KR20040099290A

KR20040099290A - 막투과형 ｎｆａｔ 저해 펩티드

Info

Publication number: KR20040099290A
Application number: KR10-2004-7013447A
Authority: KR
Inventors: 히데끼 마쯔이; 마사유끼 마쯔시따
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬; 히데끼 마쯔이; 마사유끼 마쯔시따
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2004-11-26
Also published as: WO2003072604A1; EP1486507A4; CN1303103C; JP3761476B2; US20050096267A1; DE60334194D1; US7659249B2; US7160863B2; JP2003252898A; EP1486507B1; AU2003211322A1; EP1486507A1; KR100863626B1; US20070093427A1; CN1639190A

Abstract

본 발명은 면역 질환, 심비대 또는 NFAT 활성화에서 기인하는 질환의 환자에 대하여, 투여하고 나서 실제로 효과를 발휘하기까지의 기간이 짧고, 부작용이나 항원성이 없는 펩티드 화합물을 제공함으로써 종래의 문제점을 해결한다. 또한, 수개의 연속되는 아르기닌 및 NFAT의 활성 저해 펩티드 서열을 함유하는 막투과형 NFAT 저해 펩티드, 이 펩티드로 이루어지는 NFAT 활성화 저해제, 및 상기 펩티드 화합물을 유효 성분으로 하는 면역 억제제 및 심비대 억제제를 제공한다.

Description

막투과형 ＮＦＡＴ 저해 펩티드 {Transmembrane NFAT Inhibitory Peptide}

종래부터 이식 수술 후의 거부 반응이나 아토피성 피부염 등의 면역 질환에 대하여 다양한 화합물이 면역 억제제로서 사용되고 있다. 예를 들면, 시클로스포린 A(CysA) 및 FK506은 주지된 면역 억제제이지만, 이들을 동물에게 투여한 경우에는 신장 기능 저하, 고혈압, 인슐린 분비량 저하 또는 신경 독성 등의 부작용이 생기는 것도 알려져 있다. 또한, CysA나 FK506 이외의 면역 억제제에 대해서도 여러가지 부작용이 생기는 것으로 조사되었고, 부작용이 보다 적은 면역 억제제가 절실하게 요망되었다.

현재로는 상기 합성 화합물에 의한 치료 이외에, 외래 유전자를 함유하는 벡터를 인간에게 투여하는 유전자 치료가 주목을 모으고 있고, 각종 질환에 대하여 임상 단계에서의 연구가 행해지고 있다. 그러나, 유전자 치료에 이용되는 벡터에는, 예를 들면 벡터를 인간에게 투여한 경우의 세포내로의 도입 효율, 투여로부터 단백질 발현까지 필요한 기간 및 부작용 등, 해결되어야 할 문제가 많이 남겨져 있다. 또한, 다양한 펩티드 제제 등도 연구되고 있지만, 현 시점에서는 임상적으로 사용되고 있는 것은 없다.

심비대는 유전적 배경 또는 압력 부하 등에 의해 심장이 통상보다 커진 상태이고, 심부전으로 연결될 가능성이 있다. 그러나, 심비대에 대하여, 그의 진행을 막으면서 그의 퇴행을 촉진하는 심비대 억제제는 현재 시점에서 시판되고 있지 않다. 이것은, 현재 알려진 심비대 억제제의 강한 부작용으로 인하여 실제로 인간에게 적용할 수 없기 때문이다. 따라서, 심비대를 억제하거나 또는 개선하며, 부작용 등의 문제가 없는 약제가 갈망되고 있다.

<발명의 개요>

본 발명의 과제는 상기와 같은 종래의 문제점을 해소하는 것이고, 투여하고 나서 실제로 효과를 발휘하기까지의 기간이 짧고, 부작용이나 항원성이 없는 펩티드 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명은 특히 면역 질환 및 심비대에 대한 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 NFAT 활성화 저해제도 제공한다.

아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기, 특히 아르기닌 11 잔기로 이루어지는 펩티드가 생체막 통과 신호 서열로서 매우 유효하다는 것을 일본 특허 출원 2000-358442에 개시하였다. 또한, 연구를 더욱 거듭한 결과, 아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기와 핵내 T 세포 활성화 인자(Nuclear Factor Activated T cell)인 NFAT의 활성 저해 펩티드를 융합한 펩티드 화합물을 생체내 계에서 사용한 경우에, 우수한 면역 억제 효과가 얻어지는 것을 처음으로 발견하였다. 또한, 상기 펩티드를 심비대 래트에투여한 경우에는, 심비대의 증상이 매우 양호하게 개선되는 것도 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기 및 서열 1의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기 및 서열 1의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 화합물로 이루어지는 NFAT 활성화 저해제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기 및 서열 1의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 화합물을 유효 성분으로 하는 면역 억제제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기 및 서열 1의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 화합물을 유효 성분으로 하는 심비대 억제제에 관한 것이다.

본 발명은 생체막 통과 신호 서열을 함유하는 신규 펩티드 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수개 잔기의 아르기닌과 VIVIT로 이루어지는 NFAT 활성화 저해제, 면역 억제제 및 심비대 억제제에 관한 것이다.

