PKG途径，但表明直接靶向cGMP和PKG信号传导(例如通过西地那非和氨氯地平)可能促进更大的开窗孔隙率和频率，而通过辛伐他汀释放依赖Akt的NO可能会增加窗孔直径。需要进行进一步的研究以确定这些药物在体内是否会增加老龄动物的窗孔，以及是否会导致循环中的胰岛素和脂蛋白的肝清除率增加。
也研究TRAIL的作用。TRAIL是死亡受体激动剂，可促进caspase-8依赖性程序性细胞死亡。在老龄小鼠中，TRAIL对LSEC的影响最小，而在幼龄小鼠中；TRAIL与孔隙率增加60％和开窗频率增加40％有关。TRAIL对开窗频率和直径、肌动蛋白和NOS的影响与西地那非类似。据报道，在人类脐静脉内皮细胞中以1μg/ml处理15分钟后，TRAIL会上调NOS和磷酸化NOS。总之，这些结果表明，除其他已确立的作用外，TRAIL还影响内皮细胞中NOS的表达。
有报道细胞松弛素D、7-酮胆固醇和DOI可以增加幼龄小鼠的开窗孔隙率，而对窗孔直径没有任何显著影响。在最近的研究中，我们观察到仅用7-酮胆固醇的孔隙率增加，但是细胞松弛素D却显示增加33％，但不显著(P＝0.08)。我们还发现，细胞松弛素D，7-酮胆固醇可增加老龄小鼠LSEC中的窗孔，但DOI却不增加。但我们曾报道，DOI的体内给药仅在幼龄小鼠(7个月)中增加窗孔，而在老龄小鼠(24个月)中不增加窗孔。这些结果的差异大概反映这些研究中使用的不同方法(体内与体外)和年龄(18个月与24个月)。
总之，本发明人已经证实，用NMN、西地那非和7-酮胆固醇进行的体外药物处理增加从幼龄小鼠和老龄小鼠中分离的LSEC的开窗孔隙率和频率。窗孔的调节可以由NO依赖性和非依赖性途径介导。与年龄相关的伪毛细血管化有关的窗孔损失可以通过几种不同的药物逆转，这可能对年龄相关的血脂异常和肝胰岛素抵抗产生影响。
本领域技术人员将理解的是，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是说明性的而不是限制性的。
尽管已经参照优选实施例描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明可以以许多其他形式实施。本领域技术人员将认识到，在不脱离如广泛描述的技术的精神或范围的情况下，可以对如特定实施例中所示的技术进行多种变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都应被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (29)

1.一种用于调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的组合物，所述组合物包含治疗缀合物，所述治疗缀合物包含量子点和治疗剂，所述治疗剂选自内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、钙通道阻滞剂、肌动蛋白破坏剂、脂质筏破坏剂、5-HT受体激动剂、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)或其组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述量子点是Ag2S、InP/ZnS或CuInS/ZnS量子点。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述受试者是老年受试者或患有与年龄相关的疾病或病况的受试者。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述量子点的平均直径为约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8mn、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm或20nm。
5.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述治疗缀合物是单分散的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述内皮素受体拮抗剂选自波生坦、西他生坦、安利生坦、阿曲生坦、齐泊替坦、马西替坦、替唑生坦和艾多南坦。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述磷酸二酯酶(PDE)抑制剂选自西地那非或其活性类似物、他达拉非、伐地那非、乌地那非和阿伐那非。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述钙通道阻滞剂选自氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、芬地林。在另一个实施方案中，钙通道阻滞剂是氨氯地平。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述肌动蛋白破坏剂选自细胞松弛素、latrunculin、jasplakinolid、鬼笔环肽和swinholide。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述脂质筏破坏剂选自非律平、7-酮胆固醇(7KC)和甲基-β-环糊精。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述5-HT受体激动剂选自2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)、氟哌啶醇、阿立哌唑、阿塞那平、丁螺环酮、沃替西汀、齐拉西酮、哌醋甲酯、二氢麦角胺、麦角胺、methysergide、阿莫曲普坦、依来曲普坦、夫罗曲普坦、那拉普坦、利扎曲普坦、舒马曲坦、佐米曲普坦、育亨宾、lasmiditan、那拉普坦、蟾毒色胺、麦角新碱、麦角乙脲、LSD、麦斯卡林、肉豆蔻醚、二甲-4-羟色胺、赛洛西宾、芬氟拉明、MDMA、去甲芬氟拉明、哌醋甲酯、麦角新碱、氯卡色林、tazodone、甲基5-HT、qipazine、西尼必利、西沙必利、达佐必利、甲氧氯普胺、莫沙必利、普卢卡必利、伦扎必利、替加色罗、扎考必利、麦角胺和缬草烯酸。
