CN105384793A - 一种磁性纳米带鱼铁肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,以磁性的Fe3O4颗粒和带鱼三肽为的原料,将带鱼三肽氨基化修饰,再与磁性的Fe3O4颗粒混合,负载于磁性的Fe3O4颗粒表面。本发明以具有磁性的纳米Fe3O4颗粒为核心,负载经表面氨基化修饰以后具有抑制肿瘤增殖作用的带鱼三肽,使该磁性纳米颗粒具有良好的水溶性、分散性和生物相容性,成为比较理想的供药载体。所得产品磁性纳米带鱼铁肽颗粒具有超顺磁性、分散性更好,适合于在生物体系中应用。当外加磁场达到±10000Oe时,磁性纳米带鱼铁肽的磁化强度达到饱和,达60.1emu·g-1。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性纳米颗粒及其制备方法,属于药物领域。
背景技术
纳米技术(Nanotechnology)是21世纪的新兴技术。随着纳米技术的快速发展,纳米材料因其独特性质在光学、磁学、化妆品、催化、制药和医学等领域中的应用日益增多,纳米材料为包括肿瘤在内的多种疾病的诊治提供了崭新的解决途径和借鉴价值。而磁性纳米颗粒因其生物相容性以及较强的磁响应性等优异的性能被广泛地应用于药物缓释、生物医学等领域。在磁性纳米颗粒中,由于Fe3O4具有低毒性、超顺磁性、制备方法多样、形貌多样以及易于修饰改性等许多优点,使得其被广泛地应用于磁共振成像以及药物释放等生物医学领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷,提供了一种具有超顺磁性且分布均匀的磁性纳米带鱼铁肽;
本发明的另一目的是提供上述磁性纳米带鱼铁肽的制备方法;
本发明的又一目的是提供上述磁性纳米带鱼铁肽的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来具体实现:
一种磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,以磁性的Fe3O4颗粒和带鱼三肽为的原料,将带鱼三肽氨基化修饰,再与磁性的Fe3O4颗粒混合,负载于磁性的Fe3O4颗粒表面。
带鱼三肽的氨基酸序列为:His-Tyr-Asp。其提取方法参见《带鱼下脚料酶解小肽亚铁螯合物结构鉴定及其生物活性研究》。
作为优选方案,上述的磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,包括如下步骤:
1)氨基化修饰带鱼三肽
将带鱼三肽溶于无水乙醇中,得到表面氨基化的三肽乙醇,水稀释得到三肽乙醇溶液后备用;
2)包覆
向步骤1)得到的三肽乙醇溶液中边搅拌边滴入Fe3O4磁性纳米颗粒溶液中,再在磁力搅拌下反应2h后,纯化,即可。
优选的,所述步骤1)中,带鱼三肽:无水乙醇为5mg:0.07mL;
优选的,所述步骤1)中,稀释时,每5mg带鱼三肽形成的三肽乙醇加水稀释至50ml。
优选的,所述步骤2)中,所述Fe3O4磁性纳米颗粒溶液为浓度是40wt%-50wt%的水溶液或者乙醇溶液,优选浓度是45wt%的乙醇溶液。
优选的,所述步骤2)中,所述三肽乙醇溶液与Fe3O4磁性纳米颗粒溶液之间的比例关系为:每5mg带鱼三肽形成的三肽乙醇水溶液对应40mlFe3O4磁性纳米颗粒溶液;
优选的,30min内,将步骤1)中得到的5mg带鱼三肽形成的三肽乙醇水溶液逐滴滴入到40mlFe3O4磁性纳米颗粒溶液中。
优选的,所述步骤2)中,所述磁力搅拌的转速为600rpm;
优选的,所述纯化过程为:将反应后物料以3000rpm离心40min,倒掉上清液,加入蒸馏水,超声分散,重复3次。
根据上述方法制备的磁性纳米带鱼铁肽,以具有磁性的Fe3O4纳米颗粒为核心,表面包覆有带鱼三肽,颗粒粒径为10-20nm,呈边缘无定形的球形。
优选的,所述带鱼三肽与Fe3O4颗粒的质量比为1:(0.5-1.5),优选1:1.5。
优选的,所述带鱼三肽的甲基、亚甲基、酮基与Fe3O4磁性纳米颗粒之间存在化学键的结合。
一种磁性纳米带鱼铁肽的应用,用于抑制癌细胞的生长;