도 1은 11R-VIVIT, FK506 및 11R-VEET를 각 농도로 첨가하여 배양한 세포에서의 IL-2 유전자의 전사량을 나타내는 그래프이다. 종축은 GAPDH에 대한 IL-2 유전자의 RNA 상대량을 나타낸다.

도 2는 10％ 소 태아 혈청 함유 RPMI 배지만으로 60 시간 배양한 저카트(jurkat) 세포, 11R-VIVIT 첨가 후 13 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 및 60 시간 배양한 저카트 세포, 및 FK506 첨가 후 60 시간 배양한 저카트 세포에서의 IL-2 유전자의 전사량을 나타내는 그래프이다. 종축은 GAPDH에 대한 IL-2 유전자의 RNA 상대량을 나타낸다.

도 3은 림프구 혼합 시험에 있어서, 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을나타내는 그래프이다.

도 4는 11R-VIVIT, FK506 및 11R-VEET를 투여한 마우스로부터 얻어진 세포를 이용한 림프구 혼합 시험에 있어서, 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 나타내는 그래프이다.

도 5는 이식한 베타 세포의 생존율을 카플란-마이어(Kaplan-Meier)로 평가한 그래프이다.

도 6은 이식한 베타 세포를 면역 염색한 결과를 나타내는 현미경상이다. 1은 BALB/c 마우스의 베타 세포를 나타낸다. 2는 당뇨병 모델 마우스의 신장을 나타낸다.

도 7은 각 처리를 행한 세포에 의한 인슐린 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 도 7(a)는 각 농도의 11R-VIVIT로 처리된 세포에 의한 인슐린 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 도 7(b)는 각 농도의 FK506으로 처리된 세포에 의한 인슐린 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 도 7(c)는 각 농도의 11R-VEET로 처리된 세포에 의한 인슐린 분비량을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다.

도 8은 각 처리를 행한 세포의 증식을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 도 8(a)는 11R-VIVIT로 처리된 세포의 증식을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 도 8(b)는 FK506으로 처리된 세포의 증식을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 도 8(c)는 11R-VEET로 처리된 세포의 증식을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다.

도 9는 래트의 심실내 격벽 및 좌실 전체 벽의 두께를 초음파 에코에 의해 해석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9(a)는 대조군, AoB, CysA 투여 AoB 및 11R-VIVIT 투여 AoB의 심실내 격벽 두께를 나타내는 그래프이다. 도 9(b)는 대조군, AoB, CysA 투여 AoB 및 11R-VIVIT 투여 AoB의 좌실 전체 벽 두께를 나타내는 그래프이다.

도 10은 래트 심장의 조직 표본의 현미경상이다. 도 10(a)는 정상적인 래트의 심장 절편을 나타내는 현미경상이다. 도 10(b)는 AoB의 심장 절편을 나타내는 현미경상이다. 도 10(c)는 CysA를 투여한 AoB의 심장 절편을 나타내는 현미경상이다. 도 10(d)는 11R-VIVIT를 투여한 AoB의 심장 절편을 나타내는 현미경상이다. 3은 좌심실을 나타내고, 4는 우심실을 나타낸다.

도 11은 래트의 혈액 검사 결과를 나타내는 그래프이다. 도 11(a)는 대조군, AoB, CysA 투여 AoB 및 11R-VIVIT 투여 AoB의 ANP를 나타내는 그래프이다. 도 11(b)는 대조군, AoB, CysA 투여 AoB 및 11R-VIVIT 투여 AoB의 BNP를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 펩티드 화합물 및 그의 용도에 대하여 상세히 설명한다.

본원 발명의 펩티드 화합물은 수개의 아르기닌이 연속되는 아미노산 서열 및 서열 1의 아미노산 서열을 함유한다.

연속되는 아르기닌의 잔기수는 9 내지 13 잔기가 바람직하고, 11 잔기가 가장 바람직하다. 연속된 아르기닌이 8 잔기 이하 또는 14 잔기 이상인 경우, 본원발명의 펩티드 화합물의 세포에의 도입 효율이 나빠지는 경향이 있다.

본원 발명의 펩티드 화합물은 NFAT의 활성 저해 펩티드인 VIVIT를 더 함유한다. NFAT란, 칼시뉴린(calcineurin)으로 탈인산화시킴으로써 활성화되는 전사 조절 인자이고, NFAT1, NFAT2, NFAT3 및 NFAT4 등을 포함하는 패밀리를 형성한다. VIVIT는 MAGPHPVIVITGPHEE(서열 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이다. VIVIT는 칼시뉴린의 포스파타아제 활성에 영향을 주지 않고, NFAT 패밀리에 속하는 단백질과 칼시뉴린의 상호 작용을 선택적으로 저해한다(아람부르 J.(Aramburu, J.)등, 사이언스(Science), 제285권, 2129 내지 2133 페이지, 1999년). 서열 1에 나타내는 아미노산 서열에서 각 아미노산 잔기는, NFAT를 저해하는 것이라면 생물학적으로 동등한 아미노산 서열로 치환할 수도 있고, VIVIT와 동등한 생물학적 활성을 갖는 것이라면 수개의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실되어 있을 수도 있다.

