CN108410826B - 一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法 - Google Patents

一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种青枯菌噬菌体的扩大繁殖的方法，本发明公开的无毒青枯菌株RSsw326‑2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2018197。本发明中的无毒青枯病菌是从自然发病烟草植株中分离获得的青枯病菌，经过继代培养获得变异菌株，经致病性测定，对烟苗丧失致病性即为青枯菌无毒菌株，并利用该无毒青枯病菌繁殖青枯菌噬菌体，可得到效价较高的青枯菌噬菌体。该方法有望作为青枯菌噬菌体生物农药开发中噬菌体大量扩繁的载体，避免因宿主菌株的毒性造成对防治对象的再次为害。

Description

一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域和微生物制品领域,具体涉及一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法。
背景技术
噬菌体（phage）是侵袭细菌的病毒，也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体能够杀死细菌的现象在1915年由弗德里克· 特沃特(Frederick W.Twort)发现，因而利用噬菌体控制细菌的研究已有近百年。噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的肠道里，都可以找到噬菌体。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于疾病诊断、水处理等多个领域。由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行扩大生产，现有技术的植物病原细菌的噬菌体通常是采用其宿主菌进行繁殖，而宿主菌是植物的病原菌，但是在进行噬菌体扩繁时，宿主细菌未能全部被噬菌体裂解，在田间应用时易造成对防治对象的再次为害，因而严重制约了对噬菌体应用的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述方法包括如下步骤：
（1）将所述青枯菌接种于CPG培养基平板上，倒置，28℃培养24-48h，使其长出单菌落；
（2） 挑取无毒青枯菌单菌落于装有3mL NB培养基的三角烧瓶中，28℃，180rpm振荡培养至浓度为108 CFU /mL；
（3）以体积比1%的接种浓度转接到100mL新鲜的NB培养基中，28℃，180rpm振荡培养至浓度为108 CFU /mL；
（4） 加入1mL噬菌体原液，混匀，静置15min，28℃，130rpm振荡过夜培养；所得共培液即为用无毒菌株培养好的噬菌体。
NB培养基为蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、葡萄糖2.5g，调节pH7.2，加去离子水，定容至1L。
所述的青枯菌为所述的青枯菌为茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）RSsw326-2已于2018年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO：M 2018197。地址为武汉大学。
本发明的优点在于：
本发明中的无毒青枯病菌是从自然发病烟草植株中分离的青枯病菌，经过继代培养获得的无毒青枯菌，并利用无毒青枯菌繁殖青枯菌噬菌体，可得到效价较高的青枯菌噬菌体。该方法有望作为青枯菌噬菌体生物农药开发中噬菌体大量扩繁的载体，避免因宿主菌株的毒性造成对防治对象的再次为害。
附图说明
图1 菌株RSsw326-2菌落图。
图2 噬菌斑图。
图3致病性测定（A 无毒菌株RSsw326-2，B 野生青枯菌株）。
图4无毒菌株和噬菌体的共培液的致病性测定，A: 无毒菌株和噬菌体的共培液;B毒性青枯菌和噬菌体的共培液C清水。
图5 青枯菌特异性引物759F/760R PCR扩增图（M：Marker 2000;1: 无毒菌株RSsw326-2;2: 野生青枯菌）。
具体实施方式
实施例1
1、青枯病菌的获得：从自然发病的烟草植株，采用稀释涂布分离法进行分离，挑取单菌落进行3-5次纯化，获得的野生青枯菌。
2、无毒菌株的筛选：从自然发病烟草植株中分离的野生青枯病菌，经过20代以上连续培养，挑取流动性差的菌落，进行致病性测定，测定结果该菌株丧失对烟草的致病性，即为毒性青枯菌的变异菌株，命名为RSsw326-2。
3、致病性测定：挑取继代培养获得变异菌株的单菌落于NB液体培养基中振荡培养（28℃，180rpm）至浓度约为108CFU/mL，采用灌根接种于5片真叶的烟草苗，在接种处理后30d，所接种的烟草与清水对照接种的一样，不表现症状，说明所获得的变异菌株丧失对烟草的致病性，即为无毒菌株茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）RSsw326-2。
4、青枯菌特异性引物PCR扩增：提取无毒菌株的基因组DNA，用青枯菌特异性引物759F/760R（GTCGCCGTCAACTCACTTTCC/GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG）进行PCR扩增，扩增条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火59℃，30s；延伸72℃，1min；后延伸72℃，10min。结果可获得一条大小为280bp的特异性条带。见图5。
