CN104020287B - 一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒 - Google Patents

一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104020287B
CN104020287B CN201410284858.5A CN201410284858A CN104020287B CN 104020287 B CN104020287 B CN 104020287B CN 201410284858 A CN201410284858 A CN 201410284858A CN 104020287 B CN104020287 B CN 104020287B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide chain
nano
particle
proteinase
fmoc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410284858.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104020287A (zh
Inventor
朱高红
周朴臣
王红旺
史蒂芬·博斯曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410284858.5A priority Critical patent/CN104020287B/zh
Publication of CN104020287A publication Critical patent/CN104020287A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104020287B publication Critical patent/CN104020287B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含有荧光和/或放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒，所述试剂盒组分包括磁性纳米粒子、蛋白酶特异剪切肽链和放射性核素，磁性纳米粒子包括芯核、壳层和保护层，由芯核向外层依次结合形成，磁性纳米粒子为Fe/Fe3O4芯核/壳层纳米粒子，壳层外依次设置氨基硅氧烷保护层、Au辅助保护层和有机隐蔽层；有机隐蔽层上引入核素标记物；试剂盒制备包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链的合成、核素标记物的引入及纳米试剂平台构建步骤。本发明纳米平台的各个组份均为无毒，生物适用性高的材料，蛋白酶特异的剪切肽链对和肿瘤特异的蛋白酶具有高灵敏度的响应性，该项目检测为快捷、准确、特异的方法学。