또한, 본 발명의 펩티드 화합물은 동등한 생물학적 활성을 갖는 한, 상기 수개의 아르기닌이 연속되는 아미노산 서열 및 서열 1의 아미노산 서열에 부가적으로, 수개의 아미노산 잔기가 부가, 결실 또는 치환될 수도 있다.

또한, 본원 발명의 펩티드 화합물은 세포내에 도입된 것을 확인하기 위한 마커를 함유할 수도 있다. 마커는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 플루오레세인 이소티오시아네이트(이하, FITC라 약칭함), GFP 및 로다민 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 통상의 인공 합성법에 의해 또는 일반적으로 시판되고 있는 인공 합성기에 의해 제조할 수 있다. 또는, 본 발명의 펩티드 화합물은 유전자 공학적 수법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 수개의 아르기닌이 연속되는 서열 및 VIVIT로 이루어지는 서열을 포함하는 펩티드 서열을 코딩하는 DNA를 삽입한 재조합 벡터를 제조하고, 적당한 숙주 세포에 재조합 벡터를 도입한 후, 그 숙주 세포를 배양한다. 이어서, 배양물을 회수함으로써 본 발명의 펩티드 화합물을 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드 화합물을 제조한 후, 얻어진 펩티드 화합물은 공지된 방법으로 정제할 수도 있다. 이들 펩티드 화합물의 제조법 및 정제법은 본 분야에서 일반적인 수법이고, 당업자에 의해 용이하게 실시된다.

본 발명의 펩티드 화합물은 NFAT 활성화 억제제로서 사용할 수 있다. NFAT 활성화 억제제는 NFAT의 활성화에서 기인하는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다. NFAT의 활성화에서 기인하는 질환으로서는, 예를 들면 알레르기 질환 및 심비대 등을 들 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 면역 억제를 유도하는 작용을 가지고, 이식시의 면역 억제제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 억제제는 면역 질환 등의 치료제로서 이용할 수도 있다. 구체적인 면역 질환으로서는 이식 수술 후의 거부 반응, 아토피성 피부염 등을 들 수 있다.

본 발명의 면역 억제제는 정맥내, 피하, 근육내, 경피, 직장내 등의 비경구적으로 투여할 수 있다. 특히, 펩티드 화합물을 직접 혈류에 도입함으로써 펩티드 화합물의 분해를 막을 수 있기 때문에, 정맥내 투여 또는 피하 투여가 바람직하다.

본 발명의 면역 억제제의 제형은 투여 방법에 의해 적절하게 설정할 수 있다. 구체적으로는 수용액 및 유액 등의 액제 및 연고를 예시할 수 있다.

본 발명의 면역 억제제의 유효량은 투여 방법, 적용하는 환자의 연령, 체중, 병상 등을 고려하여 적절하게 설정할 수 있고, 유효 성분으로 환산하면 통상적으로 1 내지 10 mg/kg이다. 그러나, 유효 성분인 본 발명의 펩티드 화합물의 양은 변경 가능하고, 이들 범위로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역 억제제는 본 발명의 펩티드 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 적당한 약학적 부형제, 적당한 담체, 용매, 겔 형성제, 산화 방지제, 희석제, 등장화제, 담체, pH 안정제 등 본 기술 분야에서 통상 이용되는 추가의 성분을 첨가할 수도 있다. 이러한 첨가제는 통상 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 심비대 억제제로서 유효하다. 본 발명의 심비대 억제제는 정맥내, 피하, 경피, 직장내 등의 비경구적으로 투여할 수 있다. 특히, 펩티드 화합물을 직접 혈류에 도입하는 것이 펩티드 화합물의 분해를 막기 위해 중요하기 때문에, 정맥내 투여가 바람직하다.

본 발명의 심비대 억제제의 제형은 투여 방법에 의해 적절하게 설정할 수 있다. 구체적으로는 수용액 및 유액 등의 액제 및 연고를 예시할 수 있다.

본 발명의 심비대 억제제의 투여량은 투여 방법, 적용하는 환자의 연령, 체중, 병상 등에 의해 적절하게 설정할 수 있고, 유효 성분으로 환산하면 통상적으로 0.1 내지 2 mg/kg이다. 그러나, 유효 성분인 본 발명의 펩티드 화합물의 양은 변경 가능하고, 이들 범위로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 심비대 억제제는 본 발명의 펩티드 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 적당한 약학적 부형제, 적당한 담체, 용매, 겔 형성제, 산화 방지제, 희석제, 등장화제, 담체, pH 안정제 등 본 기술 분야에서 통상 이용되는 추가의 성분을 첨가할 수도 있다. 이들 첨가제는 통상 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명의 펩티드 화합물을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 그의 취지와 적용 범위에서 일탈하지 않는 한 이들로 한정되지 않는다.

<실시예 1>

연속된 아르기닌 11 잔기, VIVIT 및 FITC를 함유하는 펩티드 화합물을 인공 합성하고(시그마 제노시스 재팬사(Sigma Genosis Japan, Inc.)에 제조 의뢰), 분취 역상 HPLC에 의해 상기 펩티드를 정제하였다. 이하, 연속된 아르기닌 11 잔기 및 글리신 3 잔기를 부가한 VIVIT로 이루어지는 펩티드를 11R-VIVIT라 약칭한다. 11R-VIVIT의 펩티드 서열을 서열 2에 나타낸다. 또한, FITC는 11R-VIVIT의 아미노 말단측에 부가되어 있다.

