ES2575224T3 - Inmovilización covalente de moléculas que comprenden un grupo amino - Google Patents

Inmovilización covalente de moléculas que comprenden un grupo amino Download PDF

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Abstract

Un método para la inmovilización covalente de al menos una molécula que comprende al menos un grupo amino, comprendiendo dicho método las etapas sucesivas de: a. proporcionar una superficie que comprende grupos -SH, b. oxidar la superficie que comprende grupos -SH por medio de reacciones rédox en presencia de al menos un ion de metal noble, para obtener agrupaciones de iones de metales nobles reactivos con azufre, c. poner en contacto la superficie con al menos una molécula que comprende al menos un grupo amino para obtener la unión covalente de la al menos una molécula a la superficie, en donde dicho al menos un grupo amino está involucrado en la obtención de dicho enlace covalente con la agrupación de ión de metal noble azufre.

Description

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Descripcion
Inmovilizacion covalente de moleculas que comprenden un grupo amino Campo tecnico
La presente invencion se refiere en general a la inmovilizacion covalente de moleculas que comprenden al menos un grupo amino.
Antecedentes
Las tecnicas para la inmovilizacion covalente de moleculas sobre superficies son de importancia crucial en la ciencia de las superficies. Por ejemplo enzimas inmovilizadas poseen muchas ventajas que incluyen que ninguna o solo una cantidad extremadamente pequena de enzima inmovilizada se disuelve en la reaccion. Al finalizar, las mezclas de reaccion tlpicamente contienen solo el disolvente y los productos de reaccion. La enzima inmovilizada se elimina facilmente de la reaccion facilitando el reciclado.
Los ejemplos incluyen pero no se limitan a areas tales como la catalisis, los biosensores, la impresion por microcontacto, la cromatografla, y los dispositivos anallticos. Hoy en dla se encuentran disponibles varias tecnicas de inmovilizacion, por ejemplo basadas en la qulmica de silanol, qulmica clic, y un metodo utilizado comunmente para la inmovilizacion de biomoleculas, el llamado metodo de NHS (N-hidroxisuccinimida). Los inconvenientes para todas esas tecnicas incluyen enlaces inestables entre las moleculas inmovilizadas y la superficie, productos qulmicos toxicos costosos o un requisito previo para disolventes organicos durante la introduccion de estructuras reactivas sobre las superficies.
La tecnica mas utilizada hoy en dla es la llamada tecnica de acoplamiento NHS (N-hidroxisuccinimida). Una de las varias desventajas con esta tecnica ha sido descrita por ejemplo por Wilchek. De acuerdo con este ultimo autor, se sabe que este metodo produce enlaces inestables especialmente para moleculas ancladas en un solo punto. Se ha informado, p. ej., de que 50% de la alanina inmovilizada por este metodo se puede perder en 40 dlas (Cuatrecasas et al. en Biochemistry, vol. 11, pag. 2291,1972). De acuerdo con Wilchek et al. en Biochemistry, vol. 26, pag. 2155, 1987 el procedimiento convencional para preparar esteres de NHS (es decir, N-hidroxisuccinimida y carbodiimidas) conduce a la formacion de compuestos inmovilizados inestables sobre pollmeros que contienen tambien grupos hidroxilo. Este fenomeno es debido a la formacion de un derivado de p-alanina que se une al pollmero que contiene hidroxi, dando como resultado un enlace inestable.
Otras desventajas de la tecnica NHS incluyen que el enlace ester que se utiliza para la inmovilizacion covalente de moleculas tales como alanina o IgG competira con la hidrolisis del ester en medios acuosos y que se deben utilizar condiciones anhidras en algunas etapas para la preparacion de este ultimo enlace ester que implica el uso de dioxano. La etapa 1 de este procedimiento es la inmovilizacion de una diamina (3',3-diaminodipropilcarbodiimida) a la matriz, seguida en la etapa 2, por un intenso lavado con dioxano para ser capaz de crear condiciones anhidras para la siguiente etapa 3. En la etapa 3, se anade N-hidroxisuccinimida, junto con la matriz y la 3',3- diaminodipropilamina que reacciona con el grupo amino introducido sobre la superficie en dioxano.
Existen alternativas al metodo NHS, pero las condiciones de reaccion implican el uso de disolventes organicos y productos qulmicos costosos.
Pavlovic et al. utilizaron la impresion por electrocontacto para inmovilizar protelnas en los patrones sobre una superficie plana de silicio tiolado, por oxidacion selectiva del sitio de tioles a tiolsulfinatos (Nanoletters vol. 3, Num. 6, 779-781, 2003).
El documento WO 2009/074692 describe un metodo para derivatizar parcialmente una superficie curva que comprende la electro-oxidacion.