Description

一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒
技术领域
本发明属于材料、生物和分析化学交叉学科技术领域，具体涉及一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒。
背景技术
磁性纳米粒子之所以具有广阔的应用前景，是因为它具有许多不同于常规材料的独特效应，如量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应及宏观量子隧道效应等，这些效应使磁性纳米粒子具有不同于常规材料的光、电、声、热、磁、敏感特性。
当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺磁性状态，无矫顽力和剩磁。众所周知，对于块状磁性材料（如Fe、Co、Ni），其体内往往形成多畴结构以降低体系的退磁场能。纳米粒子尺寸处于单畴临界尺寸时具有高的矫顽力。小尺寸效应和表面效应导致磁性纳米粒子具有较低的居里温度。另外，磁性纳米粒子的饱和磁化强度（Ms）比常规材料低，并且其比饱和磁化强度随粒径的减小而减小。当粒子尺寸降低到纳米量级时，磁性材料甚至会发生磁性相变。当上述纳米粒子应用到活的生物体内时，未受保护的纳米粒子显示完全腐蚀性。因此，开发一种能解决上述问题的耐生物性侵蚀的磁性纳米粒子是非常必要的，可以更进一步推进磁性纳米粒子的应用前景。
肿瘤的发生、发展和转移是一个高度复杂而有序的过程，且受多步骤具有降解作用的酶的级联反应所调节。据报道5种内肽酶(基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、丝氨酸蛋白酶[尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator，uPA)]、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)可能与动物和人类肿瘤的进展相关；而基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和组织蛋白酶(Cathepsin)等蛋白酶是肿瘤发生发展所必须的，是目前在肿瘤研究中最为热门的蛋白酶。
基质金属蛋白酶MMPs能降解细胞外基质(ECM)和基底膜组织(BM)，参与许多病理生理过程，且与肿瘤的发生、发展、浸润和转移以及肿瘤血管生成等事件密切相关。MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～MMP26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为6类，即胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。
uPA具有促进肿瘤发生发展、浸润转移的作用，研究表明uPA在胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中表达升高。
组织蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶（组织蛋白酶D、E）和丝氨酸蛋白酶（组织蛋白酶A、G）。根据其底物特异性分类，组织蛋白酶又包括肽链内切酶-组织蛋白酶B、F、H、K、L、S、V，肽链端解酶-组织蛋白酶B、C、H、X，氨基肽酶-组织蛋白酶C、H，羧肽酶-组织蛋白酶B、X。人类和动物的肿瘤中如胃癌、膀胱癌、结肠癌、神经胶质瘤、黑色素瘤等都发现Cat-B表达水平和/或活性升高。曾有报道在宫颈癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤组织Cat-B表达及其活性成倍甚至3-9 倍高于邻近正常组织。Ueda等认为Cat-B活性、浓度增高是移行性细胞癌变病人肿瘤侵袭、转移以及预后较差的一个危险因子。除Cat-B之外，其他许多组织蛋白酶也与肿瘤关系密切。如Cat-D与卵巢癌、黑色素瘤，尤其是乳腺癌的浸润、转移有关， 认为它可以作为乳腺癌的预后标志。Cat-L可以通过催化降解基质膜， 促进肿瘤的侵袭、转移，已经在肾癌、睾丸癌、肺非小细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌和甲状腺癌等多种癌症中发现组织蛋白酶L高表达等。
实践证明，早期发现并诊断肿瘤转移和预测肿瘤转移的风险，进而采取行之有效的预防治疗措施非常重要，即便是没有临床转移灶的部分早期癌症，术后辅助化疗也能延长患者的无瘤生存期。所以，除了寻求可靠的预后及预测因子来评估肿瘤患者的复发、转移风险，以便制定合理的治疗手段和方案，避免治疗不足和过度治疗以外，设计和表征灵敏特异快速准确的检测方法，为制定个体化治疗方案提供新的判断思路显得更为重要。为此，技术人员开发了多种适合于肿瘤早起诊断的检测肿瘤生物标志物蛋白酶的方法：比如，免疫组化分析技术（Immunohistochemical，IHC）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）。
前者亦称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术，基于免疫学及组织化学原理，利用抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究。其优点是特异性和敏感性较强，可以对组织细胞进行精确定位。其突出的缺点在于组织切片制备、染色过程繁琐，费时费力，检测成本高，不利于推广普及。
后者酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到较高的敏感度。该方法虽然简便，检测灵敏度高，易于临床推广，对临床评估预后、治疗等工作更有意义。在反应过程中，抗原决定簇与抗体的抗原结合位点在空间构型上和化学结构呈互补关系，因而使ELISA法与其他免疫组化方法相比，具有高度的特异性。但是试验中的每一种抗体都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，而且费用相对提高。实验中存在多种不可控因素，易造检测结果出现失真。换言之，ELISA法的优点可以替代组织切片免疫组化检测法，但是其存在利用组织切片进行研究费用较高、耗时，取材不便，操作步骤复杂，在临床不易被广泛推广应用的不足。
近年来，随着科学技术的发展，各种新型荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、准确、定量和自动化的方向发展。基于纳米磁粒子的光触发技术已经被开发应用，借助荧光光谱检测的灵敏性，为检测蛋白酶提供一种可靠、及时、特异和灵敏的方法打下基础。荧光光谱检测技术具有灵敏度高、选择性强、样品用量少及方法简便、能提供较多的物理参数以及环保的特点，但是其存在荧光淬灭效应、散射光的干扰等问题，同时，此方法用于复杂机体的样品测定比较困难。为此，科学工作者曾研究开发了Fe/Fe3O4核/壳磁性纳米粒子以及带有有机保护层（如硅氧烷层）的纳米粒子，用于血清中特异活性蛋白酶的检测，尤其通过剪切特异肽链，利用荧光检测技术对相关癌症进行早期诊断；并可利用磁性纳米粒子的热磁效应，将其导入人体肿瘤细胞组织，然后再利用磁热疗法或电浆热疗来提高对肿瘤细胞的靶向治疗效果。但是，研究发现，尽管这种纳米粒子增加了Fe3O4保护层以及硅氧烷保护层，但是这种纳米粒子依然经受不住人体生理环境下的组织对产生的生物腐蚀，难以逃避人体免疫系统对其的侦测与破坏。这样就给应用这种纳米粒子对血清中相关特异蛋白酶的检测的灵敏度造成影响；尤其用于导入并结合磁热治疗也难以达到预期的效果。可见，Fe/Fe3O4核/壳磁性纳米粒子的生物腐蚀性问题就成为了其用于特异蛋白酶检测，乃至导入治疗的瓶颈问题。因此，研究开发高耐蚀性人体特异蛋白酶敏感纳米粒子对将纳米技术用于针对人体组织病症表征的特异蛋白酶的检测和介入治疗意义重大，必将为人类癌症的早期诊断与治疗提供更为有效，且快速简便的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有荧光和/或放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒。
本发明的第一目的是这样实现的，所述试剂盒组分包括磁性纳米粒子、蛋白酶特异剪切肽链和放射性核素，所述的磁性纳米粒子包括芯核、壳层和保护层，由芯核向外层依次结合形成，所述的磁性纳米粒子为Fe/Fe3O4芯核/壳层纳米粒子，壳层外依次设置氨基硅氧烷保护层、Au辅助保护层和有机隐蔽层，所述的有机隐蔽层为以多巴胺为基础的低聚二醇单元，且其配体长度为2.9~7mm；所述的有机隐蔽层上引入核素标记物；所述的试剂盒制备包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链的合成、核素标记物的引入及纳米试剂平台构建步骤，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；
B、蛋白酶特异的剪切肽链的合成：将原料FMOC保护氨基酸经过HBTU活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异的剪切肽链；
C、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链，赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件下以NH3 +的形式存在，从而整个肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就被引入到纳米平台；
D、蛋白酶特异的剪切肽链与寡聚赖氨酸肽链连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接；
E、纳米平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接，赖氨酸的侧链中NH3 +和放射性核素125I-NaI或Na125I的125I－化学静电吸附的作用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
本发明纳米平台的各个组份均为无毒，生物适用性高的材料。所选取的两个荧光分子TCPP和Cy5.5具有很好的光学匹配性。放射性核素标记的蛋白酶特异的剪切肽链对和肿瘤特异的蛋白酶具有高灵敏度的响应性。同时由于该方法应用生物响应性较高的磁性纳米颗粒作为载体携带靶向性肽链，形成单一试剂体系，不但增强了试剂的稳定性，而且大大延长了试剂的有效期。反应体系系酶切反应，整个实验操作程序简单易行，温育反应后无需离心直接进行荧光探测，大大减少了标本的用量，视为目前该项目检测最为快捷、准确、特异的方法学。
附图说明
图1为磁性纳米粒子结构示意图；
图中：1-芯核，2-壳层，3-保护层，4-金属辅助保护层，5-有机隐蔽层；
图2为Fe/Fe3O4/Au磁性纳米粒子制备流程示意图；
图3为实施例3中Fe/Fe3O4/Au磁性纳米粒子制备示意图；
图4为Fe/Fe3O4磁性纳米粒子结构图；
图5为本发明高耐蚀性纳米粒子结构形成关系示意图；
图6为Fe/Fe3O4磁性纳米粒子的X射线衍射分析图；
图7为四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配图；
图8为纳米试剂平台的工作实例图；
图9为实施例2中Fe/Fe3O4磁性纳米棍示意图；
图10为肿瘤归巢的神经干细胞（NSC）和B16F10黑色素瘤细胞的细胞活性研究示意图；
注：在含有Fe/Fe3O4/隐性纳米粒子的培养基中，分别进行了24小时的细胞培养，然后按照标准程序将这些细胞进行取消并（死/活）染色。
图11为Fe/Fe3O4-剪切肽链-125I示意图；
        图12为Fe3O4-剪切肽链-125I和TCPP示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒，组分包括：
磁性纳米颗粒；
蛋白酶特异剪切肽链；
荧光分子和/或放射性核素。
所述的磁性纳米粒子包括芯核、壳层和保护层，由芯核向外层依次结合形成，所述的芯核为Au、Ag、Cu、Fe、Co、Pb或其氧化物中的一种；所述的壳层为Au、Ag、Cu、Fe、Co、Pb或其氧化物中的一种；所述的保护层为氨基硅氧烷，其特征在于所述的保护层之外还设有金属辅助保护层以及有机隐蔽层。
所述的金属辅助保护层为Au、Ag或Cu辅助保护层。