<실시예 2>

6 주령의 C3H/HeN 마우스 H-2k(크레아 재팬사(CLEA Japan, Inc.) 제조)에 대하여, 실시예 1에서 제조한 11R-VIVIT와 FITC로 이루어지는 펩티드 화합물 10 mg/kg량을 용해시킨 0.5 ㎖의 링거액을 주사제로 하는 복강내 주사를 실시하였다. 주사로부터 6 시간 후, 각 마우스로부터 비장, 림프절, 간장, 신장 및 심장을 적출하여, 각각을 3 ㎖의 히스토 프렙(Histo Prep; 피셔 사이언티픽사(FisherScientific) 제조) 중에서 -80 ℃로 동결시켰다. 다음으로, 저온 유지 장치(cryostat) 상에서 10 내지 50 ㎛의 절편을 제조하여 자이스 현미경(자이스사(Zeiss) 제조)으로 분석하였다. 또한, 대조군으로서 미처리된 C3H/HeN 마우스의 절편을 이용하였다.

분석 결과, 복합 펩티드를 투여한 마우스에서 유래하는 비장, 림프절, 간장, 신장 및 심장의 절편에서는, 모두 FITC의 형광이 관찰되었다. 한편, 대조군의 절편에서는, FITC의 형광이 관찰되지 않았다. 이것은, 복강내 투여에 의해 적어도 비장, 림프절, 간장, 신장 및 심장의 세포에는 11R-VIVIT가 도입된다는 것을 나타내는 것이다.

<실시예 3>

IL-2 유전자의 전사에 대한 11R-VIVIT의 용량 의존적 효과를 연구하였다.

1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1 μM의 11R-VIVIT를 포함하는 1 ㎖의 10％ 소 태아 혈청 함유 RPMI(인비트로겐사(Invitorogen) 제조)를 이용하여, 1×10⁵개의 저카트 세포를 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스 배양 장치(산요 덴끼 가부시끼가이샤 제조)에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 2 μM의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(시그마사(Sigma) 제조) 및 40 μM의 이오노마이신(시그마사 제조)를 포함하는 100 ㎕의 RPMI를 첨가하여 12 시간 더 배양하였다. 이어서, 세포를 회수하고, 얻어진 세포를 이용하여 하기의 실시간 정량 RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)에 의해 IL-2 유전자의 전사량을 측정하였다. 실시간 정량 RT-PCR에서는, 하우스 키핑(house keeping) 유전자로서 알려진 GAPDH를 내부 표준물질로서 사용하였다. 또한, 11R-VIVIT를 포함하지 않는 배지에서 배양한 저카트 세포를 대조군 세포로서 이용하여, 동일한 실시간 정량 RT-PCR을 실시하였다.

RNeasy 미니 키트(RNeasy Mini Kit; 퀴아겐사(QIAGEN) 제조)를 프로토콜에 따라서 사용하여, 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 얻어진 전체 RNA를 이용하여, 역전사 반응을 22 ℃에서 10 분간, 이어서 42 ℃에서 20 분간 인큐베이션함으로써 실시하였다.

이어서, 라이트 사이클러-패스트 스타트 DNA 마스터 SYBR 그린 I 키트(Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit(로슈 몰레큘러 바이오케미칼즈사(Rhoche Molecular Biochemicals) 제조)를 이용하여, 20 ㎕의 반응 혼합액(전사 산물의 1/10의 양, 4 mM MgCl₂, 4종의 프라이머 각 0.5 μM, 2 ㎕의 10×라이트 사이클러 패스트 스타트 DNA 마스터 SYBR 그린 I)을 증폭 반응용으로 제조하였다. 인간 IL-2에 대한 프라이머로서는, 경합 정량 RT-PCR 키트(Competitive Quantitative RT-PCR Kit)(프나코시 가부시끼가이샤 제조) 중에 포함되는 프라이머를 이용하였다. GAPDH에 대한 프라이머로서는 5'-CTGACCAGGGTCCTATTCCA-3'(서열 5) 및 5'-TGGTTATCCCAAGCAAGAGG-3'(서열 6)을 이용하였다(모두 젠세트사 제조). 증폭 반응은 95 ℃에서 10 분간 인큐베이션한 후, 94 ℃ 15 초간, 57 ℃ 5 초간 및 72 ℃ 10 초간의 인큐베이션을 1 사이클로 하여, 이것을 60 사이클 실시하였다. 이어서, 0.2 ℃/초로 95 ℃까지 온도를 상승시켰다. 해리 곡선 해석에는 라이트 사이클러 소프트웨어(로슈 몰레큘러 바이오케미칼즈사 제조)를 사용하였다. 해석 결과 얻어진 GAPDH에 대한 RNA 상대량을 도 1에 나타낸다(n=3).

11R-VIVIT는 IL-2 유전자의 전사를 미처리한 경우의 12％로 억제하였다. IL-2 유전자는, 알레르기나 거부 반응에 의해 T 세포가 활성화되는 경우에 전사가 촉진되는 유전자이다. 따라서, 이 결과는 11R-VIVIT가 T 세포 활성화를 억제할 수 있음을 나타낸다.

