CN115261338A - 一株具有防控烟草青枯病的裂解性噬菌体s5及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有防控烟草土传青枯病的噬菌体S5，分类命名为(Bacillusphage)，于2022年5月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62467‑B1，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；将所述的噬菌体S5应用制备防治烟草青枯病生物制剂中，利用病原菌特异性噬菌体对青枯病进行生物防治，高效裂解青枯雷尔氏菌使其死亡，室内抑菌试验显示其抑菌率达到71.5％；将噬菌体用于烟草土传青枯病防治，盆栽防病率达到68％以上，可作为用于防治烟草青枯病的微生态制剂。

Description

一株具有防控烟草青枯病的裂解性噬菌体S5及应用

技术领域

本发明涉及青枯病生物防治技术领域，更具体地说是涉及一株具有防控烟草青枯病的裂解性噬菌体S5及应用。

背景技术

青枯病是农业种植过程常见的毁灭性土传病害，由劳尔氏菌Ralstoniasolanacearum(简称青枯菌)侵染引起。通常情况下，青枯菌通过植物根尖伸长区细胞或次生根生长点的伤口处进入根部，由维管束向地上部分迁移使植株萎焉，直至死亡，造成产量损失高达80％以上。青枯菌能侵染200多种作物，特别对番茄、辣椒、茄子、烟草、马铃薯、胡椒、生姜、香蕉、桑树等侵染严重。自然条件下，青枯菌具有较强的变异性，产生不同的青枯专化型，加之青枯菌传播途径复杂，寄主范围较广，从而造成了防治上的困难。近年来，采用化学药剂防治、种植抗病品种、以及合理轮作等综合措施在一定程度上能减少青枯病危害，但仍无法有效控制该病的发生。

目前，生物防治因对环境友好，不会对人体健康带来潜在威胁，引起了国内外广大学者的重视。尤其，噬菌体是防控青枯病研究热点。Fujiwara等利用青枯菌噬菌体处理青枯雷尔氏菌，发现单独或噬菌体组合处理都能快速降低宿主菌的密度。同样，Bhunchoth采用盆栽和田间试验，也发现噬菌体能有效减少土壤中青枯菌的数量。大量研究发现，噬菌体不仅具有指数式增殖的自我复制能力，极少量即可杀灭相应的致病菌，达到预防或控制细菌性感染的目的。最重要的是，自然界中普遍存在细菌相应的噬菌体，易分离且纯化周期短，常温下保存更便于运输和应用。因此，噬菌体产品是较为安全的食品安全生物防控手段，具有安全高效、特异性强、稳定性高、自我增殖决、筛选周期短以及不影响食品感官品质等优点，发展前景非常广阔。

因此，如何提供一株具有高效防控土传青枯病的噬菌体是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明筛选出一种可以特异性裂解青枯雷尔氏菌的噬菌体S5，进而将噬菌体S5制备成生物制剂，利用病原菌特异性噬菌体对青枯病进行生物防治，高效裂解细菌使其死亡，且对环境没有毒性；特异性强，不会破坏其他正常菌群，可保持土壤微生物平衡。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株具有防控烟草青枯病的裂解性噬菌体S5，分类命名为(Bacillus phage)，于2022年5月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62467-B1，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的噬菌体S5在制备防治烟草青枯病生物制剂中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种防治烟草青枯病的生物制剂，所述生物制剂中包含所述的噬菌体S5。

作为上述技术方案优选的技术方案，所述生物制剂中噬菌体S5的含量为10⁹-10¹⁰PFU/mL。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种防治青枯雷尔氏菌的生物制剂的制备方法，过程包括：将噬菌体S5按照感染复数接入到对数生长期的青枯雷尔氏菌菌液中，混匀，置于20-40℃、150r/min摇床中振荡培养12h，使噬菌体增殖，将增殖培养后的共培养悬液离心，取上清液经0.22μm滤膜过滤，得噬菌体悬液，无菌水调节噬菌体浓度，得到噬菌体制剂。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种以生物制剂预防青枯雷尔氏菌的方法，将所述的噬菌体S5生物制剂接种到植株根际，噬菌体的添加量为5×l0⁸PFU/株。

