CN103168238B - 含氨基的分子的共价固定化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种共价固定包含至少一个氨基的至少一个分子的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一包含?SH基团的表面，b)在贵金属离子存在的情况下，使用氧化还原反应将包含?SH基团的所述表面氧化，和c)将包含至少一个氨基的至少一个分子与所述表面接触，以将所述至少一个分子共价连接到所述表面上，其中所述至少一个氨基包含在获得的所述共价键中。固定化分子通过稳定的共价键固定。因为这种方法可以一步完成，因此它更加通用。所有的反应步骤都在水溶液中进行。所有的步骤都可以在室温下进行。相对于现有技术，所使用的化学制品毒性更少，成本更低。

Description

含氨基的分子的共价固定化
技术领域
本发明主要涉及包含至少一个氨基的分子的共价固定化。
背景技术
将分子在表面共价固定化的技术在表面科学中是至关重要的。例如，固定化酶拥有很多优势，其中包括，在反应中没有或只有极少量的固定化酶溶解(dissolve)。反应完成后，反应混合物中通常只包含溶剂和反应产物。固定化酶可以很容易地从反应中去掉，使其易于回收。
这些例子包括但不限于，例如催化剂、生物传感器、微接触印刷、色谱分析和分析设备等领域。目前有多种固定化技术，例如基于硅烷醇化学、点击化学和一个常用的生物分子固定方法，就是所谓的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)法。所有这些技术的缺点包括固定分子和表面之间不稳定的化学键、昂贵有毒的化学品或在表面上引入活性结构期间必备的有机溶剂。
目前，最常用的技术是所谓的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)偶联法。而这种技术的若干缺点中的一个已经被，例如，Wilchek说明过。根据后一作者的描述，已知这种方法会产生不稳定的化学键，尤其是对于单点连接的分子。例如，据报道，50％通过这种方法固定的丙氨酸会在40天内失去(Cuatrecasas等，生物化学，1972，卷11，第2291页)(Cuatrecasas et al.in Biochemistry，vol.11，p.2291，1972)。根据Wilchek等人在1987年的生物化学第26卷第2155页中描述，通过标准方法来制备NHS酯(即N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺)的情况下，会在同样含有羟基的聚合物中形成不稳定的固定化合物。这种现象的原因是，形成了连接到含羟基的聚合物上的p-丙氨酸衍生物，导致了不稳定化学键的形成。
NHS技术的其他不足之处包括，例如，用于共价固定丙氨酸或IgG等分子的酯键将会与酯在水介质中水解的反应形成竞争，并且在这一最终酯键制备的多个步骤中，必须采用无水的条件，由此会涉及到二恶烷的使用。这一过程中的第1步是将二胺(3’3-二氨基二丙基碳二亚胺)(3’3-diaminodipropylcarbodiimide)固定到基质，然后在第2步通过用二恶烷剧烈的冲洗，为第3步创造无水的条件。在第3步中，N-羟基琥珀酰亚胺加入到基质和3’3-二氨基二丙基碳二亚胺中，3’3-二氨基二丙基碳二亚胺在二恶烷中与引入的氨基在表面上反应。
存在NHS法的替代方法，但反应条件都涉及使用有机溶剂和昂贵的化学制品。
Pavlovic等人使用电接触印刷将蛋白质按模式地固定到巯基化的硅平面上，通过位点的选择性氧化将硫醇氧化成硫代亚磺酸酯(thiolsulphinates)(Nanoletters vol.3，No.6，779-781，2003)。
WO 2009/074692公开了将弧形表面部分地衍生化的方法，包含电氧化步骤。
发明内容
本发明的一个目的是减少现有技术的至少一些缺点，并提供一种改进的方法，将包含至少一个氨基的分子固定化，以及提供包含这种固定化分子的客体。
本发明的第一个方面是提供一种方法，将包含至少一个氨基的至少一个分子共价固定，所述方法包括以下一系列的步骤：