<비교예 1>

실시예 1과 동일하게 하여, 연속된 아르기닌 11 잔기 및 글리신 3 잔기를 부가한 VEET로 이루어지는 펩티드 화합물(이하, 11R-VEET라 약칭함)을 인공 합성하여 정제하였다. VEET는 MAGPPHIVEETGPHVI(서열 3)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이다. 11R-VEET의 펩티드 서열을 서열 4에 나타낸다. 이하, 11R-VEET를 11R-VIVIT의 음성 대조군으로서 이용한다.

11R-VIVIT 대신에 100 nM의 FK506(후지사와 야꾸힝 고교 가부시끼가이샤 제조) 또는 1 μM의 11R-VEET를 포함하는 배지를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 저카트 세포를 배양하고, 얻어진 세포를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.

11R-VEET는 IL-2 유전자의 전사량에 영향을 주지 않았다.

<실시예 4>

T 세포에서의 11R-VIVIT의 반감기를 IL-2 전사에 대한 저해 활성에 기초하여 연구하였다.

1 μM의 11R-VIVIT를 포함하는 1 ㎖의 10％ 소 태아 혈청 함유 RPMI를 이용하여, 1×10⁵개의 저카트 세포를 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스배양 장치에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 2 μM PMA 및 40 μM의 이오노마이신을 포함하는 100 ㎕의 RPMI를 첨가하여 12 시간, 17 시간, 23 시간, 35 시간 또는 59 시간 더 배양하였다. 또한, 대조군 세포로서는, 11R-VIVIT를 포함하지 않는 10％ 소 태아 혈청 함유 RPMI에서 상기와 동일하게 1 시간 배양하고, 2 μM PMA 및 40 μM의 이오노마이신을 포함하는 100 ㎕의 RPMI를 첨가한 후, 12 시간, 17 시간, 23 시간, 35 시간 또는 59 시간 더 배양한 저카트 세포를 이용하였다.

이어서, 얻어진 각 세포를 시료로서 이용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여, RT-PCR 및 실시간 정량 RT-PCR을 실시하고 해석함으로써, GAPDH에 대한 RNA 상대량을 측정하였다. 결과를 도 2에 나타낸다(n=3). 도 2에 나타내는 시간은 배양 전체의 시간을 의미한다.

11R-VIVIT의 반감기는 약 30 시간이었다. 11R-VIVIT를 첨가하고 나서 60 시간 후에는, 그의 IL-2 전사 저해 활성은 볼 수 없었다.

<비교예 2>

1 μM의 FK506을 포함하는 1 ㎖의 10％ 소 태아 혈청 함유 RPMI를 이용하여, 1×10⁵개의 저카트 세포를 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스 배양 장치에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 2 μM PMA 및 40 μM의 이오노마이신을 포함하는 100 ㎕의 RPMI를 첨가한 후, 12 시간, 17 시간, 23 시간, 35 시간 또는 59 시간 더 배양하였다. 이어서, 얻어진 배양 세포를 이용한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로, RT-PCR 및 실시간 정량 RT-PCR을 실시하였다. FK506의 첨가로부터 60 시간 후의 IL-2 mRNA 상대량을 도 2에 나타낸다.

FK506은 60 시간 후에도 대사되지 않고, IL-2의 전사를 강하게 억제하였다.

<실시예 5>

T 세포의 활성화 및 증식에 대한 11R-VIVIT의 효과를 림프구 혼합 시험에 의해 연구하였다.

6 내지 8 주령의 C3H/HeN 마우스 및 6 내지 8 주령의 BALB/c 마우스 H-2d(세끼스이 짓껭 자이료 가부시끼가이샤 제조)로부터 비장 세포를 추출하였다. BALB/c 비장 세포는 마이토마이신 C(교와 핫꼬우 고교 가부시끼가이샤 제조)로 처리하여 자극 세포로서 이용하였다.

1 pM, 1 nM 또는 1 μM의 11R-VIVIT를 포함하는 RPMI를 평저 96웰 플레이트(이와끼 가부시끼가이샤 제조)에 첨가하였다. 이어서, 상기 자극 세포와 C3H/HeN 마우스 유래의 비장 세포를 1:5로 혼합한 혼합 세포를, 각 웰에 5×10⁵개 첨가하여 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스 배양 장치에서 90 시간 배양하였다. 또한, 대조군으로서, 배지만 있는 웰에 혼합 세포를 첨가하여 동일하게 배양하였다.

이어서, 0.5 μCi/웰의³H 메틸티미딘(이하, [³H]TdR이라 함. 아마샴 파마시아 바이오텍 가부시끼가이샤 제조)를 첨가하여 6 시간 배양하였다. 이어서, 세포를 직경 1 cm의 여과지 상에 놓고, 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기(벡크만사 제조)로 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.

1 μM의 11R-VIVIT는 대조군에 대하여 림프구의 증식을 43％ 억제하였다.도 3에 있어서, *는 대조군과 비교하여 P<0.05인 것을 의미하고, **는 모두 P<0.001인 것을 의미한다.