经由上述技术方案可知，本发明的噬菌体能够裂解青枯病病原菌，在温度20-40℃，pH＝5-9范围内噬菌体活性最高，裂解能力最强，均表现出较强的杀菌能力，室内抑菌试验显示其抑菌率达到了71.5％，可用于土传青枯病的防治。将本发明噬菌体用于防治土传青枯病，盆栽防病率达到68％，从根本上有效控制青枯病的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为噬菌体S5的噬菌斑形态图；

图2附图为噬菌体S5电镜形态图；

图3附图为噬菌体S5最佳比对结果图；

图4附图为噬菌体S5基因组信息图；

图5附图为噬菌体S5抑制青枯菌生长图；

图6附图为加入噬菌体S5之后，青枯菌OD₆₀₀变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1土传青枯菌噬菌体的筛选

从福建省福州市海边采集海水158份，采用菌液水样混合富集法，将培养好的土传青枯菌20210696YT菌液50mL和等体积海水样本分别混合到一起，再加入50mL新鲜NA液体培养基，培养温度为30℃，转速为170rpm，培养时间12h后，12000rpm离心l0 min，用0.22μm滤膜过滤两次，涂布点样法筛选得到噬菌体，见图1；

NA液体培养基：葡萄糖l0 g、蛋白脉5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、去离子水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。

实施例2噬菌体S5的电镜观察

挑取双层平板上单个较大噬菌斑加入至100mL对数生长时期的20210696YT菌液中，培养温度为30℃，转速为170rpm，培养时间12h后，12000rpm离心l0 min，用0.22μm滤膜过滤两次，滤液进行梯度稀释，稀释至10^-6，每个稀释梯度各取宿主菌和噬菌体各100μL进行双层板混板，以仅加入100μL浓度为5.1×10⁸Cfu/mL宿主菌的双层板进行对照，培养温度为30℃，过夜并观察噬菌斑生长状况，挑选单个噬菌斑继续纯化3次。取20μL纯化的噬菌体液滴在铜网上，静置使其自然沉淀15min，用滤纸在侧面将多余的液体吸去，然后滴一滴2％的磷钨酸在铜网上对噬菌体颗粒进行染色，继续静置l0 min后用滤纸在侧面将多余的染色液吸走，继续静置大概5min左右使样品干燥。通过电子显微镜观察噬菌体的形态，如图2所示，噬菌体S5头部呈正六面体结构，且具有伸缩性短尾，属于短尾噬菌体科。

实施例3噬菌体S5的全基因组分析

利用噬菌体DNA提取试剂盒，按操作步骤提取噬菌体基因组DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国NanoDrop公司)检测基因组DNA的纯度和浓度，送至上海探谱生物公司进行测序。测序结果表明：噬菌体S5共有75个基因，总长45kb，G+C＝41.85，国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses，工CTV)召开的第九次报告中提出短尾噬菌体的基因组大小在16-78kb之间。将噬菌体S5组装所得到的contigs与vi rus-NT数据库进行BLAST(V2.10.0+)比对，确定进化关系最近的候选参考序列，并确定比对序列所属的种属。

如图3、图4所示，噬菌体S5与KX227759.1Bacillus_phage PfIS075的同源性最高，由基因组大小和同源性可以确定噬菌体S5属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)，分类命名为(Bacillus phage)，于2022年5月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62467-B1，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

NA半固体培养基：葡萄糖l0 g、蛋白脉5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、l0 g琼脂粉、去离子水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。

NA固体培养基：葡萄糖l0 g、蛋白脉5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、20g琼脂粉、去离子水1000mL，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。

实施例4噬菌体S5的扩大培养

配置NA液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，同时加入1mL含量为10⁹CFU/mL青枯雷尔氏菌20210696YT菌液和1mL含量为10⁷PFU/mL噬菌体S5液，放置在温度为30℃，转速为170rpm的摇床培养12h，12000rpm离心10min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，所得液体即为扩大培养的噬菌体。