a.提供一包含-SH基团的表面；
b.在至少一个贵金属离子存在的情况下，通过氧化还原反应将包含-SH基团的表面氧化；和
c.将包含至少一个氨基的至少一个分子与所述表面接触，以将所述至少一个分子共价连接(covalent binding)到所述表面上，其中所述至少一个氨基包含在获得的所述共价键中。
本发明的第二个方面是提供了一包括至少一个表面的客体，其中包含至少一个氨基的至少一个分子共价连接到所述表面，其中至少一个分子通过上面的方法固定到所述表面上。
发明者进行了广泛的研究，结果发现，在贵金属离子(如金离子或铂离子)存在的情况下，在表面上通过氧化还原反应形成的带有巯基的基团会导致形成硫-金簇(sulphur-Au clusters)或硫-铂簇，其在下一步中可以与分子上的巯基和氨基反应。
本发明的优点包括，它是一种更为通用的分子固定化技术，这是因为可以省略在分子上引入巯基的额外步骤，并且所有的反应步骤可以在水溶液中进行。
另一个优点是，所有的步骤可以在室温(约20-25℃)进行。
另一个优点是，在氧化还原反应中形成的包括表面上的基团和氨基的共价键是稳定的，即使是对于单点连接的分子。
另一个优势是，这种方法执行很少的步骤。如果在开始的时候，巯基在表面上是可利用的，那么整个过程则是一单一步骤的过程。与现有技术的方法相比，这种方法更容易执行。
但进一步的优点是，与现有技术相比，使用的化学制品的毒性更少，成本更低。
快速的氧化还原过程使得纳米簇在几秒内形成。
附图说明
本发明结合以下附图作为参考进行描述，其中：
图1显示了在一个实施例中电氧化磁珠所使用的装置；通过使用安装在电极底部永磁铁，磁珠被吸引到工作电极(W)；在工作电极和参考电极(R)之间采用一恒电势器施加一电势，恒电势器还测量工作电极和反电极(C)之间的电流。
具体实施方式
在公开并详细描述本发明之前，应该理解的是，本发明并不限于此处公开的特定化合物、结构、方法步骤、基质和材料，这些化合物、结构、方法步骤、基质和材料可以有所不同。也应该理解的是，本文所用的名词术语仅用于描述特定的实施例，并不是用于限制，本发明的范围仅由所附权利要求及其等效体限定。
必须注意的是，本说明书及附带的权利要求中使用的“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除另有明确说明外。
如果没有另外定义，本文中使用的词语和科学术语的含义是本发明领域技术人员所理解的一般含义。
在说明书和权利要求中，与一数字值连接的词语“大约”表示一区间准确度，这是本领域技术人员所熟悉并可接受的。所述区间为±10％。
在说明书和权利要求中，与分子连用的词语“固定(化)”表示连接到一材料。
本发明涉及分子共价连接到一基体材料。
在说明书和权利要求中，词语“电氧化”表示通过施加外部电势或电流进行的氧化。
本发明提供了一种固定包含至少一个氨基的至少一个分子的方法，所述方法包括以下一系列步骤：a)提供一包含-SH基团的表面，b)在贵金属离子(如金离子或铂离子)存在的情况下，将包含-SH基团的表面氧化成包含-SH基团的表面，和c)将包含至少一个氨基的至少一个分子与所述表面接触，以将所述至少一个分子共价连接到所述表面上，其中所述至少一个氨基包含在获得的共价键中。
在一个实施例中，开始就使用包含-SH基团的表面，而在另一个实施例中，-SH基团是被引入到表面上的。
在一个实施例中，所述氧化包括电氧化。
氧化后，所述表面与包括至少一个氨基的至少一个分子接触。因此，在至少一个分子上的氨基发生反应并与所述表面形成共价连接，从而使至少一个分子共价连接到表面上。
在一第二实施例中，开始就使用包含-SH基团的表面，而在另一个实施例中，-SH基团是被引入到表面上的。随后，所述表面进行电氧化处理。电氧化后，所述表面与包括至少一个氨基的至少一个分子接触。因此，在至少一个分子上的氨基发生反应并与所述表面形成一共价连接，从而使至少一个分子共价连接到表面上。
不受任何特定的科学理论限制，发明者认为，当存在贵金属离子(例如金或铂离子)时，在例如金-硫纳米簇形成的过程中，氧化还原反应将表面上的巯基氧化成二硫化物。