<비교예 3>

11R-VIVIT 대신에 1 pM, 1 nM 또는 1 μM의 FK506 또는 1 μM의 11R-VEET를 포함하는 RPMI를 이용한 것 이외에는 실시예 5와 동일한 방법에 의해 혼합 세포를 배양하고, [³H]TdR을 첨가하여 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기로 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.

11R-VEET는 1 μM에서는 림프구의 증식에 영향을 주지 않았다.

<비교예 4>

11R-VIVIT를 포함하지 않는 RPMI를 배지로서 이용하여, 혼합 세포 대신에 C3H/HeN 마우스 유래의 비장 세포만을 이용한 것 이외에는 실시예 5와 동일한 방법에 의해 세포를 배양하고, [³H]TdR을 첨가하여 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기로 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.

<실시예 6>

10 mg/kg량의 11R-VIVIT를 용해시킨 0.5 ㎖의 링거액을 주사제로서 이용하여, 생체내에서의 T 세포의 활성화 및 증식에 대한 11R-VIVIT의 효과를 연구하였다.

6 주령의 C3H/HeN 마우스에 상기 주사제를 1일 1회 2일간 복강내에 주사하였다.

2회째의 주사로부터 6 시간 후에 비장을 외과적으로 적출하였다. 얻어진 비장 세포(1×10⁴개)를 마이토마이신 C로 처리된 BALB/c 마우스의 비장 세포(1×10⁵개)와 함께 평저 96웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스 배양 장치에서 90 시간 배양하였다. 배지는 RPMI를 사용하였다. 또한, 대조군으로서 배지만 있는 웰에 혼합 세포를 첨가하여 동일하게 배양하였다.

이어서, 0.5 μCi/웰의 [³H]TdR을 첨가하여 6 시간 배양하였다. 이어서, 세포를 직경 1 cm의 여과지 상에 놓고, 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기로 측정하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 있어서, **는 모두 대조군과 비교하여 P<0.001인 것을 의미한다.

생체내에서 10 mg/kg의 11R-VIVIT는 대조군에 대하여 30％의 억제 효과를 나타내었다.

<비교예 5>

11R-VIVIT 대신에 1 mg/kg의 FK506 또는 10 mg/kg의 11R-VEET를 이용한 것 이외에는 실시예 6과 동일한 방법에 의해, C3H/HeN 마우스에 대하여 복강내 주사를 실시하고, 비장 세포를 추출하여 배양하고, [³H]TdR을 첨가하여 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기로 측정하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

11R-VEET는 1 μM에서는 림프구의 증식에 영향을 주지 않았다.

<비교예 6>

11R-VIVIT를 포함하지 않는 RPMI를 배지로서 이용하고, 혼합 세포 대신에 C3H/HeN 마우스 유래의 비장 세포만을 이용한 것 이외에는 실시예 6과 동일한 방법에 의해 세포를 배양하고, [³H]TdR을 첨가하여 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기로 측정하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

<실시예 7>

10 mg/kg량의 11R-VIVIT를 용해시킨 0.5 ㎖의 링거액을 주사제로서 이용하여, 베타 세포의 이식에 대한 11R-VIVIT의 효과를 연구하였다. 이식시, 공여자로서 6 주령의 BALB/c 마우스를, 수용자로서 6 주령의 C3H/HeN 마우스를 이용하였다.

C3H/HeN 마우스에 대하여 220 mg/kg의 스트렙토조신(시그마-알드리치 재팬 가부시끼가이샤)를 1회 복강내 주사함으로써 당뇨병 모델 마우스를 제조하였다. 또한, 스트렙토조신 주사로부터 6일 후, 혈당치가 350 mg/dl을 초과한 마우스를 고혈당증이라고 판단하였다.

한편, BALB/c 마우스의 췌장을 적출하여, 불연속 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리를 실시한 후, 통상의 콜라게나아제 분해에 의해 베타 세포를 단리하였다.

단리한 약 500개의 베타 세포를 상기 당뇨병 모델 마우스의 좌측 신장의 피막하에 이식하였다. 이식 후, 마우스에게 10 mg/kg의 11R-VIVIT를 매일 1회 복강내 주사하였다(n=6). 대조군으로서 11R-VIVIT를 포함하지 않는 생리 식염수를, 베타 세포를 이식한 마우스에게 주사하였다(n=4). 혈당을 측정하여 그 값이 2일간 연속 200 mg/dl을 초과한 경우에 이식 조직 거부라 하였다. 도 5에 카플란-마이어로 평가한 결과를 나타낸다.

11R-VIVIT의 투여에 의해, 대조군과 비교하여 생존율이 유의하게 상승하였다(P<0.005).

<비교예 7>

11R-VIVIT 대신에 10 mg/kg의 11R-VEET를 이용한 것 이외에는 실시예 7과 동일하게 하여, 베타 세포의 이식에 대한 11R-VEET의 효과를 연구하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

11R-VEET는 대조군과 동일하게 이식 조직의 생존에는 아무런 영향도 주지 않았다.

<실시예 8>

실시예 1에서 11R-VIVIT를 투여한 마우스를 이용하여, 이식한 베타 세포의 기능을 연구하였다.

