CN105381461B

CN105381461B - 一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料及其制备方法

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Publication number: CN105381461B
Application number: CN201510771827.7A
Authority: CN
Inventors: 刘仕杰; 邵晨; 王浩
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2035-11-12
Also published as: CN105381461A

Abstract

本发明公开了一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料及其制备方法，是将亲疏水性的光动力分子包载入纳米粒子聚合物Poly(HDDA‑co‑DBPA)‑PEG中。这样通过制备pH响应性高分子聚合物纳米粒子，将对其进行亲水性PEG修饰，并采用亲疏水性将光动力分子药物Chlorin e6包载入纳米粒子，将多种生物抗菌技术集成，提升了杀菌的生物学效应，有效提高药物在特殊环境的粘附，抑制细菌生物生长，能够有效抗菌、生物相容性好、造价低廉，材料稳定性好。本发明提出的制备方法得到的生物高分子抗菌材料，具有有效抗菌、生物相容性好、稳定性好、造价低廉的特点。

Description

一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料及其制备方法

技术领域

本发明属于抗菌材料技术领域，涉及一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料及其制备方法。

背景技术

留置导尿管引发的导管相关性尿路感染(Catherter—associated urinarytract infection CAUTI)是目前临床最常见的医院内感染，在美国位居医院内感染第一位，我国位居第二。长期留置尿管的患者，菌尿发生率几乎达l00％，相关感染不但造成大量的医疗资源浪费，而且严重影响患者的康复，甚至威及患者生命。因此，留置尿管所致泌尿系统感染，已经成为临床上亟需解决的重大医疗问题。

近年来，为了预防泌尿系统感染的发生，有关医用泌尿系相关抗菌材料的研发正日益引起人们的高度重视。目前报道的应用于泌尿系的抗菌材料包括：抗菌肽材料，抗生素复合材料、无机材料、光动力材料。

抗生素复合材料一般是在材料表面连接抗生素，一般选用广谱抗生素，但是只有局部用药浓度达到一定抗菌浓度时才会起效，因此随着抗生素复合材料的溶解释放，局部药物浓度大大减少，不仅不能起到抗菌效果反而增加了耐药菌株的产生，造成了难以治疗的慢性长期感染。

无机金属材料方法是通过溅射镀膜或者直接将含银的抗感染润滑剂涂抹在导尿管表面，低浓度的银离子对微生物就具有杀灭作用，一般认为植入物表面金属银逐渐氧化形成氧化银，释放银离子，银离子通过干扰电子运输、作用于细胞膜从而影响细胞内酶的活性、凝固细胞内蛋白质、凝固及破坏DNA分子等多种途径完成对细菌的杀灭作用；但是无机材料在体内的银离子释放所造成的生物安全性危险也是此材料的体内应用受到质疑，而且据报道其抗菌效果并不显著。

抗菌肽作为一类生物活性的小分子多肽，具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，一般认为其抗菌作用主要来源于与细菌膜作用，在膜上形成跨膜的离子通道，破坏膜的完整性，造成细菌内容物泄漏，从而杀死细菌，因此细菌很难对抗菌肽产生耐药性，有望成为抗生素的代替品；然而目前的市场使用的抗菌肽生主要来源于动物体内提取，而抗菌肽在动物体内的含量极微，且提取工艺复杂，费用昂贵，无法实现大规模生产。已经发展的多肽合成技术，有望替代天然提取技术，但是目前还不能实现大量合成，造成了其无法大量生成制备导尿管涂层。

光动力分子，即光敏药物，具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，抗菌作用是光动力分子受到特定波长的激光照射激发，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细菌受损乃至死亡，光动力分子展现出高效抗菌活性，无耐药性，造价低廉等优点，目前市场上有很多用于体表肿瘤治疗的光敏剂已经上市，在临床上广泛应用并取得很好效果。但是对于细菌感染靶向性仍需要进行相关改良。

因此，研发高效抗菌、生物相容性好、靶向性强、造价低廉的多功能抗菌材料意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服以上现有技术的缺点，提出一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料及其制备方法，是一种采用pH响应性纳米粒子包载光动力分子的复合抗菌材料，该材料具有高效抗菌、靶向性强、防止界面粘附的特点。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料，是将亲疏水性的光动力分子包载入纳米粒子聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG中；

所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG是由单体HDDA、DBPA、mPEG通过加成法制成的纳米粒子；其中HDDA：DBPA：mPEG的摩尔比为(1～1.5)：(0.8～1.2)：(0.08～0.15)；

所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG的结构式为：

其中，R为丁基或乙基；

所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG的分子量大小为1.2～1.5万，其粒径为30～50nm；

所述的亲疏水性的光动力分子为Chlorin e6，以质量比计Chlorin e6的包载量为5～20％。

一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料的制备方法，包括以下操作：

1)以单体HDDA，DBPA，mPEG作为原料采用迈克尔加成法制备粒径30～50nm的Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG纳米粒子；其中，HDDA：DBPA：mPEG的摩尔比为(1～1.5)：(0.8～1.2)：(0.08～0.15)；

2)将得到的纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子对亲疏水性的光动力药物Chlorine6进行包载，调节纳米颗粒中光动力药物Chlorin e6掺杂量为质量比5％～20％，制备出pH响应性纳米颗粒。

所述的纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子的制备方法为：

单体HDDA，DBPA，mPEG按照摩尔比1.2:0.9:0.1比例投料，在40～60℃下恒温搅拌下反应3～10天，得到蜡黄色胶装物质，并经过透析法去杂得到纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子。

所述的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料的制备方法，其特征在于，调节纳米颗粒中光动力药物Chlorin e6掺杂量为质量比5～10％，其包封率为40～80％。

所述的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料在制备抗泌尿系细菌感染的药物中的应用。

所述的药物是靶向细菌感染酸性环境的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的pH响应性纳米粒子包载光动力药物复合抗菌材料及其制备，通过制备pH响应性纳米粒子，用其包载光动力药物，受到特定波长激光，产生活性氧杀灭细菌，此方法将多种生物抗菌技术集成，提升了多重杀菌的生物学效应。

本发明提出的制备方法得到的生物高分子抗菌材料，具有有效抗菌、生物相容性好、稳定性好、造价低廉的特点。

附图说明

图1为抗菌材料的结构示意图；

图2为抗菌材料合成示意图；

图3为抗菌材料的核磁表征图；

图4为抗菌材料透射电镜及DLS/Zeta稳定性的图；

图5为抗菌材料对于金葡球菌及大肠杆菌最小抑菌浓度测定；

图6为动力治疗效果通过共聚焦显微镜进行评测的结果之一；

图7为光动力治疗效果通过透射电镜进行评测的结果之二；

图8为抗菌材料pH响应性的靶向性检测结果示意图；

图9为抗菌材料在泌尿系感染活体模型的示意图及检测结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料，是将亲疏水性的光动力分子包载入纳米粒子聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG中。

所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG是由HDDA、DBPA、mPEG单体通过加成法制成的纳米粒子；其中HDDA：DBPA：mPEG的摩尔比为(1～1.5)：(0.8～1.2)：(0.08～0.15)。

所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG的结构式为：

其中，R为烷基。具体的，R为丁基或乙基。

如图1所示为亲疏水性的光动力分子Chlorin e6时抗菌材料的结构示意图。

参见图2，上述的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料的制备方法，包括以下操作：

1)以单体HDDA，DBPA，mPEG作为原料采用迈克尔加成法制备粒径40nm的Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG纳米粒子；其中，HDDA：DBPA：mPEG的摩尔比为(1～1.5)：(0.8～1.2)：(0.08～0.15)；

2)将得到的纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子利用亲疏水性包载光动力药物Chlorin e6，调节纳米颗粒中光动力药物Chlorin e6掺杂量为质量比5％～20％，制备出pH响应性纳米颗粒。

具体的，所述的纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子的制备为：

投料比单体HDDA，DBPA，mPEG按照摩尔比1.2:0.9:0.1比例，在50℃恒温搅拌下反应7天，得到蜡黄色胶装物质，并经过透析法去除未反应单体及饱和度不够单体。

图3所示为所制备的抗菌材料的核磁表征图，结果表明所制备的抗菌材料与预期一致。

进一步的，筛选出包封率高的投料比：调节纳米颗粒中光动力药物Chlorin e6掺杂量为质量比5％、10％、15％、20％测量药物包封率。

所述的包封率的统计为：

首先以1mg纳米粒子配制质量比为5％、10％、15％、20％的浓度配置Chlorin e6溶液，并用紫外分光光度计测量溶液的吸光度值，然后通过光敏剂Chlorin e6亲疏水性包载在纳米粒子中：以微流控装置以100μl/h加入1ml纳米粒子溶液同时1000转/分旋转，添加完毕后在继续搅拌2小时，并在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中透析12小时，完毕后再测纳米包载光动力分子溶液吸光度值。

包封率DLE＝包载后药物溶液吸光度/包载前药物溶液吸光度值百分比。

包载量DLC＝对应原始溶液质量比*包封率DLE

载药量和包封率的检测结果如表1所示。

表1载药量和包封率统计

wd/wp	DLC	DLE
			(wt％)	(wt％)	(wt％)
5	4.20±0.08	84.1±1.6
			10	4.75±0.30	47.5±3.0
15	5.64±0.30	37.6±2.0
			20	7.43±0.22	37.14±1.1

结果表明选择载药量质量比5％时，可以得到最高包封率84.1％。

本发明所制备的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料，在细菌感染酸性环境中pH响应性纳米粒子包载抗菌材料表面电荷发生由负到正转变。

TEM图像以及对应流体力学直径的检测结果图4所示，其中a)pH响应性纳米粒子和b)pH响应性纳米粒子包载光动力分子，可以看到所制备的材料为纳米粒子。

c)通过DLS/Zeta电位测量了6天的跨度，结果表明pH响应性纳米粒子包载光动力分子在PBS中稳定性。

d)pH响应性纳米粒子包载光动力分子在酸性环境Zeta电位的变化：

将制备好的纳米颗粒包载光动力分子溶解在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，用马尔文粒度分析仪测定溶液Zeta点位，然后利用稀盐酸调整溶液pH值至6.5左右，(pH＝6.5模拟细菌感染微环境酸性状态)静止溶液在室温2小时，待稳定后测定Zeta点位，发现Zeta点位从pH＝7.4是负值变为pH＝6.5时正值，即在细菌感染酸性环境纳米颗粒发生电位转变，带正电。结果表明，在细菌感染微环境中，纳米颗粒通过电荷作用带正电。

本发明提供的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料，通过测定最小抑菌浓度发现经过包载Ce6分子光动力治疗效果比Ce6单体效果优良。

将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的单菌落分别在TSB培养基中部分地培养在37℃在摇床上床以250rpm过夜。然后用培养基将细菌稀释，通过紫外可见分光法OD600nm吸光度值进行测定。吸光度值0.1表示1×10⁸CFU。100μL细菌悬浮液(2×10⁵CFU/ml)加入96孔板。100μL的PBS(pH为7.4，10mM的)作为空白对照，100μL的纳米颗粒(CE65.97-84.1μg/ml)，100μL游离CE6(5.97-84.1μg/ml)分别置于96孔板中。药物与细菌在37℃中孵育30min，并在660纳米的激光功率50mW/cm²(THORLABS M660L3)照射10分钟。然后，细菌洗涤三次，并再悬浮在1毫升的PBS液(pH7.410μM)。从各孔中抽出的20μL涂布固体介质的表面和培养在37℃过夜。所有实验重复至少两次平行。测得包载Ce6分子光动力药物及Ce6单体的最小抑菌浓度(MIC)，结果表2和图5所示

表2MIC测定结果

	E.coil	S.aureus
			NPs	17.91ug/mL	11.93ug/mL
Free Ce6	29.85ug/mL	23.86ug/mL

结果表明经过包载Ce6分子之后MIC比未包载要小，其光动力治疗效果比Ce6单体效果优良。

光动力治疗效果通过共聚焦显微镜进行评测，结果如图6所示；光动力治疗效果通过透色电镜进行评测，结果如图7所示。在以上两组试验中，分别选取四种条件a)无药物无光照组b)有药物无光照组c)无药物有光照组d)有药物有光照组

通过以上对比发现，pH响应性及光敏性的抗菌材料在光照下抗菌效果显著。

本发明提供的pH响应性纳米粒子包载抗菌材料靶向性，在细菌感染酸性环境表面电荷转变。

先前在模拟细菌感染微环境中测定了纳米药物zeta电位发现了酸性环境下纳米颗粒带正电的特性，而在细菌表面由于结构原因带负电是目前大家的共识，所以正负电荷吸引产出靶向性。为了验证pH响应性纳米粒子包载抗菌材料靶向性，首先将革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌及巨噬细胞RAW用于模拟感染微环境如图8所示。其次将细菌及细胞在相同条件下和纳米药物共同孵育，再通过共聚焦显微镜观察细菌表面纳米药物在667nm波长荧光，发现细菌表面荧光点多，即纳米药物附着多，而RAW细胞内部基本没有，因为巨噬细胞是常见的吞噬细胞，如纳米药物附着于其表面，容易被吞噬入细胞内，进而产生红色荧光，所以相对于在细菌感染微环境而言，纳米药物对细菌的靶向性由于细胞表面带负电荷产生的。

结果表明在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌表面附着多，相比于正常人体巨噬细胞，表现出明显的靶向性。

本发明提供的可应用于治疗泌尿系感染活体模型，应用于相关药物的制备：

动物实验在第四军医大学实验动物中心完成。所有涉及实验动物的程序是按照委员会批准的第四军医大学，中国的动物研究协议执行。首先，将小鼠用戊巴比妥钠深度麻醉。膀胱导尿术选取了静脉内导管，首先用PBS缓冲液冲洗膀胱两次。注入0.25％胰蛋白酶30分钟后，膀胱感染了每50μL含10⁸大肠杆菌CFU浓度。培养24小时后，分别加入50μL纳米药物(相当于200μM的CE6)，200μM的自由CE6和PBS缓冲液(pH 7.4，10mM的)。九只BALB/c小鼠随机分为3组，通过以下三种处理已建立急性膀胱炎的模式：(1)纳米药物给药；(二)游离CE6给药；(三)PBS空白对照。上述两种药物的接种小鼠约10分钟。在无菌条件下，手术暴露膀胱。通过激光照射后，缝合切口。膀胱暴露于功率密度在50mW/cm²的664nm的激光30分钟。激光束的光点调节至覆盖整个膀胱。感染在6，24，30和48小时接种后经琼脂铺板计数中细菌尿CFU。在48小时处死小鼠后，稀释匀浆膀胱组织铺板计数。

图9中，a)为小鼠急性细菌性膀胱炎模型，及实验流程图，在0h注入细菌建造模型，6h检测尿中细菌菌落数以确定建模是否成功，24h测定稳定细菌感染模型状态尿中细菌量，26h小时手术暴露膀胱，注册入膀胱纳米药物及光照治疗，在30h，48h测定尿中细菌菌落数。并在48h处死小鼠，取膀胱组织研磨铺板观察细菌菌落数。b)展示的是6，24，30和48h四个时间点尿液中统计的细菌菌落数在三种治疗的方式下。在6h测定尿中细菌菌落数发现，三组小鼠尿中细菌数处于一个水平，即膀胱炎模型建立成功。在24h，测定尿中细菌菌落数，发现此时细菌数也处于一个水平，随后在麻醉下进行膀胱暴露术，并对三组小鼠膀胱插管孵育三组不同药物30min，并用664nm激光照射膀胱。随后，30h取小鼠膀胱内尿液测定细菌菌落数，发现在纳米药物组比游离CE6组，尿中菌落数少且有显著学差异。最后在处死前，同样测定尿液中细菌菌落数。c)统计在48h研磨膀胱铺板统计细菌菌落数。小鼠处死后，研磨膀胱并将研磨液铺板测定其中细菌菌落数，发现在纳米药物组和游离CE6组之前，膀胱研磨液中细菌菌落数之间有显著学差异。

Claims

1.一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料，其特征在于，是将亲疏水性的光动力分子包载入纳米粒子聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG中；所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG是由单体HDDA、DBPA、mPEG通过加成法制成的纳米粒子；其中HDDA：DBPA：mPEG的摩尔比为(1～1.5)：(0.8～1.2)：(0.08～0.15)；所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG的结构式为：

其中，R为丁基；所述的聚合物Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG的分子量大小为1.2～1.5万，其粒径为30～50nm；所述的亲疏水性的光动力分子为Chlorin e6，以质量比计Chlorin e6的包载量为5～20％。

2.一种具有pH响应性及光敏性的抗菌材料的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

2)将得到的纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子对亲疏水性的光动力药物Chlorin e6进行包载，调节纳米颗粒中光动力药物Chlorin e6掺杂量为质量比5％～20％，制备出pH响应性纳米颗粒。

3.如权利要求2所述的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述的纳米Poly(HDDA-co-DBPA)-PEG粒子的制备方法为：

4.如权利要求2所述的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料的制备方法，其特征在于，调节纳米颗粒中光动力药物Chlorin e6掺杂量为质量比5～10％，其包封率为40～80％。

5.如权利要求1所述的具有pH响应性及光敏性的抗菌材料在制备抗泌尿系细菌感染的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物是靶向细菌感染酸性环境的药物。