在一个实施例中，在氧化所述表面的步骤之前，-SH基团的至少一部分相互发生反应。在一个实施例中，-SH基团的至少一部分反应生成-S-S键。
在一个实施例中，在氧化所述表面的步骤之前，基本上所有的-SH基团相互发生反应。从本质上讲，所有意味着至少99％的分子数目，优选地，多于99.9％进行反应。
在一个实施例中，所述包含至少一个氨基的至少一个分子选自以下组中的至少一个分子，所述组由包含至少一个碳原子、氨基酸、多肽、蛋白质、抗体、适体、病毒、病毒片段、细菌、细菌片段、细胞和细胞碎片(cell fragment)的分子组成。在一个实施例中，所述包含至少一个氨基的至少一个分子选自由蛋白质和抗体组成的组。
在一个实施例中，氧化还原反应在水溶液中进行。在一个实施例中，电氧化在的溶剂混合物中进行。
在一个实施例中，所述表面与包含至少一个氨基的至少一个分子接触的步骤在水溶液中进行。在一个实施例中，所述表面与包含至少一个氨基的至少一个分子接触的步骤在溶剂混合物中进行。
在一个实施例中，所述方法在15℃至30℃的温度下进行。在一替代实施例中，所述方法在大约20℃至25℃的室温下进行。在另一个实施例中，所述方法在5℃至45℃的温度下进行。在一替代实施例中，不包含温度敏感型生物分子，所述方法在温度高达几百度下进行。在一个实施例中，所述方法在15℃至300℃的温度下进行。
在一个实施例中，其中采用了电氧化。所述电氧化采用0.5到3V的电势并使用标准铂电极作为参考电极进行。在一个实施例中，所述电氧化采用0.1到5V的电势进行。在一个实施例中，所述电氧化采用0.5到2V的电势进行。在另一实施例中，所述电氧化采用0.5到1.5V的电势进行。在一个实施例中，所述电氧化进行的时间从1秒至10分钟。在一替代实施例中，所述电氧化进行的时间从0.1秒至10小时。
在一个实施例中，其中采用了电氧化，电氧化的装置包括一工作电极和一反电极。任选地，所述装置进一步包括一适于测量工作电极电势的参考电极。在一个实施例中，至少一个电极涂覆了金。在一个实施例中，在电氧化的过程中，至少一个电极适于在溶液中转动。在一个实施例中，构造了一液体电池(fluid cell)以在电氧化发生的地方获得较大面积的工作电极。
在一个实施例中，所述表面与包含至少一个氨基的至少一个分子的接触时间为10分钟到10小时。在一替代实施例中，所述电氧化进行的时间为0.1秒至72小时。
在一个实施例中，所述表面进行衍生化(derivatization)以在所述表面获得官能团。衍生化后，在所述表面上最终获得的官能团选自-SH基团和-SS-基团。优选地，所述表面在电氧化之前进行衍生化。
在一个实施例中，使用pH值为4-5的醋酸钠缓冲液。
本发明的第二个方面是提供了一包括至少一个表面的客体，其中包含至少一个氨基的至少一个分子共价连接到所述表面，其中所述至少一个分子通过上述方法固定到所述表面上。
在一个实施例中，所述客体是一微粒。在一个实施例中，所述客体是一传感器。在一个实施例中，所述客体是一色谱分离用的介质。在一个实施例中，所述客体是一生物材料。在一个实施例中，所述客体是一牙齿的修复材料。在一个实施例中，所述客体是一适合用作诊断目的的客体。
在一个实施例中，其中所述客体是一牙齿的修复材料，一个表面包含巯基，并局部电氧化，而另一表面包含氨基。
在一个实施例中，所述方法充当一胶水，用以将包含氧化的巯基的表面和包含氨基的表面连接起来。在一个实施例中，所述客体包括：至少一个包含氧化的巯基的表面和至少一个包含氨基的表面。
在一个实施例中，这种方法用于微接触印刷和蛋白质阵列微芯片的制造。
还提供了在贵金属离子的存在下，采用氧化还原反应修饰包含-SH基团的表面，用于随后共价连接包含至少一个氨基的至少一个分子。
还进一步提供了至少一个表面固定包含至少一个氨基的分子的使用，所述表面在贵金属离子存在的情况下，通过氧化还原反应中连接有金-硫簇。
实施例
实施例1
Micromer-M PEG-NH 2