实施例5噬菌体S5微生态制剂的制备

配置NA液体培养基1L，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，同时加入1mL含量为1×10⁹CFU/mL青枯雷尔氏菌菌液和1mL含量为1×10⁷PFU/mL噬菌体S5液，放置在温度为30℃，转速为170rpm的摇床培养12h做为种子液，先接种到10L的发酵罐中，在30℃，转速为170rpm的发酵条件下培养12h，将所得的发酵液于12000rpm离心10min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，上清液用0.22μm滤膜过滤两次即得噬菌体微生态制剂。

实施例6噬菌体S5的含量测定

将噬菌体S5进行梯度稀释，稀释至l0^-8，取100μL噬菌体稀释液和100μL青枯雷尔氏菌液制作双层板混板，以100μL浓度为5.8×l0⁸CFU/mL青枯雷尔氏菌的双层板进行对照，30℃恒温培养过夜，通过观察噬菌斑个数计算噬菌体含量。结果表明：噬菌体含量为1.8×l0¹¹PFU/mL，含量高且对青枯雷尔氏菌侵染能力强。

实施例7室内抑菌试验

将1ml噬菌体制剂与1ml培养至对数生长期的青枯菌菌液混合后加入至18mlNA液体培养基中共培养，以不加入噬菌体制剂的单培养青枯菌菌液为对照(CK)，每个处理下设有3个平行重复。置于30℃，170r/min摇床中振荡培养36h，用酶标仪测量OD₆₀₀值，并记录。根据青枯菌的生物量来表征噬菌体的抑菌效果，由图5可以看出，噬菌体S5可以抑制青枯菌生长；由图6可以看出：加入噬菌体S5之后，青枯菌OD₆₀₀值显著下降。与单培养的青枯菌相比，噬菌体S5对青枯菌有较好的抑制效果，其抑菌率达到了71.5％。

实施例8盆栽防控试验

采用盆钵试验检测噬菌体防控烟草青枯病的能力。供试土壤为育苗基质，烟草品种为红花大金元。实验设置2个处理：1、对照(CK)：20210696YT；处理：S5与20210696YT共培养液体。每个处理设有10-15个生物学重复。在30℃下光照12h/黑暗12h交替培养10-20d，观察青枯病的发生并拍照。结果表明：S5与20210696YT共培养液体处理的烟草幼苗青枯病的发病率为27.2％，而对照组的发病率达到85％，其对烟草青枯病的防控率达到68％，具有显著的防控效果。

上述结果表明，本发明从福建省沿海地区的海水中分离筛选出噬菌体S5，其对青枯雷尔氏菌具有很高的杀菌活性，能更有效的解决农作物种植中出现的细菌病害感染问题。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一株具有防控烟草青枯病的裂解性噬菌体S5，其特征在于，分类命名为(Bacillusphage)，于2022年5月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62467-B1，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.权利要求1所述的菌噬菌体S5在制备防治青枯雷尔氏菌生物制剂中的应用。

3.一种防治青枯雷尔氏菌的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中包含权利要求1所述的噬菌体S5。

4.根据权利要求3所述的一种防治青枯雷尔氏菌的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中噬菌体S5的含量为10⁹-10¹⁰PFU/mL。

5.权利要求3-4任一所述的一种防治青枯雷尔氏菌的生物制剂的制备方法，其特征在于，过程包括：将噬菌体S5按照感染复数接入到对数生长期的烟草青枯雷尔氏菌菌液中，混匀，置于20-40℃、150r/min摇床中振荡培养12h，使噬菌体增殖，将增殖培养后的共培养悬液离心，取上清液经0.22μm滤膜过滤，得噬菌体悬液，无菌水调节噬菌体浓度，得到噬菌体制剂。

6.一种以权利要求5制备得到的生物制剂预防烟草青枯病的方法，其特征在于，将所述的噬菌体S5生物制剂接种到植株根际，噬菌体的添加量为5×l0⁸PFU/株。

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