所述的磁性纳米粒子是以Fe/Fe3O4为芯核/壳层组成的纳米粒子，壳层外设置氨基硅氧烷保护层，氨基硅氧烷保护层外还设有Au辅助保护层，Au辅助保护层外设置有机隐蔽层。
所述的氨基硅氧烷为3-氨基丙基三乙基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-三甲氧基硅烷丙腈或3-三乙氧甲硅烷基丙腈中的一种。
所述的有机隐蔽层为硫醇类、醇类、硝基化合物类、磷化氢类、氧化膦类、间苯二酚类、硒化物类或芳香族化合物中的一种。
所述的有机隐蔽层为次膦酸、磷酸、磺酸、磺酸酯、羧酸、二硫化物、过氧化物、胺、腈、异腈、硫代腈、氧化干性油腈、氧硅烷、烷烃或炔烃中的一种。
所述的有机隐蔽层为烷基硫醇单分子层、氨基烷基硫醇单分子层、烷基巯基硫酸盐单分子层或有机苯酚中的一种。
所述的有机隐蔽层为有机苯酚。
所述的有机苯酚是以巴胺为基础的低聚二醇单元。
所述的低聚二醇单元配体长度小于15nm。
所述的低聚二醇单元配体长度为2.9~7mm。
本发明所述含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒的制备方法：
方法一：包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链的合成、四卟啉荧光分子的合成、花青染料的合成、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配、蛋白酶特异的剪切肽链与四卟啉荧光分子连接、纳米试剂平台构建步骤，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；
B、蛋白酶特异的剪切肽链的合成：将原料FMOC保护氨基酸经过HBTU活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异的剪切肽链；
C、四卟啉荧光分子的合成：将相同当量的4-羧基苯甲醛和吡咯在乙酸溶液中在100~140℃下缩合得到四卟啉荧光分子的粗产物，经过在体积比40~60:60~40的乙醇-乙酸混合液中重结晶后干燥即得；
D、花青染料的合成： 1）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入水溶性基团SO3ˉ；2）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入羧基； 3）第一步和第二步所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到花青染料粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得；
E、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配：四卟啉荧光分子的发射光谱和花青染料的吸收光谱高度重叠，保证了在7~10nm两个光敏分子可以进行有效的能量传递，达到荧光猝灭的效果；
F、蛋白酶特异的剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接；
G、通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接，从而构建了纳米试剂平台，即目标物。
所述含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒的制备方法，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将以五羰基铁为原料，在160~230℃温度条件下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子，在Ar气氛下，通过向反胶束溶液中加入规定量的NH2OH），调整纳米液滴中pH（从< 2 > 7），于15,000 rpm 离心分离10min得到Fe3O4纳米颗粒，再分散于0℃乙醇中，然后加入固体硼氢化钠（NaBH4），形成簇状Fe3O4纳米棒，最后，在氩气氛下，将Fe/Fe3O4纳米粒子分散于水中，再于15,000 rpm 离心分离5min；把Fe/Fe3O4纳米粒子悬浮于四氢呋喃（THF）溶液中悬浮，超声波处理30min后，通过1300~2000rpm低速离心分离未溶解的固体；澄清液中加入3-氨丙基-三乙氧基硅烷，超声波处理8~12h，以13000~20000rpm高速离心分离收集纳米粒子；重新分散于THF中，收集Fe/Fe3O4/ASOX纳米粒子，高真空下干燥，并在氩气氛下储存；将Fe/Fe3O4/ASOX纳米粒子加入HAuCl4水溶液使三价金离子预吸附到Fe/Fe3O4/ASOX的末端氨基官能团上，在60℃温度下由羟氨基团将三价金离子还原为金，高速离心收集Fe/Fe3O4/ASOX/Au纳米粒子，然后分散于乙醇中，在20℃温度条件下，添加NaBH4，将Au+3还原成Au；以高速离心分离得到Fe/Fe3O4/ASOX/Au 纳米颗粒，在于水溶液中分散-收集三次以去除杂质，得到的纳米粒子在高真空下干燥，并于氩气氛下储存；将半胱氨酸酰胺与Fe/Fe3O4/ASOX/Au在超声条件下反应30min，于THF溶液中连续五次分散-高速离心分离得到，Fe/Fe3O4/ASOX/Au/隐形层配体纳米粒子，在高真空下干燥，并在氩气氛下储存。
B、蛋白酶特异剪切肽链的合成：将原料氯甲酸芴甲酯FMOC保护氨基酸经过HBTU（O-Benzotriazole-N,N,N,N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate O-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸盐）活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链，即将相同当量的氨基酸和HBTU溶于体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1/2~1/4氨基酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用1/4~1/6二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)混合液体积的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入1/2~1/4二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)混合液体积的10~30%的体积比10~30:70~90的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、四卟啉荧光分子的合成：将相同当量的4-羧基苯甲醛和吡咯在乙酸溶液中在100~140℃下反应20~40min缩合得到四卟啉荧光分子的粗产物，经过在体积比40~60:60~40的乙醇-乙酸混合液中重结晶后干燥即得，即将相同摩尔当量的4-羧基苯甲醛和吡咯在乙酸溶液于120℃反应20~40min，冷却到室温后，加入适量乙醇继续搅拌0.5~1.5h，与0℃静置12~48h后，过滤收集所得的粗产物，经过在体积比0.5~1.5:0.5~1.5的乙醇-乙酸混合液中重结晶后，得到高纯度的卟啉荧光分子；
1H NMR (DMSO-d6) δ: -2.94 (s, 2H); 8.35 (d, 8H); 8.39 (d, 8H); 8.86 (s, 8H); 13.31 (s, 4H). 13C NMR (DMSO-d6) δ: 119.31; 127.90; 130.51; 134.44; 145.42; 167.46. MS-ESI+: m/z 791.2. Molecular weight calculated for 790.2.
D、花青染料（Cy5.5）的合成： 1）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入水溶性基团SO3ˉ；2）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入羧基； 3）第一步和第二步所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到Cy5.5；得到花青染料粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得，即将等摩尔的SO3ˉ修饰的1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚和丙二醛双（苯亚胺）溶于乙酸酐中，加热到100~140℃，搅拌40~50min。冷却到室温后，加入到相同摩尔的羧基修饰的1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚吡啶溶液，室温下搅拌15~19h。高真空抽去溶剂后，所得的粗产物用粒径为200微米的硅胶填充柱，5~15%甲醇-氯仿溶液洗脱提纯；所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到花青染料（Cy5.5）粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得；
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ (ppm): 8.48 (t, J=12Hz, 2H), 8.24(d, J=8.2Hz, 2H), 8.06(m, 2H), 7.78(m, 1H), 7.67(m, 1H), 7.51(m, 2H), 6.65(dd, J=8Hz, 1H), 6.44(d, J=12Hz, 1H), 6.33(d, J=12Hz, 1H), 4.23(m, 4H), 3.0(m, 2H), 2.08(m, 2H), 1.96(m, 2H), 1.78(s, 16H), 1.57(m, 2H), 1.42(m, 2H)
E、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配：四卟啉荧光分子的发射光谱和花青染料的吸收光谱高度重叠，保证了在7~10nm两个光敏分子可以进行有效的能量传递，达到荧光猝灭的效果；荧光共振能量传递(FRET)是一种有效的荧光淬灭的方法，其机理在于发光分子和吸光分子拥有高度的光学匹配性，如图3所示，四（4-羧基苯基）卟啉的发射光谱和花青染料Cy5.5的吸收光谱高度重叠，这就保证了在一定距离内（大约7-10纳米），两个光敏分子可以进行有效的能量传递，从而达到荧光淬灭的效果；
F、蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接；即完成所设计的肽链合成后，加入10倍摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和10倍摩尔当量的HBTU溶于(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
G、纳米试剂平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接，从而构建了纳米试剂平台。
纳米平台的构建基于氨基与肽链及花青染料Cy5.5的羧基反应。例如：100 毫克纳米粒子， 15毫克四（4-羧基苯基）卟啉，3毫克花青染料Cy5.5， 4.3 毫克EDC和2毫克DMAP溶于5 毫升二甲基甲酰胺，在60 摄氏度反应10小时后，沉降所得的纳米粒子经充分洗涤后，得到四（4-羧基苯基）卟啉和花青染料Cy5.5比例为1/20的纳米平台。
再如，100 毫克纳米粒子， 12.5毫克四（4-羧基苯基）卟啉，3毫克花青染料Cy5.5， 4.3 毫克EDC和2毫克DMAP溶于5 毫升二甲基甲酰胺，在60 摄氏度反应10小时后，沉降所得的纳米粒子经充分洗涤后，得到四（4-羧基苯基）卟啉和花青染料Cy5.5比例为1/30的纳米平台。
下面以制备部分磁性纳米粒子的具体制备对本发明做进一步说明：
1）Fe/Fe3O4磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；即将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10~20ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥备用；