优选的,所述的磁性纳米带鱼铁肽的应用,同时与交变磁场结合作用于癌细胞。
优选的,所述的磁性纳米带鱼铁肽使用pH范围是6.5~9。
本发明以具有磁性的纳米Fe3O4颗粒为核心,负载经表面氨基化修饰以后具有抑制肿瘤增殖作用的带鱼三肽,使该磁性纳米颗粒具有良好的水溶性、分散性和生物相容性,成为比较理想的供药载体。所得产品磁性纳米带鱼铁肽颗粒具有超顺磁性、分散性更好,适合于在生物体系中应用。当外加磁场达到±10000Oe时,磁性纳米带鱼铁肽的磁化强度达到饱和,达60.1emu·g-1。具体参见以下实施例中的实验分析。
附图说明
图1是Fe3O4纳米颗粒、三肽和铁肽微粒(本发明磁性纳米带鱼铁肽的简要表述,以下同)的XRD对比光谱;
图2是Fe3O4纳米颗粒、铁肽颗粒的FTIR对比光谱图;
图3是不同浓度的铁肽微粒的SEM成像;
图4是铁肽微粒的TEM照片;
图5是铁肽微粒的的能谱图;
图6是铁肽微粒的AFM照片;
图7是Fe3O4纳米颗粒、铁肽微粒的磁滞回线;
图8是流式细胞仪检测的CW-2细胞增殖周期图谱(空白对照);
图9是流式细胞仪检测的非磁场条件下0.2μg/mL磁性纳米铁肽的作用下CW-2细胞增殖周期图谱;
图10是流式细胞仪检测的交变磁场条件下0.2μg/mL磁性纳米铁肽的作用下CW-2细胞增殖周期图谱。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1:
为了说明本发明的实质,申请人进行了如下实验。
1实验材料及设备
带鱼三肽:His-Tyr-Asp,纯度95%以上
Fe3O4磁性纳米颗粒:购于重庆威斯腾公司。
本实施例中所用水采用蒸馏水,用去离子水、纯净水替代亦可实现本发明目的。
2纳米带鱼铁肽微粒的制备
取5mg的三肽溶解于0.07ml的无水乙醇中,得到表面氨基化的三肽乙醇,稀释至50ml置于分液漏斗中,30min内逐滴滴入到搅拌的40mlFe3O4磁性纳米颗粒溶液中,在磁力搅拌中转速为600rpm搅拌反应2h,最后以3000rpm离心40min,倒掉上清液,加入蒸馏水,超声分散,重复3次,纯化的纳米铁肽微粒分散在水中,4℃冷藏备用。
3纳米带鱼铁肽的结构分析
3.1晶体结构(XRD)
图1为制备的粉体样品X射线衍射图。从图中可以看出,纯Fe3O4纳米铁微粒的衍射谱峰大致出现在2θ=30.24°、35.40°,分别对应立方相(220)、(311)晶面,其X射线峰型都较宽,说明纳米铁颗粒的粒径很小。由图可以看出,三肽和三肽铁微粒都无明显的差异,但是可以看出衍射峰明显降低,说明没有显著影响Fe3O4结晶结构,三肽与Fe3O4纳米铁微粒成功的结合在一起了。
3.2红外光谱测试(FTIR)
图2是Fe3O4包括水溶液和酒精溶液)、不同比例的铁肽微粒的红外光谱图。在Fe3O4的红外光谱图中3444cm-1附近出现的谱图是因为-OH的伸缩振动产生的,586cm-1和629cm-1处的峰分别是Fe3O4纳米铁微粒中的铁氧键和和亚铁氧键的特征吸收峰。在三肽和Fe3O4混合而成的铁肽微粒的FTIR图像中可以看出,铁肽微粒在3444cm-1、1635cm-1、1114cm-1、589cm-1处具有特征吸收峰,并且与Fe3O4红外光谱一致。其中,铁肽微粒红外光谱上在589cm-1处出现Fe-O-Fe吸收峰,其他特征吸收峰几乎不变,表明复合材料中有Fe3O4的存在,而且在2924cm-1、2853cm-1、1635cm-1处有新的吸收峰,表明三肽的甲基(-CH3)亚甲基(-CH2)酮基(C=O)与Fe3O4纳米铁微粒之间存在化学键的结合。
3.3扫描电镜形貌分析(SEM)
将一定量的样品铁肽和Fe3O4量子点分散在酒精溶液中,超声分散,转移3滴左右样品溶液于硅片上,风干后在扫描电子显微镜下观察纳米颗粒的电子形貌,铁肽微粒和Fe3O4量子点的形貌分别如图2-3所示。图3不同浓度的铁肽微粒的SEM成像,其中,A)、B)、C)三肽铁颗粒SEM成像,三肽与Fe3O4混合比例分别为1:0.5,1:1,1:1.5(放大倍数为20万倍)。图D)为三肽:Fe3O4颗粒的SEM成像(1:1.5,放大倍数为60万倍)。从SEM上可以看出,合成的铁纳米颗粒呈球形,颗粒之间有粘连现象,形成团聚现象,其中1:0.5和1:1比例图像团聚颗粒明显,1:1.5比例样品分散较均匀,说明三肽:Fe3O4颗粒质量比1:1.5最佳。样品Fe3O4量子点的粒径约10nm,发生大量的团聚;样品铁肽微粒的颗粒粒径分布在10-20nm范围,平均粒径在15nm左右,减小了团聚程度,进而说明了异三肽的包覆增强了纳米铁微粒的分散稳定性。
