JP2003252898A - 膜透過型ｎｆａｔ阻害ペプチド - Google Patents
膜透過型ｎｆａｔ阻害ペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 免疫疾患、心肥大またはＮＦＡＴの活性化に
起因する疾患の患者に対し、投与してから実際に効果を
発揮するまでの期間が短く、副作用や抗原性のないペプ
チド化合物を提供することにより、従来の問題点を解決
することである。 【解決手段】 数個の連続するアルギニンおよびＮＦＡ
Ｔの活性阻害ペプチド配列とを含有する膜透過型ＮＦＡ
Ｔ阻害ペプチド、該ペプチドからなるＮＦＡＴ活性化の
阻害剤、ならびに該ペプチド化合物を有効成分とする免
疫抑制剤および心肥大抑制剤。
起因する疾患の患者に対し、投与してから実際に効果を
発揮するまでの期間が短く、副作用や抗原性のないペプ
チド化合物を提供することにより、従来の問題点を解決
することである。 【解決手段】 数個の連続するアルギニンおよびＮＦＡ
Ｔの活性阻害ペプチド配列とを含有する膜透過型ＮＦＡ
Ｔ阻害ペプチド、該ペプチドからなるＮＦＡＴ活性化の
阻害剤、ならびに該ペプチド化合物を有効成分とする免
疫抑制剤および心肥大抑制剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体膜通過シグナ
ル配列を含有する新規ペプチド化合物に関する。さらに
本発明は、数残基のアルギニンとＶＩＶＩＴからなるＮ
ＦＡＴ活性化の阻害剤、免疫抑制剤および心肥大抑制剤
に関する。
ル配列を含有する新規ペプチド化合物に関する。さらに
本発明は、数残基のアルギニンとＶＩＶＩＴからなるＮ
ＦＡＴ活性化の阻害剤、免疫抑制剤および心肥大抑制剤
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、移植手術後の拒絶反応やアト
ピー性皮膚炎などの免疫疾患に対して、様々な化合物が
免疫抑制剤として使用されている。たとえば、シクロス
ポリンＡ（ＣｙｓＡ）およびＦＫ５０６は周知の免疫抑
制剤であるが、それらを動物に投与した場合には腎機能
低下、高血圧、インスリン分泌量の低下または神経毒性
などの副作用が生じることも知られている。また、Ｃｙ
ｓＡやＦＫ５０６以外の免疫抑制剤についても、様々な
副作用が生じることが調べられており、副作用のより少
ない免疫抑制剤が切に望まれてきた。
ピー性皮膚炎などの免疫疾患に対して、様々な化合物が
免疫抑制剤として使用されている。たとえば、シクロス
ポリンＡ（ＣｙｓＡ）およびＦＫ５０６は周知の免疫抑
制剤であるが、それらを動物に投与した場合には腎機能
低下、高血圧、インスリン分泌量の低下または神経毒性
などの副作用が生じることも知られている。また、Ｃｙ
ｓＡやＦＫ５０６以外の免疫抑制剤についても、様々な
副作用が生じることが調べられており、副作用のより少
ない免疫抑制剤が切に望まれてきた。
【０００３】現在では、前記合成化合物による治療のほ
か、外来遺伝子を含有するベクターを人間に投与すると
いう遺伝子治療が注目を集めており、様々な疾患に関し
て臨床段階での検討が行われている。しかしながら、遺
伝子治療に用いられるベクターには、たとえば、ベクタ
ーを人間に投与した場合の細胞内への導入効率、投与か
らタンパク質発現までに必要な期間および副作用など、
解決されるべき問題が多く残されている。また、種々の
ペプチド製剤なども検討されているが、現時点では臨床
で使用されているものはない。
か、外来遺伝子を含有するベクターを人間に投与すると
いう遺伝子治療が注目を集めており、様々な疾患に関し
て臨床段階での検討が行われている。しかしながら、遺
伝子治療に用いられるベクターには、たとえば、ベクタ
ーを人間に投与した場合の細胞内への導入効率、投与か
らタンパク質発現までに必要な期間および副作用など、
解決されるべき問題が多く残されている。また、種々の
ペプチド製剤なども検討されているが、現時点では臨床
で使用されているものはない。
【０００４】心肥大は、遺伝的背景または圧負荷などに
よって心臓が通常より大きくなった状態であり、心不全
につながる可能性がある。しかしながら、心肥大に対
し、その進行を防ぐまたはその退縮を促進するといった
心肥大抑制剤は、現在のところ市販されていない。これ
は、現在知られる心肥大抑制剤が強い副作用を有するた
め、実際にヒトに適用することができないからである。
したがって、心肥大を抑制または改善し、かつ副作用な
どの問題のない薬剤が切望されている。
よって心臓が通常より大きくなった状態であり、心不全
につながる可能性がある。しかしながら、心肥大に対
し、その進行を防ぐまたはその退縮を促進するといった
心肥大抑制剤は、現在のところ市販されていない。これ
は、現在知られる心肥大抑制剤が強い副作用を有するた
め、実際にヒトに適用することができないからである。
したがって、心肥大を抑制または改善し、かつ副作用な
どの問題のない薬剤が切望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は前記の
ような従来の問題点を解消することであり、投与してか
ら実際に効果を発揮するまでの期間が短く、副作用や抗
原性のないペプチド化合物を提供することである。本発
明はとくに、免疫疾患および心肥大に対する治療剤を提
供することを目的とする。また本発明は、ＮＦＡＴ活性
化の阻害剤をも提供する。
ような従来の問題点を解消することであり、投与してか
ら実際に効果を発揮するまでの期間が短く、副作用や抗
原性のないペプチド化合物を提供することである。本発
明はとくに、免疫疾患および心肥大に対する治療剤を提
供することを目的とする。また本発明は、ＮＦＡＴ活性
化の阻害剤をも提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】アルギニン９残基〜１３
残基、とくにアルギニン１１残基からなるペプチドが、
生体膜通過シグナル配列として非常に有効であることを
特願２０００−３５８４４２に開示した。そして、さら
に検討を重ねた結果、アルギニン９残基〜１３残基と核
内Ｔ細胞活性化因子（Nuclear Factor Activated T cel
l）ＮＦＡＴの活性阻害ペプチドとを融合したペプチド
化合物をインビボ系で用いた場合に、優れた免疫抑制効
果が得られることを初めて見出した。そのうえ、該ペプ
チドを心肥大のラットに投与した場合には、心肥大の症
状が極めて良好に改善されることも見出し、本発明を完
成した。
残基、とくにアルギニン１１残基からなるペプチドが、
生体膜通過シグナル配列として非常に有効であることを
特願２０００−３５８４４２に開示した。そして、さら
に検討を重ねた結果、アルギニン９残基〜１３残基と核
内Ｔ細胞活性化因子（Nuclear Factor Activated T cel
l）ＮＦＡＴの活性阻害ペプチドとを融合したペプチド
化合物をインビボ系で用いた場合に、優れた免疫抑制効
果が得られることを初めて見出した。そのうえ、該ペプ
チドを心肥大のラットに投与した場合には、心肥大の症
状が極めて良好に改善されることも見出し、本発明を完
成した。
【０００７】すなわち、本発明は、アルギニン９残基〜
１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペ
プチド化合物に関する。
１３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペ
プチド化合物に関する。
【０００８】本発明は、アルギニン９残基〜１３残基お
よび配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合
物からなるＮＦＡＴ活性化の阻害剤に関する。
よび配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合
物からなるＮＦＡＴ活性化の阻害剤に関する。
【０００９】また、本発明は、アルギニン９残基〜１３
残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチ
ド化合物を有効成分とする免疫抑制剤に関する。
残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチ
ド化合物を有効成分とする免疫抑制剤に関する。
【００１０】さらに、本発明は、アルギニン９残基〜１
３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプ
チド化合物を有効成分とする心肥大抑制剤に関する。
３残基および配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプ
チド化合物を有効成分とする心肥大抑制剤に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明のペプチド化合物お
よびその用途について詳細に説明する。
よびその用途について詳細に説明する。
【００１２】本願発明のペプチド化合物は、数個のアル
ギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミ
ノ酸配列を含有する。
ギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミ
ノ酸配列を含有する。
【００１３】連続するアルギニンの残基数としては、９
〜１３残基が好ましく、１１残基が最も好ましい。連続
したアルギニンが８残基以下または１４残基以上である
場合、本願発明のペプチド化合物の細胞への導入効率が
悪くなる傾向がある。
〜１３残基が好ましく、１１残基が最も好ましい。連続
したアルギニンが８残基以下または１４残基以上である
場合、本願発明のペプチド化合物の細胞への導入効率が
悪くなる傾向がある。
【００１４】本願発明のペプチド化合物はまた、ＮＦＡ
Ｔの活性阻害ペプチドＶＩＶＩＴを含有する。ＮＦＡＴ
とは、カルシニューリンに脱リン酸化されることによっ
て活性化する転写調節因子であり、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡ
Ｔ２、ＮＦＡＴ３およびＮＦＡＴ４などを含むファミリ
ーを形成する。ＶＩＶＩＴは、ＭＡＧＰＨＰＶＩＶＩＴ
ＧＰＨＥＥ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列から
なるペプチドである。ＶＩＶＩＴは、カルシニューリン
のホスファターゼ活性に影響することなく、ＮＦＡＴフ
ァミリーに属するタンパク質とカルシニューリンとの相
互作用を選択的に阻害する（アラムブル Ｊ．（Arambu
ru, J.）ら、サイエンス（Science）、第２８５巻、２
１２９〜２１３３頁、１９９９年）。配列番号１に示す
アミノ酸配列において、各アミノ酸残基は、ＮＦＡＴを
阻害するものであれば生物学的に同等のアミノ酸配列に
置換してもよく、ＶＩＶＩＴと同等の生物学的活性を有
するものであれば、数個のアミノ酸残基が付加、欠失さ
れていてもよい。
Ｔの活性阻害ペプチドＶＩＶＩＴを含有する。ＮＦＡＴ
とは、カルシニューリンに脱リン酸化されることによっ
て活性化する転写調節因子であり、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡ
Ｔ２、ＮＦＡＴ３およびＮＦＡＴ４などを含むファミリ
ーを形成する。ＶＩＶＩＴは、ＭＡＧＰＨＰＶＩＶＩＴ
ＧＰＨＥＥ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列から
なるペプチドである。ＶＩＶＩＴは、カルシニューリン
のホスファターゼ活性に影響することなく、ＮＦＡＴフ
ァミリーに属するタンパク質とカルシニューリンとの相
互作用を選択的に阻害する（アラムブル Ｊ．（Arambu
ru, J.）ら、サイエンス（Science）、第２８５巻、２
１２９〜２１３３頁、１９９９年）。配列番号１に示す
アミノ酸配列において、各アミノ酸残基は、ＮＦＡＴを
阻害するものであれば生物学的に同等のアミノ酸配列に
置換してもよく、ＶＩＶＩＴと同等の生物学的活性を有
するものであれば、数個のアミノ酸残基が付加、欠失さ
れていてもよい。
【００１５】また、本発明のペプチド化合物は、同等の
生物学的活性を有する限り、前記の数個のアルギニンが
連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミノ酸配列
に加え、数個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換さ
れていてもよい。
生物学的活性を有する限り、前記の数個のアルギニンが
連続するアミノ酸配列および配列番号１のアミノ酸配列
に加え、数個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換さ
れていてもよい。
【００１６】さらに、本願発明のペプチド化合物は、細
胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有
してもよい。マーカーはとくに限定されるものではな
く、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（以
下、ＦＩＴＣと略称する）、ＧＦＰおよびローダミンな
どの蛍光タンパク質を使用することができる。
胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有
してもよい。マーカーはとくに限定されるものではな
く、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（以
下、ＦＩＴＣと略称する）、ＧＦＰおよびローダミンな
どの蛍光タンパク質を使用することができる。
【００１７】本発明のペプチド化合物は、通常の人工合
成法によって、または一般に市販されている人工合成機
によって製造することができる。あるいは、本発明のペ
プチド化合物は、遺伝子工学的手法を用いて製造するこ
とができる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配
列およびＶＩＶＩＴからなる配列を含むペプチド配列を
コードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、
適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細
胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、
本発明のペプチド化合物を得ることができる。本発明の
ペプチド化合物を製造後、得られたペプチド化合物は公
知の方法で精製することもできる。これらのペプチド化
合物の製造法および精製法は、本分野において一般的な
手法であり、当業者により容易に実施されるものであ
る。
成法によって、または一般に市販されている人工合成機
によって製造することができる。あるいは、本発明のペ
プチド化合物は、遺伝子工学的手法を用いて製造するこ
とができる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配
列およびＶＩＶＩＴからなる配列を含むペプチド配列を
コードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、
適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細
胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、
本発明のペプチド化合物を得ることができる。本発明の
ペプチド化合物を製造後、得られたペプチド化合物は公
知の方法で精製することもできる。これらのペプチド化
合物の製造法および精製法は、本分野において一般的な
手法であり、当業者により容易に実施されるものであ
る。
【００１８】本発明のペプチド化合物は、ＮＦＡＴ活性
化の抑制剤として使用することができる。ＮＦＡＴ活性
化の抑制剤は、ＮＦＡＴの活性化に起因する疾患の治療
剤として用いることができる。ＮＦＡＴの活性化に起因
する疾患としては、たとえば、アレルギー疾患および心
肥大などを挙げることができる。
化の抑制剤として使用することができる。ＮＦＡＴ活性
化の抑制剤は、ＮＦＡＴの活性化に起因する疾患の治療
剤として用いることができる。ＮＦＡＴの活性化に起因
する疾患としては、たとえば、アレルギー疾患および心
肥大などを挙げることができる。
【００１９】本発明のペプチド化合物は、免疫抑制を誘
導する作用を有しており、移植の際の免疫抑制剤として
用いることができる。また、本発明の免疫抑制剤は、免
疫疾患などの治療剤として利用することもできる。具体
的な免疫疾患としては、移植手術後の拒絶反応、アトピ
ー性皮膚炎などが挙げられる。
導する作用を有しており、移植の際の免疫抑制剤として
用いることができる。また、本発明の免疫抑制剤は、免
疫疾患などの治療剤として利用することもできる。具体
的な免疫疾患としては、移植手術後の拒絶反応、アトピ
ー性皮膚炎などが挙げられる。
【００２０】本発明の免疫抑制剤は、静脈内、皮下、筋
肉内、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができ
る。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入すること
によってペプチド化合物の分解を防ぐことができるた
め、静脈内投与または皮下投与が好ましい。
肉内、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができ
る。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入すること
によってペプチド化合物の分解を防ぐことができるた
め、静脈内投与または皮下投与が好ましい。
【００２１】本発明の免疫抑制剤の剤型は投与方法によ
って適宜設定することができる。具体的には、水溶液お
よび乳液などの液剤および軟膏を例示することができ
る。
って適宜設定することができる。具体的には、水溶液お
よび乳液などの液剤および軟膏を例示することができ
る。
【００２２】本発明の免疫抑制剤の有効量は、投与方
法、適用する患者の年齢、体重、病状などを考慮して適
宜設定することができ、有効成分に換算して通常は１〜
１０ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、有効成分である
本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これら
の範囲に限定されるものではない。
法、適用する患者の年齢、体重、病状などを考慮して適
宜設定することができ、有効成分に換算して通常は１〜
１０ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、有効成分である
本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これら
の範囲に限定されるものではない。
【００２３】本発明の免疫抑制剤は、本発明のペプチド
化合物を有効成分として含有するものであればとくに限
定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲ
ル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ
安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添
加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適
宜選択され得る。
化合物を有効成分として含有するものであればとくに限
定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲ
ル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ
安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添
加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適
宜選択され得る。
【００２４】本発明のペプチド化合物は心肥大抑制剤と
して有効である。本発明の心肥大抑制剤は、静脈内、皮
下、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができ
る。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入すること
が、ペプチド化合物の分解を防ぐうえで重要であること
から、静脈内投与が好ましい。
して有効である。本発明の心肥大抑制剤は、静脈内、皮
下、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができ
る。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入すること
が、ペプチド化合物の分解を防ぐうえで重要であること
から、静脈内投与が好ましい。
【００２５】本発明の心肥大抑制剤の剤形は投与方法に
よって適宜設定することができる。具体的には、水溶液
および乳液などの液剤および軟膏を例示することができ
る。
よって適宜設定することができる。具体的には、水溶液
および乳液などの液剤および軟膏を例示することができ
る。
【００２６】本発明の心肥大抑制剤の投与量は、投与方
法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜
設定することができ、有効成分に換算して通常は０．１
〜２ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、有効成分である
本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これら
の範囲に限定されるものではない。
法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜
設定することができ、有効成分に換算して通常は０．１
〜２ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、有効成分である
本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これら
の範囲に限定されるものではない。
【００２７】本発明の心肥大抑制剤は、本発明のペプチ
ド化合物を有効成分として含有するものであればとくに
限定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、
ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐ
Ｈ安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を
添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により
適宜選択され得る。
ド化合物を有効成分として含有するものであればとくに
限定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、
ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、ｐ
Ｈ安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を
添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により
適宜選択され得る。
【００２８】以下、実施例によって、本発明のペプチド
化合物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と
適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものでは
ない。
化合物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と
適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものでは
ない。
【００２９】
【実施例】実施例１
連続したアルギニン１１残基、ＶＩＶＩＴおよびＦＩＴ
Ｃを含有するペプチド化合物を人工合成し（シグマ ジ
ェノシス ジャパン社（Sigma Genosis Japan,Inc.）に
製造依頼）、分取逆相ＨＰＬＣにより該ペプチドを精製
した。以下、連続したアルギニン１１残基およびグリシ
ン３残基を付加したＶＩＶＩＴからなるペプチドを、１
１Ｒ−ＶＩＶＩＴと略称する。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴのペ
プチド配列を配列番号２に示す。なお、ＦＩＴＣは、１
１Ｒ−ＶＩＶＩＴのアミノ末端側に付加されている。
Ｃを含有するペプチド化合物を人工合成し（シグマ ジ
ェノシス ジャパン社（Sigma Genosis Japan,Inc.）に
製造依頼）、分取逆相ＨＰＬＣにより該ペプチドを精製
した。以下、連続したアルギニン１１残基およびグリシ
ン３残基を付加したＶＩＶＩＴからなるペプチドを、１
１Ｒ−ＶＩＶＩＴと略称する。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴのペ
プチド配列を配列番号２に示す。なお、ＦＩＴＣは、１
１Ｒ−ＶＩＶＩＴのアミノ末端側に付加されている。
【００３０】実施例２
６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスＨ−２ｋ（クレアジャパ
ン社（CLEA Japan, Inc.）製）に対し、実施例１で製造
した１１Ｒ−ＶＩＶＩＴとＦＩＴＣとからなるペプチド
化合物１０ｍｇ／ｋｇ量を溶解した０．５ｍｌのリンガ
ー液を注射剤とする腹腔内注射を実施した。注射から６
時間後、各マウスから脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓およ
び心臓を摘出し、それぞれを３ｍｌのヒスト プレップ
（フィッシャー サイエンティフィック社（Fisher Sci
entific）製）中で、−８０℃で凍結させた。次に、ク
リオスタット上で１０〜５０μｍの切片を作製し、ツア
イス顕微鏡（ツアイス社（Zeiss）製）で分析した。な
お、コントロールとして、未処理のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウ
スの切片を用いた。
ン社（CLEA Japan, Inc.）製）に対し、実施例１で製造
した１１Ｒ−ＶＩＶＩＴとＦＩＴＣとからなるペプチド
化合物１０ｍｇ／ｋｇ量を溶解した０．５ｍｌのリンガ
ー液を注射剤とする腹腔内注射を実施した。注射から６
時間後、各マウスから脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓およ
び心臓を摘出し、それぞれを３ｍｌのヒスト プレップ
（フィッシャー サイエンティフィック社（Fisher Sci
entific）製）中で、−８０℃で凍結させた。次に、ク
リオスタット上で１０〜５０μｍの切片を作製し、ツア
イス顕微鏡（ツアイス社（Zeiss）製）で分析した。な
お、コントロールとして、未処理のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウ
スの切片を用いた。
【００３１】分析の結果、複合ペプチドを投与したマウ
スに由来する脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の
切片では、いずれもＦＩＴＣの蛍光が観察された。一
方、コントロールの切片においては、ＦＩＴＣの蛍光は
観察されなかった。これは、腹腔内投与により、少なく
とも脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の細胞に１
１Ｒ−ＶＩＶＩＴが導入されることを示すものである。
スに由来する脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の
切片では、いずれもＦＩＴＣの蛍光が観察された。一
方、コントロールの切片においては、ＦＩＴＣの蛍光は
観察されなかった。これは、腹腔内投与により、少なく
とも脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の細胞に１
１Ｒ−ＶＩＶＩＴが導入されることを示すものである。
【００３２】実施例３
ＩＬ−２遺伝子の転写に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの容
量依存的効果を検討した。
量依存的効果を検討した。
【００３３】１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μ
Ｍの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔
血清含有ＲＰＭＩ（インビトロゲン社（Invitorogen）
製）を用いて、１×１０5細胞個のジャーカット細胞（J
urkat cells）を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定し
た炭酸ガス培養装置（山洋電気株式会社製）において１
時間培養した。ついで、２μＭのホルボール１２−ミリ
ステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマ社（Sigm
a）製）および４０μＭのイオノマイシン（シグマ社
製）を含む１００μｌのＲＰＭＩを添加し、さらに１２
時間培養を続けた。ついで細胞を回収し、得られた細胞
を用いて、下記のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（real
-time quantitative RT-PCR）によりＩＬ−２遺伝子の
転写量を測定した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで
は、ハウスキーピング遺伝子として知られるＧＡＰＤＨ
を内部標準物質として使用した。なお、１１Ｒ−ＶＩＶ
ＩＴを含まない培地で培養したジャーカット細胞をコン
トロール細胞として用い、同様のリアルタイム定量ＲＴ
−ＰＣＲを実施した。
Ｍの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔
血清含有ＲＰＭＩ（インビトロゲン社（Invitorogen）
製）を用いて、１×１０5細胞個のジャーカット細胞（J
urkat cells）を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定し
た炭酸ガス培養装置（山洋電気株式会社製）において１
時間培養した。ついで、２μＭのホルボール１２−ミリ
ステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマ社（Sigm
a）製）および４０μＭのイオノマイシン（シグマ社
製）を含む１００μｌのＲＰＭＩを添加し、さらに１２
時間培養を続けた。ついで細胞を回収し、得られた細胞
を用いて、下記のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（real
-time quantitative RT-PCR）によりＩＬ−２遺伝子の
転写量を測定した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで
は、ハウスキーピング遺伝子として知られるＧＡＰＤＨ
を内部標準物質として使用した。なお、１１Ｒ−ＶＩＶ
ＩＴを含まない培地で培養したジャーカット細胞をコン
トロール細胞として用い、同様のリアルタイム定量ＲＴ
−ＰＣＲを実施した。
【００３４】ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲ
ン社（QIAGEN）製）をプロトコルにしたがって使用し、
細胞から全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを用
い、逆転写反応を２２℃で１０分間、ついで４２℃で２
０分間インキュベーションすることにより実施した。
ン社（QIAGEN）製）をプロトコルにしたがって使用し、
細胞から全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを用
い、逆転写反応を２２℃で１０分間、ついで４２℃で２
０分間インキュベーションすることにより実施した。
【００３５】つぎに、ライトサイクラー−ファーストス
タートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（Ligh
tCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit（ロ
ッシュ モレキュラー バイオケミカルズ社（Rhoche M
olecular Biochemicals）製）を用い、２０μｌの反応
混液（転写産物の１０分の１量、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、
４種のプライマー 各０．５μＭ、２μｌの１０×ライ
トサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢ
ＲグリーンＩ）を増幅反応用に調製した。ヒトＩＬ−２
に対するプライマーとしては、競合定量ＲＴ−ＰＣＲキ
ット（Competitive Quantitative RT-PCR Kit）（フナ
コシ株式会社製）内に含まれるプライマーを用いた。Ｇ
ＡＰＤＨに対するプライマーとしては、５′−ＣＴＧＡ
ＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ−３′（配列番号
５）および５′−ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧ
ＡＧＧ−３′（配列番号６）を用いた（ともに、ジーン
セット社製）。増幅反応は、９５℃で１０分間インキュ
ベーションしたのち、９４℃１５秒間、５７℃５秒間お
よび７２℃１０秒間のインキュベーションを１サイクル
とし、これを６０サイクル実施した。ついで、０．２℃
／秒で９５℃まで温度を上昇させた。解離カーブ解析に
は、ライトサイクラーソフトウェア（ロッシュモレキュ
ラー バイオケミカルズ社製）を使用した。解析の結果
得られたＧＡＰＤＨに対する相対ＲＮＡ量を図１に示す
（ｎ＝３）。
タートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（Ligh
tCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit（ロ
ッシュ モレキュラー バイオケミカルズ社（Rhoche M
olecular Biochemicals）製）を用い、２０μｌの反応
混液（転写産物の１０分の１量、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、
４種のプライマー 各０．５μＭ、２μｌの１０×ライ
トサイクラーファーストスタートＤＮＡマスターＳＹＢ
ＲグリーンＩ）を増幅反応用に調製した。ヒトＩＬ−２
に対するプライマーとしては、競合定量ＲＴ−ＰＣＲキ
ット（Competitive Quantitative RT-PCR Kit）（フナ
コシ株式会社製）内に含まれるプライマーを用いた。Ｇ
ＡＰＤＨに対するプライマーとしては、５′−ＣＴＧＡ
ＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ−３′（配列番号
５）および５′−ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧ
ＡＧＧ−３′（配列番号６）を用いた（ともに、ジーン
セット社製）。増幅反応は、９５℃で１０分間インキュ
ベーションしたのち、９４℃１５秒間、５７℃５秒間お
よび７２℃１０秒間のインキュベーションを１サイクル
とし、これを６０サイクル実施した。ついで、０．２℃
／秒で９５℃まで温度を上昇させた。解離カーブ解析に
は、ライトサイクラーソフトウェア（ロッシュモレキュ
ラー バイオケミカルズ社製）を使用した。解析の結果
得られたＧＡＰＤＨに対する相対ＲＮＡ量を図１に示す
（ｎ＝３）。
【００３６】１１Ｒ−ＶＩＶＩＴは、ＩＬ−２遺伝子の
転写を未処理の場合の１２％に抑制した。ＩＬ−２遺伝
子は、アレルギーや拒絶反応によりＴ細胞が活性化され
る場合に、転写が促進される遺伝子である。したがって
この結果は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴがＴ細胞活性化を抑制
し得ることを示す。
転写を未処理の場合の１２％に抑制した。ＩＬ−２遺伝
子は、アレルギーや拒絶反応によりＴ細胞が活性化され
る場合に、転写が促進される遺伝子である。したがって
この結果は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴがＴ細胞活性化を抑制
し得ることを示す。
【００３７】比較例１
実施例１と同様にして、連続したアルギニン１１残基お
よびグリシン３残基を付加したＶＥＥＴからなるペプチ
ド化合物（以下、１１Ｒ−ＶＥＥＴと略称する）を人工
合成し、精製した。ＶＥＥＴは、ＭＡＧＰＰＨＩＶＥＥ
ＴＧＰＨＶＩ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列か
らなるペプチドである。１１Ｒ−ＶＥＥＴのペプチド配
列を配列番号４に示す。以下、１１Ｒ−ＶＥＥＴを１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴのネガティブコントロールとして用い
る。
よびグリシン３残基を付加したＶＥＥＴからなるペプチ
ド化合物（以下、１１Ｒ−ＶＥＥＴと略称する）を人工
合成し、精製した。ＶＥＥＴは、ＭＡＧＰＰＨＩＶＥＥ
ＴＧＰＨＶＩ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列か
らなるペプチドである。１１Ｒ−ＶＥＥＴのペプチド配
列を配列番号４に示す。以下、１１Ｒ−ＶＥＥＴを１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴのネガティブコントロールとして用い
る。
【００３８】１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１００ｎＭ
のＦＫ５０６（藤沢薬品工業株式会社製）または１μＭ
の１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む培地を使用したほかは実施例
３と同様にして、ジャーカット細胞を培養し、得られた
細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図１に示
す。
のＦＫ５０６（藤沢薬品工業株式会社製）または１μＭ
の１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む培地を使用したほかは実施例
３と同様にして、ジャーカット細胞を培養し、得られた
細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図１に示
す。
【００３９】１１Ｒ−ＶＥＥＴは、ＩＬ−２遺伝子の転
写レベルに影響を与えなかった。
写レベルに影響を与えなかった。
【００４０】実施例４
Ｔ細胞における１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの半減期を、ＩＬ−
２転写に対する阻害活性に基づき検討した。
２転写に対する阻害活性に基づき検討した。
【００４１】１μＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍｌ
の１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて、１×１０
5細胞個のジャーカット細胞を、３７℃、５％炭酸ガス
濃度に設定した炭酸ガス培養装置において１時間培養し
た。ついで、２μＭ ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマ
イシンを含む１００μｌのＲＰＭＩを添加し、さらに１
２時間、１７時間、２３時間、３５時間または５９時間
培養を続けた。なお、コントロール細胞としては、１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰ
ＭＩで前記同様に１時間培養し、２μＭ ＰＭＡおよび
４０μＭのイオノマイシンを含む１００μｌのＲＰＭＩ
を添加したのち、さらに１２時間、１７時間、２３時
間、３５時間または５９時間培養したジャーカット細胞
を用いた。
の１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて、１×１０
5細胞個のジャーカット細胞を、３７℃、５％炭酸ガス
濃度に設定した炭酸ガス培養装置において１時間培養し
た。ついで、２μＭ ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマ
イシンを含む１００μｌのＲＰＭＩを添加し、さらに１
２時間、１７時間、２３時間、３５時間または５９時間
培養を続けた。なお、コントロール細胞としては、１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰ
ＭＩで前記同様に１時間培養し、２μＭ ＰＭＡおよび
４０μＭのイオノマイシンを含む１００μｌのＲＰＭＩ
を添加したのち、さらに１２時間、１７時間、２３時
間、３５時間または５９時間培養したジャーカット細胞
を用いた。
【００４２】ついで、得られた各細胞を試料として用い
たほかは実施例３と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲおよびリ
アルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して解析することに
より、ＧＡＰＤＨに対する相対ＲＮＡ量を測定した。結
果を図２に示す（ｎ＝３）。図２に示す時間は、培養全
体の時間を意味する。
たほかは実施例３と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲおよびリ
アルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して解析することに
より、ＧＡＰＤＨに対する相対ＲＮＡ量を測定した。結
果を図２に示す（ｎ＝３）。図２に示す時間は、培養全
体の時間を意味する。
【００４３】１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの半減期は、約３０時
間であった。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを添加してから６０時
間後には、そのＩＬ−２転写阻害活性はみられなかっ
た。
間であった。１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを添加してから６０時
間後には、そのＩＬ−２転写阻害活性はみられなかっ
た。
【００４４】比較例２
１μＭのＦＫ５０６を含む１ｍｌの１０％ウシ胎仔血清
含有ＲＰＭＩを用いて、１×１０5細胞個のジャーカッ
ト細胞を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガ
ス培養装置において１時間培養した。ついで、２μＭ
ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマイシンを含む１００μ
ｌのＲＰＭＩを添加したのち、さらに１２時間、１７時
間、２３時間、３５時間または５９時間培養した。つぎ
に、得られた培養細胞を用いたほかは実施例３と同様の
方法で、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−Ｐ
ＣＲを実施した。ＦＫ５０６の添加から６０時間後の相
対ＩＬ−２ ｍＲＮＡレベルを、図２に示す。
含有ＲＰＭＩを用いて、１×１０5細胞個のジャーカッ
ト細胞を、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガ
ス培養装置において１時間培養した。ついで、２μＭ
ＰＭＡおよび４０μＭのイオノマイシンを含む１００μ
ｌのＲＰＭＩを添加したのち、さらに１２時間、１７時
間、２３時間、３５時間または５９時間培養した。つぎ
に、得られた培養細胞を用いたほかは実施例３と同様の
方法で、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ−Ｐ
ＣＲを実施した。ＦＫ５０６の添加から６０時間後の相
対ＩＬ−２ ｍＲＮＡレベルを、図２に示す。
【００４５】ＦＫ５０６は６０時間後においても代謝さ
れず、ＩＬ−２の転写を強く抑制した。
れず、ＩＬ−２の転写を強く抑制した。
【００４６】実施例５
Ｔ細胞の活性化および増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ
の効果を、リンパ球混合試験により検討した。
の効果を、リンパ球混合試験により検討した。
【００４７】６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスおよび
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスＨ−２ｄ（清水実験材
料株式会社製）から脾臓細胞を取り出した。ＢＡＬＢ／
ｃ脾臓細胞はマイトマイシンＣ（協和醗酵工業株式会社
製）で処理し、刺激細胞として用いた。
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスＨ−２ｄ（清水実験材
料株式会社製）から脾臓細胞を取り出した。ＢＡＬＢ／
ｃ脾臓細胞はマイトマイシンＣ（協和醗酵工業株式会社
製）で処理し、刺激細胞として用いた。
【００４８】１ｐＭ、１ｎＭもしくは１μＭの１１Ｒ−
ＶＩＶＩＴを含むＲＰＭＩを、平底９６穴プレート（イ
ワキ株式会社製）に添加した。ついで、前記刺激細胞と
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾臓細胞とを１：５で混合
した混合細胞を、各ウェルに５×１０5個添加し、３７
℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置にお
いて９０時間培養した。なお、コントロールとして、培
地のみのウェルに混合細胞を添加し、同様に培養した。
ＶＩＶＩＴを含むＲＰＭＩを、平底９６穴プレート（イ
ワキ株式会社製）に添加した。ついで、前記刺激細胞と
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾臓細胞とを１：５で混合
した混合細胞を、各ウェルに５×１０5個添加し、３７
℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置にお
いて９０時間培養した。なお、コントロールとして、培
地のみのウェルに混合細胞を添加し、同様に培養した。
【００４９】つぎに、０．５μＣｉ／穴の3Ｈメチルチ
ミジン（以下、［3Ｈ］ＴｄＲとする。アマシャム フ
ァルマシア バイオテク株式会社製）を添加し、６時間
培養した。ついで、細胞を直径１ｃｍのフィルター紙上
に置き、細胞に取り込まれた［ 3Ｈ］ＴｄＲの放射活性
を、ベータカウンター（ベックマン社製）により測定し
た。結果を図３に示す。
ミジン（以下、［3Ｈ］ＴｄＲとする。アマシャム フ
ァルマシア バイオテク株式会社製）を添加し、６時間
培養した。ついで、細胞を直径１ｃｍのフィルター紙上
に置き、細胞に取り込まれた［ 3Ｈ］ＴｄＲの放射活性
を、ベータカウンター（ベックマン社製）により測定し
た。結果を図３に示す。
【００５０】１μＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴは、コントロ
ールに対し、リンパ球の増殖を４３％抑制した。図３に
おいて、＊はコントロールと比較してＰ＜０．０５であ
ることを意味し、＊＊はいずれもＰ＜０．００１である
ことを意味する。
ールに対し、リンパ球の増殖を４３％抑制した。図３に
おいて、＊はコントロールと比較してＰ＜０．０５であ
ることを意味し、＊＊はいずれもＰ＜０．００１である
ことを意味する。
【００５１】比較例３
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１ｐＭ、１ｎＭもしくは
１μＭのＦＫ５０６または１μＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを
含むＲＰＭＩを用いたほかは実施例５と同様の方法によ
り、混合細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細
胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータ
カウンターにより測定した。結果を図３に示す。
１μＭのＦＫ５０６または１μＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを
含むＲＰＭＩを用いたほかは実施例５と同様の方法によ
り、混合細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細
胞に取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータ
カウンターにより測定した。結果を図３に示す。
【００５２】１１Ｒ−ＶＥＥＴは、１μＭでは、リンパ
球の増殖に影響を与えなかった。
球の増殖に影響を与えなかった。
【００５３】比較例４
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まないＲＰＭＩを培地として用
い、混合細胞の代わりにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾
臓細胞のみを用いたほかは実施例５と同様の方法によ
り、細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に
取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウ
ンターにより測定した。結果を図３に示す。
い、混合細胞の代わりにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾
臓細胞のみを用いたほかは実施例５と同様の方法によ
り、細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に
取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウ
ンターにより測定した。結果を図３に示す。
【００５４】実施例６
１０ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．
５ｍｌのリンガー液を注射剤として用い、インビボにお
けるＴ細胞の活性化および増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶ
ＩＴの効果を検討した。
５ｍｌのリンガー液を注射剤として用い、インビボにお
けるＴ細胞の活性化および増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶ
ＩＴの効果を検討した。
【００５５】６週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅｎマウスに、前記注
射剤を、１日１回２日間、腹腔内に注射した。
射剤を、１日１回２日間、腹腔内に注射した。
【００５６】２回目の注射から６時間後に、脾臓を外科
的に摘出した。得られた脾臓細胞（１×１０4個）を、
マイトマイシンＣで処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾
臓細胞（１×１０5個）とともに平底９６穴プレートに
添加し、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス
培養装置において９０時間培養した。培地は、ＲＰＭＩ
を使用した。なお、コントロールとして、培地のみのウ
ェルに混合細胞を添加し、同様に培養した。
的に摘出した。得られた脾臓細胞（１×１０4個）を、
マイトマイシンＣで処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾
臓細胞（１×１０5個）とともに平底９６穴プレートに
添加し、３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス
培養装置において９０時間培養した。培地は、ＲＰＭＩ
を使用した。なお、コントロールとして、培地のみのウ
ェルに混合細胞を添加し、同様に培養した。
【００５７】つぎに、０．５μＣｉ／穴の［3Ｈ］Ｔｄ
Ｒを添加し、６時間培養した。ついで、細胞を直径１ｃ
ｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた
［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより
測定した。結果を図４に示す。図４において、＊＊はい
ずれもコントロールと比較してＰ＜０．００１であるこ
とを意味する。
Ｒを添加し、６時間培養した。ついで、細胞を直径１ｃ
ｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた
［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより
測定した。結果を図４に示す。図４において、＊＊はい
ずれもコントロールと比較してＰ＜０．００１であるこ
とを意味する。
【００５８】インビボにおいて、１０ｍｇ／ｋｇの１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴは、コントロールに対して３０％の抑制
効果を示した。
Ｒ−ＶＩＶＩＴは、コントロールに対して３０％の抑制
効果を示した。
【００５９】比較例５
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０
６または１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＥＥＴを用いたほ
かは実施例６と同様の方法により、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウ
スに対して腹腔内注射を実施し、脾臓細胞を取り出して
培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に取り込まれ
た［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性をベータカウンターにより
測定した。結果を図４に示す。
６または１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＥＥＴを用いたほ
かは実施例６と同様の方法により、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウ
スに対して腹腔内注射を実施し、脾臓細胞を取り出して
培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に取り込まれ
た［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性をベータカウンターにより
測定した。結果を図４に示す。
【００６０】１１Ｒ−ＶＥＥＴは、１μＭでは、リンパ
球の増殖に影響を与えなかった。
球の増殖に影響を与えなかった。
【００６１】比較例６
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まないＲＰＭＩを培地として用
い、混合細胞の代わりにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾
臓細胞のみを用いたほかは実施例６と同様の方法によ
り、細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に
取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウ
ンターにより測定した。結果を図４に示す
い、混合細胞の代わりにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来の脾
臓細胞のみを用いたほかは実施例６と同様の方法によ
り、細胞を培養し、［3Ｈ］ＴｄＲを添加して、細胞に
取り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウ
ンターにより測定した。結果を図４に示す
【００６２】実施例７
１０ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．
５ｍｌのリンガー液を注射剤として用い、ベータ細胞の
移植における１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。移
植の際、ドナーとして６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、
レシピエントとして６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを用
いた。
５ｍｌのリンガー液を注射剤として用い、ベータ細胞の
移植における１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。移
植の際、ドナーとして６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、
レシピエントとして６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを用
いた。
【００６３】Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに対して２２０ｍｇ
／ｋｇのストレプトゾシン（シグマ−アルドリッチ ジ
ャパン株式会社）を１回腹腔内注射することにより、糖
尿病モデルマウスを作製した。また、ストレプトゾシン
注射から６日後、グルコース値が３５０ｍｇ／ｄｌを超
えたマウスを高血糖症であると判断した。
／ｋｇのストレプトゾシン（シグマ−アルドリッチ ジ
ャパン株式会社）を１回腹腔内注射することにより、糖
尿病モデルマウスを作製した。また、ストレプトゾシン
注射から６日後、グルコース値が３５０ｍｇ／ｄｌを超
えたマウスを高血糖症であると判断した。
【００６４】一方、ＢＡＬＢ／ｃマウスの膵臓を取り出
し、不連続フィコール密度勾配遠心を実施したのち、通
常のコラゲナーゼ消化によりベータ細胞を単離した。
し、不連続フィコール密度勾配遠心を実施したのち、通
常のコラゲナーゼ消化によりベータ細胞を単離した。
【００６５】単離した約５００個のベータ細胞を、前記
糖尿病モデルマウスの左腎の被膜下に移植した。移植
後、毎日１回、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＩ
ＶＩＴを腹腔内注射した（ｎ＝６）。コントロールとし
て、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない生理食塩水を、ベー
タ細胞を移植したマウスに注射した（ｎ＝４）。血糖を
測定し、その値が２日間連続２００ｍｇ／ｄｌを超えた
場合に移植組織拒絶とした。図５に、カプランマイヤー
で評価した結果を示す。
糖尿病モデルマウスの左腎の被膜下に移植した。移植
後、毎日１回、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＶＩ
ＶＩＴを腹腔内注射した（ｎ＝６）。コントロールとし
て、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含まない生理食塩水を、ベー
タ細胞を移植したマウスに注射した（ｎ＝４）。血糖を
測定し、その値が２日間連続２００ｍｇ／ｄｌを超えた
場合に移植組織拒絶とした。図５に、カプランマイヤー
で評価した結果を示す。
【００６６】１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの投与により、コント
ロールと比較して、生存率が有意に上がった（Ｐ＜０．
００５）。
ロールと比較して、生存率が有意に上がった（Ｐ＜０．
００５）。
【００６７】比較例７
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１０ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ
−ＶＥＥＴを用いたほかは実施例７と同様にして、ベー
タ細胞の移植に対する１１Ｒ−ＶＥＥＴの効果を検討し
た。結果を図５に示す。
−ＶＥＥＴを用いたほかは実施例７と同様にして、ベー
タ細胞の移植に対する１１Ｒ−ＶＥＥＴの効果を検討し
た。結果を図５に示す。
【００６８】１１Ｒ−ＶＥＥＴは、コントロールと同様
に、移植組織の生存には何の影響も与えなかった。
に、移植組織の生存には何の影響も与えなかった。
【００６９】実施例８
実施例１において１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したマウス
を用い、移植したベータ細胞の機能を検討した。
を用い、移植したベータ細胞の機能を検討した。
【００７０】ベータ細胞の移植から５０日後の腎臓を外
科的に摘出した。ついで、凍結ミトクローム（カールツ
アイス社製）を用い、３０μｍの腎臓の切片を作製し
た。つぎに、得られた切片について、インスリンに対す
るポリクローナル抗体（サンタクルーズ社製）およびア
ビジン、ビオチンペルオキシダーゼ法（ベクター社製）
を用いて免疫染色を実施した。
科的に摘出した。ついで、凍結ミトクローム（カールツ
アイス社製）を用い、３０μｍの腎臓の切片を作製し
た。つぎに、得られた切片について、インスリンに対す
るポリクローナル抗体（サンタクルーズ社製）およびア
ビジン、ビオチンペルオキシダーゼ法（ベクター社製）
を用いて免疫染色を実施した。
【００７１】免疫染色の結果を図６に示す。図６におい
て、１は移植されたベータ細胞であり、２はレシピエン
トの腎臓である。移植したベータ細胞がインスリン抗体
により染色されたことから、移植細胞がインスリンを産
生していることを確認した。
て、１は移植されたベータ細胞であり、２はレシピエン
トの腎臓である。移植したベータ細胞がインスリン抗体
により染色されたことから、移植細胞がインスリンを産
生していることを確認した。
【００７２】実施例９
βＴＣ６細胞によるインスリン分泌に対する１１Ｒ−Ｖ
ＩＶＩＴの効果を検討した。βＴＣ６細胞は、グルコー
ス応答性でインスリンを分泌するランゲルハンス島の細
胞系である。
ＩＶＩＴの効果を検討した。βＴＣ６細胞は、グルコー
ス応答性でインスリンを分泌するランゲルハンス島の細
胞系である。
【００７３】βＴＣ６細胞（アメリカン タイプ カル
チャー コレクション（American Type Culture collec
tion）、ＣＲＬ−１１５０６）を９６穴プレートに播種
し（５×１０4細胞個／穴）、１０、１００、１０００
または１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍ
ｌの１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて３７℃、
５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において
９６時間培養した。培地は２４時間毎に、１１Ｒ−ＶＩ
ＶＩＴを含む新鮮な培地と交換した。９６時間後、新鮮
な培地に交換してさらに１時間培養し、培養上清を回収
した。コントロールとして、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含ま
ない培地を用いたほかは同様にして、βＴＣ６細胞の培
養を実施した。
チャー コレクション（American Type Culture collec
tion）、ＣＲＬ−１１５０６）を９６穴プレートに播種
し（５×１０4細胞個／穴）、１０、１００、１０００
または１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む１ｍ
ｌの１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩを用いて３７℃、
５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において
９６時間培養した。培地は２４時間毎に、１１Ｒ−ＶＩ
ＶＩＴを含む新鮮な培地と交換した。９６時間後、新鮮
な培地に交換してさらに１時間培養し、培養上清を回収
した。コントロールとして、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含ま
ない培地を用いたほかは同様にして、βＴＣ６細胞の培
養を実施した。
【００７４】つぎに、回収した培養上清を用いて、マウ
スインスリンＥＬＩＳＡ（ＴＭＢ）キット（シバヤギ
製）をプロトコルにしたがって使用し、分泌されたイン
スリンを分析した。図７（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ
で処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロ
ールに対する相対値で示したものである。
スインスリンＥＬＩＳＡ（ＴＭＢ）キット（シバヤギ
製）をプロトコルにしたがって使用し、分泌されたイン
スリンを分析した。図７（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ
で処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロ
ールに対する相対値で示したものである。
【００７５】βＴＣ６細胞のインスリン分泌量は、１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴが０〜１μＭの範囲でコントロールとほ
ぼ同じであったが、１０μＭではコントロールの７１％
であった（Ｐ＝０．０４２）。
Ｒ−ＶＩＶＩＴが０〜１μＭの範囲でコントロールとほ
ぼ同じであったが、１０μＭではコントロールの７１％
であった（Ｐ＝０．０４２）。
【００７６】比較例８
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１、１０、１００もしく
は１０００ｎＭのＦＫ５０６または１０、１００、１０
００もしくは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む
完全培地を用いたほかは実施例９と同様の方法により、
βＴＣ６細胞を培養し、βＴＣ６細胞によるインスリン
分泌に対する効果を検討した。その結果を図７（ｂ）お
よび図７（ｃ）に示す。
は１０００ｎＭのＦＫ５０６または１０、１００、１０
００もしくは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む
完全培地を用いたほかは実施例９と同様の方法により、
βＴＣ６細胞を培養し、βＴＣ６細胞によるインスリン
分泌に対する効果を検討した。その結果を図７（ｂ）お
よび図７（ｃ）に示す。
【００７７】βＴＣ６細胞のインスリン分泌量は、ＦＫ
５０６により著しく減少され、一方、１１Ｒ−ＶＥＥＴ
により影響されなかった。
５０６により著しく減少され、一方、１１Ｒ−ＶＥＥＴ
により影響されなかった。
【００７８】実施例１０
βＴＣ６細胞の増殖に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果
を検討した。
を検討した。
【００７９】βＴＣ６細胞を９６穴プレートに播種し
（５×１０4細胞個／穴）、１０、１００、１０００ま
たは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む完全培
地を用いて３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガ
ス培養装置において８８時間培養した。培地は２４時間
毎に、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む新鮮な培地と交換し
た。つぎに、１μＣｉ／穴の［3Ｈ］ＴｄＲを添加し、
さらに８時間培養した。コントロールとして、１１Ｒ−
ＶＩＶＩＴを含まない培地を用いたほかは同様にして、
βＴＣ６細胞の培養を実施した。ついで、細胞を直径１
ｃｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた［3
Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定
した。図８（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された
細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したも
のである。
（５×１０4細胞個／穴）、１０、１００、１０００ま
たは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む完全培
地を用いて３７℃、５％炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガ
ス培養装置において８８時間培養した。培地は２４時間
毎に、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを含む新鮮な培地と交換し
た。つぎに、１μＣｉ／穴の［3Ｈ］ＴｄＲを添加し、
さらに８時間培養した。コントロールとして、１１Ｒ−
ＶＩＶＩＴを含まない培地を用いたほかは同様にして、
βＴＣ６細胞の培養を実施した。ついで、細胞を直径１
ｃｍのフィルター紙上に置き、細胞に取り込まれた［3
Ｈ］ＴｄＲの放射活性を、ベータカウンターにより測定
した。図８（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された
細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したも
のである。
【００８０】βＴＣ６細胞の増殖に関しては、１１Ｒ−
ＶＩＶＩＴが０〜１μＭの範囲ではコントロールとほぼ
同じであったが、１０μＭではコントロールの７３％で
あった（Ｐ＝０．０７５）。
ＶＩＶＩＴが０〜１μＭの範囲ではコントロールとほぼ
同じであったが、１０μＭではコントロールの７３％で
あった（Ｐ＝０．０７５）。
【００８１】比較例９
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに１、１０、１００もしく
は１０００ｎＭのＦＫ５０６または１０、１００、１０
００もしくは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む
完全培地を用いたほかは実施例１０と同様の方法によ
り、βＴＣ６細胞を培養し、βＴＣ６細胞の増殖に対す
る効果を検討した。その結果を図８（ｂ）および図８
（ｃ）に示す。
は１０００ｎＭのＦＫ５０６または１０、１００、１０
００もしくは１００００ｎＭの１１Ｒ−ＶＥＥＴを含む
完全培地を用いたほかは実施例１０と同様の方法によ
り、βＴＣ６細胞を培養し、βＴＣ６細胞の増殖に対す
る効果を検討した。その結果を図８（ｂ）および図８
（ｃ）に示す。
【００８２】ＦＫ５０６および１１Ｒ−ＶＥＥＴは、β
ＴＣ６細胞の増殖に対して阻害効果を示さなかった。
ＴＣ６細胞の増殖に対して阻害効果を示さなかった。
【００８３】実施例１１
心肥大に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの効果を検討した。
【００８４】心肥大モデルラットに対し、１．５ｍｇ／
ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．５ｍｌのリ
ンガー液を隔日で皮下注射した（ｎ＝６）。なお、心肥
大モデルラットは、体重２００〜２５０ｇの７週齢の雄
ウィスターラット（清水実験材料株式会社製）の大動脈
を結紮し心臓に圧負荷をかけることにより作製した。以
下、心肥大モデルラットをＡｏＢと略称する。
ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを溶解した０．５ｍｌのリ
ンガー液を隔日で皮下注射した（ｎ＝６）。なお、心肥
大モデルラットは、体重２００〜２５０ｇの７週齢の雄
ウィスターラット（清水実験材料株式会社製）の大動脈
を結紮し心臓に圧負荷をかけることにより作製した。以
下、心肥大モデルラットをＡｏＢと略称する。
【００８５】ついで、０、１、２、３、４および５週後
にラットの心臓を以下の方法で評価した。なお、コント
ロールとして１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与されなかった正
常なラットを用いた。
にラットの心臓を以下の方法で評価した。なお、コント
ロールとして１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与されなかった正
常なラットを用いた。
【００８６】コントロールおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを
投与したＡｏＢに対し、超音波エコー検査（ＵＬＣ）、
組織標本の作製および血液検査を、以下のようにして実
施した。
投与したＡｏＢに対し、超音波エコー検査（ＵＬＣ）、
組織標本の作製および血液検査を、以下のようにして実
施した。
【００８７】ＵＬＣは、ラットの心室中隔および左室全
壁の厚さを超音波エコー（日立株式会社製）により、小
児用プローブを用いて解析した。結果を図９（ａ）およ
び図９（ｂ）に示す。その結果、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投
与により、ＡｏＢにおける心室中隔壁厚および左室全壁
厚はともに改善されることを確認した。
壁の厚さを超音波エコー（日立株式会社製）により、小
児用プローブを用いて解析した。結果を図９（ａ）およ
び図９（ｂ）に示す。その結果、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投
与により、ＡｏＢにおける心室中隔壁厚および左室全壁
厚はともに改善されることを確認した。
【００８８】組織標本は、ラットの心臓を外科的に摘出
し、凍結ミクロトームにより厚さ５μｍの切片を作製
し、ついで得られた切片をヘマトキシリンエオジン染色
法で染色することにより作製した。得られた組織標本
は、顕微鏡で観察した（図１０（ｄ））。図１０におい
て、３は左心室を示し、４は右心室を示す。その結果、
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、正常に近い形態にまで
症状が改善されることを確認した。
し、凍結ミクロトームにより厚さ５μｍの切片を作製
し、ついで得られた切片をヘマトキシリンエオジン染色
法で染色することにより作製した。得られた組織標本
は、顕微鏡で観察した（図１０（ｄ））。図１０におい
て、３は左心室を示し、４は右心室を示す。その結果、
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、正常に近い形態にまで
症状が改善されることを確認した。
【００８９】心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）
およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の測定
は、日本エスアールエル株式会社に依頼した。結果を図
１１（ａ）および図１１（ｂ）に示す。その結果、１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、ＡｏＢにおけるＡＮＰおよ
びＢＮＰはともに改善されることを確認した。
およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の測定
は、日本エスアールエル株式会社に依頼した。結果を図
１１（ａ）および図１１（ｂ）に示す。その結果、１１
Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与により、ＡｏＢにおけるＡＮＰおよ
びＢＮＰはともに改善されることを確認した。
【００９０】比較例１０
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与しないＡｏＢを用いたほかは
実施例１１と同様にしてＵＬＣの測定、組織標本の作製
および血液検査を実施した。結果を図９（ａ）、図９
（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）および図１１
（ｂ）に示す。
実施例１１と同様にしてＵＬＣの測定、組織標本の作製
および血液検査を実施した。結果を図９（ａ）、図９
（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）および図１１
（ｂ）に示す。
【００９１】比較例１１
１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの代わりに５ｍｇ／ｋｇのＣｙｓＡ
を用いたほかは実施例１１と同様にして、心肥大に対す
るＣｙｓＡの効果を検討した。結果を図９（ａ）、図９
（ｂ）、図１０（ｃ）、図１１（ａ）および図１１
（ｂ）に示す。
を用いたほかは実施例１１と同様にして、心肥大に対す
るＣｙｓＡの効果を検討した。結果を図９（ａ）、図９
（ｂ）、図１０（ｃ）、図１１（ａ）および図１１
（ｂ）に示す。
【００９２】試験例１
肝機能および腎臓機能に対する１１Ｒ−ＶＩＶＩＴの毒
性を、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢを用いて検
討した。
性を、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢを用いて検
討した。
【００９３】１．５ｍｇ／ｋｇ量の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ
を溶解した０．５ｍｌのリンガー液を隔日で４週間、Ａ
ｏＢに皮下注射した（ｎ＝６）。得られたＡｏＢについ
て、以下の測定を日本エスアールエル株式会社に依頼し
た。
を溶解した０．５ｍｌのリンガー液を隔日で４週間、Ａ
ｏＢに皮下注射した（ｎ＝６）。得られたＡｏＢについ
て、以下の測定を日本エスアールエル株式会社に依頼し
た。
【００９４】肝機能検査としてグルタミン酸オキサロ酢
酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を測定し、腎臓
機能検査としてクレアチニン（Ｃｒ）および尿素窒素
（ＢＵＮ）を測定した。なお、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投
与しない正常ラットおよびＡｏＢをコントロールとして
使用した。結果を表１に示す。
酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を測定し、腎臓
機能検査としてクレアチニン（Ｃｒ）および尿素窒素
（ＢＵＮ）を測定した。なお、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投
与しない正常ラットおよびＡｏＢをコントロールとして
使用した。結果を表１に示す。
【００９５】
【表１】
【００９６】測定の結果、本発明のペプチド化合物は肝
臓および腎臓の機能に影響を与えないことが示唆され
た。
臓および腎臓の機能に影響を与えないことが示唆され
た。
【００９７】
【発明の効果】本発明のペプチド化合物は、副作用が極
めて少ないＮＦＡＴの活性化に起因する疾患の治療剤と
して使用することができる。具体的には、たとえば免疫
抑制剤および心肥大抑制剤として使用し得るため、非常
に有用である。
めて少ないＮＦＡＴの活性化に起因する疾患の治療剤と
して使用することができる。具体的には、たとえば免疫
抑制剤および心肥大抑制剤として使用し得るため、非常
に有用である。
【００９８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Hideki, Matsui
Japan Science and Technology Corporation
<120> Membrane-permeable NFAT inhibitor peptide
<130> JP-13253
<160> 6
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Met Ala Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu
1 5 10 15
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: fusion peptide sequence
<400> 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala
1 5 10 15
Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu
20 25 30
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> human
<400> 3
Met Ala Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile
1 5 10 15
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: fusion peptide sequence
<400> 4
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala
1 5 10 15
Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile
20 25 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> human
<400> 5
ctgaccaggg tcctattcca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> human
<400> 6
tggttatccc aagcaagagg 20
【図１】図１は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ、ＦＫ５０６およ
び１１Ｒ−ＶＥＥＴを各濃度で添加して培養した細胞に
おけるＩＬ−２遺伝子の転写量を示すグラフである。縦
軸は、ＧＡＰＤＨに対するＩＬ−２遺伝子の相対ＲＮＡ
量を表す。
び１１Ｒ−ＶＥＥＴを各濃度で添加して培養した細胞に
おけるＩＬ−２遺伝子の転写量を示すグラフである。縦
軸は、ＧＡＰＤＨに対するＩＬ−２遺伝子の相対ＲＮＡ
量を表す。
【図２】図２は、１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ培地
のみで６０時間培養したジャーカット細胞、１１Ｒ−Ｖ
ＩＶＩＴ添加後１３時間、１８時間、２４時間、３６時
間および６０時間培養したジャーカット細胞およびＦＫ
５０６添加後６０時間培養したジャーカット細胞におけ
るＩＬ−２遺伝子の転写量を示すグラフである。縦軸
は、ＧＡＰＤＨに対するＩＬ−２遺伝子の相対ＲＮＡ量
を表す。
のみで６０時間培養したジャーカット細胞、１１Ｒ−Ｖ
ＩＶＩＴ添加後１３時間、１８時間、２４時間、３６時
間および６０時間培養したジャーカット細胞およびＦＫ
５０６添加後６０時間培養したジャーカット細胞におけ
るＩＬ−２遺伝子の転写量を示すグラフである。縦軸
は、ＧＡＰＤＨに対するＩＬ−２遺伝子の相対ＲＮＡ量
を表す。
【図３】図３は、リンパ球混合試験において、細胞に取
り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を示すグラフであ
る。
り込まれた［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を示すグラフであ
る。
【図４】図４は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ、ＦＫ５０６およ
び１１Ｒ−ＶＥＥＴを投与したマウスから得られた細胞
を用いたリンパ球混合試験において、細胞に取り込まれ
た［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を示すグラフである。
び１１Ｒ−ＶＥＥＴを投与したマウスから得られた細胞
を用いたリンパ球混合試験において、細胞に取り込まれ
た［3Ｈ］ＴｄＲの放射活性を示すグラフである。
【図５】図５は、移植したベータ細胞の生存率をカプラ
ンマイヤーで評価したグラフである。
ンマイヤーで評価したグラフである。
【図６】図６は、移植したベータ細胞を免疫染色した結
果を示す顕微鏡像である。
果を示す顕微鏡像である。
【図７】図７は、各処理を行った細胞によるインスリン
分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフ
である。図７（ａ）は、各濃度の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで
処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロー
ルに対する相対値で示したグラフである。図７（ｂ）
は、各濃度のＦＫ５０６で処理された細胞によるインス
リン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグ
ラフである。図７（ｃ）は、各濃度の１１Ｒ−ＶＥＥＴ
で処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロ
ールに対する相対値で示したグラフである。
分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフ
である。図７（ａ）は、各濃度の１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで
処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロー
ルに対する相対値で示したグラフである。図７（ｂ）
は、各濃度のＦＫ５０６で処理された細胞によるインス
リン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグ
ラフである。図７（ｃ）は、各濃度の１１Ｒ−ＶＥＥＴ
で処理された細胞によるインスリン分泌量を、コントロ
ールに対する相対値で示したグラフである。
【図８】図８は、各処理を行った細胞の増殖を、コント
ロールに対する相対値で示したグラフである。図８
（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された細胞の増殖
を、コントロールに対する相対値で示したグラフであ
る。図８（ｂ）は、ＦＫ５０６で処理された細胞の増殖
を、コントロールに対する相対値で示したグラフであ
る。図８（ｃ）は、１１Ｒ−ＶＥＥＴで処理された細胞
の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフ
である。
ロールに対する相対値で示したグラフである。図８
（ａ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴで処理された細胞の増殖
を、コントロールに対する相対値で示したグラフであ
る。図８（ｂ）は、ＦＫ５０６で処理された細胞の増殖
を、コントロールに対する相対値で示したグラフであ
る。図８（ｃ）は、１１Ｒ−ＶＥＥＴで処理された細胞
の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフ
である。
【図９】図９は、ラットの心室中隔および左室全壁の厚
さを超音波エコーにより解析した結果を示すグラフであ
る。図９（ａ）は、コントロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投
与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢの心室中
隔壁厚を示すグラフである。図９（ｂ）は、コントロー
ル、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶ
ＩＴ投与ＡｏＢのラットの左室全壁厚を示すグラフであ
る。
さを超音波エコーにより解析した結果を示すグラフであ
る。図９（ａ）は、コントロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投
与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢの心室中
隔壁厚を示すグラフである。図９（ｂ）は、コントロー
ル、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶ
ＩＴ投与ＡｏＢのラットの左室全壁厚を示すグラフであ
る。
【図１０】図１０は、ラット心臓の組織標本の顕微鏡像
である。図１０（ａ）は、正常なラットの心臓切片を示
す顕微鏡像である。図１０（ｂ）は、ＡｏＢの心臓切片
を示す顕微鏡像である。図１０（ｃ）は、ＣｙｓＡを投
与したＡｏＢの心臓切片を示す顕微鏡像である。図１０
（ｄ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢの心臓
切片を示す顕微鏡像である。
である。図１０（ａ）は、正常なラットの心臓切片を示
す顕微鏡像である。図１０（ｂ）は、ＡｏＢの心臓切片
を示す顕微鏡像である。図１０（ｃ）は、ＣｙｓＡを投
与したＡｏＢの心臓切片を示す顕微鏡像である。図１０
（ｄ）は、１１Ｒ−ＶＩＶＩＴを投与したＡｏＢの心臓
切片を示す顕微鏡像である。
【図１１】図１１は、ラットの血液検査結果を示すグラ
フである。図１１（ａ）は、コントロール、ＡｏＢ、Ｃ
ｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢ
のＡＮＰを示すグラフである。図１１（ｂ）は、コント
ロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−Ｖ
ＩＶＩＴ投与ＡｏＢのＢＮＰを示すグラフである。
フである。図１１（ａ）は、コントロール、ＡｏＢ、Ｃ
ｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−ＶＩＶＩＴ投与ＡｏＢ
のＡＮＰを示すグラフである。図１１（ｂ）は、コント
ロール、ＡｏＢ、ＣｙｓＡ投与ＡｏＢおよび１１Ｒ−Ｖ
ＩＶＩＴ投与ＡｏＢのＢＮＰを示すグラフである。
１ ＢＡＬＢ／ｃマウスのベータ細胞
２ 糖尿病モデルマウスの腎臓
３ 左心室
４ 右心室
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 BA01 BA08
BA19 BA23 CA18 CA59 MA17
MA22 MA28 MA55 MA60 MA63
MA66 NA14 ZA362 ZB082
ZC202
4H045 AA10 AA30 BA18 BA19 BA41
CA40 EA20 FA20 GA25
Claims (5)
- 【請求項１】 アルギニン９残基〜１３残基および配列
番号１のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物。 - 【請求項２】 アルギニンが１１残基である請求項１記
載のペプチド化合物。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のペプチド化合物
からなるＮＦＡＴ活性化の阻害剤。 - 【請求項４】請求項１または２記載のペプチド化合物を
有効成分とする免疫抑制剤。 - 【請求項５】 請求項１または２記載のペプチド化合物
を有効成分とする心肥大抑制剤。
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