2）Fe/Fe3O4/ASOX/Au磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，将所得的纳米粒子分散到50ml 2%的油胺/氯仿溶液中，随后加入0.3g 绿金酸，搅拌48小时后，用磁铁将金包裹的磁性纳米粒子收集，用乙醇充分洗涤后，干燥备用。
方法二：包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链的合成、核素标记物的引入及纳米试剂平台构建步骤，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；
B、蛋白酶特异的剪切肽链的合成：将原料FMOC保护氨基酸经过HBTU活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异的剪切肽链；
C、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK），赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷（用zeta-电势法进行检测），将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就被引入到纳米平台。
D、蛋白酶特异的剪切肽链与寡聚赖氨酸肽链连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接；
E、纳米平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接，赖氨酸的侧链中NH3 +和放射性核素125I-NaI或Na125I的125I－化学静电吸附的作用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
方法三：包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链合成、四卟啉荧光分子的合成、花青染料的合成、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配、花青染料的合成、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配、蛋白酶特异的剪切肽链与四卟啉荧光分子连接、纳米试剂平台构建步骤，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；
B、蛋白酶特异的剪切肽链的合成：将原料FMOC保护氨基酸经过HBTU活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异的剪切肽链；
C、四卟啉荧光分子的合成：将相同当量的4-羧基苯甲醛和吡咯在乙酸溶液中在100~140℃下缩合得到四卟啉荧光分子的粗产物，经过在体积比40~60:60~40的乙醇-乙酸混合液中重结晶后干燥即得；
D、花青染料的合成： 1）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入水溶性基团SO3ˉ；2）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入羧基； 3）第一步和第二步所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到花青染料粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得；
E、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配：四卟啉荧光分子的发射光谱和花青染料的吸收光谱高度重叠，保证了在7~10nm两个光敏分子可以进行有效的能量传递，达到荧光猝灭的效果；
F、蛋白酶特异的剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接；
G、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK），赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
H、纳米试剂平台构建：
具体包括以下步骤：
1）、A步骤合成的磁性纳米颗粒的表面修饰，以增加纳米颗粒的水溶性和生物兼容性，其具体步骤为：a) 在纳米颗粒表面引入多巴胺； b) 在纳米颗粒表面引入氧化硅保护层。其检测的方法包括：a) 检查修饰前后水溶性的变化； b) 检查修饰前后zeta-电势的变化；c) 检查对比修饰前后细胞毒性的变化；
2）、在经过修饰的纳米颗粒表面引入蛋白酶特异剪切肽链；由于经表面修饰的纳米颗粒带有活性氨基，蛋白酶特异剪切肽链的C端羧基可以与其反应而形成酰胺键，达到引入肽链的目的；
3）、依据事先设计的荧光分子和核素标记物125I的比例，通过氨基与羧基的缩合反应在纳米颗粒表面的剪切肽链上分别引入四卟啉荧光分子和寡聚赖氨酸肽链，由于对荧光的检测和对核素放射的检测方法互不干扰，这一比例的范围可以是99/1到75/25；
4）、核素标记物125I的引入：将第三步所得到的纳米颗粒分散到30~100 毫摩尔浓度的Na125I水溶液中，用超声仪充分混合反应10分钟，收集磁性纳米颗粒，充分水洗后，干燥备用。
B步骤所述的氨基酸包括：
B步骤所述的蛋白酶包括基质金属蛋白酶系列（MMP 1、MMP 2、MMP 3、MMP 7、MMP 9、MMP 11、MMP 13）、尿激酶A（uPA）、组织蛋白酶系列（CTS B、CTS D、CTS K、CTS L）；所述的特异剪切肽链包括VPMS-MRGG、IPVS-LRSG、RPFS-MIMG、VPLS-LTMG、VPLS-LYSG、GGAAN-LVRGG、GPQGLA-GQRGIV、SGR-SA、SLLKSR-MVPNFN、SLLIFR-SWANFN、GPR-AG、SGVVIA-TVIVIT。
本发明的应用为所述含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒在检测乳腺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤的肿瘤特异性蛋白酶上的应用。
本发明的特点：
1、基质金属蛋白MMP1、MMP2、MMP3、 MMP7、 MMP9、MMP11、 MMP13,　尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)和组织蛋白酶B,D, L 和K等在绝大多数乳腺癌和非小细胞肺癌处于正调节状态，因此它们对相关癌症具有一定的诊断价值。
2、本发明能充当肿瘤细胞生存、进展、新生血管和组织侵袭的生物标志物。
3、本发明能够灵敏的诊断Ⅱ期乳腺癌和Ⅰ期非小细胞肺癌。这个检测癌标志物的技术要比现在常用于临床的检测方法灵敏10-100倍（例如，前列腺癌的癌标志物PSA）。
4、其研究项目旨在通过简单的荧光和／或光子的测量，优化和检测以纳米磁粒子为基础的生物癌标志物蛋白酶的定量分析。我们的纳米平台是由Fe/Fe3O4磁纳米粒子、染料和／或放射性核素、选择性蛋白酶共同剪切系列（肽段）组成，彼此间通过化学键连接。通过蛋白酶对相应肽系列的选择性剪切而触发光事件，即荧光和／或光子，这种荧光和／或光子能进行定量探测。通常样品温育10-30分钟就开始产生荧光和／或光子信号。
5、本发明基于纳米磁粒子的光闪烁技术具有快速（＜30分钟）、灵敏（5×10-14M）。
6、血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒为整体成分组成，操作过程简单，从而减少了操作误差。
试剂成本较低，与其它癌标志物检测方法相比，大大减少了患者的诊断费用。
实施例1
A、Fe/Fe3O4磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10~20ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，分散于500ml氯仿溶液中，加入100g多巴胺，搅拌20小时后，用高速离心的方法将纳米粒子收集起来，用氯仿充分洗涤后，干燥备用。
B、UpA蛋白酶特异剪切肽链的合成(SGRSA)：将3mmol的丝氨基酸和2.9 mmol 的HBTU溶于18ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1 mmol丙氨基酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6 ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用精氨酸、甘氨酸、丝氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、四卟啉荧光分子的合成：将4 mmol的4-羧基苯甲醛和4.5 mmol 吡咯在30ml乙酸溶液中于100~140℃下反应20~40min，冷却到室温后，加入40ml的100%乙醇继续搅拌0.5~1.5h，与0℃静置12~48h后，过滤收集所得的粗产物，经过在体积比0.5~1.5:0.5~1.5的乙醇-乙酸混合液中重结晶后，得到高纯度的卟啉荧光分子；
1H NMR (DMSO-d6) δ: -2.94 (s, 2H); 8.35 (d, 8H); 8.39 (d, 8H); 8.86 (s, 8H); 13.31 (s, 4H). 13C NMR (DMSO-d6) δ: 119.31; 127.90; 130.51; 134.44; 145.42; 167.46. MS-ESI+: m/z 791.2. Molecular weight calculated for 790.2。
D、花青染料（Cy5.5）的合成：将1.5 mol的SO3ˉ修饰的1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚和1.8mol丙二醛双（苯亚胺）溶于乙酸酐中，加热到100~140℃，搅拌40~50min，冷却到室温后，加入到2.2mol的羧基修饰的1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚吡啶溶液，室温下搅拌15~19h，高真空抽去溶剂后得粗产物，用粒径为200微米的硅胶填充柱，5~15%甲醇-氯仿溶液洗脱提纯；所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到花青染料（Cy5.5）粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得；
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ (ppm): 8.48 (t, J=12Hz, 2H), 8.24(d, J=8.2Hz, 2H), 8.06(m, 2H), 7.78(m, 1H), 7.67(m, 1H), 7.51(m, 2H), 6.65(dd, J=8Hz, 1H), 6.44(d, J=12Hz, 1H), 6.33(d, J=12Hz, 1H), 4.23(m, 4H), 3.0(m, 2H), 2.08(m, 2H), 1.96(m, 2H), 1.78(s, 16H), 1.57(m, 2H), 1.42(m, 2H)
E、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配：四卟啉荧光分子的发射光谱和花青染料的吸收光谱高度重叠，保证了在7~10nm两个光敏分子可以进行有效的能量传递，达到荧光猝灭的效果；荧光共振能量传递(FRET)是一种有效的荧光淬灭的方法，其机理在于发光分子和吸光分子拥有高度的光学匹配性，如图3所示，四（4-羧基苯基）卟啉的发射光谱和花青染料Cy5.5的吸收光谱高度重叠，这就保证了在一定距离内（大约7-10纳米），两个光敏分子可以进行有效的能量传递，从而达到荧光淬灭的效果；
F、蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：将3 摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和2.9摩尔当量的HBTU溶于适量的(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