3.4投射电镜(TEM)
图4是铁肽微粒TEM照片,A)Fe3O4-三肽纳米复合物的透射电镜照片;B)Fe3O4-三肽纳米复合物放大的透射电镜照片;C)Fe3O4-三肽纳米复合物的高分辨透射电镜照片。从图中可以看出,合成的Fe3O4-三肽纳米颗粒呈球形,颗粒之间有粘连现象,形成缠绕弯曲的线状。样品Fe3O4-三肽的颗粒粒径约10nm,球形状为Fe3O4-三肽纳米颗粒,而它的边缘呈无定形的即为三肽。图4C是Fe3O4-三肽纳米颗粒的高分辨电镜图片,可以清晰的看到Fe3O4纳米颗粒的晶格,证明其结晶性能非常好,从图4C显示其晶格间距为0.298nm,属于(220)晶面。图5是Fe3O4-三肽纳米颗粒的EDS能谱图,可以看到N元素的存在,这应该可以归结为三肽含有的N元素;Fe和O元素的原子比例为41.95:58.05,与Fe3O4纳米颗粒的成分相符合。
3.5原子力显微镜测试(AFM)
通过AFM测试每一层的高度成像(三维图)、相位图像、扫描图像,结果如图6所示,其中图A)-C)为Fe3O4-三肽微粒中三肽与Fe3O4的混合比例均为1:1.5,AFM可以测试样品的粗糙度,测试结果的表面根均方值会因为样品浓度和样品种类的不同而改变,由图可知铁肽微粒分布较均匀,而且很平坦。图6可以观察到Fe3O4-三肽纳米复合物分布非常均匀,由于三肽的胶黏作用,Fe3O4与三肽形成了团聚,A)-C)通过不同的放大倍数(A,扫描尺寸5.00μm;B,扫描尺寸2.00μm;C,扫描尺寸600.00nm;),可以清楚的观察到Fe3O4-三肽纳米复合物颗粒大约10-20nm左右。
3.6磁性能测量
用振动样品磁强计(VSM)在磁场范围-10kOe~10kOe内,于室温下测定了样品的磁性。图7分别为Fe3O4纳米颗粒、纳米带鱼铁肽的磁滞回线。从图中可以看出,所制备样品的磁滞回线与一般的磁性材料不同。一般磁性材料的磁滞回线通常是两条不重合的磁化曲线,组成一个闭合的环形回路。而图7所示的磁滞回线则是两条重合的磁化曲线,这正体现了磁性材料的一个重要特征:超顺磁性。随着外加磁场的增强,样品的磁化强度也随之变强。当外加磁场达到±10000Oe时,磁性纳米带鱼铁肽的磁化强度达到饱和,达60.1emu·g-1。
3.7磁性纳米带鱼铁肽的稳定性
本实验制备的磁性纳米带鱼铁肽,在pH=6.5的条件下,存放3周时间不产生任何聚集;调整pH到9以上时,会产生少量的聚集。这是由于氨基的等电点在pH=9左右,碱性过强时,会中和掉氨基所带的正电荷;改变pH到5以下时,由于纳米颗粒本身有碱性氧化物组成,因此放置2天以后,纳米颗粒会被溶解。因此,磁性纳米带鱼铁肽颗粒的最佳使用pH范围是6.5~9,比较适合于在生物体系中应用。
4磁性纳米带鱼铁肽抗肿瘤作用研究
4.1纳米铁肽对CW-2细胞增殖的影响
表1纳米铁肽对CW-2细胞增殖的影响(x±s,)
*p<0.01与同时间对照组相比
表1显示的是CW-2细胞经磁性纳米铁肽和或磁场处理后MTT检测的结果。从表中可见,0.1和0.2ug/mL浓度磁性纳米铁肽单独处理细胞24h并未对细胞造成可观察的影响,相应浓度的磁性纳米铁肽结合交变磁场处理组24h可明显导致细胞的生长抑制(p<0.01),这种抑制效应随时间的延长显著增加。0.4和0.8ug/mL浓度磁性纳米铁肽单独处理细胞24h可抑制细胞活性,但相应浓度的磁性纳米铁肽结合交变磁场处理组相比较,肿瘤细胞抑制率更显著(p<0.01)。实验结果显示,交变磁场结合磁性纳米铁肽共同作用可明显导致细胞的生长抑制,二者的联合作用显示出协同效应。且这种效应随着药物浓度的增加显著的增加,呈良好的量效关系。为防止培养时间过长,细胞自然老化死亡而引起对抑制率测定结果的干扰,在随后的试验中均选择24h作为其含样培养时间。
4.2对CW-2细胞膜流动性的影响