Compendio
Un objeto de la presente invencion consiste en aliviar al menos algunos de los inconvenientes de la tecnica anterior y proporcionar un metodo mejorado para la inmovilizacion de moleculas que comprenden al menos un grupo amino y proporcionar objetos que comprenden tales moleculas inmovilizadas.
En un primer aspecto, se proporciona un metodo para la inmovilizacion covalente de al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino, comprendiendo dicho metodo las etapas sucesivas de:
a. proporcionar una superficie que comprende grupos -SH,
b. oxidar la superficie que comprende los grupos -SH por medio de reacciones redox en presencia de al menos un ion de metal noble, para obtener agrupaciones de iones de metales nobles reactivos con azufre,
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c. poner en contacto la superficie con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino para obtener la union covalente de al menos una molecula a la superficie, en donde dicho al menos un grupo amino esta involucrado en la obtencion de dicho enlace covalente con la agrupacion de iones de metales nobles- azufre.
En un segundo aspecto, se proporciona un objeto que comprende al menos una superficie, en donde al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino se une covalentemente a la superficie, en donde al menos una molecula se inmoviliza sobre la superficie por medio del metodo anterior.
Los autores de la presente invencion han llevado a cabo una amplia investigacion y han encontrado que los grupos que se forman por reacciones redox que implican grupos tiol sobre una superficie en presencia de iones de metales nobles tales como iones Au o iones Pt dan como resultado la formacion de agrupaciones de azufre-Au o agrupaciones azufre-Pt que son reactivas en la siguiente etapa con los tioles y los grupos amino de las moleculas.
Las ventajas de la invencion incluyen el hecho de que es una tecnica mas versatil para la inmovilizacion de moleculas puesto que la etapa adicional de introducir grupos tiol en la molecula se puede eliminar y todas las etapas de reaccion se puede llevar a cabo en solucion acuosa.
Una ventaja adicional es que todas las etapas se pueden llevar a cabo a la temperatura ambiente (aproximadamente 20-25°C).
Otra ventaja es que los enlaces covalentes formados durante las reacciones redox que afectan a los grupos de la superficie y los grupos amino son estables, incluso para moleculas ancladas en un solo punto.
Otra ventaja mas es que el metodo se puede llevar a cabo con muy pocas etapas. Si los grupos tiol estan disponibles sobre la superficie desde el principio, el procedimiento es un procedimiento de una unica etapa. El metodo es mas facil de realizar en comparacion con los metodos de acuerdo con la tecnica anterior.
Sin embargo, una ventaja adicional es que los productos qulmicos utilizados son menos costosos y menos toxicos en comparacion con los de la tecnica anterior.
El procedimiento redox es rapido, lo que lleva a la formacion de nano-agrupaciones en cuestion de segundos.
Breve descripcion de los dibujos
La invencion se describe con referencia a los siguientes dibujos en los que:
La Figura 1 muestra una realizacion en la que las moleculas que contienen -SH sobre una superficie son electro-oxidadas.
La figura 2 muestra una configuracion utilizada en una realizacion para la electro-oxidacion de cuentas magneticas. Las cuentas magneticas son atraldas por el electrodo de trabajo (W) mediante el uso de un iman permanente montado debajo del electrodo. Se aplica un potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia (R) empleando un potenciostato, que tambien mide la corriente entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo (C).
Descripcion detallada
Antes de dar a conocer y describir la invencion en detalle, se debe entender que esta invencion no se limita a los compuestos, configuraciones, etapas del metodo, sustratos, y materiales concretos descritos en la presente memoria ya que tales compuestos, configuraciones, etapas del metodo, sustratos, y materiales pueden variar algo. Se debe entender tambien que la terminologla empleada en la presente memoria se utiliza con el proposito de describir realizaciones concretas y no se pretende que sea limitante ya que el alcance de la presente invencion esta limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
Hay que senalar que, como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una" y "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Si no se define nada mas, los terminos y terminologla cientlficos utilizados en la presente memoria estan destinados a tener los significados comunmente entendidos por los expertos en la tecnica a la que pertenece esta invencion.
El termino "aproximadamente" segun se utiliza en relacion con un valor numerico a lo largo de la descripcion y las reivindicaciones, indica un intervalo de precision, conocido y aceptado por un experto en la tecnica. Dicho intervalo es de ± 10%.
Segun se utiliza a lo largo de las reivindicaciones y de la descripcion, el termino "inmovilizacion" en relacion con las moleculas indica la union a un material. La presente invencion tiene que ver con la union covalente de las moleculas a un material base.
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Segun se utiliza a lo largo de las reivindicaciones y de la description, el termino "electro-oxidacion" se refiere a la oxidation por un potencial electrico o corriente aplicados externos.