베타 세포의 이식으로부터 50일 후의 신장을 외과적으로 적출하였다. 이어서, 동결 마이크로톰(컬츠아이스사 제조)를 이용하여 30 ㎛의 신장 절편을 제조하였다. 이어서, 얻어진 절편에 대하여, 인슐린에 대한 폴리클로날 항체(산타크루즈사 제조) 및 아비딘, 비오틴 퍼옥시다아제법(벡터사 제조)를 이용하여 면역 염색을 실시하였다.

면역 염색의 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 있어서, 1은 이식된 베타 세포이고, 2는 수용자의 신장이다. 이식한 베타 세포가 인슐린 항체에 의해 염색되었기 때문에, 이식 세포가 인슐린을 생산하고 있음을 확인하였다.

<실시예 9>

βTC6 세포에 의한 인슐린 분비에 대한 11R-VIVIT의 효과를 연구하였다. βTC6 세포는 글루코오스에 반응하여 인슐린을 분비하는 랑게르한스섬의 세포계이다.

βTC6 세포(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture collection), CRL-11506)를 96웰 플레이트에 접종하고(웰 당 5×10⁴개의 세포), 10, 100, 1000 또는 10000 nM의 11R-VIVIT를 포함하는 1 ㎖의 10％ 소 태아 혈청 함유 RPMI를 이용하여 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스 배양 장치에서 96 시간 배양하였다. 배지는 24 시간마다 11R-VIVIT를 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. 96 시간 후, 신선한 배지로 교환하여 1 시간 더 배양하고, 배양 상청액을 회수하였다. 대조군으로서, 11R-VIVIT를 포함하지 않는 배지를 이용한 것 이외에는 동일하게 하여 βTC6 세포의 배양을 실시하였다.

이어서, 회수한 배양 상청액을 이용하고, 마우스 인슐린 ELISA(TMB) 키트(시바야기사 제조)를 프로토콜에 따라서 사용하여, 분비된 인슐린을 분석하였다. 도 7(a)는 11R-VIVIT로 처리된 세포에 의한 인슐린 분비량을, 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이다.

βTC6 세포의 인슐린 분비량은, 11R-VIVIT가 0 내지 1 μM의 범위에서 대조군과 거의 동일하였지만, 10 μM에서는 대조군의 71％이었다(P=0.042).

<비교예 8>

11R-VIVIT 대신에 1, 10, 100 또는 1000 nM의 FK506 또는 10, 100, 1000 또는 10000 nM의 11R-VEET를 포함하는 완전 배지를 이용한 것 이외에는 실시예 9와 동일한 방법에 의해 βTC6 세포를 배양하여, βTC6 세포에 의한 인슐린 분비에 대한 효과를 연구하였다. 그 결과를 도 7(b) 및 도 7(c)에 나타낸다.

βTC6 세포의 인슐린 분비량은 FK506에 의해 현저히 감소되고, 한편 11R-VEET에 의해 영향을 받지 않았다.

<실시예 10>

βTC6 세포의 증식에 대한 11R-VIVIT의 효과를 연구하였다.

βTC6 세포를 96웰 플레이트에 접종하고(웰 당 5×10⁴개의 세포), 10, 100, 1000 또는 10000 nM의 11R-VIVIT를 포함하는 완전 배지를 이용하여 37 ℃, 5％ 탄산 가스 농도로 설정한 탄산 가스 배양 장치에서 88 시간 배양하였다. 배지는 24 시간마다 11R-VIVIT를 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. 이어서, 1 μCi/웰의 [³H]TdR을 첨가하여 8 시간 더 배양하였다. 대조군으로서, 11R-VIVIT를 포함하지 않는 배지를 이용한 것 이외에는 동일하게 하여 βTC6 세포의 배양을 실시하였다. 이어서, 세포를 직경 1 cm의 여과지 상에 놓고, 세포에 혼입된 [³H]TdR의 방사 활성을 베타 계수기로 측정하였다. 도 8(a)는 11R-VIVIT로 처리된 세포의 증식을 대조군에 대한 상대값으로 나타낸 것이다.

βTC6 세포의 증식에 대해서는, 11R-VIVIT가 0 내지 1 μM의 범위에서는 대조군과 거의 동일하였지만, 10 μM에서는 대조군의 73％이었다(P=0.075).

<비교예 9>

11R-VIVIT 대신에 1, 10, 100 또는 1000 nM의 FK506 또는 10, 100, 1000 또는 10000 nM의 11R-VEET를 포함하는 완전 배지를 이용한 것 이외에는 실시예 10과동일한 방법에 의해 βTC6 세포를 배양하여, βTC6 세포의 증식에 대한 효과를 연구하였다. 그 결과를 도 8(b) 및 도 8(c)에 나타낸다.

FK506 및 11R-VEET는 βTC6 세포의 증식에 대하여 저해 효과를 나타내지 않았다.

<실시예 11>

심비대에 대한 11R-VIVIT의 효과를 연구하였다.

심비대 모델 래트에 대하여, 1.5 mg/kg량의 11R-VIVIT를 용해시킨 0.5 ㎖의 링거액을 격일로 피하 주사하였다(n=6). 또한, 심비대 모델 래트는, 체중 200 내지 250 g의 7 주령의 수컷 위스타 래트(세끼스이 짓껭 자이료 가부시끼가이샤 제조)의 대동맥을 결찰하여 심장에 압력 부하를 가함으로써 제조하였다. 본 명세서에 있어서, 심비대 모델 래트는 AoB라 약칭한다.

