WO2007057486A2 - Método para promoción de crecimiento de plantas de tomate - Google Patents

Método para promoción de crecimiento de plantas de tomate Download PDF

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Antonieta De Cal Y Cortina
Pilar Sabuquillo Castrillo
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    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/36Penicillium
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    • A01N63/30Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom

Definitions

  • the present invention relates to a method to enhance or promote the growth of tomato plants.
  • the method consists in a treatment of the seedlings with a microorganism, specifically with the penicillium oxalicum, a fungus that colonizes the tomato plant, promoting its growth.
  • microorganisms on plant growth is a well known phenomenon in a series of microorganism-plant systems such as rhizobacteria-legume symbiosis and other bacterial associations with different plant species (Spaink et al, 1998, Oke et al, 1999; Rai et al 2000).
  • the promotion of growth by different genera of fungi has also been verified and a series of molecules with characteristics of phytohormones that are capable of carrying out this growth promoting effect have been isolated (Okon, 1994; Tikhonovich et al., 2004).
  • the growth promoting effect is also a characteristic.
  • Penicillium oxalicwn is a biocontrol agent of pathogen-induced tomato vascular wilt like Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and Verticillium dahliae. In previous in vitro experiments it has been seen that the immersion of seeds of different tomato cultivars in conidia suspensions of P.
  • the conidia used were produced in an axenic laboratory medium, dextrose potato agar, impossible to use on a large scale at an industrial level.
  • the method proposed by the invention demonstrates the promotion of growth in tomato plants planted in seedlings and treated with penicillium oxalicum. This method of application is simple and It can be carried out under real cultivation conditions, while conidia are produced by an easily scalable method at the industrial level.
  • Conidia are presented in a dry formulation that is stable and easily applicable under practical conditions and growth promotion is related to the biocontrol of tomato vascular wilt.
  • the method consists in putting the plants in contact with the conidia, specifically in the seedling phase for the first ones, in the corresponding seedbed, with a final concentration in the substrate of said seedbed between 1x10 and 10xO conidia per gram.
  • the suspension application can be carried out by direct spraying on the seedlings or by irrigating the soil.
  • Figure L- Shows two photographs of plant seedlings tomato, those on the left treated with "penicillium oxalicum" and those on the right untreated.
  • Figure 2. Shows photographs of tomato seedlings, those on the right treated in seedbed with conidia of penicillium oxalicum and those on the left untreated.
  • Figure 3. It shows, finally, photographs of tomato plants transplanted into pots, those on the right previously treated in seedbed with conidia of penicillum oxalicum and those on the left untreated.
  • the P. oxalicum isolate (PO-212), is currently in the American Crop collection and has the ATCC number 201888. It is stored in tubes with potato dextrose agar at 4 0 C and for initial conidia production it is grown in plates of Petri with APD at 20-25 0 C for 7 days in the dark.
  • the conidia used to perform the growth promotion experiments are produced and formulated as follows. The fungus is grown in a peat mixture (Gebr. BRILL substrate GmbH & Co. KG, Germany): vermiculite (Termita, Asfaltex, SA, Barcelona, Spain): lentil flour (1: 1: 0.5, p / p / p) .
  • This suspension is mixed in an orbital shaker (Lab-Line Instruments, Inc., model 3527, Melrose Park, Illinois, USA ) at 200 rpm for 10 min and filtered through glass wool Most of the conidia pass through it and the collected conidia suspension is concentrated by centrifugation at 10,000 rpm for 10 min and vacuum filtration through filter paper (l ⁇ m) The final yield of conidia obtained after this process is 10 conidia g dry weight of the substrate These conidia have an average viability of 80%
  • the formulated conidia (FOR4) are obtained by adding sodium alginate to the conidia paste P. oxalicum obtained after the extraction described above. Conidia of P.
  • oxalicum are maintained for 10 minutes in a solution of 1.5% sodium alginate and filtered under vacuum through filter paper (l ⁇ m). Once filtered, the formulated and unformed conidia are dried in a fluid bed until their humidity is less than 10%. For drying, the conidia paste is introduced in a fluid bed model 35Os (Burkard Manufacturing Co Ltd., Hertfordshire, UK), at maximum air flow and at 4O 0 C for the time necessary to achieve the required humidity.
  • Tomato seeds cv. San Pedro were planted in trays (27x42x7 cm) containing an autoclaved mixture of vermiculite and peat (1: 1, v: v). The trays were maintained in a growth chamber at 22-28 0 C under fluorescent lights (100 ⁇ E / ms 16 h photoperiod) and 80-100% relative humidity for 3 weeks. At that time the seedlings had 2-4 leaves and received an irrigation in the - fi -
  • Table 1 Effect of the treatment of conidia of Pencillium oxalicum on the growth of tomato plants cv San Pedro.