Se proporciona un metodo para la inmovilizacion de al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino, comprendiendo dicho metodo las etapas sucesivas de: a) proporcionar una superficie que comprende grupos -SH, b) oxidar la superficie que comprende los grupos -SH en presencia de iones de metales nobles tales como iones Au o iones Pt a una superficie que comprenden grupos SH y c) poner en contacto la superficie con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino para obtener una union covalente de la al menos una molecula a la superficie, en donde dicho al menos un grupo amino esta involucrado en la obtencion de dicho enlace covalente.
En una realization, se utiliza una superficie que comprende grupos -SH como punto de partida y en una realization alternativa los grupos -SH se introducen sobre la superficie.
En una realizacion, la oxidacion comprende electro-oxidacion.
Despues de la oxidacion, la superficie se pone en contacto con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino. De esta manera el grupo amino de la al menos una molecula reacciona y forma un enlace covalente con la superficie de modo que la al menos una molecula se une covalentemente a la superficie.
En una segunda realizacion, se utiliza una superficie que comprende grupos -SH como punto de partida y en una realizacion alternativa se introducen grupos -SH sobre la superficie. La superficie se somete a continuation al tratamiento con electro-oxidacion. Despues de la electro-oxidacion la superficie se pone en contacto con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino. De esta manera el grupo amino de al menos una molecula reacciona y forma un enlace covalente con la superficie de modo que la al menos una molecula se une covalentemente a la superficie.
Sin desear estar ligado a ninguna teorla cientlfica particular, los autores de la presente invention creen que las reacciones redox en presencia de iones de metales nobles, tales como iones de oro o de platino oxidan los tioles a disulfuros sobre la superficie durante la formation de, p. ej., nanoagrupaciones de Au-azufre.
En una realizacion, al menos una fraction de los grupos -SH se hace reaccionar entre si antes de la etapa de oxidacion de la superficie. En una realizacion, al menos una fraccion de los grupos -SH se hace reaccionar para producir enlaces -S-S-.
En una realizacion, esencialmente todos los grupos -SH se hacen reaccionar entre si antes de la etapa de oxidacion de la superficie. Por esencialmente todo se entiende que se hace reaccionar al menos 99% del numero de moleculas, preferiblemente mas de 99,9%.
En una realizacion que no forma parte de la invencion la al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino es al menos una molecula seleccionada del grupo que consiste en moleculas que comprenden al menos un atomo de carbono, un aminoacido, un peptido, una protelna, un anticuerpo, un aptamero, un virus, un fragmento de virus, una bacteria, un fragmento bacteriano, una celula, y un fragmento de celula. En una realizacion, la al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino es al menos una molecula seleccionada del grupo que consiste en una protelna, y un anticuerpo.
En una realizacion la reaction redox se lleva a cabo en una solution acuosa. En una realizacion, la electro-oxidacion se lleva a cabo en una mezcla de disolventes.
En una realizacion la etapa de poner en contacto la superficie con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino se realiza en una solucion acuosa. En una realizacion la etapa de poner en contacto la superficie con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino se lleva a cabo en una mezcla de disolventes.
En una realizacion el metodo se lleva a cabo a una temperatura de 15°C a 30°C. En una realizacion alternativa, el metodo se lleva a cabo a una temperatura ambiente de aproximadamente 20°C a 25°C. En otra realizacion mas, el metodo se lleva a cabo a una temperatura de 5°C a 45°C. En una realizacion alternativa que no comprende biomoleculas sensibles a la temperatura, el metodo se lleva a cabo a una temperatura de hasta varios cientos de grados. En una realizacion el metodo se lleva a cabo a una temperatura de 15°C a 300°C.
En una realizacion en la que se utiliza la electro-oxidacion, la electro-oxidacion se lleva a cabo utilizando un potencial de 0,5 a 3 V en relation con un electrodo de platino convencional como electrodo de referencia. En una realizacion, la electro-oxidacion se lleva a cabo utilizando un potencial de 0,1 a 5 V. En una realizacion, la electro-oxidacion se lleva a cabo utilizando un potencial de 0,5 a 2 V. En otra realizacion, la electro-oxidacion se lleva a cabo utilizando un potencial de 0,5 a 1,5 V. En una realizacion, la electro-oxidacion se lleva a cabo durante un perlodo de tiempo de 1 segundo a 10 minutos. En una realizacion alternativa, la electro-oxidacion se lleva a cabo durante un perlodo de tiempo de 0,1 segundos a 10 horas.