可从市面上购买的单分散的-M微粒(Micromod partikeltechnologieGmbH)用于进行这些研究。每个微粒都包含一磁赤铁矿(γ-Fe203)纳米微粒的核心，所述纳米微粒包含在苯乙烯-马来酸共聚物的基质中，其表面的涂层包括由具有氨基官能团(amino function)(-NH-(CH2-O-CH2)200-NH2)的双官能团团聚乙二醇修饰的交联聚(甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸)(poly(methylmethacrylate-co-methacrylic acid)组成。磁珠具有4.9μm的平均直径，标准偏差为0.2μm。他们分散在水中，浓度为7×108个微粒/ml，而磁性材料的浓度为50mg/ml。根据生产商所述，取代度为每毫克5-6nmol的NH2基团或每个微粒2×108个NH2-基团。
在Micromer-M PEG-NH 2 上引入的SS-吡啶基
在1000μl PBS(10mM磷酸盐、150mM NaCl、10mM EDTA，pH为7.4)中洗涤-M PEG-NH2(100μl，7×108个微粒/毫升)三次，并在1000μl PBS中再悬浮。添加氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯(SPDP)(25μl，在DMSO中浓度为20mM)至磁珠悬浮液中，并反应90分钟。使用1000μl PBS冲洗磁珠5次，在1000μl PBS中再悬浮并保持在4℃。
确定SS-吡啶基/微粒的比率
将Micromer-M PEG-SS-吡啶基(100μl，7×107个微粒)与含2％(w/v)二硫苏糖醇(DTT)的1000μl PBS混合，并置于室温下反应20分钟。用一磁铁聚集微粒，而悬浮液进一步用于SS-吡啶基含量(图1)的分光光度分析，使用岛津(日本京都)UV-2101PC分光光度计和石英比色皿在波长343nm下检测。每个微粒大约连接1.0×108个SS-吡啶基基团。
制备Micromer-M PEG-SH
电氧化之前，使用外部的磁铁聚集在1000μl悬浮液(7×107微粒/ml)中的Micromer-M PEG-SS-吡啶基微粒，并把缓冲液换成1000μl的二硫苏糖醇(DTT)的醋酸缓冲液(pH为4.5，2％w/v的DTT)，置于室温下反应20分钟。使用PBS(10mM磷酸盐、150mM NaCl，pH为7.4)冲洗磁珠5次，再悬浮在80ml PBS中，最终浓度为8.75×106个微粒/ml，在室温下保存。
制备琼脂糖-SH微粒
用蒸馏水在玻璃滤器上冲洗Sepharose 6B，并吸干。在2.4ml 1M的氢氧化钠溶液中悬浮3克干凝胶微粒，并在室温下搅拌着，逐滴加入0.45ml的表氯醇。温度升高到60℃并维持2小时。在玻璃过滤器上用蒸馏水冲洗琼脂糖凝胶，直到达到中性。进一步地，在玻璃过滤器上用50ml、0.5M、pH为6.3的磷酸盐缓冲液冲洗环氧化物活化的凝胶(3克)，并吸干。该凝胶在磷酸盐缓冲液(6ml)中再悬浮。加入3ml 2M的硫代硫酸钠，并在室温下震荡混合物6小时。用蒸馏水从硫代硫酸酯凝胶中洗掉过量的硫代硫酸钠。为了制备一巯基化的凝胶，硫代硫酸酯凝胶使用二硫苏糖醇(DTT)还原。在玻璃过滤器上冲洗0.1克的硫代硫酸酯凝胶，并悬浮在3ml 0.1M的碳酸氢钠溶液中。加入含0.1克DTT的EDTA溶液2ml(1mM)，并还原该酯凝胶30分钟。该还原的凝胶使用30ml的0.1M碳酸氢钠溶液(1M氯化钠和1mMEDTA)冲洗，最后用100ml的1mM EDTA溶液冲洗。巯基化的Sepharose 6B微粒悬浮在10mM的磷酸钠缓冲液中。
电氧化实验装置
用于微粒电氧化的反应池由一金板组成，其上安装有聚四氟乙烯圆筒。通过一安装在金板底部的永久磁铁施加一垂直磁场(金板的内表面上350毫特斯拉)。反电极和参考电极安装在反应池内，而充当工作电极的金板在外部连接到反应池(见图1)。
电氧化微粒上的巯基
在实验前，反应池和工作电极在7.5ml的30％(w/v)双氧水(默克公司，分析纯)和15ml硫酸(分析纯)的混合液中清洗，然后再用水冲洗。然后，将0.75mg巯基化的微粒或0.25mg磁性微粒或2-6mg琼脂糖微粒的3mlPBS溶液加入反应池中。微粒依靠重力(琼脂糖微粒)和磁场(磁性微粒)分布在金表面5分钟。施加相对Ag/AgCl参考电极为0.45-0.90V的电势1秒钟。在不同电势氧化巯基化磁珠之间，用PBS冲洗工作电极、反电极和参考电极。其后，再悬浮微粒的数量，并且通过永久磁铁聚集磁性微粒和通过离心作用聚集琼脂糖微粒，体积减少到200μl。测量之前，在没有微粒的情况下，在PBS溶液中记录一循环伏安图(-0.2至+1.5V，50mV/s)，以验证工作电极的正常工作。