G、纳米试剂平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接，从而构建了纳米试剂平台，将100 毫克纳米粒子， 15毫克四（4-羧基苯基）卟啉，3毫克花青染料Cy5.5， 4.3 毫克EDC和2毫克DMAP溶于5 毫升二甲基甲酰胺，在60 摄氏度反应10小时后，沉降所得的纳米粒子经充分洗涤后，得到四（4-羧基苯基）卟啉和花青染料Cy5.5比例为1/20的纳米平台。
实施例2
A、Fe/Fe3O4磁性纳米棍的制备：将1 mmol 三氯化铁和3 mmol鲸蜡基三甲基溴化铵（CTAB）溶于2 ml 去离子水， 6ml 正辛烷中，1ml 丁醇的混合溶液中。在磁力搅拌的情况下，缓慢滴加5 ml 28%氨水溶液。形成的纳米棍通过高速离心收集，充分水洗后干燥后，分散到15 ml 无水乙醇中，加入0.4g硼氢化钠，还原反应后，得到零价铁的纳米棍。将得到的纳米棍分散到20ml甲苯中，加入1ml（3 - 氨基丙基）三乙氧基硅烷，回流24小时后，高速离心收集纳米棍，用乙醇充分洗涤后干燥备用。（见附图7）
B、MMP-1蛋白酶特异剪切肽链的合成(VPMS-MRGG)：将3 mmol的甘氨基酸和2.9 mmol 的HBTU溶于10 ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1mmol氨基酸当量的树脂担载的甘氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用精氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、MMP-1蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：将3摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和2.9摩尔当量的HBTU溶于(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
（D、E、F步骤同上）
G、纳米试剂平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接，从而构建了纳米试剂平台，将100 毫克纳米粒子， 12.5毫克四（4-羧基苯基）卟啉，3毫克花青染料Cy5.5， 4.3 毫克EDC和2毫克DMAP溶于5 毫升二甲基甲酰胺，在60 摄氏度反应10小时后，沉降所得的纳米粒子经充分洗涤后，得到四（4-羧基苯基）卟啉和花青染料Cy5.5比例为1/30的纳米平台。
实施例3
A、Fe/Fe3O4/Au磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，将所得的纳米粒子分散到50ml 2%的油胺/氯仿溶液中，随后加入0.3g 绿金酸，搅拌48小时后，用磁铁将金包裹的磁性纳米粒子收集，用乙醇充分洗涤后，干燥备用。（见附图8）
B、MMP-2蛋白酶特异剪切肽链的合成IPVS-LRSGC：将3 mmol的甘氨酸和2.9mmol 的HBTU溶于10ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1mmol半胱氨酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、MMP-2蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：将3摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和2.9摩尔当量的HBTU溶于(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂MMP-2蛋白酶特异的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
（D、E、F步骤同上）
G、纳米试剂平台构建：通过高效的硫-金键的作用，从而构建了纳米试剂平台，将50毫克纳米粒子， 1毫克四（4-羧基苯基）卟啉-MMP-2溶于10毫升pH = 7.4 的PBS 缓冲溶液中，在50 摄氏度反应20小时后，沉降所得的纳米粒子经充分洗涤后，得到四（4-羧基苯基）卟啉-MMP-2-Fe/Fe3O4/Au纳米平台。
实施例4
A、Fe/Fe3O4磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10~20ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，分散于500ml氯仿溶液中，加入100g多巴胺，搅拌20小时后，用高速离心的方法将纳米粒子收集起来，用氯仿充分洗涤后，干燥备用。
B、UpA蛋白酶特异剪切肽链的合成(SGRSA)：将3mmol的丝氨基酸和2.9 mmol 的HBTU溶于18ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1 mmol丙氨基酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6 ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用精氨酸、甘氨酸、丝氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK）。赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
D、蛋白酶特异的剪切肽链与寡聚赖氨酸肽链连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接；
E、纳米平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接，赖氨酸的侧链中NH3 +和放射性核素125I-NaI的125I－化学静电吸附的作用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
实施例5
A、Fe/Fe3O4磁性纳米棍的制备：将1 mmol 三氯化铁和3 mmol鲸蜡基三甲基溴化铵（CTAB）溶于2 ml 去离子水， 6ml 正辛烷中，1ml 丁醇的混合溶液中。在磁力搅拌的情况下，缓慢滴加5 ml 28%氨水溶液。形成的纳米棍通过高速离心收集，充分水洗后干燥后，分散到15 ml 无水乙醇中，加入0.4g硼氢化钠，还原反应后，得到零价铁的纳米棍。将得到的纳米棍分散到20ml甲苯中，加入1ml（3 - 氨基丙基）三乙氧基硅烷，回流24小时后，高速离心收集纳米棍，用乙醇充分洗涤后干燥备用。（见附图7）
B、MMP-1蛋白酶特异剪切肽链的合成(VPMS-MRGG)：将3 mmol的甘氨基酸和2.9 mmol 的HBTU溶于10 ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1mmol氨基酸当量的树脂担载的甘氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用精氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK）。赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
D、蛋白酶特异的剪切肽链与寡聚赖氨酸肽链连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接；
E、纳米平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接，赖氨酸的侧链中NH3 +和放射性核素Na125I的125I－化学静电吸附的作用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
实施例6
A、Fe/Fe3O4/Au磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，将所得的纳米粒子分散到50ml 2%的油胺/氯仿溶液中，随后加入0.3g 绿金酸，搅拌48小时后，用磁铁将金包裹的磁性纳米粒子收集，用乙醇充分洗涤后，干燥备用。（见附图8）
B、MMP-2蛋白酶特异剪切肽链的合成IPVS-LRSGC：将3 mmol的甘氨酸和2.9mmol 的HBTU溶于10ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1mmol半胱氨酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK）。赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静 电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
D、蛋白酶特异的剪切肽链与寡聚赖氨酸肽链连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接；
E、纳米平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接，赖氨酸的侧链中NH3 +和放射性核素125I-NaI的125I－化学静电吸附的作用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
实施例7
A、Fe/Fe3O4磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10~20ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，分散于500ml氯仿溶液中，加入100g多巴胺，搅拌20小时后，用高速离心的方法将纳米粒子收集起来，用氯仿充分洗涤后，干燥备用。
B、UpA蛋白酶特异剪切肽链的合成(SGRSA)：将3mmol的丝氨基酸和2.9 mmol 的HBTU溶于18ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1 mmol丙氨基酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6 ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用精氨酸、甘氨酸、丝氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、四卟啉荧光分子的合成：将4 mmol的4-羧基苯甲醛和4.5 mmol 吡咯在30ml乙酸溶液中于100~140℃下反应20~40min，冷却到室温后，加入40ml的   100%乙醇继续搅拌0.5~1.5h，与0℃静置12~48h后，过滤收集所得的粗产物，经过在体积比0.5~1.5:0.5~1.5的乙醇-乙酸混合液中重结晶后，得到高纯度的卟啉荧光分子；
1H NMR (DMSO-d6) δ: -2.94 (s, 2H); 8.35 (d, 8H); 8.39 (d, 8H); 8.86 (s, 8H); 13.31 (s, 4H). 13C NMR (DMSO-d6) δ: 119.31; 127.90; 130.51; 134.44; 145.42; 167.46. MS-ESI+: m/z 791.2. Molecular weight calculated for 790.2。
D、花青染料（Cy5.5）的合成：将1.5 mol的SO3ˉ修饰的1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚和1.8mol丙二醛双（苯亚胺）溶于乙酸酐中，加热到100~140℃，搅拌40~50min，冷却到室温后，加入到2.2mol的羧基修饰的1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚吡啶溶液，室温下搅拌15~19h，高真空抽去溶剂后得粗产物，用粒径为200微米的硅胶填充柱，5~15%甲醇-氯仿溶液洗脱提纯；所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到花青染料（Cy5.5）粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得；