表2磁性纳米带鱼铁肽对CW-2细胞膜P,η值的影响
注:*p<0.05与同状态对照组相比**p<0.01与同状态对照组相比
4.3对CW-2细胞增殖周期的影响
参见图8-10,流式细胞仪检测磁性纳米铁肽对CW-2细胞周期的影响,在交变磁场和非磁场条件的处理下,G0/G1期细胞百分比在逐渐减少由50.20%下降至45.25%(非磁场)和38.48%(交变磁场),S期的细胞在不同处理下,没有显著变化,保持在40%左右,而G2/M期细胞比率则随浓度升高呈现逐渐上升的趋势。细胞周期一般经历G1-S-G2-M期,大多数抗肿瘤物质具有细胞周期特异性,它有两个重要的调控点,G1/S和G2/M。从实验结果可以看出,G0/G1期细胞比例下降,G2/M期细胞比率升高,这表明当磁性纳米铁肽结合交变磁场60min处理后,CW-2人结肠癌细胞由合成后期进入有丝分裂期时受阻而发生积累,从而阻滞了细胞进入下一个正常细胞增殖周期,导致处于G0/G1期的细胞减少,诱导细胞凋亡。而磁性纳米铁肽单独处理细胞G0/G1期的细胞减少不明显。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,其特征在于:以磁性的Fe3O4颗粒和带鱼三肽为的原料,将带鱼三肽氨基化修饰,再与磁性的Fe3O4颗粒混合,负载于磁性的Fe3O4颗粒表面。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,其特征在于:包括如下步骤:
1)氨基化修饰带鱼三肽
将带鱼三肽溶于无水乙醇中,得到表面氨基化的三肽乙醇,用水稀释得到三肽乙醇溶液后备用;
2)包覆
向步骤1)得到的三肽乙醇溶液中边搅拌边滴入Fe3O4磁性纳米颗粒溶液中,再在磁力搅拌下反应2h后,纯化,即可。
3.根据权利要求2所述的磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,其特征在于:所述步骤1)中,带鱼三肽:无水乙醇为5mg:0.07mL;
和/或,稀释时,每5mg带鱼三肽形成的三肽乙醇加水稀释至50ml。
4.根据权利要求2所述的磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,其特征在于:所述步骤2)中,所述Fe3O4磁性纳米颗粒溶液为浓度是40wt%-50wt%的水溶液或者乙醇溶液,优选浓度是45wt%的乙醇溶液。
5.根据权利要求2所述的磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,其特征在于:所述步骤2)中,所述三肽乙醇溶液与Fe3O4磁性纳米颗粒溶液之间的比例关系为:每5mg带鱼三肽形成的三肽乙醇水溶液对应40mlFe3O4磁性纳米颗粒溶液;
和/或,30min内,将步骤1)中得到的5mg带鱼三肽形成的三肽乙醇水溶液逐滴滴入到40mlFe3O4磁性纳米颗粒溶液中。
6.根据权利要求2所述的磁性纳米带鱼铁肽的制备工艺,其特征在于:所述步骤2)中,
所述磁力搅拌的转速为600rpm;
和/或,所述纯化过程为:将反应后物料以3000rpm离心40min,倒掉上清液,加入水,超声分散,重复3次。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备的磁性纳米带鱼铁肽,其特征在于:以具有磁性的Fe3O4纳米颗粒为核心,表面包覆有带鱼三肽,颗粒粒径为10-20nm,呈边缘无定形的球形。
8.根据权利要求7所述的磁性纳米带鱼铁肽,其特征在于:所述带鱼三肽与Fe3O4颗粒的质量比为1:(0.5-1.5),优选1:1.5。
9.根据权利要求7或8所述的磁性纳米带鱼铁肽,其特征在于:所述带鱼三肽的甲基、亚甲基、酮基与Fe3O4磁性纳米颗粒之间存在化学键的结合。
10.一种磁性纳米带鱼铁肽的应用,用于抑制癌细胞的生长;
优选的,所述的磁性纳米带鱼铁肽的应用,同时与交变磁场结合作用于癌细胞;
优选的,所述的磁性纳米带鱼铁肽使用pH范围是6.5~9。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160309 |