生物分子和电氧化微粒的连接
从电氧化实验得到的微粒悬浮液与100μl生物分子(IgG、β-丙氨酸、α-乳白蛋白、α-乳白蛋白(FITC)和蛋白A)(2mg/ml，PBS中)混合，并反应40分钟。用大约10ml的PBS冲洗微粒来去除未连接的生物分子。对微粒表面的荧光度和氨基酸进行分析来评价反应。使用配有Nikon CoolPix摄像头的尼康Eclipse荧光荧光显微镜对荧光进行评价。调整荧光滤光片以提供494nm的激发波长和520nm的发射波长。根据Spackman、Stein和Moore开发的经典法改进版本来进行氨基酸分析，这种方法通过使用特殊的过滤器，允许在一4.6×200mm的高分辨Ultrapac8树脂(biachrome)PEEK柱分离所有的氨基酸。使用Biachrome 20和Biachrome 30分析仪，在两种不同的波长，440nm和570nm下检测氨基酸的量。检测限为25-50pmol，而定量限为50-100pmol。将2ml的6M HCl(包含一内标准)添加到一已知重量的固定体积的微粒悬浮液中，然后在100℃下水解24小时。在氨基酸分析之前，冷冻干燥琼脂糖颗粒。
实施例2
研究在不同电势下进行电氧化
通过使用FITC标记的分子研究，固定化分子均匀地分散在整个磁珠表面。连接分子的能力取决于电氧化步骤过程中施加的电压(见表1a)，其中，在0伏时，分子非特异性吸附，而在0.9伏电压时达到最大吸附。表1中所显示的结果表明，可以通过施加电压和微粒的浓度来调节微粒上分子的取代度。生物分子的结合容量在琼脂糖(Sepharose6B)上进行研究，并且发现每克冷冻干燥的琼脂糖结合29.4mg IgG。
表1a：
电势，V 微粒质量(mg) 生物分子 容量mg/微粒
0.9 0.75 IgG 3.5
0.75 0.75 IgG 2.2
0.45 0.75 IgG 1.8
在不同的电压下，研究α-乳白蛋白结合到琼脂糖的能力。进行60秒电氧化。进行氨基酸分析来计算结合的α-乳白蛋白的量。请参阅表1b的结果。
表1b：
实施例3
稳定性研究
为了研究表面和固定化分子之间化学键的稳定性，将IgG和β-丙氨酸固定到电氧化的磁性微粒上。用过量的pH为7.2的磷酸盐缓冲液充分地洗涤微粒几小时(duringhours)，以及在这一充分洗涤步骤的前后进行氨基酸分析。
充分洗涤后，磁性微粒上的固定化IgG和β-丙氨酸的稳定性分别是100％和75％，见表2a。
通过新鲜电氧化的微粒存储在二恶烷和乙醇(50％v/v在蒸馏水中)中30天后，结合IgG以研究磁性微粒表面上的活性硫/金复合物的稳定性，见表2b。电氧化中形成的活性结构显示为分别66％和42％的稳定性。
对在电氧化过程中形成的琼脂糖上的硫/金复合物的活性稳定性进行了研究。在1.0V下，对琼脂糖电氧化60秒。一半的琼脂糖与作为参考样本的α-乳白蛋白反应，另一半则储存在pH为5的醋酸盐缓冲液中。40天后，去掉醋酸盐缓冲液，并加入α-乳白蛋白。对两个样品进行氨基酸分析。参考样本每克干琼脂糖获得31mgα-乳白蛋白，而存储在醋酸盐缓冲液中的琼脂糖微粒每克干琼脂糖获得27mgα-乳白蛋白。因此，储存在醋酸盐缓冲液中后，硫/金复合物的活性是88％。
表2a和2b。A上半部分，IgG和β-丙氨酸固定到电氧化的磁性微粒上的化学键的稳定性。B下半部分，储存在二恶烷和50％乙醇中后连接IgG，微粒表面上的活性结构的稳定性。
实施例4
低pH值下的稳定性研究
为了研究在低pH值下固定蛋白到电化学氧化的琼脂糖的稳定性，蛋白A和IgG已成功如上文所述固定了。其后，琼脂糖-蛋白微粒用pH为3的甘氨酸缓冲液处理20分钟。如表3所示，蛋白A和IgG之间的化学键在pH为3时能稳定至少20分钟。可以得出的结论是，固定化分子在低pH值下是稳定的。