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ (ppm): 8.48 (t, J=12Hz, 2H), 8.24(d, J=8.2Hz, 2H), 8.06(m, 2H), 7.78(m, 1H), 7.67(m, 1H), 7.51(m, 2H), 6.65(dd, J=8Hz, 1H), 6.44(d, J=12Hz, 1H), 6.33(d, J=12Hz, 1H), 4.23(m, 4H), 3.0(m, 2H), 2.08(m, 2H), 1.96(m, 2H), 1.78(s, 16H), 1.57(m, 2H), 1.42(m, 2H)
E、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配：四卟啉荧光分子的发射光谱和花青染料的吸收光谱高度重叠，保证了在7~10nm两个光敏分子可以进行有效的能量传递，达到荧光猝灭的效果；荧光共振能量传递(FRET)是一种有效的荧光淬灭的方法，其机理在于发光分子和吸光分子拥有高度的光学匹配性，如图3所示，四（4-羧基苯基）卟啉的发射光谱和花青染料Cy5.5的吸收光谱高度重叠，这就保证了在一定距离内（大约7-10纳米），两个光敏分子可以进行有效的能量传递，从而达到荧光淬灭的效果；
F、蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：将3 摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和2.9摩尔当量的HBTU溶于适量的(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
G、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK）。赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
H、纳米平台构建：依据事先设计的荧光分子和核素标记物125I的比例，通过氨基与羧基的缩合反应在纳米颗粒表面的剪切肽链上分别引入四卟啉荧光分子和寡聚赖氨酸肽链，再将得到的纳米颗粒分散到30毫摩尔浓度的的Na125I水溶液中，用超声仪充分混合反应10分钟，收集磁性纳米颗粒，充分水洗后，干燥备用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
实施例8
A、Fe/Fe3O4磁性纳米棍的制备：将1 mmol 三氯化铁和3 mmol鲸蜡基三甲基溴化铵（CTAB）溶于2 ml 去离子水， 6ml 正辛烷中，1ml 丁醇的混合溶液中。在磁力搅拌的情况下，缓慢滴加5 ml 28%氨水溶液。形成的纳米棍通过高速离心收集，充分水洗后干燥后，分散到15 ml 无水乙醇中，加入0.4g硼氢化钠，还原反应后，得到零价铁的纳米棍。将得到的纳米棍分散到20ml甲苯中，加入1ml（3 - 氨基丙基）三乙氧基硅烷，回流24小时后，高速离心收集纳米棍，用乙醇充分洗涤后干燥备用。（见附图7）
B、MMP-1蛋白酶特异剪切肽链的合成(VPMS-MRGG)：将3 mmol的甘氨基酸和2.9 mmol 的HBTU溶于10 ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1mmol氨基酸当量的树脂担载的甘氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用精氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、MMP-1蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：将3摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和2.9摩尔当量的HBTU溶于(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
（D、E、F步骤同上）
G、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK）。赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
H、纳米平台构建：依据事先设计的荧光分子和核素标记物125I的比例，通过氨基与羧基的缩合反应在纳米颗粒表面的剪切肽链上分别引入四卟啉荧光分子和寡聚赖氨酸肽链，再将得到的纳米颗粒分散到100毫摩尔浓度的的Na125I水溶液中，用超声仪充分混合反应10分钟，收集磁性纳米颗粒，充分水洗后，干燥备用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
实施例9
A、Fe/Fe3O4/Au磁性纳米粒子制备：将油胺溶于体积比50~70倍1-十二烯中，加热至160~230℃，在氩气保护条件下，加入10ml五羰基铁，保持160~230℃的温度搅拌0.5~1.5h，自然冷却至室温，待制备所得的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子沉降后，倾出上清液，将沉降的铁-四氧化三铁（Fe/Fe3O4）纳米粒子用无水乙醇洗涤4~6次，干燥后，将所得的纳米粒子分散到50ml 2%的油胺/氯仿溶液中，随后加入0.3g 绿金酸，搅拌48小时后，用磁铁将金包裹的磁性纳米粒子收集，用乙醇充分洗涤后，干燥备用。（见附图8）
B、MMP-2蛋白酶特异剪切肽链的合成IPVS-LRSGC：将3 mmol的甘氨酸和2.9mmol 的HBTU溶于10ml体积比1:20~25的二异丙基乙基胺(DIEA)-二甲基甲酰胺(DMD)的混合液中，将此溶液加入到1mmol半胱氨酸当量的树脂担载的氨基酸中，在室温下缓慢摇动0.5~1.5h，滤去液体后，用5ml的二甲基甲酰胺洗涤树脂4~6次，然后加入6ml的10-15%的的哌啶-二甲基甲酰胺溶液，轻摇5~15min以脱去FMOC保护基，分别选用丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异剪切肽链；
C、MMP-2蛋白酶特异剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：将3摩尔当量的四（4-羧基苯基）卟啉和2.9摩尔当量的HBTU溶于(DIEA/DMF=1/23)二异丙基乙基胺/二甲基甲酰胺的混合液中，将此溶液加入到仍担载在树脂MMP-2蛋白酶特异的肽链，经过24小时的反应后，多余的四（4-羧基苯基）卟啉和HBTU经过充分洗涤后除去。从树脂上切割以后，四（4-羧基苯基）卟啉-肽链经高效液相色谱纯化后备用。
（D、E、F步骤同上）
G、核素标记物的引入：为了引进核素标记物125I，我们设计了带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链（KKKKKKKKKK）。赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件（pH=7.4）下会以NH3 +的形式存在，从而整个（KKKKKKKKKK）肽链带有十个正电荷，将这一肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就可以被引入到纳米平台。
H、纳米平台构建：依据事先设计的荧光分子和核素标记物125I的比例，通过氨基与羧基的缩合反应在纳米颗粒表面的剪切肽链上分别引入四卟啉荧光分子和寡聚赖氨酸肽链，再将得到的纳米颗粒分散到50毫摩尔浓度的的Na125I水溶液中，用超声仪充分混合反应10分钟，收集磁性纳米颗粒，充分水洗后，干燥备用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
实施例10——磁性纳米粒子（MNP）毒性试验
以实施例3中制备的Fe/Fe3O4/Au磁性纳米粒子进行试验，具体如下：
磁性纳米粒子（MNP）毒性测试是基于MNP中铁的浓度。含各种铁浓度的MNP介质中加入神经干细胞和B16-F10细胞，并培育过夜。随着铁含量的增加，这些磁性纳米粒子的毒性作用增加。不同磁性纳米粒子浓度对神经干细胞和B16-F10肿瘤细胞的细胞生存力评估显示见附图9。MNP显示出在B16-F10细胞中的毒性，比其在神经干细胞中的毒性更强。在铁浓度达到20 mg / mL（附图9）前，神经干细胞对MNP的耐受性都良好，然而在B16-F10中，铁浓度仅到5 mg / mL时，B16-F10细胞数就降低了。值得注意的是，在上述的培养条件下，没有发现MS-1上皮细胞的细胞活力显著降低。B16F10的新陈代谢是最快的，其次是神经干细胞。比起这两者来，上皮细胞的新陈代谢明显较慢。Fe/Fe3O4/隐形纳米粒子的吸收遵循以上顺序。此外，肿瘤细胞内pH值（高达几乎8.0）35较在干细胞或上皮细胞中更为基本，pH几乎达到中性。因此，可以预期，肿瘤细胞中NP腐蚀增强，导致NP中Fe（Ⅱ）更快释放，因此反应的氧化损伤进一步增强。
实施例11   ——以实施例3制备的纳米平台对乳腺癌和非小细胞肺癌患者活性蛋白酶的测定：
试验地点：美国内部拉斯加州东南部的癌症中心（SENCC）
试验血样品：20个乳腺癌患者、12个非小细胞肺癌患者和12个健康体检者的血样品
试验方法及步骤：
１、3.5uL样品中加入3.0 mL的 PBS纳米试剂。
２、加0.10 mL右旋糖酐(100 mg mL-1)
３、25 oC温育１小时
４、25 oC平衡比色杯10 min
５、读荧光光谱（激发光在421 nm波段)
６、整合患者样品和质控的荧光强度
20个乳腺癌患者、12个非小细胞肺癌患者和12个健康自愿者的血样品检测了基质金属蛋白MMP1、MMP2、MMP3、 MMP7、 MMP9、MMP13,　尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)和组织蛋白酶B 和L，每个样品做３个重复管。
试验结果：乳腺癌第II期能检测到MMP7、uPA活性蛋白酶，第III、IV期能检测到组织蛋白酶B及uPA。
非小细胞肺癌第I期就能检测到MMP-1, MMP-7和MMP-9，第II和III期检测到组织蛋白酶Ｂ、MMP-1和MMP-9。
乳腺癌患者不同期不同蛋白酶的表达检测结果：
N 表示对疾病的不同阶段和控制样本的检测的结果没有统计差别（N- no statistical difference between the stage of disease and control condition）
H 表示对疾病的不同阶段和控制样本的检测的结果有统计差别，并且疾病的不同阶段检测结果的均值高于控制样本借测结果的均值。（H- Difference was seen , the mean value of the outcome variable was higher in the disease stage than the control stage）
L表示对疾病的不同阶段和控制样本的检测的结果有统计差别，并且疾病的不同阶段检测结果的均值低于控制样本借测结果的均值。（L- Difference was seen , the mean value of the outcome variable was lower in the disease stage than the control stage）
病期的肺癌患者与对照组相比结果：
N 表示对疾病的不同阶段和控制样本的检测的结果没有统计差别（N- no statistical difference between the stage of disease and control condition）
H 表示对疾病的不同阶段和控制样本的检测的结果有统计差别，并且疾病的不同阶段检测结果的均值高于控制样本借测结果的均值。（H- Difference was seen , the mean value of the outcome variable was higher in the disease stage than the control stage）
L表示对疾病的不同阶段和控制样本的检测的结果有统计差别，并且疾病的不同阶段检测结果的均值低于控制样本借测结果的均值。（L- Difference was seen , the mean value of the outcome variable was lower in the disease stage than the control stage）
试验结论：本发明用于检测血标本活性蛋白酶的Fe/Fe3O4核－壳纳米磁颗粒试剂，乳腺癌自第II期、非小细胞肺癌自第I期就能检测到相关活性蛋白酶的表达。由于晚期癌症患者平均寿命急剧下降，所以对开发癌症患者早期检测及诊断具有深远意义。