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Abstract

El método consiste en poner en contacto con las plántulas de tomate una suspensión de conidias formuladas de penicillium oxalicum, cuando las plantas están en el semillero, de manera que los hongos generados por dichas conidias potencian el desarrollo o crecimiento de las plántulas de tomate.

Description

MÉTODO PAK A PKOMOrTÓN T)F, CftFCTMTFNTO DF, PT, ANT A S T>F, TOMATF,
π F, S Γ K Ϊ P Γ T O N
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para potenciar o promocionar el crecimiento de plantas de tomate.
El método consiste en un tratamiento de las plantas en semillero con un microorganismo, concretamente con el penicillium oxalicum, hongo que coloniza la planta de tomate potenciando el crecimiento de la misma.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La influencia de microorganismos en el crecimiento de las plantas es un fenómeno bien conocido en una serie de sistemas microorganismo-planta como las simbiosis rizobacteria-leguminosa y otras asociaciones bacterianas con especies vegetales diferentes (Spaink et al ,1998, Oke et al, 1999; Rai et al 2000). La promoción del crecimiento por diferentes géneros de hongos también ha sido constatada y se han aislado una serie de moléculas con características de fitohormonas que por si mismas son capaces de llevar a cabo este efecto promotor del crecimiento (Okon, 1994; Tikhonovich et al., 2004). El efecto promotor del crecimiento también es una característica asociada a muchos microorganismos que actúan como antagonistas induciendo resistencia en plantas frente a infecciones por patógenos (Murphy et al., 2000; Park et al., 2000; Zehnder et al, 2001; Tikhonovich et al., 2004). Penicillium oxalicwn es un agente de biocontrol de la marchitez vascular del tomate inducida por patógenos como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici y Verticillium dahliae. En experimentos in vitro previos se ha visto que la inmersión semillas de distintos cultivares de tomate en suspensiones de conidias de P. oxalicum durante 30 minutos da lugar a plantas que presentan un desarrollo más rápido y un mayor peso de raíces que las que no han sido expuestas a la acción del hongo (García-Lepe et al., 1996; Pascual, 1998). En estos ensayos se evaluó la promoción de crecimiento en semillas tratadas y no tratadas con P. oxalicum y sembradas en placas de Petri con distintos medios de cultivo. También se ha demostrado previamente que el tratamiento de semillas con P. oxalicum no es el más adecuado para conseguir controlar la marchitez vascular (De Cal et al., 1999). Se ha demostrado que el mejor momento de aplicación de las conidias para el control de esta enfermedad en plantas de tomate se produce mediante un riego a las raíces en el semillero una semana antes del transplante (De Cal et al., 1999).
Además, en los experimentos aludidos las conidias utilizadas se producían en un medio axénico de laboratorio, agar patata dextrosa, imposible de utilizar a gran escala a nivel industrial.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El método que la invención propone demuestra la promoción del crecimiento en plantas de tomate plantadas en semillero y tratadas con penicillium oxalicum. Dicho método de aplicación es sencillo y puede llevarse a cabo en condiciones de cultivo reales, a la vez que las conidias se producen mediante un método fácilmente escalable a nivel industrial.
Las conidias se presentan en una formulación seca que es estable y fácilmente aplicable en condiciones prácticas y la promoción de crecimiento está relacionada con el biocontrol de marchiteces vasculares de tomate.
De forma más concreta el método consiste en poner en contacto las plantas con las conidias, concretamente en fase de plántulas para las primeras, en el correspondiente semillero, con una concentración final en el sustrato de dicho semillero comprendido entre 1x10 y lOxlO conidias por gramo.
La aplicación en suspensión puede llevarse a cabo mediante pulverización directa sobre las plántulas o bien mediante riego del terreno.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
La figura L- Muestra dos fotografías de semilleros de plantas de tomate, las de la izquierdas tratadas con "penicillium oxalicum" y las de la derecha no tratadas.
La figura 2.- Muestra fotografías de plántulas de tomate, las de la derecha tratadas en semillero con conidias de penicillium oxalicum y las de la izquierda no tratadas.
La figura 3.- Muestra, finalmente, fotografías de plantas de tomate transplantadas a macetas, las de la derecha tratadas previamente en semillero con conidias de penicillum oxalicum y las de la izquierda sin tratar.
EXPERIMENTO DE REALIZACIÓN PRACTICA DE LA INVENCIÓN