表3.IgG和蛋白A固定在电氧化巯基琼脂糖微粒上，以用于研究在pH为3时，IgG和蛋白A之间的化学键的稳定性。
实施例5
比较琼脂糖-SH微粒的化学氧化和电氧化
使用过氧化氢的化学氧化。2mg巯基化琼脂糖微粒在2ml 3.5％的pH为5的H2O2醋酸盐缓冲液中氧化20小时。氧化后，微粒在玻璃过滤器上用10ml PBS冲洗。500μlα-乳白蛋白(FITC)(PBS中2mg/ml)生物分子添加到氧化的琼脂糖-SH微粒中。反应40分钟和24小时后，对微粒表面的荧光度进行评估。反应40分钟后，发现没有荧光。反应24小时后，在荧光显微镜中使用200倍放大，在微粒表面上可见弱荧光。与电氧化琼脂糖-SH微粒相比较，对于琼脂糖微粒上的天然生物分子来说，这是一种效率不高的技术，而电氧化在40分钟后，肉眼可见α-乳白蛋白(FITC)的荧光。
使用过氧化氢和氯化金(III)的化学氧化
8mg巯基化琼脂糖微粒在10ml 3.5％的pH为5的H2O2醋酸盐缓冲液中氧化12小时，氧化后，微粒在玻璃过滤器上用50ml PBS冲洗。然后，微粒与10ml氯化金(III)(在PBS中8mM)溶液混合2分钟。在玻璃过滤器上用100ml PBS冲洗，然后与500μlα-乳白蛋白(FITC)(在PBS中2mg/ml)生物分子混合40分钟。然后，在玻璃过滤器上再用50mlPBS冲洗微粒。该微粒显示出强烈的均匀的荧光，表示生物分子成功地固定到琼脂糖微粒上。
使用氯化金(III)的化学氧化。8mg的巯基化琼脂糖微粒与10ml氯化金(III)(在PBS中8mM)溶液混合2分钟。在玻璃过滤器上用100ml PBS冲洗，然后与500μlα-乳白蛋白(FITC)(在PBS中2mg/ml)生物分子混合40分钟。然后，在玻璃过滤器上再用50mlPBS冲洗微粒。该微粒显示出强烈的均匀的荧光，表示生物分子成功地固定到琼脂糖微粒上。
表4.显示了在不同氧化过程后金的含量，以及生物分子固定到氧化的琼脂糖-SH微粒上后α-乳白蛋白(FITC)(LALBA)的含量。e.Ox是如上文所述在1.0伏下电氧化60秒，C.Ox琼脂糖(AuCl3)是用氯化金(III)进行化学氧化，而C.Ox琼脂糖(H2O2/AuCl3)是用过氧化氢和氯化金(III)进行化学氧化。在所有情况下，氧化8mg的琼脂糖-SH微粒。使用ICP测量金的含量，而LALBA的含量通过氨基酸分析来确定。

Claims (34)

1.一种将包含至少一个氨基的至少一个分子共价固定的方法，所述方法包括以下一系列的步骤：
a)提供一包含-SH基团的表面；
b)在至少一个贵金属离子存在的情况下，通过氧化还原反应将包含-SH基团的表面氧化，以获得可反应的贵金属离子簇；和
c)将包含至少一个氨基的至少一个分子与所述表面接触，以将所述至少一个分子共价连接到所述表面上，其中所述至少一个氨基包含在获得的连接至所述贵金属离子簇的共价键中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个贵金属离子选自由金和铂组成的组。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述氧化还原反应在所述表面生成至少一个官能团，并且其中所述至少一个官能团选自由二硫键、硫代亚磺酸酯基和硫代磺酸基组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述表面上的官能团与贵金属离子反应。
5.根据权利要求1所述的方法，其中使用氧化还原反应氧化所述表面的步骤之前，-SH基团的至少一部分相互发生反应。
6.根据权利要求1所述的方法，其中使用氧化还原反应氧化所述表面的步骤之前，基本所有的-SH基团相互发生反应。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子选自以下组，所述组由包含氨基酸、多肽、蛋白质和适体的分子组成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子为实体的一部分，所述实体选自以下组，所述组由包含病毒的实体、包含病毒片段的实体、包含细菌的实体、包含细菌片段的实体、包含细胞的实体和包含细胞碎片的实体组成。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子为包含碳原子的分子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子是蛋白质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原反应是在水溶液中进行的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原反应是在溶剂混合物中进行的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面与包含至少一个氨基的至少一个分子接触的步骤在水溶液中进行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面与包含至少一个氨基的至少一个分子接触的步骤在溶剂混合物中进行。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在温度15℃到300℃进行。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原反应包括电氧化，并且其中所述电氧化采用0.5V到3V的电势进行。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原反应包括电氧化，并且其中所述电氧化的进行时间为1秒到10分钟。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面与包含至少一个氨基的至少一个分子的接触，该过程的进行时间为10分钟到10小时。
21.一种包括至少一个表面的客体，其中包含至少一个氨基的至少一个分子共价结合到所述表面，其中所述至少一个分子通过权利要求1-19中任一项所述的方法固定到所述表面上。
22.根据权利要求21所述的客体，其中所述客体是一传感器。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的客体，其中所述客体是适用于诊断目的的客体。
24.根据权利要求21所述的客体，其中所述客体是一色谱分离用的介质。
25.根据权利要求21所述的客体，其中所述客体是一生物材料。
26.根据权利要求21所述的客体，其中包含氧化的巯基的至少一个表面与包含氨基的至少一个表面连接。
27.根据权利要求21所述的客体，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子选自以下组，所述组由包含氨基酸、多肽、蛋白质和适体的分子组成。
28.根据权利要求21所述的客体，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子为实体的一部分，所述实体选自以下组，所述组由包含病毒的实体、包含病毒片段的实体、包含细菌的实体、包含细菌片段的实体、包含细胞的实体和包含细胞碎片的实体组成。
29.根据权利要求21所述的客体，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子为包含碳原子的分子。
30.根据权利要求27所述的客体，其中所述蛋白质为抗体。
31.根据权利要求22所述的客体，其中所述包含至少一个氨基的至少一个分子是蛋白质。
32.根据权利要求31所述的客体，其中所述蛋白质为抗体。
33.一种用以形成可与氨基反应而形成共价键的硫-金属离子复合物或簇并用于随后共价连接包含至少一个氨基的至少一个分子的方法，所述方法在贵金属离子的存在下，在包含-SH基团的表面上进行氧化还原反应。
34.一种在贵金属离子存在的情况下，通过氧化还原反应制得结合硫代亚磺酸酯基的表面和结合硫代磺酸基的表面中的至少一个并用于固定包含至少一个氨基的分子的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105792925B (zh) * 2013-09-09 2018-03-09 微球实验公司 磁性颗粒的制造