Claims (4)

1.一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒，所述试剂盒组分包括磁性纳米粒子、蛋白酶特异剪切肽链、放射性核素，所述的磁性纳米粒子包括芯核、壳层和保护层，由芯核向外层依次结合形成，所述的磁性纳米粒子为Fe/Fe3O4芯核/壳层纳米粒子，壳层外依次设置氨基硅氧烷保护层、Au辅助保护层和有机隐蔽层，所述的有机隐蔽层为以多巴胺为基础的低聚二醇单元，且其配体长度为2.9~7mm；所述的有机隐蔽层上引入核素标记物；所述试剂盒的制备方法包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链的合成、核素标记物的引入及纳米试剂平台构建步骤，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；
B、蛋白酶特异的剪切肽链的合成：将原料FMOC保护氨基酸经过HBTU活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异的剪切肽链；所述氨基酸包括：
；
C、核素标记物的引入：设计带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链，赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件下以NH3 +的形式存在，从而整个肽链带有十个正电荷；将寡聚赖氨酸肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就被引入到纳米平台；
D、蛋白酶特异的剪切肽链与寡聚赖氨酸肽链连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接；
E、纳米平台构建：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与寡聚赖氨酸肽链和纳米粒子相连接，赖氨酸的侧链中NH3 +和放射性核素125I-NaI或Na125I的125I－化学静电吸附的作用，从而构建了放射性核素纳米试剂平台，即目标物。
2.一种含有荧光分子和放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒，其特征在于所述试剂盒组分包括磁性纳米粒子、蛋白酶特异剪切肽链、荧光分子和放射性核素，所述的磁性纳米粒子包括芯核、壳层和保护层，由芯核向外层依次结合形成，所述的磁性纳米粒子为Fe/Fe3O4芯核/壳层纳米粒子，壳层外依次设置氨基硅氧烷保护层、Au辅助保护层和有机隐蔽层，所述的有机隐蔽层为以多巴胺为基础的低聚二醇单元，且其配体长度为2.9~7mm；所述的有机隐蔽层上引入核素标记物；所述试剂盒的制备方法包括磁性纳米粒子制备、蛋白酶特异的剪切肽链合成、四卟啉荧光分子的合成、花青染料的合成、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配、花青染料的合成、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配、蛋白酶特异的剪切肽链与四卟啉荧光分子连接、纳米试剂平台构建步骤，具体为：
A、磁性纳米粒子制备：将原材料五羰基铁在160~230℃下分解得到Fe/Fe3O4磁性纳米粒子；
B、蛋白酶特异的剪切肽链的合成：将原料FMOC保护氨基酸经过HBTU活化后，形成酰胺键将氨基酸连接到树脂上，经脱FMOC后，进一步与新的氨基酸反应，选用不同氨基酸循环上述步骤达到延长肽链制备蛋白酶特异的剪切肽链；所述氨基酸包括：
氨基酸 分子式 分子量 Fmoc-Ala-OH C18H17NO4 311.3 Fmoc-Arg(pbf)-OH C34H40N4O7S 648.8 Fmoc-Asn(Trt)-OH C38H32N2O5 596.7 Fmoc-Asp(OtBu)-OH C23H25NO6 411.5 Fmoc-Cys(Trt)-OH C37H31NO4S 585.7 Fmoc-Gln(Trt)-OH C39H34N2O5 610.7 Fmoc-Glu(OtBu)-OH C24H27NO6 425.5 Fmoc-Gly-OH C17H15NO4 297.3 Fmoc-His(Trt)-OH C40H33N3O4 619.7 Fmoc-Ile-OH C21H23NO4 353.4 Fmoc-Lue-OH C21H23NO4 353.4 Fmoc-Lys(Boc)-OH C26H32N2O6 468.5 Fmoc-Met-OH C20H21NO4S 371.5 Fmoc-Phe-OH C24H21NO4 387.4 Fmoc-Pro-OH C20H19NO4 337.4 Fmoc-Ser(tBu)-OH C22H25NO5 383.4 Fmoc-Thr(tBu)-OH C23H27NO5 397.5 Fmoc-Trp(Boc)-OH C31H30N2O6 526.6 Fmoc-Tyr(tBu)-OH C28H29NO5 459.5 Fmoc-Val-OH C20H21NO4 339.4
；
C、四卟啉荧光分子的合成：将相同当量的4-羧基苯甲醛和吡咯在乙酸溶液中在100~140℃下缩合得到四卟啉荧光分子的粗产物，经过在体积比40~60:60~40的乙醇-乙酸混合液中重结晶后干燥即得；
D、花青染料的合成：1）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入水溶性基团SO3ˉ；2）在1,1,2 - 三甲基-1H-苯并[e]吲哚上引入羧基；3）第一步和第二步所得的产物与丙二醛双（苯亚胺）缩合和后得到花青染料粗产物，经过硅胶柱纯化后，干燥即得；
E、四卟啉荧光分子和花青染料光学匹配：四卟啉荧光分子的发射光谱和花青染料的吸收光谱高度重叠，保证在7~10nm距离内两个光敏分子进行有效能量传递，达到荧光猝灭的效果；
F、蛋白酶特异的剪切肽链与四卟啉荧光分子连接：通过氨基与羧基的缩合反应使肽链与四卟啉荧光分子和纳米粒子相连接；
G、核素标记物的引入：设计带有正电荷的寡聚赖氨酸肽链，赖氨酸的侧链中带有一个氨基，在生物体内的酸碱条件下会以NH3 +的形式存在，从而整个肽链带有十个正电荷；将寡聚赖氨酸肽链连接到纳米平台后，通过静电吸附的作用，核素标记物125I就被引入到纳米平台；
H、纳米试剂平台构建，具体包括以下步骤：
1）A步骤合成的磁性纳米颗粒的表面修饰，以增加纳米颗粒的水溶性和生物兼容性，表面修饰具体步骤为：a) 在纳米颗粒表面引入多巴胺；b) 在纳米颗粒表面引入氧化硅保护层；表面修饰的检测方法包括：a) 检查修饰前后水溶性的变化；b) 检查修饰前后纳米颗粒zeta-电势和纳米颗粒半径的变化；c) 检查对比修饰前后细胞毒性的变化；
2）在经过修饰的纳米颗粒表面引入蛋白酶特异剪切肽链，经表面修饰的纳米颗粒带有活性氨基，蛋白酶特异剪切肽链的C端羧基与其反应而形成酰胺键；
3）依据事先设计的荧光分子和核素标记物125I的比例，通过氨基与羧基的缩合反应在纳米颗粒表面的剪切肽链上分别引入四卟啉荧光分子和核素标记物125I寡聚赖氨酸肽链，荧光分子和核素标记物125I比例的范围是99/1到75/25；
4）核素标记物125I的引入：将第三步所得到的纳米颗粒分散到30~100毫摩尔浓度的Na125I水溶液中，用超声仪充分混合反应10分钟，收集磁性纳米颗粒，充分水洗后，干燥备用。
3.根据权利要求1所述含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒，其特征在于B步骤所述的蛋白酶包括基质金属蛋白酶MMP 1、MMP 2、MMP 3、MMP 7、MMP 9、MMP 11或MMP 13，尿激酶A，组织蛋白酶CTS B、CTS D、CTS K或CTS L；所述的特异剪切肽链包括VPMS-MRGG、IPVS-LRSG、RPFS-MIMG、VPLS-LTMG、VPLS-LYSG、GGAAN-LVRGG、GPQGLA-GQRGIV、SGR-SA、SLLKSR-MVPNFN、SLLIFR-SWANFN、GPR-AG、SGVVIA-TVIVIT。
4.根据权利要求2所述含有荧光分子和放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒，其特征在于B步骤所述的蛋白酶包括基质金属蛋白酶MMP 1、MMP 2、MMP 3、MMP 7、MMP 9、MMP 11或MMP 13，尿激酶A，组织蛋白酶CTS B、CTS D、CTS K或CTS L；所述的特异剪切肽链包括VPMS-MRGG、IPVS-LRSG、RPFS-MIMG、VPLS-LTMG、VPLS-LYSG、GGAAN-LVRGG、GPQGLA-GQRGIV、SGR-SA、SLLKSR-MVPNFN、SLLIFR-SWANFN、GPR-AG、SGVVIA-TVIVIT。
CN201410284858.5A 2014-06-24 2014-06-24 一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒 Active CN104020287B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410284858.5A CN104020287B (zh) 2014-06-24 2014-06-24 一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410284858.5A CN104020287B (zh) 2014-06-24 2014-06-24 一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104020287A CN104020287A (zh) 2014-09-03
CN104020287B true CN104020287B (zh) 2015-09-16