En una realizacion en la que se utiliza la electro-oxidacion, la configuracion de electro-oxidacion comprende un
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electrodo de trabajo y un contraelectrodo. Opcionalmente, la configuracion comprende adicionalmente un electrodo de referencia adaptado para medir el potencial electrico del electrodo de trabajo. En una realizacion, al menos uno de los electrodos esta recubierto con oro. En una realizacion, al menos uno de los electrodos esta adaptado para girar en la solucion durante la electro-oxidacion. En una realizacion, se construye una celda de fluido para obtener una gran area de superficie del electrodo de trabajo, en la que se lleva a cabo la electro-oxidacion.
En una realizacion la puesta en contacto de la superficie con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino se lleva a cabo durante un perlodo de tiempo de 10 minutos a 10 horas. En una realizacion alternativa, la electro-oxidacion se lleva a cabo durante un perlodo de tiempo de 0,1 segundos a 72 horas.
En una realizacion, la superficie se somete a derivatizacion para obtener grupos funcionales sobre la superficie, los grupos funcionales que finalmente se obtienen sobre la superficie despues de la derivatizacion se seleccionan entre grupos -SH y grupos -SS-. Preferiblemente, la superficie se somete a derivatizacion antes de la electro-oxidacion.
En una realizacion se utiliza un tampon de acetato de Na con un pH de 4-5.
En un segundo aspecto, se proporciona un objeto que comprende al menos una superficie, en donde al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino se une covalentemente a la superficie, en donde la al menos una molecula se inmoviliza sobre la superficie por medio del metodo descrito anteriormente.
En una realizacion el objeto es una partlcula. En una realizacion el objeto es un sensor. En una realizacion el objeto es un medio de separacion cromatografica. En una realizacion el objeto es un biomaterial. En una realizacion el objeto es un material de reparacion para un diente. En una realizacion el objeto es un objeto adecuado para fines de diagnostico.
En una realizacion en la que el objeto es un material de reparacion para un diente, una superficie comprende tioles y es localmente electro-oxidada, mientras que la otra superficie comprende grupos amino.
En una realizacion, el metodo se utiliza como un pegamento para unir una superficie que comprende tioles que estan oxidados y una superficie que comprende grupos amino. En una realizacion el objeto comprende al menos una superficie que comprende grupos tiol oxidados unida con al menos una superficie que comprende grupos amino.
En una realizacion se utiliza el metodo para la impresion por micro-contacto y la fabricacion de microchips para matrices de protelnas.
Tambien se proporciona el uso de una reaccion redox para modificar una superficie que comprende grupos -SH en presencia de iones de metales nobles para la posterior union covalente de al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino.
Se proporciona adicionalmente la utilizacion de al menos una superficie unida a una agrupacion de Au-S elaborada por medio de una reaccion redox en presencia de iones de metales nobles para inmovilizar una molecula que comprende al menos un grupo amino.
Ejemplos
Ejemplo 1
Micromer -M PEG -NH2
En estas investigaciones se utilizaron partlculas Micromer® -M (Micromod Partikeltechnologie GmbH) monodispersas disponibles en el mercado. Cada partlcula consiste en un nucleo de nanopartlculas de maghemita (y- Fe2O3) incluido en una matriz copolimerica de estireno-acido maleico con un recubrimiento de superficie que consiste en poli(metacrilato-acido co-metacrllico) entrecruzado modificado con polietilenglicol bifuncional con funcionalidad amino (-NH-(CH2-O-CH2)2oo-NH2). Las cuentas tenlan un diametro medio de 4,9 pm con una desviacion tlpica de 0,2 pm. Estas se dispersaron en agua con una concentracion de 7 x 108 partlculas/ml y con un contenido de material magnetico de 50 mg/ml. El grado de sustitucion fue de 5-6 nmoles de grupos NH2 por mg o 2,2 x 108 grupos NH2 por partlcula, de acuerdo con el fabricante.
Introduccion de SS-piridilo en Micromer -M PEG-NH2
Se lavo tres veces Micromer® -M PEG-NH2 (100 pL, 7 x 108 partlculas/mL) en 1000 pL de PBS (fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4) y se resuspendio en 1000 pL de PBS. Se anadio 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (25 pL, 20 mM en DMSO) a la suspension de cuentas y se hizo reaccionar durante 90 minutos. Las cuentas se lavaron cinco veces con 1000 pL de PBS, se resuspendieron en 1000 pL de PBS y se mantuvieron a 4°C.
Determinacion de la razon de SS-piridilo/partfcula
Se mezclo Micromer -M PEG-SS-piridilo (100 pL, 7 x 107 partlculas) con 1000 pL de ditiotreitol (DTT) en PBS que
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contenla 2% p/v de DTT y se incubo a la temperatura ambiente durante 20 min. Las partlcuias se recogieron con un iman y el sobrenadante se utilizo adicionalmente en los analisis espectrofotometricos del contenido de SS-piridilo (Fig. 2) determinados por medio de espectrofotometrla, utilizando un espectrofotometro Shimadzu (Kyoto, Japon) UV-2101 PC y cubetas de cuarzo, a una longitud de onda de 343 nm (? = 8080 M-1cm-1). Se anclaron a cada partlcula aproximadamente 1,0 x 108 grupos SS-piridilo.
Preparacion de Micromer -M PEG-SH
Inmediatamente antes de la electro-oxidacion, se recogieron las partlculas de Micromer -M PEG-SS-piridilo en 1000 pL de suspension (7 x 107 partlculas/ml) con un iman externo y el tampon se cambio a 1000 pL de ditiotreitol (DTT) en tampon de acetato (pH 4,5, DTT al 2% p/v) y se incubo a la temperatura ambiente durante 20 min. Las cuentas se lavaron cinco veces con PBS (fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4), se resuspendieron en 80 ml de PBS a una concentracion final de 8,75 x 106 partlculas/ml y se mantuvieron a la temperatura ambiente.
Preparacion de partlculas de agarosa - SH
Se lavo Sefarosa 6B con agua destilada sobre un filtro de vidrio y se seco por succion. Se suspendieron 3 g de partlculas secas de gel en 2,4 ml de solucion de hidroxido sodico 1 M y se anadio epiclorhidrina 0,45 ml gota a gota con agitacion a la temperatura ambiente. La temperatura se aumento a 60°C y se mantuvo durante 2 horas. El gel de sefarosa se lavo con agua destilada hasta la neutralidad sobre un filtro de vidrio. Adicionalmente, el gel activado con epoxido (3 g) se lavo sobre el filtro de vidrio con 50 ml de tampon de fosfato 0,5 M pH 6,3 y se seco por succion. El gel se resuspendio en tampon de fosfato (6 ml). Se anadieron 3 ml de tiosulfato de sodio 2 M y la mezcla se sacudio durante 6 horas a la temperatura ambiente. El tiosulfato de sodio en exceso se lavo fuera del gel de ester de tiosulfato con agua destilada. Con el fin de preparar un gel tiolado se redujo el gel de ester de tiosulfato con ditiotreitol (DTT). Se lavo 1 g del gel de ester de tiosulfato sobre un filtro de vidrio y se suspendio en 3 ml de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadieron 0,1 g de DTT en 2 ml de EDTA (1 mM) y el gel de ester se redujo durante 30 minutos. El gel reducido se lavo con 30 ml de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M (cloruro de sodio 1 M y EDTA 1 mM) y finalmente con 100 ml de solucion de EDTA 1 mM. Las partlculas de Sefarosa 6B tioladas se suspendieron en tampon de fosfato de sodio 10 mM.
Ajuste experimental para la electro-oxidacion
La celda de reaccion utilizada para la electro-oxidacion de las partlculas consistio en un cilindro de teflon montado sobre la parte superior de una placa de oro. Se aplico un campo magnetico vertical mediante el uso de un iman permanente montado debajo de la placa de oro (350 mT en la superficie interior de la placa de oro). Los contra- electrodos y los electrodos de referencia se montaron dentro de la celda de reaccion y la placa de oro que actuaba como electrodo de trabajo se conecto fuera de la celda de reaccion (vease la Fig. 2)
Electro-oxidacion de tioles sobre las partlculas
Antes de los experimentos, la celda de reaccion y el electrodo de trabajo se limpiaron en una mezcla de 7,5 ml de peroxido de hidrogeno al 30% (p/v) de (Merck Inc., calidad P.A.) y 15 ml de acido sulfurico (calidad P.A.), seguido de aclarado con agua. A continuacion se anadieron partlculas tioladas, partlculas magneticas 0,75 mg o 0,25 mg o 2-6 mg de partlculas de agarosa, en 3 ml de PBS a la celda de reaccion. Se permitio que las partlculas se distribuyeran sobre la superficie de oro por las fuerzas de gravedad (partlculas de agarosa) y el campo magnetico (partlculas magneticas) durante 5 min. Se aplicaron potenciales que abarcaban de 0,45 a 0,90 V frente al electrodo de referencia de Ag/AgCl durante 1 s. Entre las diferentes oxidaciones de cuentas tioladas los contraelectrodos de trabajo y los electrodos de referencia se lavaron con PBS. Despues de eso las partlculas se resuspendieron y se redujo el volumen a 200 pL mediante la recogida de partlculas magneticas con un iman permanente y de las partlculas de agarosa por medio de centrifugacion. Antes de las mediciones, se registro un voltamograma clclico (0,2 a +1,5 V, 50 mV/s) en la solucion de PBS en ausencia de partlculas para verificar que el electrodo de trabajo de oro estaba funcionando correctamente.