El aislado de P. oxalicum (PO-212), se encuentra actualmente en la colección Americana de Cultivos y tiene el número ATCC 201888. Se almacena en tubos con agar patata dextrosa a 4 0C y para producción inicial de conidias se crece en placas de Petri con APD a 20-250C durante 7 dias en la oscuridad. Las conidias utilizadas para realizar los experimentos de promoción de crecimiento se producen y formulan de la siguiente forma. El hongo se crece en una mezcla de turba (Gebr. BRILL substrate GmbH&Co. KG, Germany) : vermiculita (Termita, Asfaltex, S.A., Barcelona, Spain): harina de lenteja (1:1:0.5, p/p/p). Cincuenta gramos de este substrato (con un 40% p/p de contenido de agua) se introducen en bolsas de plástico (600 cm3) diseñadas para fermentación sólida (VALMIC , Sacherei de Pont-Audemer S.A., France), se sellan y se esterilizan por autoclave a 1.0 kg cm"2 y 120 0C durante 1 h y 3 dias consecutivos. Las bolsas se inoculan entonces con una suspensión de conidias de P. oxalicum producidas en agar patata dextrosa a una concentración tal que se obtengan 105 conidia g"1 substrato seco, se sellan de nuevo y se incuban en la oscuridad a 20-25 0C durante 5 dias. Se añade agua a esta mezcla de conidias + substrato a una proporción de 1 :4, p/v. Esta suspensión se mezcla en un agitador orbital (Lab-Line Instruments, Inc., modelo 3527, Melrose Park, Illinois, USA) a 200 rpm durante 10 min y se filtra por lana de vidrio. La mayoría de las conidias pasan a través de ella y la suspensión de conidias recogida se concentra por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min y filtración a vacío a través papel de filtro (lμm). El rendimiento final de conidias obtenido tras este proceso es de 10 conidia g peso seco de substrato. Estas conidias tienen una viabilidad media del 80%. Las conidias formuladas (FOR4) se obtienen añadiendo alginato sódico a la pasta de conidias de P. oxalicum obtenida tras la extracción descrita anteriormente. Se mantienen las conidias de P. oxalicum durante 10 minutos en una solución de 1.5% alginato sódico y se filtran a vacío a través papel de filtro (lμm). Un vez filtradas, las conidias formuladas y sin formular se secan en un lecho fluido hasta conseguir que la humedad de las mismas sea inferior al 10%. Para el secado se introduce la pasta de conidias en un lecho fluido modelo 35Os (Burkard Manufacturing Co Ltd., Hertfordshire, UK), al máximo flujo de aire y a 4O0C durante el tiempo necesario para conseguir la humedad requerida.
Semillas de tomate cv. San Pedro se sembraron en bandejas (27x42x7 cm) que contenían una mezcla autoclavada de vermiculita y turba (1:1, v:v). Las bandejas se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 22-28 0C con luz fluorescente (100 μE/m s, 16 h fotoperiodo) y 80-100% humedad relativa durante 3 semanas. En ese momento las plántulas tenían 2-4 hojas y recibieron un riego en el - fi -
semillero con una suspensión de conidias formuladas de P. oxalicum a una concentración tal que la concentración final en el substrato del semillero (vermiculita:turba, 1:1 v/v) fue de 6 x 106 conidias g"1. El tratamiento control consistió en regar las plántulas sólo con agua destilada estéril. Una vez tratadas las bandejas de semillero se trasladaron a un invernadero, en el que estuvieron 7 días, transcurridos los cuales las plántulas se transplantan a su terreno de asiento. En este momento se sacaron cuidadosamente las plantas del semillero, separándose la parte aérea de las raíces. Se contó el número total de hojas de 10 plantas por tratamiento y se pesaron por separado las raíces de 3 plantas por tratamiento. Los datos se analizaron por análisis de la varianza. Cuando el test F resultaba significativo (P = 0.05) las medias se compararon por el test de Student-Newman-Keul (P = 0.05).
Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 1
Tabla 1: Efecto del tratamiento de conidias de Pencillium oxalicum sobre el crecimiento de plantas de tomate cv San Pedro.
Figure imgf000007_0001
Como se puede observar el n° de hojas es mayor en las plantas tratadas y el peso de raíz se duplica.

Claims

re y, T V Í N Π Í Γ A Γ T O N F, s
Ia.- Método para promoción de crecimiento de plantas de tomate, caracterizado porque consiste en poner en contacto las plantas de tomate con conidias de penicillium oxalicum.
2a.- Método para promoción de crecimiento de plantas de tomate, según reivindicación Ia, caracterizado porque las conidias, almacenadas en forma de pasta en seco, se introducen en una solución de alginato sódico, se seca en un lecho fluido hasta conseguir una humedad inferior al 10% y se aplican sobre las plantas de tomate o sobre la tierra en la que están implantadas.
3a.- Método para promoción de crecimiento de plantas de tomate, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de conidias está comprendida el 1x10 el 10x10 conidias por gramo.
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