Family

ID=51437155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410284858.5A Active CN104020287B (zh) 2014-06-24 2014-06-24 一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104020287B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105241939B (zh) * 2015-09-16 2017-08-01 山东理工大学 一种基于金银核壳磁性石墨烯吸附镉离子免疫传感器的制备方法及应用
CN108514647B (zh) * 2018-05-30 2021-04-09 苏州艾渂鑫生物医药技术有限公司 基质金属蛋白酶-2特异性多模态分子影像探针及其制备方法与在制备肿瘤成像剂中的应用
CN110596060B (zh) * 2019-09-12 2020-08-21 江南大学 一种检测前列腺特异性抗原的光谱分析中荧光传感器的构建方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5230883A (en) * 1989-05-04 1993-07-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for localization and treatment of tumors using polylysine complexes
CN101500591A (zh) * 2005-09-08 2009-08-05 Mnd诊断有限公司 用于检测病毒的组合物及使用该组合物检测病毒的方法
WO2012050896A2 (en) * 2010-09-29 2012-04-19 Kansas State University Research Foundation Protease selective supramolecular assemblies
CN102813944A (zh) * 2012-08-07 2012-12-12 上海交通大学 蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009111470A2 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Kansas State University Research Foundation Protease assay
EP2210616A1 (en) * 2009-01-21 2010-07-28 Centre National de la Recherche Scientifique Multifunctional stealth nanoparticles for biomedical use
CA2776295A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Kansas State University Research Foundation Mri and optical assays for proteases

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5230883A (en) * 1989-05-04 1993-07-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for localization and treatment of tumors using polylysine complexes
CN101500591A (zh) * 2005-09-08 2009-08-05 Mnd诊断有限公司 用于检测病毒的组合物及使用该组合物检测病毒的方法
WO2012050896A2 (en) * 2010-09-29 2012-04-19 Kansas State University Research Foundation Protease selective supramolecular assemblies
CN102813944A (zh) * 2012-08-07 2012-12-12 上海交通大学 蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A systemic route for drug loading to lymphatic phagocytes.;M.I.Papisov等;《Molecular Pharmaceutics》;20050121;第2卷(第1期);第48页-49页 *
Hongwang Wang等.Nanoplatforms for highly sensitive fluorescence detection of cancer-related proteases..《Photochem Photobiol Sci》.2013,第13卷 *
Ming Zhao等.Magnetic sensors for protease assays..《Angew Chem Int Ed》.2003,第42卷(第12期), *
Wellington Pham等.Developing a peptide-based near-infrared molecular probe for protease sensing..《Bioconjugate Chem》.2004,第15卷 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104020287A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Meng et al. Protein‐protected metal nanoclusters: An emerging ultra‐small nanozyme
Oh et al. Magnetic nanozyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive influenza A virus detection
Fu et al. Dramatically enhanced immunochromatographic assay using cascade signal amplification for ultrasensitive detection of Escherichia coli O157: H7 in milk
Fan et al. Human ferritin for tumor detection and therapy
Xu et al. Metal-enhanced fluorescent dye-doped silica nanoparticles and magnetic separation: A sensitive platform for one-step fluorescence detection of prostate specific antigen
Dadmehr et al. Dual mode fluorometric and colorimetric detection of matrix metalloproteinase MMP-9 as a cancer biomarker based on AuNPs@ gelatin/AuNCs nanocomposite
Ambrosi et al. Enhanced gold nanoparticle based ELISA for a breast cancer biomarker
Xu et al. Ultrasensitive detection of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus based on immunofluorescent carbon dots/SiO2 nanosphere-based lateral flow assay
Shin et al. Recent research trends and future prospects in nanozymes
Cui et al. Recent progress in quantum dot based sensors
Li et al. Immobilization of trypsin on superparamagnetic nanoparticles for rapid and effective proteolysis
Yang et al. Gold nanoparticle based signal enhancement liquid crystal biosensors for DNA hybridization assays
Karami et al. Colorimetric immunosensor for determination of prostate specific antigen using surface plasmon resonance band of colloidal triangular shape gold nanoparticles
Lei et al. Biosensors and bioassays for determination of matrix metalloproteinases: state of the art and recent advances
Wang et al. Peptide-derived biosensors and their applications in tumor immunology-related detection
Liao et al. Controlled antibody orientation on Fe3O4 nanoparticles and CdTe quantum dots enhanced sensitivity of a sandwich-structured electrogenerated chemiluminescence immunosensor for the determination of human serum albumin
JP6117185B2 (ja) 二機能の腫瘍診断試薬及び方法
Yin et al. A ligation DNAzyme-induced magnetic nanoparticles assembly for ultrasensitive detection of copper ions
JP5171958B2 (ja) カスケード酵素免疫測定法
Elingarami et al. Surface-engineered magnetic nanoparticles for molecular detection of infectious agents and cancer
KR20110033575A (ko) 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법
CN104020287B (zh) 一种含有放射性核素的血清特异活性蛋白酶检测纳米试剂盒
Wang et al. Synthesis of multifunctional fluorescent magnetic nanoparticles for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple juice
Han et al. Fluorescence turn-on immunosensing of HE4 biomarker and ovarian cancer cells based on target-triggered metal-enhanced fluorescence of carbon dots
Hou et al. based immunosensor with NH2-MIL-53 (Fe) as stable and multifunctional signal label for dual-mode detection of prostate specific antigen

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent for invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhu Gaohong

Inventor after: Zhou Puchen

Inventor after: Wang Hongwang

Inventor after: Stephen Bosman

Inventor before: Zhu Gaohong

Inventor before: Zhou Puchen

Inventor before: Wang Hongwang

Inventor before: Shi Difenbosiman

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant