CN103936834A

CN103936834A - pH选择性抗肿瘤多肽及其应用

Info

Publication number: CN103936834A
Application number: CN201410163472.9A
Authority: CN
Inventors: 屠志刚
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN103936834B

Abstract

本发明涉及一种高效pH选择性抗肿瘤多肽及其应用，属于抗肿瘤药物研发与应用技术领域。本发明采用核糖体展示技术，构建了一系列富含组氨酸且具有膜裂解和抗肿瘤活性多肽多肽，又利用组氨酸咪唑侧链的特殊酸度系数，构建了一系列对正常生理条件和肿瘤特征性酸性条件有选择性的抗肿瘤多肽。它们对肺癌细胞和乳腺癌细胞均有杀伤作用，能选择性的杀死酸性条件下的肿瘤细胞；在小鼠异种移植模型中抑制了肿瘤的生长，尤其是高选择性的抑制酸性条件下的肿瘤生长。通过显微镜观察、乳酸脱氢酶实验、荧光淬灭及多肽的圆二色谱，证明这些多肽通过插入、裂解细胞膜，增加了其通透性，导致了细胞活性降低和死亡。

Description

pH选择性抗肿瘤多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效pH选择性抗肿瘤多肽及其应用，属于抗肿瘤药物研发与应用技术领域。

背景技术

肿瘤的多药耐药性一直是困扰癌症治疗的一个重大障碍。而高效抗癌多肽，作为一种直接强效破坏肿瘤细胞的候选药物，由于其特殊的作用机理，不易发生肿瘤耐药性，正受到越来越多的关注。高效特异的抗癌多肽的设计是学术界公认的热点。开发具有药用价值的抗肿瘤多肽具有广泛的市场前景。然而，抗癌多肽也有自身的局限性，主要是选择性差。本发明设计了一系列的具有pH值选择性的抗癌多肽，显著增加了高效抗癌多肽的选择性。该项研究，对于癌症治疗，学术成果产业化都有着重要意义。

生物活性多肽是一种有着特殊的生物功能的多肽。一些比较成功的多肽药物包括控制糖尿病的胰高血糖素样多肽1 (GLP-1)；用来治疗肥胖的脑肠肽（ghrelin）；用来治疗癌症的胃泌激素释放多；及用作抗微生物的防御素。由于技术的局限性，以往多肽药物的研发多数仅限于研究领域，真正能走向临床的并不多。但随着近年来，生物技术的不断突破，以多肽为核心的新药层出不穷，并在临床上大显身手。多肽药物与传统小分子药物相比，有很多不同之处。首先，由于多肽是生物体内天然存在的物质，故毒性很小。其次，多肽药物一般不会像小分子药物那样富集在肝肾，对其产生毒副作用。而且，多肽与目标分子，例如靶蛋白，结合更紧密，故作用强大。

人们通过实验发现许多实体瘤的细胞外pH值比正常组织要低。肿瘤组织的酸性主要来源于肿瘤脉管系统的混乱、肿瘤细胞增加的糖酵解、质子输出的增加、肿瘤组织间液缓冲能力的降低及扩散减缓等因素。基于这样的机理，设计具有pH值选择性的生物活性多肽，使之能区分正常组织和肿瘤；用这类多肽选择性地在酸性环境中杀死肿瘤细胞，而不影响生理pH条件下的正常组织。

通过组氨酸取代设计pH敏感的裂解肽。在二十种常见氨基酸中，组氨酸由于它的特殊侧链，所以很特别。组氨酸的咪唑侧链的pKa值大约6.05，这意味着pH在6左右偏移很少一点就会改变它的电荷。实际上，多肽中组氨酸侧链的 pKa值和自由组氨酸的侧链略有不同。根据Bechinger的报告，基于不同的微环境，多肽的组氨酸侧链的pKa值在4.9到6.6之间（Burkhard, B., Unconventional concepts in environmental medicine. Versicherungsmedizin, 1996. 48(5): p. 179-84）。阳离子裂解肽靠多肽上的正电荷和靶细胞膜上的负电荷之间的吸引力结合到靶上。因此，一个含组氨酸的裂解肽，当环境的pH从中性变为酸性，多肽的电荷就可以朝正电方向变化，多肽将更易与靶细胞结合。另一方面，要抑制多肽在中性pH的活性。带正电的赖氨酸和精氨酸非常普遍，并且在阳离子裂解肽中起着关键作用，为了抑制多肽在中性pH的活性，可以减少多肽中赖氨酸和精氨酸的数量。在本发明中还发现，组氨酸取代赖氨酸和精氨酸对多肽构象有一定影响，并且这种影响对于提高多肽选择性有帮助。

核糖体展示技术筛选膜裂解肽。核糖体展示技术（Ribosome Display）主要是在体外转录DNA为没有终止密码子的mRNA成库后，体外翻译mRNA形成核糖体-mRNA-蛋白复合物。这些复合物就可以以正确折叠的待筛选的多肽或蛋白来直接和固定的靶蛋白相互作用，再接合太弱的和非特异性结合的文库成分被洗去后，筛选出的复合物里的mRNA可以被洗脱和纯化。通过逆转录可进一步引入突变，产生出新的DNA库，富集更佳的结合产物，以供下一轮筛选。通过多轮重复筛选，从而最终在体外实现达尔文式的蛋白进化。核糖体展示和mRNA展示技术都具有建库容易、库容量大（10¹⁴）、通过随机的突变和选择来进化蛋白、分子多样性强等优点，是筛选大型文库和获取抗体和功能性多肽和酶的强有力的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一系列高效的具有pH选择性抗肿瘤多肽序列。

本发明所提供的多肽序列如表1.所示：

表1. 多肽的序列：

本发明采用核糖体展示技术筛选具有膜裂解和抗肿瘤活性多肽，具体技术方案如下：

（1）核糖体展示载体（pRDV，Genbank号 AY327136）被用于筛选，以限制性内切酶BamHI和HindIII在载体内插入DNA文库。含19个、22个和25个随机多肽序列的DNA文库由一个GNN密码子和18个、或21个或24个 NNS密码子通过DNA连接所组成，N是腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）的混合物，S是C和G的混合物。NNS可以编码所有20基本氨基酸，但是仅编码三个终止子中的一个。该文库可以编码19个氨基酸、22个氨基酸和25个氨基酸长度的多肽。然后，PCR反应中使用T7B和tolAk的引物，在文库的序列前引入T7 RNA聚合酶启动子序列、核糖体结合位置（序列）和稳定结构的5’茎环结构，在文库序列后引入3’茎环结构和tolA间隔序列，为体外转录准备DNA模板，以琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。之后，在冰上加入T7 RNA聚合酶到准备体外的转录，在37℃反应2-3小时完成体外转录。使用传统的LiCl沉淀法纯化mRNA产物,以20,000g离心30分钟得到沉淀物，并以70%的乙醇清洗，真空抽干。水溶解沉淀物后，离心除去不溶于水的杂质。在180 μL上清液中加入20 μL 3 M NaOAc和预冷的500 μL 100%乙醇，离心出沉淀物。并且再以70%的乙醇清洗，真空抽干。

（2）在体外翻译实验中，加入2.0 μL最终浓度200 mM的甲硫氨酸，41 μL的氨基酸混合物，10 μg转录的mRNA，160 μL大肠杆菌S30核糖体粗提物。氨基酸混合物由18 μM anti-ssrA寡核苷酸、1.75 mM每种基本氨基酸（除甲硫氨酸以外）、10 mM ATP、2.5 mM GTP、5 mM cAMP、2.5 mg/mL 大肠杆菌MRE600株tRNA(罗氏No. 10109541001)和0.1 mg/mL 亚叶酸(西格玛奥德里奇No. 47612)。体外翻译反应约在37℃反应10分钟完成。反应停止后，20,000g离心5分钟，在新的96孔板每个孔中加入100 μL离心所得的上清液用于筛选反应。

（3）用生物素固定脂质小囊。脂质小囊中的脂由50 μmol二棕榈酸磷脂酰胆碱（DPPC）、10 μmol胆固醇、2.5 μmol二棕榈磷丝氨酸（DPPS）和0.5 μmol biotin-X DHPE（生物素-2-双十六烧基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，美国生命技术公司B-1616）构成。加到圆底烧瓶并溶解在4.0 mL氯仿中。有机溶剂在50 ℃真空蒸发半小时去除，得到一个薄的脂膜。烧瓶在真空中过夜，蒸发掉痕量的有机溶剂。向烧瓶中加入PBS（pH 7.4），在50 ℃水浴中旋转2小时获得悬浮的脂质小囊。而后，脂质小囊要经过5个冰冻-解冻循环来增加小囊的包裹率。脂质小囊混合物中脂的浓度最终由ferrithiocyanate法测得。在96孔V-型板中包被streptavidin，清洗并用0.5% BSA溶液封闭。在板上固定100 μL 100-200 nM的生物素-脂质小囊，清洗后，加入新鲜的完成体外翻译的上清液，在冰上结合1小时，清洗8-10次。然后加入终浓度50 μg/mL的酵母RNA和100 μL含EDTA的EB溶液洗脱protein-mRNA-ribosome复合物中的mRNA并纯化，用液氮速冻并保存于-80℃。对mRNA进行逆转录RT-PCR，使用WTC4和EWT5引物，产物cDNA用液氮速冻并保存在-20℃。进行进一步的PCR扩增，以限制性内切酶BamHI和HindIII在载体内插入PCR扩增后的文库，联入核糖体展示载体，生成pRDV_DARPin。

（4）易错的PCR突变：用1-20 μM的核苷酸类似物dPTP和8-oxo-dGTP调整突变概率，PCR反应中还要加入10 ng pRDV_DARPin模板，250 μM脱氧核糖核苷酸混合物（dNTP）， 1 μM T7B和tolAk引物，1.5 mM MgCl₂和 0.2 μL Platinum? Taq DNA聚合酶。该PCR产物将用以下一轮体外转录的模板。

（5）分别经过六轮筛选后，经测序获得了获得了一系列多肽并给予命名：多肽19-肽ZTU0、22-肽ZTU2、ZTU3和25-肽ZTU4、ZTU5序列。

ZTU0经过有目的的组氨酸取代赖氨酸或色氨酸取代苯丙氨酸，获得多肽序列ZTU6、ZTU7、ZTU8、ZTU9、ZTU10、ZTU12、ZTU13、ZTU17。

以上实验所用的引物序列：

T7B: 5’-ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG-3’

tolAk: 5’-CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT-3’

anti-ssrA：5’-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3’

WTC4: 5’-TTTGGGAAGCTTTTGCAGGATTTCAGC-3’

EWT5s: 5’-TTCCTCCATGGGTATGAGAGGATCG-3’

本发明通过多种物理化学试验、生物试验（包括细胞株杀伤实验和小鼠异种移植模型）证实了以上多肽的抗癌作用。

有益效果：

本发明的优点在于：利用核糖体展示技术筛选得到的与动物细胞膜有较强亲和力的多肽，选择性的对癌细胞的细胞膜有裂解破坏作用。序列中含组氨酸的多肽，在酸性pH值有选择性的杀伤作用，能够增强发明的多肽对于肿瘤的选择性。此外，本发明的序列中部分多肽含有色氨酸，较易进行精确定量和其他机制的研究。

附图说明

图1. 多肽筛选制备示意图。

图 2. 小鼠不同实验组的肿瘤生长情况。

图 3. 对照组和ZTU0的组织图。

图4. ZTU17的pH7.5和pH5.5治疗组组织图。

图5. LDH释放和细胞活性关系图。

图6. ZTU0对A549细胞的细胞膜剥离作用。

图7. 较长时间的ZTU0对A549细胞的细胞膜剥离作用。

图8. ZTU17处理的A549细胞的显微镜检查结果。A. 细胞在pH 7.5 PBS；B. 细胞在pH 5.5 PBS；C. 细胞加ZTU17（pH 7.5）； D. 细胞加ZTU17（pH 5.5）。

图9. ZTU17处理的A549细胞的荧光显微镜图。A. 对照组；B. 细胞加ZTU17（pH 7.5）； C.细胞加ZTU17（pH 5.5）。

图10. ZTU0在pH 7.5（■）和pH 5.5（●）时对脂质小囊（模仿哺乳动物细胞膜）的作用。图中的数据是平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验。

图11. ZTU12在pH 7.5（■）和pH 5.5（●）时对脂质小囊（模仿哺乳动物细胞膜）的作用。图中的数据是平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验。

图12. ZTU13在pH 7.5（■）和pH 5.5（●）时对脂质小囊（模仿哺乳动物细胞膜）的作用。图中的数据是平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验。

图13. ZTU17在pH 7.5（■）和pH 5.5（●）时对脂质小囊（模仿哺乳动物细胞膜）的作用。图中的数据是平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验。

图14. ZTU17对正电性（■）、中性（●）和负电性（▲）的脂质小囊的作用。

图15. 脂质小囊的Zeta电压。图中的数据为平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验。

图16. 多肽的Zeta电压值。图中的数据为平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验。多肽的浓度为0.15 mM。其中，含组氨酸的多肽ZTU12（●）、ZTU13（▲）、ZTU17（▼）、不含组氨酸的多肽的ZTU0（■）。

图17. 多肽在不同pH值时的细胞结合能力，图中的数据为平均值±标准偏差，数据来源于四个独立实验，**, P<0.01, 和pH 7.5时的数值相比。

图18. pH7.5时多肽ZTU12（■）、ZTU13（●）和ZTU17（▲）的荧光峰位移。

图19. pH5.5时多肽ZTU12（■）、ZTU13（●）和ZTU17（▲）的荧光峰位移。

图20. KI对pH7.5条件下的自由（黑色）和结合（灰色）的多肽的淬灭效果，图中的数据为平均值±标准偏差。

图21. KI对pH5.5条件下的自由（黑色）和结合（灰色）的多肽的淬灭效果，图中的数据为平均值±标准偏差。

图22. 丙烯酰胺对pH7.5条件下的自由（黑色）和结合（灰色）的多肽的淬灭效果，图中的数据为平均值±标准偏差。

图23. 丙烯酰胺对pH5.5条件下的自由（黑色）和结合（灰色）的多肽的淬灭效果，图中的数据为平均值±标准偏差。

图24. ZTU0在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图25. ZTU0在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图26. ZTU3在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图27. ZTU3在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图28. ZTU4在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图29. ZTU4在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图30. ZTU5在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图31. ZTU5在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图32. ZTU6在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图33. ZTU6在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图34. ZTU7在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图35. ZTU7在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图36. ZTU8在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱。

图37. ZTU8在不同pH值的10 mM SDS的CD谱。

图38. 多肽在不同pH值和两种缓冲液中α-螺旋含量的不同。

图39. 多肽在不同pH值和两种缓冲液中α-螺旋含量的不同。

具体实施方式

下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限定本发明。

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。

实施例1. 多肽的制备

（1）核糖体展示载体（pRDV，Genbank号 AY327136）被用于筛选，以限制性内切酶BamHI和HindIII分别切开空的载体和文库，在载体BamHI和HindIII的酶切位点内插入文库（如图1）。含19个、22个和25个随机多肽序列的DNA文库由一个GNN密码子和18个、或21个或24个 NNS密码子所组成，N是腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）的混合物，S是C和G的混合物。NNS可以编码所有20基本氨基酸，但是仅编码三个终止子中的一个。该文库可以编码19个氨基酸、22个氨基酸和25个氨基酸长度的多肽。然后，PCR扩增以上的插入文库后的载体，通过使用T7B和tolAk为引物，在文库的序列前引入T7 RNA聚合酶启动子序列、核糖体结合位置（序列）和稳定结构的5’茎环结构，在文库序列后引入3’茎环结构和tolA间隔序列（pRDV，Genbank号 AY327136），为体外转录准备DNA模板，以琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。之后，在冰上加入T7 RNA聚合酶到准备体外的转录，在37℃反应2-3小时完成体外转录。使用传统的LiCl沉淀法纯化mRNA产物,以20,000g离心30分钟得到沉淀物，并以70%的乙醇清洗，真空抽干。水溶解沉淀物后，离心除去不溶于水的杂质。在180 μL上清液中加入20 μL 3 M NaOAc和预冷的500 μL 100%乙醇，离心出沉淀物。并且再以70%的乙醇清洗，真空抽干。

（2）在体外翻译实验中，加入2.0 μL最终浓度200 mM的甲硫氨酸，41 μL的氨基酸混合物，10 μg转录的mRNA，160 μL大肠杆菌S30核糖体粗提物。氨基酸混合物由18 μM anti-ssrA寡核苷酸、1.75 m M每种基本氨基酸（除甲硫氨酸以外）、10 mM ATP、2.5 mM GTP、5 mM cAMP、2.5 mg/mL 大肠杆菌MRE600株tRNA(罗氏No. 10109541001)和0.1 mg/mL 亚叶酸(西格玛奥德里奇No. 47612)。体外翻译反应约在37℃反应10分钟完成。反应停止后，20,000g离心5分钟，在新的96孔板每个孔中加入100 μL离心所得的上清液用于筛选反应。

（3）用生物素固定脂质小囊。脂质小囊中的脂由50 μmol二棕榈酸磷脂酰胆碱（DPPC）、10 μmol胆固醇、2.5 μmol二棕榈磷丝氨酸（DPPS）和0.5 μmol biotin-X DHPE（生物素-2-双十六烧基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，美国生命技术公司B-1616）构成。加到圆底烧瓶并溶解在4.0 mL氯仿中。有机溶剂在50 ℃真空蒸发半小时去除，得到一个薄的脂膜。烧瓶在真空中过夜，蒸发掉痕量的有机溶剂。向烧瓶中加入PBS（pH 7.4），在50 ℃水浴中旋转2小时获得悬浮的脂质小囊。而后，脂质小囊要经过5个冰冻-解冻循环来增加小囊的包裹率。脂质小囊混合物中脂的浓度最终由ferrithiocyanate法测得。在96孔V-型板中包被streptavidin，清洗并用0.5% BSA溶液封闭。在板上固定100 μL 100–200 nM的生物素-脂质小囊，清洗后，加入新鲜的完成体外翻译的上清液，在冰上结合1小时，清洗8-10次。然后加入终浓度50 μg/mL的酵母RNA和100 μL含EDTA的EB溶液洗脱protein–mRNA–ribosome复合物中的mRNA并纯化，用液氮速冻并保存于-80℃。对mRNA进行逆转录RT-PCR，使用WTC4和EWT5引物，产物cDNA用液氮速冻并保存在-20℃。进行进一步的PCR扩增，以限制性内切酶BamHI和HindIII在载体内插入PCR扩增后的文库，联入核糖体展示载体，生成pRDV_DARPin。

（4）易错的PCR突变：用1-20 μM的核苷酸类似物dPTP和8-oxo-dGTP调整突变概率，PCR反应中还要加入10 ng pRDV_DARPin模板, 250 μM脱氧核糖核苷酸混合物（dNTP）, 1 μM T7B和tolAk引物, 1.5 mM MgCl₂和 0.2 μL Platinum? Taq DNA聚合酶。该PCR产物将用以下一轮体外转录的模板。

（5）分别经过六轮筛选后，经测序获得了多肽19-肽ZTU0、22-肽ZTU2、ZTU3和25-肽ZTU4、ZTU5序列。

以上实验所用的引物序列：

T7B: 5’-ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG-3’

tolAk: 5’-CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT-3’

anti-ssrA：5’-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3’

WTC4: 5’-TTTGGGAAGCTTTTGCAGGATTTCAGC-3’

EWT5s: 5’-TTCCTCCATGGGTATGAGAGGATCG-3’

筛选和组氨酸或色氨酸取代后的多肽由固相合成法合成大量多肽，经过电喷雾质谱和高效液相分析，纯度大于90%。每种多肽都在DMSO中配成100 mM的浓溶液，再由过滤过的纯水稀释为5 m M储存液，储存在-20℃。

实施例2. 多肽的抗癌活性测试

多肽的抗癌活性分别在人肺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺的成纤维细胞株CCD-13Lu和人乳腺上皮细胞株MCF-10A中检测。按5×10³个细胞/孔的密度将细胞植入96孔板中，37℃培养24小时。将多肽用培养液（待测pH的）稀释到不同浓度以替换原有培养液。在37℃培养2小时。然后，根据MTT的标准实验方法，测得多肽在不同pH值的活性。

表2.多肽在pH 7.5 和 5.5时的活性。

*: IC₂₀ （μM）: 抑制20%细胞活性时的多肽浓度。

pH选择性 = (pH 7.5时的IC₅₀)/ (pH 5.5时的IC₅₀)

结果表明，以上研究的多肽（除ZTU8）均具有较高的抗癌活性，可以有效的杀死人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7。此外，含组氨酸的多肽在酸性条件下（pH=5.5时）比生理条件下（pH=7.5时）有更高的细胞毒性，选择性在1.6～3.8之间。

实施例3. 体内实验

Nu/Nu裸鼠的饲养维持。在无病原条件的笼子里，按12小时灯光/12小时黑夜的节律，饲养小鼠。在小鼠的左侧腹皮下注射100 mL含1.7′10 ⁶ 个的A549细胞悬浮液。每隔一天，以游标卡尺测量肿瘤大小，体积按如下公式计算：体积 = 0.5 ′ W ′ L ′ H，W、L和H分别代表宽、长和高。当肿瘤长到约100 mm³时开始静脉注射。小鼠分为四组：（1）生理盐水（对照）；（2）ZTU0 在生理盐水中（pH 7.5）；（3）ZTU17在生理盐水中（pH 7.5）；（4）ZTU17在生理盐水中（pH 5.5）。每个组由6至7只小鼠组成。多肽注射液（20 nmol 多肽/小鼠，溶解在100 ml生理盐水）每三天注射一次。肿瘤体积在开始注射多肽后每四天测量一次。在开始注射24天后，所有的小鼠都处死并解剖。肿瘤一部分速冻保存，一部分以福尔马林固定，制作石蜡切片，并用苏木精和曙红染色，以光学显微镜观察。

如图2所示，对照组小鼠肿瘤的体积随着时间的增加而增大。实验结束时，对照组肿瘤的平均体积增加到了原来的三倍。相反，ZTU0 有非常强的抑制肿瘤生长的能力。ZTU17仅在pH 5.5而非 pH 7.5时显著抑制了肿瘤的生长，再次验证了其依赖于pH值的肿瘤杀伤能力。

在ZTU0和ZTU17（酸性）处理组的组织切片中，观察到了膨胀的细胞结构和组织空洞（图3和4），图3可看出，ZTU0治疗组可以观察到膨胀的细胞结构和组织的空洞。图4可知，ZTU17的pH5.5治疗组可以观察到膨胀的细胞结构和组织的空洞。ZTU17的pH7.5治疗组的组织的结构和对照组更相似。。同时还观察到了扩大的细胞核和模糊的核仁结构。

实施例4. 乳酸脱氢酶（LDH）释放实验

证明了多肽会增加细胞通透性，因而导致细胞死亡。

以5 ×10³个细胞/孔的密度将CCD-13Lu细胞加到96孔板中培养。多肽（ZTU0和ZTU7在pH 7.5时）与细胞共同孵育2小时。LDH浓度（LDH_sample）用显色的LDH试剂盒测定。Triton-X 100（0.2%终浓度）加到某些孔中准备细胞裂解液。细胞裂解液中的LDH浓度定义为LDH_total。LDH的释放（LDH_release）按照以下的公式来计算：

LDH _release = 100% × (LDH_sample / LDH_total)

细胞活性实验是在上清液都取出做LDH 释放实验后，在同样的细胞上完成的。细胞活性值和LDH释放值列在表3中。LDH释放值对细胞活性值在图5中，由图5可看出，多肽ZTU0和ZTU7处理细胞后，LDH的释放随着多肽浓度的增加而增加。LDH的释放通常用于衡量细胞膜的通透性，结果显示ZTU7和ZTU0杀死细胞的机制是一样。多肽会增加细胞通透性，因而导致细胞的活性降低、死亡。

表3. 细胞活性和LDH释放的关系

以上结果表明，在ZTU0 和ZTU7对细胞作用后，LDH释放直接与细胞活性的降低有关。正常细胞约有5-10%的LDH释放到外面。在ZTU0 和ZTU7对细胞作用后，LDH的释放随着多肽浓度的增加而增加。由于LDH的释放通常用于衡量细胞膜的通透性，结果显示ZTU7和ZTU0杀死细胞的机制是一样，细胞通透性增加导致细胞的活性降低。

实施例5. 多肽与细胞膜裂解

（1） ZTU0处理后细胞的显微镜观察

A549 细胞（20000个/孔）植入玻片小室并过夜培养。第二天去除培养液后以绿色的核酸染料SYTO 9（PBS）对细胞染色10分钟。之后用PBS冲洗细胞两次。再加30 μM ZTU0，每隔15秒用激光共聚焦显微镜拍摄一次。激发和发射波长分别为488和530 nm，放大倍率为200倍。

（2） ZTU17处理后细胞的显微镜观察

A549 细胞（20000个/孔）植入玻片小室并过夜培养。第二天去除培养液后以绿色的核酸染料SYTO 9（PBS）对细胞染色10分钟。细胞以30 μM ZTU17在pH 7.5或5.5时处理。用激光共聚焦显微镜拍摄照片，激发和发射波长分别为488和530 nm，放大倍率200倍。

（3）多肽ZTU0处理过的细胞的显微观察结果

在被ZTU0处理了30秒后，细胞出现了一些球形结构（图6和图7）。图6 中表明，在加了多肽的最初150秒，细胞膜脱离细胞形成球状，随着时间延长而增大。箭头指向一些图片中的典型的剥离的细胞膜。图7中，根据长时间显微观察结果得知，球状结构在3分钟时达到最大，然后就破裂和消失。6分钟以后就不再有新的球状结构出现。几乎所有视野中的细胞都出现了至少一个球状结构。这种现象在文章中被称为“膜发泡（membrane blebbing）”。

（4） ZTU17处理过的细胞的显微观察结果

A549细胞受到ZTU17在pH5.5处理后，出现了类似的“膜发泡”现象 (图8) 。图8中，

在对照组（PBS）没有发现明显的起泡现象，ZTU17在pH7.5时也没有产生膜的起泡。这里所有的多肽的浓度为30 μM。在这个浓度下，多肽可以在pH5.5时杀死40%的细胞，在pH7.5时则没有活性。

在另一个实验中 (图9)，ZTU17浓度为30 μM，多肽在染色前处理细胞1小时。活细胞呈绿色，死细胞呈红色。在图A中，对照组的细胞都是活的；图B中，在pH 7.5时，用ZTU17处理的细胞大部分是活的；图C中，在pH 5.5时，用ZTU17处理的细胞几乎都是死的或快要死的细胞，并且因为染色过程中冲去了部分死细胞，使该组的细胞数量显得少了。

A549细胞用ZTU17处理后，进行了SYTO 9 和 PI染色。只有膜破裂的细胞才会被PI所染色。在pH 7.5 时，大部分被ZTU17处理的细胞仍是活的。在pH 5.5时，多数被ZTU17处理的细胞被染为红色和黄色。PI染色的成功表明了这组细胞的细胞膜受到了损伤。

实施例6. 多肽与钙黄绿素（calcein）的释放

（1）脂质小囊的制备

脂质小囊中的脂根据组成的需要（正性、中性、负性和模拟哺乳动物细胞膜）加到圆底烧瓶并溶解（表4）在4.0 mL氯仿中。有机溶剂在50 ℃真空蒸发半小时去除，得到一个薄的脂膜。烧瓶在真空中过夜，蒸发掉痕量的有机溶剂。向烧瓶中加入PBS（pH 7.4），在50 ℃水浴中旋转2小时获得悬浮的脂质小囊。而后，脂质小囊要经过5个冰冻-解冻循环来增加小囊的包裹率。脂质小囊混合物中脂的浓度最终由ferrithiocyanate法测得。

表4. 脂质小囊的组成

（2）钙黄绿素释放实验

包裹钙黄绿素的脂质小囊也由上面提及的方法制备而成。没有包裹进小囊的钙黄绿素通过一个G-100柱子，用等渗的缓冲液（10 mM Tris和140 mM NaCl，pH 7.4)除去。在每个样品中，脂质小囊（2-5 mL）与恒定体积（200 μL）的多肽混匀。混合物中的脂的浓度保持在120 μM，多肽的浓度在1.0 μM到20 μM之间。混合物在室温孵育5分钟。多肽诱导的染料泄漏会引起荧光增加，以荧光读板机读数。激发和发射波长分别是485和525 nm，结果以F/F₀表达，F是加多肽后的荧光强度，F₀是初始的荧光强度。

（3）ZTU系列多肽对模仿哺乳动物细胞膜的脂质小囊的作用

在pH 7.5和5.5时进行实验。多肽的活性以F/F₀ 对多肽浓度进行作图（图 10-13）。斜率可以代表多肽的活性，多肽的pH选择性可以用以下公式:

pH选择值 = pH 5.5时的斜率/ pH 7.5时的斜率

ZTU0、12、13和17的pH选择值分别为1.56、2.64、2.73和4.14（表5）。这个结果和细胞上的获得的选择性的结果很接近。

表5.ZTU系列多肽对模仿了哺乳动物的细胞膜的脂质小囊的作用

(4)ZTU17 多肽对不同电荷的脂质小囊的作用

用不同原料准备了带正电荷、负电荷和不带电荷的脂质小囊。试验了ZTU17多肽对不同电荷的脂质小囊在pH 7.5的作用。多肽的活性以F/F₀对多肽浓度表示（图14）。由于曲线的线性特性，拟合线的斜率就是ZTU17对脂质小囊的活性。ZTU17对正电荷、中性和负电荷的脂质体的斜率分别为0.25、 0.34和 0.52。这些数据显示在相同pH条件下，负电荷越多的脂质小囊更易受影响。由于试验的多肽ZTU17带有正电荷，负电荷越多的脂质小囊更易受影响，证明了多肽和细胞膜存在静电引力的作用，多肽有极大可能通过细胞膜裂解时多肽和脂质小囊之间静电引力来作用。

(5)脂质小囊的Zeta电压

新鲜制备的模仿哺乳动物细胞膜的脂质小囊以pH值5.5到7.5范围的PBS缓冲液稀释到60 μM。脂质小囊的表面电荷以Zeta电压计读得。ZTU0、12、13和17用PBS缓冲液在不同pH制备为0.15 mM。多肽的Zeta电压由Zeta电压计读得。

在pH7.5到5.5的整个测试范围内，脂质小囊的Zeta电压几乎不变，保持在-28 至-30 mV (图15)。但是Zeta电压对于每个多肽是不同的(图16)，在pH7.5时，ZTU17有着最低的Zeta电压(-13.6mV)，ZTU0有着最高的电压 (9.2mV)。当pH降低时，含组氨酸的多肽ZTU12、13和17的 Zeta电压显著的增加，然而ZTU0增加的最少（表6）。在pH 5.5时，ZTU0的Zeta电压（15.9 mV）仍然比ZTU12（13.2 mV）和13（12.7 mV）高；ZTU17（5.1 mV）电压，尽管显著增加了18.7 mV, 仍然比其他多肽的电压明显低。

表6. 多肽在pH 7.5和5.5时的Zeta电压

平均值±标准偏差，n=4

脂质小囊在本研究中模仿了哺乳动物细胞膜的脂质层组成。为人们所熟知的是，在多肽和细胞膜之间的静电引力对于多肽结合到膜表面很重要。当缓冲液的pH值改变时，脂质膜上的负电荷保持不变，同时多肽的正电荷显著增加（除ZTU0以外）。因此，脂质膜和多肽之间的引力在pH从7.5变为5.5时增加了（除ZTU0以外）。不过，多肽Zeta电压的变化仍然只能部分预测多肽活性在pH值变化时的改变。对此，一个合理的解释就是细胞膜要比人造的脂质小囊要复杂的多。

实施例7. 多肽结合到细胞的能力

细胞植入24-孔板（5×10 ⁴个细胞/孔），在37℃孵育24小时。第二天，每个孔加入加入1.0 mL多肽溶液（40 μM）。20分钟孵育后，从每个孔中收集上清液后通过0.22 μm孔径的millipore膜过滤。过滤后溶液的多肽浓度（Cp）用定量MALDI质谱实验测得。

细胞结合的多肽的nmol量 = (40 μM – Cp (μM) )′ 10^-3L

结果表明，在pH 5.5时，结合到细胞上的多肽要比pH 7.5时高很多，除了ZTU0没有什么变化（图17）。这个结果给ZTU系列多肽在不同pH值的活性变化给出了一个直接的支持。在较低的pH值时，更多的含组氨酸的多肽结合在细胞膜上，这也就意味着含组氨酸的多肽的利用率更高。增加了细胞膜上的多肽浓度最终导致了细胞膜的裂解。

实施例8. 多肽的天然荧光

ZTU9、10、12、13和17的序列中有一个色氨酸残基，因此它们有天然荧光。尽管理论上所有三个芳香族氨基酸残基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）都具有天然荧光，色氨酸残基是多肽和蛋白质中使用最广泛的天然荧光检测的工具，因为色氨酸残基的荧光和光量子产率最高。在色氨酸残基从水溶液移到疏水环境中时，色氨酸残基的天然荧光的峰值有蓝移（10-20 nm）。

模仿哺乳动物细胞膜的脂质小囊用之前描述的方法制备。10 μM的多肽ZTU12、13和 17分别和20 到200 μM脂质小囊混合，在室温孵育10分钟。荧光分光光度计用来记录多肽的天然荧光。激发波长设在295 nm，发射波长在320到360 nm之间，激发和发射的狭缝均为10 nm。脂质小囊的光散射通过减去脂质小囊的空白谱来消除影响。

当多肽结合到脂质小囊上，多肽的固有的荧光光谱会发生蓝移。峰的迁移可以用以下方

程来定义： Δλ = 自由多肽的峰值（nm）- 结合的多肽的峰值（nm）

实验得到了自由多肽和结合的多肽的峰值（表7和8）。当脂/多肽的比例增加，谱向较短的波长迁移，峰迁移值增加（Δλ）（表 9 和 10）。因此，谱的峰迁移值代表了总的多肽中结合的多肽的比例。结合的多肽的比例可以用以下的公式计算而得（表 11和12）：

结合率= Δλ/Δλ_Total

这个公式基于一个假设：多肽的荧光强度在多肽结合到脂质小囊后变化不大。这个假设是得到我们的结果和之前的研究结果的支持的。

表7. 多肽在pH 7.5的荧光谱的峰值

表8. 多肽在pH 5.5的荧光谱的峰值

当脂/多肽的比例增加，越来越多的多肽结合到脂质小囊上。ZTU12和13 在pH 7.5时显示出了比ZTU17更高的对脂质小囊的亲和力（图18）。但是在pH 5.5，ZTU17的结合能力显著增加，并且ZTU17、12和13的结合能力几乎相似（图19）。

表9. 多肽在pH 7.5时的峰迁移值

表10. 在pH 5.5 时多肽的峰迁移值

表11. pH 7.5时多肽结合到脂质小囊的比例

表 12. pH 5.5时多肽结合到脂质小囊的比例

含组氨酸的多肽在pH5.5时与脂质小囊的结合比在在pH7.5时显著增加。

实施例9. 多肽的荧光淬灭实验测试多肽插入脂膜的构象变化

色氨酸残基的荧光可以被碘化钾（KI）和丙烯酰胺淬灭。吲哚环的激活状态（M*）和淬灭剂的淬灭反应如以下反应所示：

结果以Stern-Volmer方程来分析（Epps, D.E., et al., Inaccessibility of tryptophan residues of recombinant human renin to quenching agents. J Biol Chem, 1987. 262(22): p. 10570-3.；Lehrer, S.S., Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion. Biochemistry, 1971. 10(17): p. 3254-63.）：

此处，F₀ 代表初始荧光值，F代表加淬灭剂后的荧光值，K_SV 是淬灭常数（Andersen, N.H., Z. Liu, and K.S. Prickett, Efforts toward deriving the CD spectrum of a 3(10) helix in aqueous medium. FEBS Lett, 1996. 399(1-2): p. 47-52.）。当色氨酸残基包在蛋白的中心或脂中间，水溶液中淬灭剂的Ksv将大大降低，因为疏水环境阻止了淬灭剂接近发色团。

两对荧光 ZTU多肽（ZTU9和12及ZTU10和13）来测试多肽插入脂膜的构象变化。ZTU9和12都是从ZTU6在不同位置的色氨酸取代而得。ZTU7上类似的修饰得到了多肽ZTU10和13。为了保证多肽和脂质小囊的完全结合，多肽和脂质小囊在高浓度混合（多肽75 μM，脂质小囊3000 μM），并在室温孵育30分钟。之后，混合物用pH 7.5或5.5的PBS稀释，样品的天然荧光立即用荧光分光光度计读取。多肽和脂的最终浓度分别是2和80 μM。激发和发射波长分别是295和336 nm。不同数量的淬灭剂（KI或丙烯酰胺）加到了混合物中。立即读取加了淬灭剂的混合物的荧光。自由多肽的淬灭实验也以相似的实验步骤测试，仅仅不加脂质小囊。

（1） KI作为淬灭剂

当多肽结合到脂膜上时淬灭常数降低（表13）。和膜结合的多肽的淬灭常数仅仅为自由多肽的1/3-1/4。

在pH 7.5时，自由多肽的淬灭常数很相似（图20）。当它们结合到脂质小囊后，结合的多肽的淬灭常数降低。在pH 5.5的环境下，多肽埋入了脂质膜的里面，ZTU9和 10的淬灭常数剧烈的下降，ZTU12和 13 的淬灭常数下降一定的比例（图21）。

表13. KI对自由和与脂质小囊结合的多肽的淬灭效果

平均值± 标准偏差，n=4

（2）以丙烯酰胺作为淬灭剂

以丙烯酰胺作为淬灭剂也得到了以上的类似结果（表14）。在pH 7.5时，当多肽结合到脂质小囊后，结合的多肽的淬灭常数下降（图22）。在pH 5.5 时，多肽买入脂质膜中，ZTU9 和10 的淬灭常数显著下降，ZTU12和13 的常数下降一个比例（图23）。

表14. 丙烯酰胺对自由和与脂质小囊结合的多肽的淬灭效果

平均值±标准偏差，n=4

Ksv比例= (结合多肽的Ksv)/ (自由多肽的Ksv)

在pH 7.5时, ZTU9和12与ZTU10和13的Ksv比例类似(表13和14)。在pH 5.5时，ZTU9和10的Ksv 比例ZTU12 和13的小很多（图21和23）。无论用KI或是丙烯酰胺作淬灭剂，都可以得到相同的结论。

前面已经提及，ZTU9 和12 是从 ZTU6衍生而来。ZTU10 和 13 是由 ZTU7衍生而来。色氨酸修饰取代的一个主要目的就是用它们检测膜结合多肽对pH值变化可能发生的构象变化。结果显示，当pH值从7.5变为5.5时，已经和膜结合的多肽（ZTU6 和 7）会有一个意义显著的构象变化。在pH7.5时，多肽可能平行的位于脂膜上；当pH 变为5.5时，多肽的N端会深深的插入脂膜中。因此，要淬灭ZTU9和10的N端的色氨酸残基比淬灭ZTU12 和13的中间部位的色氨酸残基要困难，因为极性淬灭剂要插入非极性的脂膜很困难。

因此，根据以上结果可以发现，生理条件下，多肽倾向于平行于细胞膜上；而在酸性条件下，多肽能更有效插入细胞膜，设计的多肽可能通过插入非极性的脂膜来起到裂解细胞膜，来杀死癌细胞。

实施例10. 用圆二色谱(CD)测定多肽的二级结构。

多肽样品（30 μM）的CD谱在pH值不同的缓冲液中用分光偏光仪测得。CD谱在25℃的光径1.0 cm的石英光学管中测得。数据采集从240到 200nm，以1nm为间隔，每个波长扫描2秒。每个测试的五个扫描平均、平滑、去背景后转化为Δε（升×摩尔^-1×厘米^-1）。通过和以前的研究结果的比较可以推测出基本的结构信息（Andersen, N.H., Z. Liu, and K.S. Prickett, Efforts toward deriving the CD spectrum of a 3(10) helix in aqueous medium. FEBS Lett, 1996. 399(1-2): p. 47-52.；Viguera, A.R., et al., Conformational analysis of peptides corresponding to beta-hairpins and a beta-sheet that represent the entire sequence of the alpha-spectrin SH3 domain. J Mol Biol, 1996. 255(3): p. 507-21.）。CDPro软件用来分析数据，以此获得更丰富的信息（Johnson, W.C., Analyzing protein circular dichroism spectra for accurate secondary structures. Proteins, 1999. 35(3): p. 307-12.；Sreerama, N. and R.W. Woody, Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol, 2004. 383: p. 318-51.）。

多肽的CD谱在两种缓冲液中采集（图24-37）：20 mM NaAc（代表亲水环境）和10 mM SDS（代表疏水环境）。如图所示，一些二级结构是完美的α-螺旋，一些是完全的无规卷曲，还有许多是杂合的结构。CD谱的数据以处理CD谱的专业软件CDPro来处理。