이어서, 0, 1, 2, 3, 4 및 5주 후에 래트의 심장을 이하의 방법으로 평가하였다. 또한, 대조군으로서 11R-VIVIT를 투여하지 않은 정상적인 래트를 이용하였다.

대조군 및 11R-VIVIT를 투여한 AoB에 대하여, 초음파 에코 검사(ULC), 조직 표본의 제조 및 혈액 검사를 이하와 같이 하여 실시하였다.

ULC는, 래트의 심실내 격벽 및 좌실 전체 벽의 두께를 초음파 에코(히타치 가부시끼가이샤 제조)에 의해 소아용 프로브를 이용하여 해석하였다. 결과를 도 9(a) 및 도 9(b)에 나타낸다. 그 결과, 11R-VIVIT 투여에 의해 AoB에서의 심실내 격벽 두께 및 좌실 전체 벽 두께는 모두 개선되는 것을 확인하였다.

조직 표본은 래트의 심장을 외과적으로 적출하여, 동결 마이크로톰에 의해 두께 5 ㎛의 절편을 제조하고, 이어서 얻어진 절편을 헤마톡실린 에오신 (hematoxylin eosin) 염색법으로 염색함으로써 제조하였다. 얻어진 조직 표본은 현미경으로 관찰하였다(도 10(d)). 도 10에서 3은 좌심실을 나타내고, 4는 우심실을 나타낸다. 그 결과, 11R-VIVIT 투여에 의해 정상에 가까운 형태까지 증상이 개선되는 것을 확인하였다.

심방성 나트륨 이뇨 펩티드(ANP) 및 B형 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)의 측정은 닛본 에스알엘 가부시끼가이샤에 의뢰하였다. 결과를 도 11(a) 및 도 11(b)에 나타낸다. 그 결과, 11R-VIVIT 투여에 의해 AoB에서의 ANP 및 BNP의 값은 모두 개선되는 것을 확인하였다.

<비교예 10>

11R-VIVIT를 투여하지 않는 AoB를 이용한 것 이외에는 실시예 11와 동일하게 하여, ULC의 측정, 조직 표본의 제조 및 혈액 검사를 실시하였다. 결과를 도 9(a), 도 9(b), 도 10(b), 도 11(a) 및 도 11(b)에 나타낸다.

<비교예 11>

11R-VIVIT 대신에 5 mg/kg의 CysA를 이용한 것 이외에는 실시예 11와 동일하게 하여, 심비대에 대한 CysA의 효과를 연구하였다. 결과를 도 9(a), 도 9(b), 도 10(c), 도 11(a) 및 도 11(b)에 나타낸다.

<시험예 1>

간 기능 및 신장 기능에 대한 11R-VIVIT의 독성을, 11R-VIVIT를 투여한 AoB를 이용하여 연구하였다.

1.5 mg/kg량의 11R-VIVIT를 용해시킨 0.5 ㎖의 링거액을, 격일로 4주간 AoB에 피하 주사하였다(n=6). 얻어진 AoB에 대하여, 이하의 측정을 닛본 에스알엘 가부시끼가이샤에 의뢰하였다.

간 기능 검사로서 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나아제(GOT) 및 글루탐산 피루브산 트랜스아미나아제(GPT)를 측정하고, 신장 기능 검사로서 크레아티닌(Cr) 및 요소 질소(BUN)를 측정하였다. 또한, 11R-VIVIT를 투여하지 않는 정상 래트 및 AoB를 대조군으로서 사용하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

측정 결과, 본 발명의 펩티드 화합물은 간장 및 신장의 기능에 영향을 주지 않는 것으로 시사되었다.

본 발명의 펩티드 화합물은, NFAT의 활성화에서 기인하는 질환에 대한 부작용이 매우 적은 치료제로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 면역 억제제 및 심비대 억제제로서 사용할 수 있기 때문에 매우 유용하다.

<서열목록에 대한 설명>

서열 2: 융합 펩티드 서열

서열 4: 융합 펩티드 서열

<110> Japan Science and Technology Corporation <110> Hideki, MATSUI <110> Masayuki, MATSUSHITA <120> Membrane-permeable NFAT inhibitor peptide <130> FP-8321PCT <160> 6 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Ala Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: fusion peptide sequence <400> 2 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala 1 5 10 15 Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu 20 25 30 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 3 Met Ala Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile 1 5 10 15 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: fusion peptide sequence <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala 1 5 10 15 Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile 20 25 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 5 ctgaccaggg tcctattcca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 6 tggttatccc aagcaagagg 20

Claims

아르기닌 9 잔기 내지 13 잔기 및 서열 1의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 화합물.
제1항에 있어서, 아르기닌이 11 잔기인 펩티드 화합물.
제1항 또는 제2항에 기재된 펩티드 화합물로 이루어지는 NFAT 활성화 저해제.
제1항 또는 제2항에 기재된 펩티드 화합물을 유효 성분으로 하는 면역 억제제.
제1항 또는 제2항에 기재된 펩티드 화합물을 유효 성분으로 하는 심비대 억제제.