Conjugacion de biomoleculas a partlculas electro-oxidadas
La suspension de partlculas procedentes de los experimentos de electro-oxidacion se mezclo con 100 pL de biomoleculas (IgG, p-alanina, a-lactoalbumina, a-lactoalbumina (FITC) y protelna A) (2 mg/ml en PBS) y se incubo durante 40 minutos. Las biomoleculas no unidas se eliminaron por lavado de las partlculas en aproximadamente 10 ml de PBS. Las reacciones se evaluaron con respecto al grado de fluorescencia de la superficie de la partlcula y con el analisis de aminoacidos. La fluorescencia se evaluo con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse equipado con una camara Nikon Coolpix. El filtro de fluorescencia se sintonizo para proporcionar una longitud de onda de excitacion de 494 nm y una longitud de onda de emision de 520 nm. Los analisis de aminoacidos se llevaron a cabo de acuerdo con una version mejorada del metodo clasico desarrollado por Spackman, Stein y Moore, por medio del cual la eliminacion de amoniaco mediante el uso de filtros especiales permite la separacion de todos los aminoacidos en una columna PEEK de alta resolucion de 4,6 x 200 mm con resina Ultrapac 8 (Biachrome). Se detecto la cantidad de aminoacidos a dos longitudes de onda diferentes, 440 nm y 570 nm, mediante el uso de los aparatos anallticos Biachrome 20 y Biachrome 30. El llmite de deteccion es de 25-50 pmoles y el llmite de cuantificacion es de 50-100
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pmoles. Se anadieron 2 ml de HCl 6 M (que contenla un patron interno) a un volumen fijo de suspension de partlcuias de peso conocido, que despues se hidrolizo a 100°C durante 24 h. Las partlculas de agarosa se liofilizaron antes del analisis de aminoacidos.
Ejemplo 2
Estudio de diferente potencial durante la electro-oxidacion
Las moleculas inmovilizadas se distribuyeron homogeneamente por toda la superficie de la cuenta investigada mediante el uso de moleculas marcadas con FITC. La capacidad para unirse a las moleculas depende del voltaje aplicado durante la etapa de electro-oxidacion (vease la Tabla 1a) con una adsorcion inespeclfica de las moleculas a voltaje cero y un maximo a un voltaje de 0,9 V. Los resultados mostrados en la Tabla 1 indican que es posible regular el grado de sustitucion de las moleculas sobre las partlculas, tanto por el voltaje aplicado como por la concentracion de partlculas. Se investigo la capacidad de union de las biomoleculas sobre agarosa (Sepharose 6B) y se encontro que era de 29,4 mg de IgG por g de agarosa liofilizada.
Tabla 1a:
Potencial, V
Masa de partlculas (mg) biomolecula Capacidad mg/partlcula
0,9
0,75 IgG 3,5
0,75
0,75
IgG 2,2
0,45
0,75 IgG 1,8
La capacidad de union de a-lactoalbumina a agarosa se investigo para diferentes voltajes. La electrooxidacion se llevo a cabo durante 60 segundos. Se realizo un analisis de aminoacidos para calcular la cantidad de a- lactoalbumina unida. Veanse los resultados en la Tabla 1b.
Tabla 1b:
Potencial, V
Masa en mg de a- lactoalbumina por peso en g de agarosa seca biomolecula
0
1,23 mg / g a-lactoalbumina
0,5
0,91 mg / g a-lactoalbumina
1,0
51,96 mg / g a-lactoalbumina
1,5
28,7 mg / g a-lactoalbumina
2,0
26,0 mg / g a-lactoalbumina
Ejemplo 3
Estudios de estabilidad
Con el fin de investigar la estabilidad de los enlaces entre la superficie y la biomolecula inmovilizada, se inmovilizaron IgG y p-alanina a partlculas magneticas sometidas a electro-oxidacion. Las partlculas se lavaron exhaustivamente con un gran exceso de solucion salina tamponada con fosfato a pH 7,2 durante horas y los analisis de aminoacidos se llevaron a cabo antes y despues de este extenso procedimiento de lavado.
La estabilidad para la IgG y la p-alanina inmovilizadas sobre las partlculas magneticas despues de un lavado
5
10
15
20
25
exhaustivo es de 100% y 75% respectivamente, vease la Tabla 2a.
La estabilidad del complejo de azufre reactivo/Au sobre la superfine de las particulas magneticas fue investigada mediante el almacenamiento de las particulas recien electro-oxidadadas durante 30 dias en dioxano y etanol (50% v/v en agua destilada) antes del anclaje de IgG, vease la Tabla 2b. Las estructuras reactivas formadas en la electro- oxidacion muestran una estabilidad de 66% y 42% respectivamente.