图24显示了ZTU0在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，该谱显示了很强的无规卷曲的特征。图25为ZTU0在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，显示了α-螺旋结构的特征。图26为ZTU3在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，显示了无规卷曲的特征。图27为ZTU3在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，显示了α-螺旋结构的特征。图28为ZTU4在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，显示了大部分是α-螺旋结构的特征。图29为ZTU4在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，显示了几乎理想的α-螺旋结构的特征。图30为ZTU5在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，显示了大部分是α-螺旋结构的特征。图31为ZTU5在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，显示了几乎理想的α-螺旋结构的特征。图32为ZTU6在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，酸性条件下，该谱显示了无规卷曲的特征；在中性和碱性条件下，显示了很强的α-螺旋结构的特征。图33为ZTU6在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，α-螺旋结构的占了主导。图34为ZTU7在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，酸性条件下，该谱显示了无规卷曲的特征；在中性和碱性条件下，显示了α-螺旋结构的特征。图35为ZTU7在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，显示了大部分是α-螺旋结构的特征。图36为ZTU8在不同pH值的20 mM NaAc的CD谱，酸性条件下，该谱显示了无规卷曲的特征；在中性和碱性条件下，显示了α-螺旋结构的特征。图37为ZTU8在不同pH值的10 mM SDS的CD谱，显示了理想的α-螺旋结构的特征。

每个多肽在不同缓冲液和pH值时的α-螺旋的量列在表15和16中。

表15. 20 mM NaAc中多肽的α-螺旋含量

表16. 10 mM SDS中多肽的α-螺旋含量

所有有活性的多肽都是同一个模型：在亲水溶液中，多肽的α-螺旋量很低；在疏水环境中，α-螺旋量很高，例如ZTU0、3、6、7和8。相反地是，没有活性的多肽则不遵循这样的规律。它们在亲水环境时以α-螺旋为结构，例如ZTU4和5。有组氨酸的多肽在pH变化时，结构有所变化；pH高时，α-螺旋量很低；pH降低时，α-螺旋量升高。从这些多肽的结果，我们可以得出这样的结论，在多肽结合和膜裂解时构象的变化很重要。这和其他研究者得出的结论一致，并且再次确证了最有潜力的裂解肽是在亲水环境中是无规卷曲，在疏水环境中是α-螺旋结构的多肽。

α-螺旋的量的统计可以更好的解释假设。α-螺旋在两种缓冲液中的差异值可以用以下的公式来定义 (表17)：

Δα-螺旋 = (α-螺旋在SDS的量) – (α-螺旋在NaAc的量)

Δα-螺旋对pH值作图（图38-39）。从图中可以看出，高Δα-螺旋对应高活性。Δα-螺旋一直超过45%的多肽ZTU0和3，显示出了非常强的杀细胞活性。Δα-螺旋一直低于25%的多肽ZTU4和5，则几乎没有活性。同时，Δα-螺旋随着pH值增加而减小的多肽ZTU6、7和8，它们的活性随着pH值增加而降低（图38-39）。所有这些结果都显示出高的Δα-螺旋的量对多肽的活性是必要的。

这里需要指出的一点是，Δα-螺旋的变化不是完全和多肽ZTU6、7和8的活性变化是一致的。多肽ZTU6和7在pH值7.5且Δα-螺旋小于25%时仍有较高的活性（表17）。这些例外说明尽管构象变化是个重要的因素，但不是唯一的因素。其它因素，如电荷的变化，或是一些不明的因素，也和构象变化一起决定着多肽的活性。

表17. 不同缓冲液中多肽的Δα-螺旋。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> pH选择性抗肿瘤多肽及其应用

<130> pH选择性抗肿瘤多肽及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe Lys Gly Ile Thr Lys Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Asp Gln Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe Lys Gly Ile

1 5 10 15

Thr Lys Ile Val Ile Leu

20

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Arg Lys Gln Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe Lys Gly Ile

1 5 10 15

Thr Lys Ile Val Ile Leu

20

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Gly Asp Pro Ser Gln Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe

1 5 10 15

Lys Gly Ile Thr Lys Ile Val Ile Leu

20 25

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Gly Asp Gly Gly Gln Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe

1 5 10 15

Lys Gly Ile Thr Lys Ile Val Ile Leu

20 25

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe His Gly Ile Thr Lys Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe Lys Gly Ile Thr His Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe His Gly Ile Thr His Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Tyr Val Ile Trp Ile Ala Gly Val Phe His Gly Ile Thr Lys Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Tyr Val Ile Trp Ile Ala Gly Val Phe Lys Gly Ile Thr His Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Trp His Gly Ile Thr Lys Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Trp Lys Gly Ile Thr His Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

<210> 13

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ala Tyr Val Ile Phe Ile Ala Gly Val Trp His Gly Ile Thr His Ile

1 5 10 15

Val Ile Leu

Claims

1.一种pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，所述多肽具有如I、II或III所示的氨基酸序列：

I：AYVIFIAGVFKGITKIVIL；

II：X- AYVIFIAGVFKGITKIVIL；

III：根据I的序列取代部分氨基酸合成制备的序列。

2.根据权利要求1所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，II中X为DDQ时，

所述多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；X为RKQ时，所述多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；X为DGDPSQ时，所述多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；X为时，所述多肽具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，III中所述的序列，

当I的序列11位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

当I的序列15位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

当I的序列11和15位均被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

当I的序列5位被色氨酸、11位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

当I的序列5位被色氨酸，15位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；

当I的序列10位被色氨酸，11位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；

当I的序列10位被色氨酸，15位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；

当I的序列10位被色氨酸，11和15位被组氨酸取代时，所述多肽具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，具有 III 所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-3任一所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，I 、II 和III所示多肽与细胞膜的脂质结构有亲和力。

6.根据权利要求1所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，I 所示多肽的第5位和10位有苯丙氨酸，11和15位有赖氨酸，由19个氨基酸所组成。

7.根据权利要求1所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，I 和II 所示多肽的筛选方法为采用核糖体展示技术，使用的是生物素-脂质小囊为筛选底物。

8.根据权利要求1所述pH选择性抗肿瘤多肽，其特征在于，III 所示多肽的制备方法，采用多肽固相合成法，根据权利要求1所述抗肿瘤多肽 I 的序列取代部分氨基酸合成制备。

9.权利要求1-8任一所述pH选择性抗肿瘤多肽在抗肿瘤药物制备上的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌或乳腺癌。