12.一种调节受试者的内皮细胞开窗、孔隙率、直径和频率中的一个或多个的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-11中任一项的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者是患有与年龄有关的疾病或病况的受试者。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病况选自动脉粥样硬化、心血管疾病、关节炎、白内障、年龄相关的黄斑变性、听力损失、骨质疏松、骨关节炎、2型糖尿病、高血压、帕金森病、痴呆、阿尔茨海默病、年龄相关的肝脏微循环改变、年龄相关的血脂异常、胰岛素抵抗、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述受试者是患有与降低的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个有关的疾病或病况的受试者。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述治疗剂或治疗缀合物与内皮细胞结合。
17.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述治疗缀合物选择性地与内皮细胞结合。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述内皮细胞是肝内皮细胞。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述调节是内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的增加。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述增加是至少5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
21.包含量子点和治疗剂的治疗缀合物在制备用于调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的药物中的用途。
22.一种调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、钙通道阻滞剂、肌动蛋白破坏剂、脂质筏破坏剂、5-HT受体激动剂、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)或其组合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述内皮素受体拮抗剂选自波生坦、西他生坦、安利生坦、阿曲生坦、齐泊替坦、马西替坦、替唑生坦和艾多南坦。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述磷酸二酯酶(PDE)抑制剂选自西地那非或其活性类似物、他达拉非、伐地那非、乌地那非和阿伐那非。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述钙通道阻滞剂选自氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、依拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、芬地林。在另一个实施方案中所述钙通道阻滞剂是氨氯地平。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述肌动蛋白破坏剂选自细胞松弛素、latrunculin、jasplakinolid、鬼笔环肽和swinholide。
27.根据权利要求23所述的方法其中所述脂质筏破坏剂选自非律平、7-酮胆固醇(7KC)和甲基-β-环糊精。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述5-HT受体激动剂选自2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)、氟哌啶醇、阿立哌唑、阿塞那平、丁螺环酮、沃替西汀、齐拉西酮、哌醋甲酯、二氢麦角胺、麦角胺、methysergide、阿莫曲普坦、依来曲普坦、夫罗曲普坦、那拉普坦、利扎曲普坦、舒马曲坦、佐米曲普坦、育亨宾、lasmiditan、那拉普坦、蟾毒色胺、麦角新碱、麦角乙脲、LSD、麦斯卡林、肉豆蔻醚、二甲-4-羟色胺、赛洛西宾、芬氟拉明、MDMA、去甲芬氟拉明、哌醋甲酯、麦角新碱、氯卡色林、tazodone、甲基5-HT、qipazine、西尼必利、西沙必利、达佐必利、甲氧氯普胺、莫沙必利、普卢卡必利、伦扎必利、替加色罗、扎考必利、麦角胺和缬草烯酸。
29.磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、钙通道阻滞剂、肌动蛋白破坏剂、脂质筏破坏剂、5-HT受体激动剂、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN)或其组合在制备用于调节受试者的内皮细胞开窗孔隙率、直径和频率中的一个或多个的药物中的用途。
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