Investigation de la estabilidad del complejo de azufre/Au reactivo sobre agarosa formado durante la electro- oxidacion. La agarosa se sometio a electro-oxidacion a 1,0 V durante 60 s. La mitad de la agarosa se hizo reaccionar con a-lactoalbumina, como una muestra de referencia, y la otra mitad se almaceno en tampon de acetato a pH 5. Despues de 40 dias se retiro el tampon de acetato y se anadio a-lactoalbumina. Los analisis de aminoacidos se realizaron en ambas muestras. La muestra de referencia obtuvo 31 mg de a-lactoalbumina por g de agarosa seca mientras que las particulas de agarosa almacenadas en tampon de acetato obtuvieron 27 mg de a-lactoalbumina por g de agarosa seca. Por lo tanto, la reactividad del complejo de azufre/Au fue de 88% despues del almacenamiento en tampon de acetato.
Tabla 2a y 2b. A parte superior, estabilidad de los enlaces para IgG y p-alanina inmovilizadas a particulas magneticas electro-oxidadas. B parte inferior, estabilidad de las estructuras reactivas en la superficie de las particulas en dioxano y etanol al 50% antes del anclaje de IgG.
Potencial, V
Masa de particulas, mg biomolecula lavado con PBS, ml Capacidad mg/particula Estabilidad %
0,9
0,75 IgG 10 3,6 100
0,9
0,75 IgG 50 3,6 100
0,9
0,75 p-alanina 10 0,8 100
0,9
0,75 p-alanina 50 0,6 75
Potencial, V
Masa de particulas, mg Medios de almacenamiento Dias Capacidad mg/particula Estabilidad %
0,9
0,25 PBS 0 7,4 100
0,9
0,25 Dioxano 30 4,9 66
0,9
0,25 Etanol del 50% en peso 30 3,1 42
Ejemplo 4
Estudios de estabilidad a pH bajo
Con el fin de investigar la estabilidad a pH bajo de las proteinas inmovilizadas a agarosa electroquimicamente oxidada, se inmovilizaron satisfactoriamente proteina A e IgG como se ha descrito anteriormente. Despues de eso, las particulas de agarosa-proteina se trataron con tampon de glicina, pH 3 durante 20 minutos. Como se muestra en la Tabla 3 la union entre la proteina A inmovilizada y la IgG fue estable durante al menos 20 minutos a pH 3. Se puede concluir que las moleculas inmovilizadas son estables a pH bajo.
Tabla 3. IgG y proteina A inmovilizadas sobre particulas de tiol-agarosa electro-oxidadadas para la investigacion de la estabilidad de los enlaces entre la proteina A y la agarosa a pH 3.
Potencial, V
Masa de agarosa, mg biomolecula Capacidad mg/particula
0,9
2,01 IgG 29,4
5
10
15
20
25
30
Potencial, V
Masa de agarosa, mg biomolecula Capacidad mg/partfcula
0,9
2,01 Protefna A 3,2
0,9
2,01 Protefna A lavada con tampon de glicina pH 3 durante 20 minutos 7,8
Ejemplo 5
Comparacion entre la oxidacion qufmica y la electro-oxidacion de partfculas de agarosa-SH
Oxidacion qufmica con peroxido de hidrogeno. Se oxidaron 2 mg de partfculas de agarosa tiolada en 2 ml de H2O2 al 3,5% en tampon de acetato pH 5 durante 20 horas. Despues de la oxidacion las partfculas se lavaron sobre un filtro de vidrio con 10 ml de PBS. Las biomoleculas, 500 pl de a-lactoalbumina (FITC) (2 mg/ml en PBS) se anadieron a las partfculas de agarosa - SH oxidadas. Se evaluo la reaccion despues de 40 minutos y despues de 24 horas con respecto al grado de fluorescencia de la superficie de la partfcula. Despues de 40 minutos no se encontro ninguna fluorescencia. Despues de 24 horas, aparecio en la superficie de la partfcula una fluorescencia debil, que era visible en el microscopio de fluorescencia con un aumento de 200 veces. En comparacion con las partfculas de agarosa - SH electro-oxidadas, donde la fluorescencia de la a-lactoalbumina (FITC) es visible a simple vista despues de 40 minutos, esta no es una tecnica eficiente para la inmovilizacion de biomoleculas nativas sobre partfculas de agarosa.
Oxidacion qufmica con peroxido de hidrogeno y cloruro de oro (III). Se oxidaron 8 mg de partfculas de agarosa tiolada en 10 ml de H2O2 al 3,5% en tampon de acetato a pH 5 durante 12 horas. Despues de la oxidacion, las partfculas se lavaron sobre un filtro de vidrio con 50 ml de PBS. Las partfculas se mezclaron a continuacion con una solucion de 10 ml de cloruro de oro (III) (8 mM en PBS) durante 2 minutos. Las partfculas se lavaron sobre un filtro de vidrio con 100 ml de PBS y a continuacion se mezclaron con las biomoleculas, 500 pl de a-lactoalbumina (FITC) (2 mg/ml en PBS) durante 40 minutos. A continuacion, las partfculas se lavaron de nuevo en un filtro de vidrio con 50 ml de PBS. Las partfculas muestran una fuerte fluorescencia homogenea que indica que las biomoleculas se inmovilizan con exito sobre las partfculas de agarosa.
Oxidacion qufmica con cloruro de oro (III). Se mezclaron 8 mg de partfculas de agarosa tiolada con una solucion de 10 ml de cloruro de oro (III) (8 mM en PBS) durante 2 minutos. Las partfculas se lavaron sobre un filtro de vidrio con 100 ml de PBS y a continuacion se mezclaron con las biomoleculas, 500 pl de a-lactoalbumina (FITC) (2 mg/ml en PBS) durante 40 minutos. A continuacion, las partfculas se lavaron de nuevo sobre un filtro de vidrio con 50 ml de PBS. Las partfculas muestran una fuerte fluorescencia homogenea que indica que las biomoleculas se inmovilizan con exito sobre las partfculas de agarosa.
Tabla 4. Muestra el contenido de oro, despues de diferentes procedimientos de oxidacion, y a-lactoalbumina (FITC) (LALBA) despues de la inmovilizacion de las biomoleculas sobre las partfculas de agarosa - SH oxidadas. e.Ox es la electro-oxidacion como se describio anteriormente durante 60 segundos a 1,0 voltios, C.Ox Agarosa (AuCl3) es la oxidacion qufmica con cloruro de oro (III) y C.Ox Agarosa (H2O2/AuCl3) es la oxidacion qufmica con peroxido de hidrogeno y cloruro de oro (III). Se oxidan 8 mg de partfculas de agarosa - SH en todos los casos. El contenido de oro se mide con ICP y el contenido de LALBA se determina con el analisis de aminoacidos.
Muestra
Mg Au Mmoles Au Mg LALBA nmoles LALBA
e.Ox Agarosa-SH
80,3 0,407614 176 12,57143
C.Ox Agarosa (AuCl3)
729,7 3,704061 296,8 21,2
C.Ox Agarosa
372,3 1,889848 218,1 15,57857
Muestra
M9 ^moles M9 nmoles
Au Au LALBA LALBA
(H2O2/AuCl3)

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la inmovilizacion covalente de al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino, comprendiendo dicho metodo las etapas sucesivas de:
    a. proporcionar una superficie que comprende grupos -SH,
    b. oxidar la superficie que comprende grupos -SH por medio de reacciones redox en presencia de al menos un ion de metal noble, para obtener agrupaciones de iones de metales nobles reactivos con azufre,
    c. poner en contacto la superficie con al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino para obtener la union covalente de la al menos una molecula a la superficie, en donde dicho al menos un grupo amino esta involucrado en la obtencion de dicho enlace covalente con la agrupacion de ion de metal noble- azufre.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el al menos un ion de metal noble se selecciona del grupo que consiste en Au y Pt.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde al menos una fraccion de los grupos -SH se hace reaccionar entre si antes de la etapa de oxidacion de la superficie utilizando reacciones redox.
  4. 4. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino es al menos una molecula seleccionada del grupo que consiste en una protelna, y un anticuerpo.
  5. 5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha reaccion redox comprende electrooxidacion, y en donde la electro-oxidacion se lleva a cabo utilizando un potencial de 0,5 a 3 V.
  6. 6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha reaccion redox comprende electrooxidacion, y en donde la electro-oxidacion se lleva a cabo durante un perlodo de tiempo de 1 segundo a 10 minutos.
  7. 7. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la superficie se somete a derivatizacion para obtener grupos funcionales sobre la superficie, en donde los grupos funcionales se seleccionan del grupo que consiste en grupos -SH y grupos -SS-.
  8. 8. Un objeto que comprende al menos una superficie, en donde al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino se une covalentemente a la superficie, en donde la al menos una molecula se inmoviliza sobre la superficie por el metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  9. 9. El objeto de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde el objeto es un sensor.
  10. 10. El objeto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en donde el objeto es un medio de separacion cromatografica.
  11. 11. El objeto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde el objeto es un biomaterial.
  12. 12. El objeto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde al menos una superficie que comprende grupos tiol oxidados se une con al menos una superficie que comprende grupos amino.
  13. 13. El objeto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde la al menos una molecula que comprende al menos un grupo amino es al menos una molecula seleccionada del grupo que consiste en una protelna, y un anticuerpo.
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