5、无毒菌株RSsw326-2对 3种双糖和3种己醇的利用情况：在基础培养基（NH4H2PO41g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蛋白胨 1.0 g、酚红 80 mg、琼脂 3 g、调节pH7.4，加去离子水，定容至1L），分别加入过滤除菌的乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇，使其终浓度为1%，分装试管，每管3mL，按1%比例接种无毒菌株悬浮液（浓度约为108 CFU /mL），置于28℃恒温培养箱中培养。结果表明该菌株可利用乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇。见表1。
表 1 无毒菌株RSsw326-2对三糖三醇的利用情况
Figure DEST_PATH_IMAGE001
RSsw326-2在TTC培养基上其菌落圆形（见图1），中央暗红色，边缘乳白色，流动性差，通过菌株对3种双糖和3种己醇的利用情况和青枯菌特异性引物PCR扩增结果鉴定其为茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）。
实施例2
1、无毒菌株的筛选：从自然发病烟草植株中分离的青枯病菌，经过20代以上连续培养，挑取流动性差的菌落，进行致病性测定，测定结果该菌株丧失对烟草的致病性，即为毒性青枯菌的变异菌株，命名为RSsw326-2。
2、无毒菌株致病性测定：5片真叶的烟草苗，品种：翠碧1号，青枯病菌接种浓度：108CFU/mL；接种方法：灌根接种；
3、无毒菌株寄主范围测定：
使用点滴法测定无毒菌株寄主范围。具体操作为：
取1mL对数期茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）培养物加入CPG半固体培养基中，混匀后倒入预先制备好的CPG固体琼脂平板上，待凝固后取0.5μＬ噬菌体原液滴加到平板表面，吹干，28℃倒置培养过夜， 第2d观察噬菌斑的形成情况。结果表明该菌株可被青枯菌噬菌体寄生。（图2）
4、无毒菌株培养噬菌体
⑴ 将茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）RSsw326-2接种于CPG培养基上，倒置，28℃培养36h，使其长出单菌落。
⑵ 挑取茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）RSsw326-2单菌落于装有3mL NB（蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、葡萄糖2.5g，调节pH7.2，加去离子水，定容至1L）培养基的三角烧瓶中，28℃，180rpm振荡培养至浓度约为108CFU/mL。
⑶ 以体积比1%的接种浓度转接到100mL新鲜的NB培养基中，28℃，180rpm振荡培养至浓度约为108CFU/mL。
⑷ 加入1mL噬菌体原液，混匀，静置15min，28℃，130rpm振荡过夜培养。所得共培液即为用无毒菌株培养好的噬菌体。
（5）采用双层平板法测定噬菌体效价：测定结果表明，无毒青枯菌RSsw326-2培养青枯菌噬菌体效价可达1010PFU /mL。
5、无毒菌株和噬菌体的共培液的致病性测定
⑴ 将菌株RSsw326-2和毒性青枯病菌分别接种于CPG培养基上，倒置，28℃培养36h，使其长出单菌落。
⑵ 分别挑取无毒菌株RSsw326-2和毒性青枯病菌单菌落于装有3mL NB（蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、葡萄糖2.5g，调节pH7.2，加去离子水，定容至1L）培养基的三角烧瓶中，28℃，180rpm振荡培养至浓度约为108CFU/ml。
⑶ 以体积比1%的接种浓度转接到100mL新鲜的NB培养基中，28℃，180rpm振荡培养至浓度约为108CFU/ml。
⑷ 加入1mL噬菌体原液，混匀，静置15min，28℃，130rpm过夜振荡培养。所得共培液分别为无毒菌株和噬菌体的共培液及毒性青枯菌和噬菌体的共培液。
（5）分别将无毒菌株和噬菌体的共培液及毒性青枯菌和噬菌体的共培液灌根接种于烟苗，结果表明，接种后30d，无毒菌株和噬菌体的共培液接种的烟草不发病，毒性青枯菌和噬菌体的共培液接种的烟草的发病率为50%（图4）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgccgtca actcactttc c 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgccgtca gcaatgcgga atcg 24

Claims (2)

1.一种青枯菌噬菌体扩大繁殖的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）将青枯菌接种于CPG培养基平板上，倒置，28℃培养24-48h，使其长出单菌落；
（2） 挑取无毒青枯菌单菌落于装有3mL NB培养基的三角烧瓶中，28℃、180rpm振荡培养至浓度为108 CFU /mL；
（3）以体积比1%的接种浓度转接到100mL新鲜的NB培养基中，28℃，180rpm振荡培养至浓度为108 CFU /mL；
（4） 加入1mL噬菌体原液，混匀，静置15min，28℃，130rpm振荡过夜培养；所得共培液即为用无毒菌株培养好的噬菌体；
所述的青枯菌为茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearium）RSsw326-2 ，已于2018年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 2018197。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：NB培养基为蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、葡萄糖2.5g，调节pH7.2，加去离子水，定容至1L。
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