JP6525341B2 (ja) * 2013-09-09 2019-06-05 ラボ − オン − ア − ビード エービー 磁気分離のための新規な方法及びシステム
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CN112763703B (zh) * 2020-12-31 2023-04-28 深圳天深医疗器械有限公司 一种免疫磁珠及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1538879A (zh) * 2001-06-01 2004-10-20 ������������ʽ���� 导电催化剂颗粒及其生产方法、气体-扩散催化电极和电化学器件

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2227322T3 (da) * 2007-12-13 2012-05-14 Sven Oscarsson Partiel derivatisering af partikler

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1538879A (zh) * 2001-06-01 2004-10-20 ������������ʽ���� 导电催化剂颗粒及其生产方法、气体-扩散催化电极和电化学器件

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A review on polysiloxane-immobilized ligand systems:Synthesis, characterization and applications;EL-NAHHAL I M ET AL.,;《JOURNAL OF ORGANOMETALLIC CHEMISTRY》;20070615;第692卷(第14期);第2861-2886页 *
Electrocatalytic activities of gold-5-amino-mercaptobenzimidazole-Mn+ self-assembled monolayer complexes(Mn+:Ag+，Cu2+) for hydroquinone oxidation investigated by CV and EIS;Reza Karimi Shervedani et al.;《ELECTROCHIMICA ACTA》;20080110;第53卷;第4185-4192页 *
Generation of Thiolsulfinates/Thiolsulfonates by Electrooxidation of Thiols on Silicon Surfaces for Reversible Immobilization of Molecules;Elisabeth Pavlovic et al.;《Langmuir》;20030404;第19卷;摘要、图1、流程图1，第4218页左栏第2、5段，右栏第2-3段 *
Protein layer coating method on metal surface by electrochemical process through genetical introduced tag;HARUYAMA T ET AL.;《BIOMATERIALS》;20050801;第26卷(第24期);第4944-4947页 *
Synthesis of a Stable and Specific Surface Plasmon Resonance Biosensor Surface Employing Covalently Immobilized Peptide Nucleic Acids;Martin Burgener et al.;《Bioconjugate Chem.》;20001021;第11卷(第6期);第749-754页 *

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